Summary
Questo protocollo descrive un singolo throughput per complementari tecniche analitiche e omiche che culmina in una caratterizzazione completamente accoppiato di sostanza organica naturale e proteomica microbica in ecosistemi differenti. Questo approccio permette confronti robusti per identificare vie metaboliche e trasformazioni importanti per descrivere la produzione di gas serra e predire le risposte al cambiamento ambientale.
Abstract
Materia organica naturale (NOM) è composto da una miscela molto complessa di migliaia di composti organici che, storicamente, si è rivelata difficile da caratterizzare. Tuttavia, per comprendere i controlli termodinamici e cinetici di produzione di gas (anidride carbonica [CO2] e [CH4] metano) serra derivanti dalla decomposizione di NOM, una caratterizzazione a livello molecolare accoppiato con microbica analisi del proteoma è necessario. Clima e cambiamenti ambientali si prevedono ulteriori, per perturbare gli ecosistemi naturali, sconvolgendo potenzialmente complesse interazioni che influenzano sia la fornitura di substrati di materia organica e i microrganismi eseguire le trasformazioni. Una dettagliata caratterizzazione molecolare della materia organica, proteomica microbica e le vie e le trasformazioni mediante il quale la materia organica viene decomposta sarà necessaria prevedere la direzione e l'entità degli effetti dei cambiamenti ambientali. Questo articolo viene descritto un throughput metodologico per la caratterizzazione completa del metabolita in un singolo campione di iniezione diretta Fourier transform ionica risonanza ciclotronica (FTICR-MS), gas cromatografia spettrometria di massa (GC-MS), spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), liquido cromatografia spettrometria di massa (LC-MS) e l'analisi proteomica. Questo approccio si traduce in un set di dati completamente accoppiato che migliora la confidenza statistica per la deduzione delle vie di decomposizione di materia organica, la risultante di CO2 e tassi di produzione4 CH e le loro risposte a perturbazioni ambientali. Qui presentiamo i risultati dell'applicazione di questo metodo a NOM campioni raccolti da torbiere; Tuttavia, il protocollo è applicabile a qualsiasi campione NOM (ad es., torba, terreno boscoso, sedimenti marini, ecc.).
Introduction
Globalmente, le zone umide sono stimate a contengono Pg 529 del carbonio (C), principalmente come C organico seppellito in depositi di torba1. Attualmente, tali torbiere agiscono come un lavandino C netto, sequestrante 29 Tg C y-1 nel Nord America da solo1. Tuttavia, disturbi ambientali come drenante, incendi, siccità e temperature più calde possono compensare questo sink C aumentando la decomposizione di materia organica con conseguente aumentata C perdite tramite gas serra (anidride carbonica [CO2] e 1,produzione di metano [CH4])2. Cambiamento climatico può contribuire alla perdita di C se temperature più calde o essiccatore condizioni stimolano più veloce C decomposizione da parte dei microrganismi. In alternativa, più alte temperature e concentrazioni in aria CO2 possono stimolare la produzione primaria per sequestrare più CO2 come carbonio organico (OC). In quale misura e quanto velocemente tale OC viene quindi scomposto in CO2 e CH4 dipende da complesse interazioni tra i substrati di donatore di elettrone, la disponibilità di accettori e i microrganismi che mediano il trasformazione. In molti casi, i meccanismi non sono ben caratterizzati, così loro risposta a perturbazioni ambientali non è ben vincolata e non è ancora chiaro quale sarà il risultato del cambiamento climatico sul bilancio del carbonio negli ecosistemi delle torbiere.
La natura complessa della materia organica naturale (NOM) ha fatto anche identificare i composti organici presenti nelle miscele NOM storicamente difficile. Gli avanzamenti recenti hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di caratterizzare i composti che tradizionalmente e, in qualche misura continua ad essere, considerato recalcitrante umico fulvico composti3,4,o5. Ora capiamo che molti di questi composti sono in realtà microbica disponibili e può essere decomposto se un accettore di elettroni terminale adatto (TEA) è reso disponibile6,7. Calcolare lo stato di ossidazione nominale del carbonio (NOSC) per un composto fornisce una metrica per predire il potenziale di decomposizione e il rendimento energetico del tè richiesto. Tuttavia, esso richiede una caratterizzazione a livello molecolare della materia organica7. NOSC è calcolato dalla formula molecolare tramite la seguente equazione7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, dove z è la carica netta. NOSC è correlata con la termodinamica guida forza8, in cui composti con NOSC superiori sono più facili da degradare, mentre composti con bassa NOSC richiedono sempre più energico tè al fine di essere ridotto. Composti con NOSC inferiore a − 2 richiedono un'alta energia producendo tè come O2, nitrato o MnIVe non può essere degradate da che si verificano comunemente più basso energia producendo tè come FeIII o solfato7. Questa è una considerazione importante nelle condizioni anossiche impregnato d'acqua trovato nelle zone umide dove O2 e altre ad alta energia producendo tè sono scarse9 e quindi la degradazione di composti NOSC inferiore in queste condizioni sono termodinamicamente limitato. Perturbazione ambientale può influenzare lo stato termodinamico dell'ecosistema attraverso i cambiamenti idrologici che influenzano O2 (il più energico accettore di elettroni), cambiamenti in substrati organici e accettori messi a disposizione dal principale produzione e in misura minore dalla temperatura. Un esempio importante degli effetti di temperatura nei sistemi di zona umida si verifica per quanto riguarda il compromesso che si verifica tra homoacetogenesis (cioè, produzione di acetato da CO2 e H2) e hydrogenotrophic metanogenesi ( cioè, produzione4 CH da CO2 e H2). A basse temperature, sembra che homoacetogenesis è leggermente favorito, mentre temperature più calde favoriscono CH4 produzione10. Questo effetto di temperatura può avere implicazioni importanti per la risposta degli ecosistemi al cambiamento climatico, come CH4 è un gas serra molto più forte di CO211 e quindi aumentare la produzione di CH4 a spese di CO2 alle temperature più calde può contribuire ad un feedback positivo con il riscaldamento climatico.
Le torbiere producono globalmente significative quantità di CO2 e CH46tramite respirazione microbica di biofiltri organici importa. NOSC dei substrati organici carbonio determina la proporzione relativa di CO2: CH4 prodotto che è un parametro critico a causa del maggiore forcing radiativo di CH4 rispetto al CO211, ma anche perché sforzi modellanti hanno identificato questo rapporto come un parametro critico per la stima C flusso in torbiere12. In assenza di accettori terminali diverso da CO2, può essere dimostrato dall'equilibrio di elettroni che substrati organici C con volontà > 0 NOSC producano CO2: CH4 > 1, C organico con NOSC = 0 produce CO2 e CH4 in rapporto equimolare e C organico con NOSC < 1 produrrà CO2: CH4 < 113. Decomposizione di OC negli ecosistemi naturali è mediata da microrganismi, così che anche quando la degradazione di un composto specifico è thermodinamicamente fattibile, cineticamente è limitato dall'attività di enzimi microbici e, in condizioni anossiche, per la forza motrice termodinamico (cioè, NOSC)7. Fino ad ora esso è stato impegnativo per caratterizzare completamente la materia organica, perché la diversità dei composti presenti richiede diverse tecniche complementari per la loro caratterizzazione. Gli avanzamenti recenti hanno chiuso il gap; utilizzo di una suite di tecniche analitiche possiamo analizzare una vasta gamma di composti organici fornendo la caratterizzazione a livello molecolare e, in alcuni quantificazione di casi, da piccoli metaboliti primari come il glucosio fino a 800 Da poli-eterocicli. In precedenza tali grandi molecole complesse sarebbero sono state caratterizzate semplicemente come lignina-come o tannino-come e presupposto per essere stato ricalcitrante. Caratterizzazione molecolare-livello, tuttavia, consente il calcolo di NOSC per anche queste grandi molecole complesse. Questi valori NOSC sono correlati linearmente con la forza motrice termodinamica che permettano una valutazione della qualità della sostanza organica disponibile per decomposizione, che in molti casi rivela che queste molecole complesse possono effettivamente essere microbica degradabile anche sotto le condizioni anossiche che prevalgono nelle zone umide.
Poiché introduzione di O2 permette di materia organica di quasi tutti i valori NOSC naturalmente osservati per essere decomposto, qui ci concentriamo sui cambiamenti nella materia organica e proteomica microbica che rischiano di essere i driver primari in zona umida (cioè, sistemi di limitata O2). Tuttavia, tutte le tecniche che si discuterà possono essere applicate alla materia organica da qualsiasi ecosistema. Comunemente, misurazioni di massa sulla basano ottica, e l'analisi di fluorescenza sono stati usati per valutare la qualità di materia organica3,14. Quando si utilizza bulk misure come queste, tuttavia, dettagli raffinati sono persi come un numero elevato di molecole Classificato insieme in termini generici come humics o fulvics. Le definizioni di queste categorie non sono vincolate e, infatti, possono variare da studio a Studio facendo paragoni impossibili. Inoltre, misurazioni di massa non forniscono i dettagli molecolari necessari per calcolare la termodinamica che regolano il sistema e pertanto sono privi veramente valutare qualità di materia organica15.
Tecniche individuali come Fourier trasformano ionica a risonanza ciclotronica (FTICR-MS), spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), gas cromatografia spettrometria (GC-MS) di massa e fare liquido cromatografia spettrometria di massa (LC-MS) fornire tali dettagli a livello molecolare. Mentre ciascuna di queste tecniche presenta le proprie limitazioni, portano anche i propri punti di forza che può essere sfruttati in un approccio integrato per raggiungere i minimi dettagli molecolari necessari per quantificare la qualità di materia organica in un rigoroso senso termodinamico . GC-MS è utile per l'identificazione dei metaboliti piccole critiche che possano avere influenza prossimale il CO2 e produzione di4 CH (per esempio, glucosio, acetato, ecc.); Tuttavia, GC-MS richiede la verifica rispetto a uno standard ed è quindi limitato ai già noti composti presenti nel database impedendo l'identificazione di nuovi composti. Inoltre, GC-MS è una tecnica semi-qualitativa permettendo inferenza circa i cambiamenti nelle concentrazioni relative, ma non fornisce le informazioni di effettiva concentrazione necessarie per il calcolo ad esempio energie libere di Gibb. Infine, GC-MS richiede derivatizzazione di molecole prima dell'analisi che limita la risoluzione a composti più ~ 400 Da piccolo e alcoli volatili vengono perse durante la fase di asciugatura.
Unidimensionale (1D) 1H stato liquido NMR permette la caratterizzazione altamente quantitativa dei piccoli metaboliti (compresi i metaboliti primari piccolo peso molecolare e composti volatili come acetato, alcool, acetone, formiato, piruvato, succinato, gli acidi grassi a catena corta, come pure una gamma di carboidrati notoriamente assente o compromesse da metodi basati su MS) e le loro concentrazioni sono particolarmente utili per il calcolo dei parametri termodinamici. Eppure, come GC-MS, NMR 1D di miscele complesse richiede standardizzazione rispetto a un database e pertanto non solo permettono una facile identificazione di nuovi composti che rischiano di essere abbondanti in ecosistemi naturali e mutevoli complessi. Inoltre, è meno sensibile che le tecniche basate su MS NMR e dunque, profiling del metabolita quantitativa è realizzato solo di sopra di 1 µM mediante NMR sistemi dotati di sonde-freddo raffreddato ad elio. Non ampiamente apprezzato, alcuni NMR freddo-sonde sono sale-tolleranti e consentono un'analisi ambientale miscela in presenza di concentrazioni millimolar sale quando utilizzato in più piccolo diametro (< 3 mm di diametro esterno) campione tubi16. Tuttavia, un'ulteriore complicazione di RMN è che elevate quantità di minerali e metalli paramagnetici (ad es., Fe e Mn sopra 1-3 wt %), che può essere abbondante nei terreni di montagna, può ampliare le caratteristiche spettrali e complicano l'interpretazione degli spettri NMR . Mediante estrazione in fase solida (SPE) possono contribuire all'interpretazione di NMR e MS-based metabolomica metodi riducendo i sali minerali e aumentando la qualità spettrale.
FTICR-MS di iniezione diretta è una tecnica altamente sensibile in grado di rilevare decine di migliaia di metaboliti da un unico campione, ma non acquisisce i metaboliti di piccoli critici come succinato, piruvato e acetato ed è notoriamente difficile da utilizzare per gli zuccheri e altri carboidrati17, né fornisce informazioni quantitative. Tuttavia, a differenza di altre tecniche, FTICR-MS eccelle all'individuazione e assegnazione formula molecolare di nuovi composti e identifica pertanto il maggior numero di composti che fornisce informazioni più molecolare rispetto a qualsiasi delle altre tecniche descritte. Questo è utile, perché le informazioni molecolari fornite da FTICR-MS (e altre tecniche) possono essere utilizzate per calcolare NOSC è imparentato con la forza motrice termodinamica che disciplinano la probabilità di determinate reazioni8 e le loro tariffe in determinate condizioni7. Inoltre, accoppiando FTICR-MS con tecniche di separazione, come LC insieme a tandem MS, informazioni strutturali quantitative possono essere raggiunti, compensare alcuni degli svantaggi di questa tecnica. LC-MS è utile per identificare composti lipido-simili e altri metaboliti che non sono ben caratterizzati da uno qualsiasi degli altri metodi. FTICR LC-MS o LC-MS di accoppiamento con un collezionista di frazione e raccogliendo le frazioni di incognite specifici di interesse per la delucidazione strutturale dallo stato liquido di bidimensionale (2D) NMR è la situazione ideale per identificare e quantificare i composti sconosciuti18 ,19. Tuttavia, questo è un passo molto che richiede tempo che potrebbe essere utilizzato se e quando necessario. Presi singolarmente, ognuna di queste tecniche forniscono un'istantanea differente della materia organica, e integrandoli, possiamo raggiungere una comprensione più completa rispetto all'utilizzo di qualsiasi tecnica di isolamento.
Mentre le considerazioni termodinamiche impostano i vincoli ultimati su quali trasformazioni sono possibili in un sistema, decomposizione di materia organica è mediata dai microrganismi di cui attività enzimatiche controllare la velocità di reazione. Quindi, comprendere pienamente i controlli sulla decomposizione di materia organica e, in definitiva, produzione di gas (CO2 e CH4) Serra da zone umide richiede un approccio integrato omics alla che caratterizzano l'attività degli enzimi microbici, nonché i metaboliti. In questo articolo, descriviamo un metodo per il raggiungimento di tali un'analisi completa da un unico campione utilizzando un approccio sequenziale che si traduce in un'analisi completamente accoppiata. Questo approccio consente di espandere il metabolita, la proteina ed il protocollo di estrazione (MPLex) del lipido in cui proteomica è stato accoppiato con GC-MS e LC-MS20 per identificare piccoli metaboliti, proteine e lipidi incorporando informazioni quantitative metabolita via NMR e identificazione dei maggiori metaboliti secondari tramite FTICR-Sig. ra leggermente diverso da MPLex, iniziamo il protocollo con l'estrazione di acqua e quindi uso sequenziale estrazione con solventi non polari sempre più. Tutte le estrazioni sono effettuate su un campione unico che conserva il campione quando i volumi sono limitati o difficili da ottenere e diminuisce l'errore sperimentale introdotto attraverso variazioni tra le aliquote da matrici di campioni eterogenei (ad es., terreno e torba) o differenze nelle condizioni di conservazione e durata.
Infine, accoppiando le analisi di OM con analisi proteomica della comunità microbica, possiamo costruire reti metaboliche che descrivono le vie e la trasformazione di decomposizione di materia organica. Questo ci permette di testare ipotesi specifiche sull'influenzano di perturbazioni al sistema ultimate CO2 e produzione4 CH attraverso alterazione i substrati organici disponibili, accettori e comunità microbiche mediando le reazioni tramite l'attività di catalizzatori di enzima.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un protocollo di singola velocità effettiva per l'analisi dei metaboliti, lipidi e proteine microbiche da un singolo campione creando un dataset completamente accoppiato per la costruzione di reti metaboliche mentre vincolando gli errori analitici .
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Protocol
1. sequenziale estrazione della materia organica da suolo, sedimenti o torba
- Raccogliere il suolo, sedimenti o torba tramite carotaggi e dividere nuclei secondo l'ipotesi che in fase di test (ad es., profondità). Esempi di Store in politetrafluoroetilene rivestito contenitori e congelare a-80 ° C per la conservazione prima dell'analisi.
Nota: Circa 25 mg C è necessario per questo protocollo. Per torba (in genere 45% C), 50 mg di torba secca è richiesto. Grandi quantità di campione può essere necessaria per Bassi campioni organici come suoli minerali o boscose alture a seconda la C contenuto (fino a 5 g). Poiché l'estrazione con solventi organici tirerà qualsiasi polietilenglicole (PEG) in estratti, che influenzano negativamente la ionizzazione durante passaggio 2.4, è importante evitare che i campioni contattare plastica in qualsiasi punto durante la raccolta, deposito o estrazione. - Quando si è pronti per analizzare i campioni, congelare a secco fino a peso costante, poi macinare i campioni in un mulino a sfere ad alta velocità usando le sfere di macinazione in acciaio inox per omogeneizzare e spezzare qualsiasi aggregazione.
Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e il materiale conservato a-80 ° C. - Usando un etanolo-lavato vasellame di acciaio inox, aliquotare 50 mg di ciascuno dei campioni secchi in singoli 2 mL fiale di vetro. Questi campioni saranno estratti in modo sequenziale utilizzando una serie di solventi per estrarre consecutivamente sempre più non-polare metaboliti da ciascun campione. Aggiungere 1 mL di acqua distillata, degassato (H2O) per ogni campione, chiudere le fiale e agitare per 2 h su un tavolo di shaker.
- Dopo agitazione permettono le soluzioni riposare a temperatura ambiente (TA) per 20 min, poi Centrifugare a 15.000 x g per 30 min, decantare e salvare il surnatante da ciascuno.
Nota: Queste soluzioni saranno iniettate nel FTICR-MS di iniezione diretta. - Condotta una Folch estrazione21 (noto anche come MPLEx20) per l'ora dell'acqua residui estratti ripetendo i punti 1.3 e 1.4 sostituendo con 1 mL di un da-20 ° C miscela cloroformio: metanolo: 4:3 per l'acqua nel passaggio 1.3.
Attenzione: Cloroformio e metanolo sono altamente infiammabili e tossici. Utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) per evitare il contatto con la pelle ed evitare fiamme libere. - Separare con cura i due risultanti solvente strati, che saranno visivamente distinguibile, per analisi separata di FTICR-MS utilizzando una separazione imbuto o semplicemente rimuovere lo strato superiore pipettando attenta.
Nota: La frazione contenenti cloroformio sarà nella parte inferiore, mentre la frazione contenente metanolo è meno densa e sarà in alto a sinistra. - Diluire l'Estratto di cloroformio (passo 1.6) 1:1 in metanolo e l'Estratto di acqua (punto 1.4) 2:1 in metanolo per migliorare l'efficienza di ionizzazione (ESI) di electrospray per FTICR-MS di iniezione diretta.
Nota: La frazione contenente metanolo dal passaggio 1.7 non ha bisogno di essere diluito ulteriormente in metanolo. Lo strato di metanolo verrà eseguito tramite iniezione diretta su FTICR-MS.
Analisi 2.FTICR-MS
- Calibrare lo spettrometro FTICR iniettando direttamente 100 µ l di una soluzione di ottimizzazione (Vedi Tabella materiali) che coprono un intervallo di massa di circa 100-1.300 Da in FTICR-MS.
- Preparare lo standard di acido fulvico di Suwannee River (Vedi Tabella materiali) facendo una soluzione di 1 mg mL-1 in acqua ultrapura filtrata e quindi diluendo la soluzione risultante a 20 µ g mL-1 in metanolo.
- Diretto iniettare 23 µ l di questa soluzione finale alla sorgente ESI accoppiata allo spettrometro FTICR attraverso una pompa a siringa impostata su una portata di 3,0 µ l min-1. Dell'ago tensione impostata + 4,4 kV, Q1 a 150 m/z e vetro capillare a 180 ° C. Ispezionare spettri risultanti utilizzando il software di analisi (Vedi Tabella materiali) per confermare la qualità dei dati.
- Utilizzare metanolo HPLC prima esecuzione esempi e durante il campionamento per monitorare riporto. Introdurre 23 μL di ogni estratto tramite iniezione diretta alla sorgente ESI accoppiata allo spettrometro FTICR attraverso una pompa a siringa impostata su una portata di 3,0 µ l min-1. Dell'ago tensione impostata + 4,4 kV, Q1 a 150 m/z e vetro capillare a 180 ° C.
- Regolare il tempo di accumulo dello ione (IAT) per ogni campione o un gruppo di campioni da influenzare la variazione nella concentrazione C. Valori tipici sono compresi tra 0,1 e 0,3 s. 144 raccogliere scansioni per ogni campione, media le scansioni e poi condurre una calibrazione interna utilizzando CH2 omologa (cioè, 14 Da separazione) serie.
Nota: Dopo analisi FTICR-MS, la decisione può essere fatta o combinare l'acqua e metanolo estratta frazioni al fine di semplificare i passaggi rimanenti o le frazioni possono essere tenute separate durante i passaggi successivi. I vantaggi e gli svantaggi di ogni approccio sono descritti a lungo nella discussione. Se in questo modo, unire l'acqua e le frazioni estratte con metanolo. - Asciugare gli estratti utilizzando un concentratore e salvare il resto degli estratti (~ 1 mL) per successive GC-MS (acqua, metanolo o acqua + metanolo), LC-MS (cloroformio) e analisi NMR (acqua + metanolo).
Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e il materiale conservato a-20 ° C.
3. FTICR-MS informatica
- Co-allineare tutti gli elenchi di picco di esempio per l'intero set di dati per ridurre la massa turni e standardizzare le assegnazioni di picco utilizzando Formularity software22 prima assegnazione formula.
- Utilizzare il software di Formularity22 per assegnare la formula molecolare utilizzando un segnale di rumore superiore a 7, massa misura errore < 1 ppm e permettendo di C, H, O, N, S e P escludendo tutti gli altri elementi.
- Se più formule candidato vengono restituite per una data massa (frequente sopra 500 Da) impongono vincoli coerenti con il materiale campione. Ad esempio, nella torba, vincoli tipici includono: errore di massa più basso, più basso numero di eteroatomi (N, S, P), e quando presenti, P deve essere nella forma ossidata (vale a dire, ci deve essere almeno 4 atomi di O per ogni atomo di P nella formula).
4. chimica derivatizzazione per GC-MS
- Preparare i campioni di controllo vuoto di esano di grado HPLC in GC-MS autocampionatore fiale23. Sciogliere 100 mg acidi grassi esteri metilici (FAMEs: C8 - C28) tempo di ritenzione di miscela standard a 200 µ l di esano.
- Per proteggere i gruppi carbonilici, aggiungere 20 μL di 30 mg mL-1 dimethylamine cloridrato in piridina a ciascuno del metanolo estratti e acqua estratti (o estratti combinati metanolo/acqua se utilizza) dal passo 2.6, spazi vuoti e fama calibrazione campioni23. Fiale con tappi di tenuta.
Attenzione: Piridina è sia altamente tossici e infiammabili. Indossare appropriati PPE per prevenire la pelle o contatto con gli occhi ed evitare fiamme libere. Inoltre, piridina migrando a RT causando contaminazione dell'aria è nocivo. Funziona solo in spazi ben ventilati sotto cappa aspirante. - Estratti di vortice per 20 s. Sonicate estratti per 60 s. Quindi, incubare estratti in una centrifuga a 37 ° C per 90 min a 100 x g.
Nota: Una quantità eccessiva di carboidrati o sali può causare metaboliti a cristallizzarsi dopo asciugato giù. Sonicating i campioni contribuirà a ricostituire i metaboliti cristallizzati nel reagente derivatizzante. - Dopo l'incubazione, aggiungere 80 µ l di N-metil - N-(trimetilsilile) trifluoroacetamide con trimethylchlorosilane 1% per ogni campione, estratti di vortice per 20 s. Sonicate estratti per 60 s e incubare estratti nuovamente in una centrifuga a 37 ° C per 30 min a 100 x g.
- Estratti di cool per RT (20-24 ° C), poi trasferire in fiale autocampionatore GC-MS.
5. analisi GC-MS
- Sintonizzare e calibrare MS secondo le raccomandazioni del fornitore (Vedi Tabella materiali) prima dell'analisi per assicurarsi che la macchina leggere MS dati correttamente. Controllare che la pressione del gas dell'elio è entro la tolleranza specificata.
- Metaboliti polari separate su una colonna GC (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Impostare il protocollo di temperatura del forno come segue: (1) iniziale temperatura di 60 ° C per 1 min, (2) rampa per 325 ° C a una velocità di 10 ° C min-1e (3) tenere premuto a 325 ° C per 5 min.
- Analizzare gli estratti utilizzando un GC accoppiato ad un singolo quadrupolo MS. Set temperatura di porta di iniezione per una costante di 250 ° C. Iniettare 1 μL di ogni Estratto derivatizzato nella modalità splitless.
6. elaborazione dati GC-MS
- Ispezionare tutti i file di dati per garantire che essi sono stati acquisiti correttamente. Prestare attenzione alle potenziali cambiamenti per quanto riguarda i tempi di ritenzione standard interno e intensità per confermare che i dati acquisiti costantemente in tutta l'analisi.
- Convertire il formato di dati MS specifico fornitore in un formato MS generale se necessario. File di dati raw di processo utilizzando MetaboliteDetector24 calibrazione indici di conservazione sulla base delle norme interne di fama. Dopo aver allineato i tempi di ritenzione di tutti i file di dati, continuare con deconvoluzione e, infine, l'identificazione dei metaboliti da corrispondenti indici di ritenzione e spettri di GC-MS contro il FiehnLib polar metabolita biblioteca25.
- Controllo incrociato restanti non identificati metaboliti contro la libreria NIST14 GC-MS utilizzando la corrispondenza spettrale. Convalidare le identificazioni singolarmente per eliminare false identificazioni e ridurre gli errori di deconvoluzione.
7. liquido stato analisi NMR
- Diluire il resto degli estratti dell'acqua (~ 300 µ l) del 10% (vol/vol) con uno standard interno 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 di 5 mM. In alternativa, unire acqua e metanolo estrae dal passaggio 1 resubstitute poi in acqua. In questo modo, tuttavia, alcuni dei composti volatili possono essere persi durante il passaggio di liofilizzazione. Volumi di campione finale tipiche sono nel range 180-300 µ l.
- Trasferire il composto in un tubo di vetro borosilicato NMR di alta qualità 3 mm diametro esterno (O.D.).
- Raccogliere gli spettri utilizzando uno spettrometro NMR (idealmente almeno 600 MHz), dotato di una sonda di freddo sale-tolleranti di 5mm risonanza triple e un freddo-carbonio pre-amplificatore.
- Raccogliere gli spettri di 1H 1D utilizzando un 1D nucleare Overhauser effetto spettroscopia (NOESY) presaturation esperimento a 298 K con un tempo di acquisizione s 4, 1,5 s recycle ritardo, 65.536 punti complessi e 512 scansioni.
- Raccogliere 1H -1H correlazione totale (TOCSY) spettri per aiutare nell'assegnazione di metaboliti e convalida e correlazione di 2D 1H -13C eteronucleari singolo-quantistica (HSQC).
- Elaborare, assegnare e analizzare tutti gli spettri utilizzando il software di analisi NMR (Vedi Tabella materiali) per quantificare l'intensità rispetto lo standard interno. Identificare i metaboliti abbinando informazioni chimiche shift, J-accoppiamento e intensità nei campioni contro la libreria.
Nota: La libreria è ulteriormente rafforzata da standard personalizzati mirati metabolita e metabolita aggiunte apportate su base regolare. Il protocollo può essere sospesa a questo punto e il materiale conservato a-20 ° C.
8. analisi lipidomica LC-MS
- Asciughino Estratto del cloroformio secchi generato durante passaggio 2.5 con 200 µ l di metanolo.
- Iniettare 10 µ l di ciascun estratto in un cromatografo liquido ultra-prestazioni accoppiato ad un spettrometro di massa Orbitrap utilizzando una carico colonna superficie ibrido (dimensione delle particelle di 3,0 mm × 150 mm × 1.7 μm) in fase inversa. Impostare una sfumatura di 34-min (fase mobile a: acetonitrile/H2O (40: 60) contenente acetato di ammonio 10mm; fase mobile b: acetonitrile/isopropanolo (10:90) contenente acetato di ammonio 10 mM) con una portata di 250 µ l/min uso sia negativi che positivi modalità di ionizzazione con dissociazione di alto-energia collisione e dissociazione indotta da collisione.
Attenzione: L'Acetonitrile è un occhio, la pelle e irritante delle vie respiratorie. Indossare appropriati PPE. Inoltre, acetonitrile è infiammabile. Non consentono di contattare agenti ossidanti, fumi tossici possono essere prodotti durante la combustione. - Caricare i file di dati raw di LC-MS/MS in liquido insieme al file di destinazione (cioè, elenco delle specie di lipidi > 25.000) per la modalità di ionizzazione rispettivi (positiva o negativa). Elaborare il file raw. Convalidare manualmente le identificazioni risultante esaminando gli spettri MS/MS per la presenza di ioni diagnostici, se applicabile, corrispondenti frammenti ionici (ad es., catene dell'acilico grassi), la separazione isotopica, errore di ppm di precursori e il tempo di ritenzione di massa. Esporta elenco risultante dei lipidi con fiducia identificati come file TSV.
Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto e conservare il materiale a-20 ° C.
9. analisi proteomica
- Estratto di proteine secondo il protocollo MPLEx20 dal resto della fase di metanolo derivante dal passaggio 2.4, lavando l'estratto con 20 volte il volume di Estratto del metanolo di ulteriori freddo (-20 ° C).
- Utilizzare un 1 mL/50 mg a base di silice sorbente (Vedi Tabella materiali) per colonne SPE C18 condizione con 3 mL di metanolo, 2 mL di 0,1% acido trifluoroacetico (TFA) in acqua, seguita dall'aggiunta dell'estratto dal passaggio 9.1 a una velocità non supera a 1 mL/min.
- In seguito all'aggiunta del campione, lavare la colonna con 4 mL di acqua 95:4.9:0.1: acetonitrile:TFA, quindi lasciare per asciugare. Inserire un tubo di raccolta di 1,5 mL sotto la colonna SPE ed eluire il campione con 1 mL di metanolo: acqua: TFA 80:19.9:0.1.
- Concentrato di estratti a 100 µ l sotto vuoto-assistite congelare essiccatore, quindi misurare la concentrazione di proteina di bicinconinico acido (BCA) saggio colorimetrico26 alla lunghezza d'onda di 562 nm.
- Centrifuga estrae a 10.000 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante risultante e asciugare la pallina restante sotto vuoto per 5 min. Risospendere il pellet di proteine in acqua ad una concentrazione finale di 0,1 µ g peptide per µ l.
- Aggiungere dithiothreitol ad una concentrazione finale di 5 mM e incubare a 60 ° C per 30 min. Diluire 10 volte con soluzione di urea di 100mm NH4HCO38 M e incubare a 37 ° C per 3 h in presenza di 1 mM CaCl2 e tripsina suina un 01:50 enzima alla proteina rapporto.
Nota: Protocollo può essere sospesa a questo punto e conservare il materiale a-20 ° C. - Estratti separati tramite cromatografia liquida utilizzando un gradiente esponenziale di un acido formico 0,1% in acqua fase mobile (A) e un acido formico 0.1% in fase mobile acetonitrile (B) a 10 kpsi e 500 nL min-1.
- Introdurre eluente risultante in un spettrometro di massa ESI-accoppiato raccolta di spettri da 400-2.000 m/z con risoluzione di 100.000 a m/z 400 in uno spettrometro di massa Orbitrap presa lineare dello ione (LTQ).
- Convertire i file RAW spettri nel formato di simone utilizzando msConvert o ProteoWizard accettando tutti i parametri di default. Utilizzare lo strumento di ricerca del database universale MSGFPlus per cercare proteomi risultanti in un database di proteina mirati di sequenze proteiche preveduto dalle pertinenti metagenoma assemblato genomi.
- Aggiungere contaminanti comuni (ad es., tripsina, cheratina, albumina) e rimuovere tutte le sequenze proteiche esattamente duplicata per migliorare le statistiche delle partite di peptide-di-massa-spettro. Valutare i punteggi di probabilità spettrale MSGF risultanti per determinare quale partita di peptide-di-massa-spettro è migliore. Utilizzare il valore di Q da MSGFPlus per filtrare il mucchio di dati intero al tasso di 1% false discovery (FDR).
10. metabolomica analisi e creazione rete metabolica
- Compilare tutte le formula molecolare di metabolita identificato nei passaggi 3, 6, 7 e 8 in un unico database dei metaboliti presenti nei campioni. Combinare questi metaboliti con i numeri degli enzimi della Commissione (CE) o KEGG ortologhe (KO) degli enzimi identificati nel passaggio 9. Cerca questo dataset combinato contro il database27 KEGG, sezione di vie metaboliche.
- Valutare manualmente i risultati per identificare vie più probabile e integrare in un modello metabolico.
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Representative Results
Abbiamo eseguito il protocollo descritto analisi complementari ed abbiamo paragonato la torba con profondità nella palude S1 in abete e le torbiere risposta sotto cambiando ambienti (SPRUCE) sito in Minnesota, Stati Uniti d'America. Questi risultati sono paragonati a quelli da una palude di permafrost e fen dal nord della Svezia per mostrare come siti possono variare nelle attività metabolita e degli enzimi. Abbiamo identificato 3.312 enzimi nell'analisi proteomica. Un'analisi delle attività di enzimi con profondità rivela che il numero di enzimi diminuisce acutamente tra 15 e 45 cm in abete palude (Figura 1).
Mentre i risultati di proteomica indicano quali proteine sono espressi, i dati metabolici mostrano quali reazioni si verificano in realtà. Nel complesso, abbiamo identificato 67.040 metaboliti (compreso i lipidi) in tutti i campioni di torba dalla combinazione di FTICR-MS, NMR, analisi LC-MS e GC-MS. Di questi, siamo stati in grado di assegnare la formula molecolare di 15.385 composti (Figura 2). I dati metabolici combinati si estende su una gamma di Stati di ossidazione, masse e classi di composti.
Questo è in genere visualizzato tramite l'utilizzo di un diagramma di van Krevelen in cui i rapporti H/C atomici della formula identificato vengono confrontati con loro rapporti di atomico o/c28. Abbiamo incluso una nuova dimensione nel tipico formato 2D, raffigurante NOSC mediante colore codifica i simboli che rappresentano singolo formula (Figura 3 e Figura 4). Con l'aumento di profondità nella palude abete, c'è un aumento del numero totale dei metaboliti secondari grande identificato da FTICR-MS, specificamente in altamente condensata (angolo inferiore sinistro della trama van Krevelen) e idrogenati formule (parte superiore della trama) (Figura 4 ). Sopra la profondità stessa c'è una diminuzione del numero di piccoli composti altamente energetici identificati mediante GC-MS e nei lipidi (Figura 5). Questo potrebbe suggerire che i lipidi e piccoli metaboliti sono consumati nella torba della superficie prima di raggiungere i fondali più profondi o che i tassi di decomposizione nella torba profondo sono più veloci nella superficie tale che verso il basso advecting composti sono rapidamente consumati. Differenziazione tra queste due ipotesi contrastanti richiede una comprensione del livello di processo del C in bicicletta presso il sito. Tale una comprensione a livello di processo può essere acquisita solo accoppiando i DataSet metabolomica e proteomica. Compiamo questo dalla Croce-convalida il combinato FTICR-MS, GC-MS, LC-MS e NMR identificati metaboliti contro il database KEGG. In tal modo, troviamo che i composti che abbiamo identificato sono vie coinvolte in comune metaboliche come il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA), la glicolisi e metabolismo degli zuccheri. Poiché diversi metaboliti possono essere coinvolti più conferma di vie con gli enzimi aumenta la nostra fiducia nell'assegnazione di percorsi (Figura 6).
Attraverso questa mappatura troviamo prove di metabolismo di saccarosio e amido nella torba della superficie, mentre nelle profondità più profonda di piruvato e di altri prodotti di fermentazione costruire (Figura 6). Questi risultati sono coerenti con la prima ipotesi che zuccheri e altri metaboliti energetici sono degradati nella torba superficiale e non raggiungono la profondità di torba. Come si può vedere nella Figura 5, zuccheri (NOSC = 0) e aminoacidi (0 < NOSC < 1) sono consumati nella torba della superficie, mentre i lipidi (-2 < NOSC < -1) sembrano accumulare con profondità. Ciò è coerente con aspettative basate su valori NOSC che superiore NOSC composti sono più facilmente degradati, mentre inferiore NOSC composti persistono in altamente anaerobica (cioè, tè-limitata) condizioni di sottosuolo torba. Questo approccio si distingue con successo anche tra tipi di suolo da ambienti diversi. Ad esempio, materia organica del suolo da Torbiere boreali sembra essere composizionalmente differenti di permafrost peatland, così come all'interno di fen e bog all'interno della regione di permafrost. Questi risultati sono coerenti con un precedente studio che ha mostrato differenze in geochimica sito tra questi habitat29, suggerendo che geochimica del sito hanno un grande effetto sulla degradazione microbica di C sotto terra.
Figura 1 : Analisi di proteomica indicano stratificazione forte profondità del numero di enzimi. Le barre indicano medie e barre di errore indicano una deviazione standard di abbondanze. Ciò suggerisce che i microrganismi sono più attivi nella superficie torba. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Il numero di composti identificati da ogni tecnica nella superficie torba (< 30 cm) di ogni habitat nonché la metà (45 cm) e profondo (87 cm) torba da palude abete. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : The van Krevelen diagramma (atomico H/C vs o/c di ciascuno identificato formula molecolare) per la superficie (15 cm) abete bog profondità per dimostrare la copertura dei composti caratterizzati da ogni tecnica. FTICR-MS permette di identificare il maggior numero di composti (piccoli cerchi), mentre il GC-MS (triangoli) è buono per differenziare e identificare gli zuccheri (H/C = 2 e/o c = 1). La spettroscopia NMR (piazze) fornisce informazioni quantitative su composti energeticamente importanti come zuccheri, aminoacidi, piruvato, ecc. LC-MS (diamanti) fornisce informazioni sui lipidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : The van Krevelen diagramma (atomico H/C vs o/c di ciascuno identificato formula molecolare) per il profondo (87 cm) abete bog profondità per dimostrare la copertura dei composti caratterizzati da ogni tecnica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : La relativa frazione di classi chimiche differenti identificate via le varie tecniche a diverse profondità. Barre vengono tracciate come medie per ogni profondità ± una deviazione standard. Tracciate le classi includono gli aminoacidi, sfingolipidi (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diacilglicerolo (DG), trigliceridi (TG) e zuccheri. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Combinando risultati per creare una rete metabolica. Distribuzioni di profondità di metaboliti identificati da NMR (un) e GC-MS (b) e una mappa metabolica semplificata (c) mostrando un numero selezionato di trasformazioni identificati al bog abete. Caselle verdi indicano metaboliti che diminuiscono con i contenitori di profondità, marrone indicano metaboliti che aumentano con la profondità. Verde collegamento frecce indicano enzima identificato nel nostro dataset che mediano la trasformazione indicata (numeri CE enzima indicati accanto a frecce). Frecce di collegamento grigie indicano trasformazioni per le quali gli enzimi non sono stati identificati nel nostro dataset. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il singolo-throughput, analisi completamente accoppiati flusso utilizzato per caratterizzare metaboliti e il proteoma fornisce intuizioni le vie da cui C ciclismo è in corso in un complesso ecosistema. Terreno e torba sono matrici eterogenee, e di conseguenza, si verifica una delle fasi critiche di questo metodo nei primi passaggi nel garantire che la partenza di torba o materiale del terreno è altamente omogeneo. È preferibile per macinare il campione bene come aggregati possono ridurre l'efficienza di estrazione. Si tratta di un problema particolare per terreni aggregati e terreno con C basso e alto contenuto di minerali che potrebbe richiedere l'uso di un grinder a pallina in acciaio inox per omogeneizzare adeguatamente. Perché eterogeneità spaziale dei suoli e torba all'interno di un sito sperimentale può essere elevato, replicati biologici sono altamente raccomandati.
Questo metodo utilizza tre solventi: acqua, metanolo e cloroformio, che polarizzare i tipi di composti è possibile estrarre. In linea di principio, questo metodo di estrazione sequenziale dovrebbe solubilizzare composti che coprono una gamma vasta di polarità. Tuttavia, questi solventi non sono ottimizzati per l'estrazione dei complessi organo-minerali o complessi altamente stabilizzati. Se tali composti sono di interesse, i solventi più severe come gli acidi forti e basi sono comodo, ma più severe processi di estrazione potrebbero alterare la chimica dei campioni. Che incorporano tali solventi alla fine della sequenza di estrazione può minimizzare questo effetto. Inoltre, cloroformio sarà inattivare clinicamente importante terreno e torba batterico e agenti patogeni virali e altri patogeni agenti biologici di malattia-causanti sciogliendo i lipidi della membrana cellulare. Così, incorporando cloroformio nel protocollo estrazione ridurrà i rischi coinvolti negli studi di biologia dei campioni potenzialmente infettati da agenti patogeni provenienti da diverse regioni del mondo. Se ci sono preoccupazioni circa le cellule microbiche morto, detriti o particolato a seguito di estrazione, gli estratti che filtra attraverso un filtro di fibra di vetro µm 0,2 è raccomandato.
Per semplificare il processo, l'acqua e metanolo estratti potrebbero combinarsi per analisi GC-MS durante passaggio 4.1. Tuttavia, questi estratti devono rimanere separati per analisi FTICR-MS a causa di problemi di efficienza di ionizzazione con la sorgente ESI. Il vantaggio dell'esecuzione l'estratto combinato su GC-MS è che saranno individuati ulteriori metaboliti (che coprono una gamma più grande di polarità). Lo svantaggio di combinando gli estratti a questo punto è che uno dei principali metaboliti importanti nella trasformazione microbica della sostanza organica è metanolo. Tracce di metanolo rimarrà sempre nel campione combinato, anche dopo l'asciugatura, quindi se il metanolo è un metabolita di interesse, l'Estratto di acqua deve essere eseguita separatamente. Avere buoni controlli con nessun analiti aiuterà anche nell'identificazione di potenziali contaminazioni nei campioni.
Nel passaggio 7.1 di preparazione degli estratti per analisi NMR, come l'analisi GC-MS, sia l'Estratto di acqua da solo o combinato acqua e metanolo estratti possono essere usati. Gli svantaggi di questa operazione sono simili a quelli enumerati al paragrafo precedente. Il vantaggio di combinare gli estratti di acqua e metanolo è che alcuni dei metaboliti meno polari che sono solubilizzati nella frazione metanolo saranno identificati. Tuttavia, a causa del passaggio di liofilizzazione, molti composti più volatili andranno persi. Si tratta di una posizione di particolare svantaggio se quantificazione degli acidi grassi volatili è un componente critico dell'esperimento.
In questa procedura per l'identificazione di proteomics, unici completamente triptico peptidi sono attività peptidasica cercato, così endogeno e frammentazioni nell'origine ci mancherà. D'altra parte, metionina ossidata può essere considerata come una modificazione post-traduzionale per i candidati di peptide questa modifica si verifica comunemente durante il trattamento e la movimentazione di campionamento. Quantificazione degli enzimi utilizzando aree di eluizione del peptide può essere fatto, ma non rientra nell'ambito di questo progetto.
Molti recenti progressi nell'analisi del NOM e microbici parametri stanno fornendo una vasta gamma di tecniche per la comprensione C organico in bicicletta. Combinando queste tecniche in un unico protocollo semplificato, guadagniamo una romanzo visione dei processi che si svolgono. L'analisi proteomica con le analisi metaboliche di accoppiamento fornisce convincenti evidenze avvaloranti che una reazione è effettivamente in corso. Metabolica analisi da solo sono limitato, ci informa quali metaboliti sono superiori o inferiori in concentrazione nei confronti tra siti o dopo un effetto di trattamento, ma non possono discernere le cause di tali modifiche. Ad esempio, abbiamo identificato le concentrazioni di zucchero in declino con profondità nella palude, ma senza ulteriori informazioni non è chiaro se il declino con profondità è dovuto ingressi lenti o veloce degradazione nella torba profonda. Analisi del proteoma e l'espressione degli enzimi in declino con profondità permette di respingere la seconda ipotesi. Piuttosto i nostri risultati sono costanti con degradazione veloce zucchero negli input superficie torba limitante per i fondali più profondi. Queste intuizioni particolare sono solo possibile quando tutte le tecniche sono considerate in tandem come ognuno fornisce un unico, ma un pezzo fondamentale della C ciclismo puzzle.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare J.P. Chanton, J.E. Kostka e M.M. Kolton per assistenza con la raccolta di campioni di torba. Parti di questo lavoro sono stati condotti presso il laboratorio di scienze molecolari ambientale, un ufficio di DOE di impianto utente scienza sponsorizzato dall'ufficio di biologico e ricerca ambientale. PNNL è gestito da Battelle per il DOE sotto contratto DE-AC05-76RL01830. Questo lavoro è stato supportato dal US Department of Energy, ufficio per la scienza e della ricerca ufficio di biologico e ambientale (concede: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE SC0012088 e DE-SC0014416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
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