Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

doi: 10.3791/59035 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

Abstract

자연 유기 물질 (NOM) 역사적으로, 특성화 하기 어려운 증명 하는 유기 화합물의 수천의 매우 복잡 한 혼합물으로 구성 된다. 그러나, NOM의 분해에서 발생 하는 온실 가스 (이산화탄소 CO2와 메탄 [채널4]) 생산에 열역학 및 운동 제어, 이해 하는 분자 수준의 특성화와 결합 하 여 미생물 프로테옴 분석은 필요 합니다. 또한, 기후 및 환경 변화는 잠재적으로 유기 물 기판의 공급 및 변환을 수행 하는 미생물에 영향을 주는 복잡 한 상호 작용을 열 받은 자연 생태계를 교란 하 예상 된다. 유기 물, 미생물 proteomics, 경로 및 유기 물 분해 되는 변환의 상세한 분자 특성화 방향 및 환경 변화의 효과의 크기를 예측 하는 데 필요한 것입니다. 이 문서에서는 단일 샘플에서 포괄적인 대사 산물 특성화에 대 한 방법론 처리량 푸리에 변환 이온 싸이 클 로트 론 공명 질량 분석 (MS FTICR), 가스 크로마토그래피 질량 분석 (GC-MS)를 직접 주입 하 여 핵 자기 공명 (NMR) 분광학, 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (MS LC), 그리고 proteomics 분석. 이 방법은 유기 물질 분해, 결과 CO2 와 채널4 생산 속도, 그리고 환경 섭 동에 대 한 그들의 응답의 통로 유추에 대 한 통계 신뢰도 향상 완벽 하 게 결합 하 여 데이터 집합에서 발생 합니다. 여기 우리는 peatlands;에서 수집 된 NOM 샘플에이 메서드를 적용 한 결과 제시 그러나, 프로토콜 (예를 들어, 물, 숲된 토양, 해양 퇴적 물, ) 어떤 NOM 샘플에 적용 됩니다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

세계적으로, 습지 유기 C 토 탄 예금1매장으로 주로 탄소 (C), 529 페이지 포함 견적 된다. 현재, 이러한 peatlands 북미 혼자129 Tg C y-1 를 격리 그물 C 싱크 역할을 합니다. 그러나, 배수, 화재, 가뭄, 더 온난 한 온도 등 환경 장애 온실 가스를 통해 증가 C 손실의 결과로 유기 물 분해를 증가 시켜이 C 싱크를 상쇄 수 있습니다 (이산화탄소 [CO2]와 [4채널] 메탄) 생산1,2. 기후 변화는 더 온난 한 온도 또는 건조 조건 빠른 C 분해 미생물에 의해 자극 하는 경우 C 감소에 기여할 수 있습니다. 또는, 높은 온도 및 공기 CO2 농도 유기 탄소 (OC는)로 더 많은 CO2 격리를 기본 생산을 자극 수 있습니다. OC CO2 로 분해 다음 어느 정도 하 고 얼마나 빨리와 채널4 는 전자 기증자 기판, 전자 수락자의 가용성 및 중재 미생물 사이 복잡 한 상호 작용에 따라 달라 집니다를 변환입니다. 대부분의 경우, 메커니즘은 잘 성격을 나타낸, 따라서 환경 섭 반응 잘 제한 된 이며 기후 변화의 결과 peatland 생태계에 탄소 균형에 있을 것입니다 불분명 남아.

자연 유기 물질 (NOM)의 복잡 한 자연도 역사적으로 어려운 다른 혼합물에 있는 유기 화합물을 식별 했다. 최근 발전 하는 전통적으로 화합물의 특성, 어느 정도 계속 완강히 humic 또는 fulvic 화합물3,,45으로 간주, 우리의 능력 크게 향상. 우리는 지금 이러한 화합물의 많은 microbially 실제로 사용할 수 있으며 적당 한 터미널 전자 수락자 (차) 제공6,7경우 분해 수 있습니다 이해 합니다. 화합물에 대 한 탄소 (NOSC)의 명목상 산화 상태 계산 분해 하 고 필요한 차 에너지 생산량에 대 한 가능성을 예측에 대 한 통계를 제공 합니다. 그러나, 그것은7유기 물질 분자 수준 특성을 요구 한다. NOSC는 분자 수식을 통해 다음 방정식7에서 계산: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, z 그물 충전이. NOSC 열역학 운전 힘8, 어떤 점에서 더 높은 NOSC와 화합물은 저하, 낮은 NOSC와 화합물 감소 하기 위해 점점 더 에너지 차와 필요로 쉽게 상관 된다. NOSC −2 보다는 더 적은으로 화합물 O2, 질산염 또는 미네소타4, 같은 차를 양보 하는 높은 에너지를 필요로 하 고 일반적으로 발생 하 여 저하 될 수 없습니다 FeIII 같은 차 들을 생성 하는 에너지를 낮은 또는 황산7. 이것은 O2 와 다른 고 에너지 차와 저조한는 부족9 및 따라서 이러한 조건 하에서 낮은 NOSC 화합물의 저하는 습지에 물이 찼 네요 무산 소 조건에서 중요 한 고려 사항 열역학으로 제한. 환경 섭 동 O2 (가장 정력적 인 전자 수락자), 유기 기판에 전자 수락자 사용할 수 변화에 영향을 주는 문학적 변화를 통해 생태계의 열역학적 상태에 영향을 미칠 수 있습니다 기본으로 생산, 및 온도 의해 더 작은 넓이에. Homoacetogenesis (, CO2 와 H2에서 초 산 생산)와 hydrogenotrophic methanogenesis (사이 발생 하는 교환 관련 하 여 발생 하는 습지 시스템에서 온도 효과의 중요 한 예 , CO2 와 H2에서 채널4 생산). 낮은 온도에서 그 homoacetogenesis는 약간 선호 따뜻한 온도 선호 채널4 생산10동안 나타납니다. 채널4 는 CO211 및 따라서 증가 생산의 비용에 채널4 의 보다 훨씬 더 강한 온실 가스가 온도 효과, 기후 변화 하는 생태계의 응답에 대 한 중요 한 암시를 할 수 있습니다. 따뜻한 온도에서 CO2 기후 온난화와 긍정적인 의견을 기여할 수 있습니다.

Peatlands CO2 의 세계적으로 중요 한 양을 생성 그리고 채널46을 통해 미생물의 호흡 유기 자연적 중요 합니다. 유기 탄소 기판의 NOSC CO2의 상대적 비율 결정: 채널4 채널4 때문에 뿐만 아니라 CO211에 비해 높은 복사 강제 때문에 중요 한 매개 변수는 생산 모델링 노력 peatlands12C 자 속 추정을 위한 중요 한 매개 변수로이 비율을 확인 했습니다. CO2이외의 터미널 전자 수락자의 부재, 그것은 수 있다 표시 전자 균형에 의해 NOSC > 0 것 유기 C 기판 CO2생산: 채널4 > 1, NOSC 유기 C = 0 생성 CO24 채널 < 1 아데닌의 비율, 그리고 NOSC 유기 C에서 CO2를 생산할 예정 이다: 채널4 < 113. OC의 자연 생태계에서 분해 미생물, 중재는 그래서 그 경우에 특정 화합물의 열역학으로 가능, 운동 제한 무산 소 조건 하에서 그리고 미생물 효소의 활동으로 (, NOSC) 강제로 열역학 운전7. 지금까지 그것은 화합물 존재의 다양성 그들의 특성에 대 한 다른 보완 기술이 필요 하기 때문에 유기 물질을 완벽 하 게 특성을 도전 하고있다. 최근 발전 격차; 폐쇄 분석 기법에의 한 벌을 사용 하 여 우리가 유기 화합물 분자 수준 특성을 제공 하 고, 800 다 폴 리-heterocycles까지 포도 당 같은 작은 기본 대사 산물에서 어떤 경우 부 량에서 큰 범위를 분석할 수 있습니다. 이전 같은 큰 복잡 한 분자 것가지고 되었습니다 단순히으로 리그 닌 같은 또는 탄 닌 같은 특징 완강히 되었다고 가정. 그러나 분자 수준 특성,,도 이러한 큰 복잡 한 분자에 대 한 NOSC의 계산을 허용 한다. 이 NOSC 값은 선형 열역학 원동력의 유기 물 분해, 많은 경우에는 이러한 복잡 한 분자 microbially 수 실제로 있습니다 보여 사용할 수 있는 품질의 평가 대 한 수 있도록 연관 습지에 승리 무산 소 조건 에서도 분해.

O2 의 유기 물 분해를 거의 모든 자연 관찰 된 NOSC 값의 수, 이후 여기 우리가 변화에 포커스에서 유기 물질과 미생물 단백질 (, 습지에서 기본 드라이버를 될 것입니다. 제한 된 O2) 시스템입니다. 그러나, 우리가 논의할 것 이다 모든 기법 모든 생태계에서 유기 물질에 적용할 수 있습니다. 일반적으로, 대량 측정 광학에 기반 하 고 형광 분석 유기 물질 품질3,14을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나 이러한 대량 측정을 사용 하 여,, 세부 묘사가 손실 됩니다 분자의 많은 수는 함께 humics 또는 fulvics 같은 일반적인 용어 분류로. 이러한 범주 정의 잘 제한 된 그리고, 사실, 연구에서 연구 하 고 비교 불가능 한 다를 수 있습니다. 또한, 대량 측정 하지 시스템을 관리 하는 열역학 계산에 필요한 분자 정보 제공 고 따라서 진정으로 유기 물 품질15평가 짧은을.

푸리에 등 개별 기술 이온 싸이 클 로트 론 공명 질량 분석 (MS FTICR), 핵 자기 공명 (NMR) 분광학을 변형, 가스 착 색 인쇄기 질량 분 광 분석 (GC-MS), 그리고 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LC-MS) 이러한 분자 수준의 정보를 제공 합니다. 이러한 기술을 각각 선물 자체의 한계, 하는 동안 그들은 또한는 분자 세부 엄격한 열역학적 의미에서 유기 물 품질 측정에 필요한 달성 하기 위해 통합된 된 접근 방식에 활용 될 수 있는 그들의 자신의 힘을가지고 . GC-MS는 CO2 와 채널4 생산 (예를 들면, 포도 당, 아세테이트,);에 근 영향을 미칠 가능성이 중요 한 작은 대사 산물을 식별 하는 데 유용 그러나, GC-MS 표준에 대 한 확인 필요 이며 따라서 소설 화합물을 방지 하는 데이터베이스에 있는 이미 알려진된 화합물으로 제한. 또한, GC-MS 상대적 농도 변화에 대 한 유추를 허용 하지만 예 Gibb의 자유 에너지 계산에 필요한 실제 농도 정보를 제공 하지 않는 세미 질적 기술입니다. 마지막으로, GC-MS 분석 화합물 ~ 400 다 보다 작은 해상도 제한 이전 분자의 derivatization 필요 하 고 휘발성 알코올 건조 단계 동안 손실 됩니다.

1 차원 (1d) 1H 액체 상태 NMR 수 작은 대사 (포함 기본 작은 분자량 대사와 같은 알콜, 아세테이트, 아세톤, formate, pyruvate, 호박, 휘발성의 높은 양적 특성 짧은 체인 지방산 뿐만 아니라 탄수화물 악명 결 석 하 또는 MS 기반 방법에서 타협의 범위) 및 그들의 농도 특히 열역학 매개 변수를 계산 하는 데 유용. 그러나, GC-MS, 같은 복잡 한 혼합물의 1d NMR 데이터베이스를 기준으로 표준화를 요구 하 고 따라서 혼자 복잡 한 자연과 변화 생태계에서 풍부한 될 것 소설 화합물의 쉽게 식별을 허용 하지 않습니다. 또한 NMR은 MS 기반 기술을 보다 덜 민감한 따라서, NMR 시스템 헬륨 냉각 냉 프로브를 사용 하 여 1 µ M 이상만 달성은 양적 대사 산물 프로 파일링. 감사 합니다 널리 하지, 일부 NMR 냉 프로브 소금 관대 고 작은 직경 (< 3 m m 외부 직경) 튜브 샘플16에서 사용 될 때 millimolar 소금 농도의 환경 혼합물 분석을 허용 한다. 그러나, NMR의 더 합병증이 상자성 금속 및 무기물의 높은 금액 (예를 들어, Fe와 Mn, 고지대 토양에서 풍부한 수 1-3 wt %), 스펙트럼 기능을 확대 수 있습니다 그리고 복잡 하 게 NMR 스펙트럼의 해석 . 고체 상 추출 (SPE)를 사용 하 여 NMR과 MS 기반 metabolomics의 해석에서 보좌관 수 미네랄 소금 스펙트럼 품질 증가 여 방법.

직접 주입 하 여 FTICR MS 단일 샘플에서 대사 산물의 수천 수만 감지 능력이 매우 중요 한 기술 하지만 아세테이트, pyruvate, 호박 등 중요 한 작은 대사 산물을 캡처하지 않습니다 하 고 악명 높게 어렵다 설탕과 다른 탄수화물17에 대 한 사용 하 여도 그것은 정량적 인 정보를 제공지 않습니다. 그러나, 다른 기법과 달리 FTICR MS 식별 하 고 소설 화합물 분자 수식을 할당에서 능가 하 고 따라서 다른 설명 기법 보다 더 분자 정보를 제공 하는 화합물의 가장 큰 수를 식별 합니다. 특정 반응8 및 특정 아래 그들의 비율의 가능성을 통치 열역학 원동력 관련 있는 NOSC 계산 하 FTICR MS (및 다른 기술)에 의해 제공 하는 분자 정보를 사용할 수 있습니다 때문에이 유용 조건7. 또한, 함께 협동 MS, LC 등 분리 기술로 FTICR MS를 연결 하 여 양적 구조 정보 수 있습니다 달성 될,이 기술의 단점 들을 상쇄. LC-MS 지질 같은 화합물과 다른 방법의 특징이 잘 하지 않은 다른 대사 산물을 식별 하는 데 유용 합니다. 일부 수집기와 구조 설명에 대 한 관심의 특정 신원 미상의 2 차원 (2D) 액체 상태 NMR은 식별 하 고 알 수 없는 화합물18 측정을 위한 이상적인 상황에 의해 수집 LC FTICR-MS 또는 LC MS 커플링 ,19. 그러나,이 필요할 때 사용할 수 있는 매우 시간이 걸리는 단계입니다. 개별적으로 촬영, 이러한 기술의 각 유기 물질의 다른 스냅샷을 제공 하 고 그들을 통합 하 여 격리에서 기법 중 하나를 사용 하 여 보다 더 완벽 한 이해를 얻을 수 있습니다.

열역학 고려 사항에 어떤 변환 시스템에서 가능한 최고의 제약을 설정 하는 동안 유기 물 분해 미생물의 효소 활동 반응 속도 제어에 의해 중재 됩니다. 따라서, 미생물 효소 활동을 특성화 하는 통합된 omics 접근 필요 완벽 하 게 이해 하는 유기 물 분해 및 궁극적으로 습지에서 온실 가스 (CO2 와 채널4) 생산에 컨트롤 뿐만 아니라 대사 산물입니다. 이 문서에서는, 우리 완전히 대응된 분석 결과 순차적 접근을 사용 하 여 단일 샘플에서 이러한 포괄적인 분석을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 대사 산물, 단백질, proteomics와 GC-MS LC MS20 작은 대사, 단백질 및 지질 대사 산물 양적 정보를 통합 하 여 식별 하 결합 했다 지질 추출 (MPLex) 프로토콜에 확장 통해 NMR 및 더 큰 2 차 대사 산물 을 통해 FTICR 양 약간 다른 MPLex의 식별, 우리 물 추출 그리고 점점 비 극 지 용 매로 사용 하 여 순차 추출와 프로토콜을 시작합니다. 모든 기사는 단일 샘플 볼륨 제한 또는 얻기 어려운 때 샘플을 보존 하 고 이기종 샘플 매트릭스 (예를 들면, 토양 및 토 탄)에서 aliquots 사이 변이 통해 소개 하는 실험적인 오류 감소에 완료 또는 보관 조건 및 기간에 차이입니다.

마지막으로, 미생물 커뮤니티의 proteomics 분석 옴 분석 커플링, 우리 통로 유기 물 분해의 변화를 설명 하는 대사 네트워크를 구축할 수 있습니다. 이것은 우리가 어떻게 섭 시스템에 영향을 미치는 궁극 CO2 와 변경 사용할 수 유기 기판, 전자 수락자, 미생물 커뮤니티를 통해 채널4 생산에 대 한 특정 가설을 테스트 하 반응을 통해 효소 촉매의 활동을 중재.

이 방법의 전반적인 목표 대사 산물, 지질, 및 분석 오류를 제한 하는 동안 대사 네트워크를 구축 하기 위한 완벽 하 게 짝된 데이터 집합 만드는 단일 샘플에서 미생물 단백질을 분석 하기 위한 단일 처리 프로토콜을 제공 하는 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 토양, 앙금, 또는 토 탄에서 유기 물질의 연속 추출

  1. 토양, 앙금, 또는 토 탄을 통해 유선 수집 하 고 (예를 들어, 깊이) 테스트 중인 가설에 따르면 코어 분할. 소계에 게 샘플 컨테이너 코팅 및 분석 전에 저장에 대 한-80 ℃에서 동결.
    참고: 약 25 mg C이이 프로토콜에 대 한 필요 합니다. 토 탄 (일반적으로 45 %C), 말린된 토 탄의 50 mg이 필요 합니다. 더 많은 양의 샘플 C에 따라 미네랄 또는 숲이 우거진 고원 지 대 토양 콘텐츠 (최대 5 g) 처럼 낮은 유기 샘플에 대 한 필요할 수 있습니다. 유기 용 매와 추출 됩니다 2.4 단계 이온화에 부정적인 영향을 미칠, 추출 물에 어떤 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 당길 것 이다 때문에 샘플을 수집, 저장 하는 동안 어떤 시점에서 플라스틱에 연결할 수 있도록 하는 피하기 위해 중요 하다 또는 추출입니다.
  2. 때 준비는 샘플을 분석, 일정 무게, 건조 동결 후 균질 하 고 어떤 집계 헤어 스테인리스 분쇄 볼을 사용 하 여 고속 볼 밀에서 샘플을 갈기.
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다이 시점에서 고-80 ° c.에 저장 된 자료
  3. 개별 2 mL 유리 튜브에는 에탄올 세척 스테인리스 기구, 말린된 샘플의 각 aliquot 50 밀리 그램을 사용 하 여. 이 샘플은 연속적으로 각 샘플에서 점점 비 극 지 대사 산물을 추출 하는 일련의를 사용 하 여 순차적으로 추출 됩니다. 각 샘플에 증류수, degassed 물 (H2O) 1 mL를 추가 하 고 캡 튜브 쉐이 커 테이블에 2 h 흔들.
  4. 20 분, 후 30 분 동안 15000 x g에서 원심 분리기 실 온 (RT)에 서 서 솔루션을 허용 떨고, 후 가만히 따르다 고 각은 상쾌한을 저장 합니다.
    참고:이 솔루션은 주입 FTICR MS에 직접 주입 하 여.
  5. 지금에 행위 Folch 추출21 (일컬어 MPLEx20) 1.3 단계에서 물에 대 한 4:3 클로 프롬: 메탄올 혼합물 1.3과 1.4-20 ° C의 1 mL를 대체 하는 단계를 반복 하 여 추출된 잔류물을 물.
    주의: 클로 프롬과 메탄올은 모두 높은 가연성 및 독성. 피부 접촉을 방지 하 고 오픈 화 염 방지 하려면 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 사용 합니다.
  6. 조심 스럽게 두 레이어 분리를 사용 하 여 FTICR MS에 의해 별도 분석에 대 한 시각적으로 구별할 수 있을 것입니다 퍼 널 또는 단순히 주의 pipetting으로 상위 레이어를 제거 하는 용 매 인을 구분 합니다.
    참고: 클로 프롬 포함 된 분수 것 하단에 메탄올을 포함 하는 분수 덜 들이 상단에 있을 것입니다 하는 동안.
  7. 클로 프롬 추출 물 (단계 1.6) 1:1 메탄올과 물 추출 물 (단계 1.4) 직접 분사에 의해 FTICR MS에 대 한 분무 이온화 (ESI) 효율성을 개선 하기 위해 메탄올에서 2:1 희석.
    참고: 단계 1.7에서에서 메탄올을 포함 하는 분수 희석 필요 하지 않습니다 더 메탄올에서. 메탄올 레이어 FTICR MS에 직접 주입 하 여 실행 됩니다.

2.FTICR MS 분석

  1. 직접 튜닝 솔루션의 100 µ L를 주입 하 여 FTICR 분석기 보정 ( 재료의 표참조) FTICR MS에 약 100-1300 다의 대량 범위를 확장.
  2. Suwannee 강 Fulvic 산 표준 준비 ( 재료의 표참조) 초순 필터링 된 물에서 1 mg mL-1 솔루션 하 고 다음 결과 솔루션 메탄올에서 20 µ g m l-1 을 diluting.
  3. ESI 소스 FTICR 분석기 3.0 μ 분-1의 유량을 설정 하는 주사기 펌프를 통해 결합이 최종 솔루션의 23 µ L을 주입 하는 직접. +4.4 바늘 전압 설정 kV, 1 분기 150 m/z 와 유리 180 ° c.에서 모 세관 분석 소프트웨어를 사용 하 여 결과 스펙트럼을 검사 ( 테이블의 자료참조)는 데이터의 품질을 확인 하.
  4. Carryover 모니터링 HPLC 학년 메탄올 및 샘플링을 통해 샘플을 실행 하기 전에 사용 합니다. 각 추출 통해 직접 분사 ESI 소스 FTICR 분석기 3.0 μ 분-1의 유량을 설정 하는 주사기 펌프를 통해 결합의 23 μ를 소개 합니다. +4.4 바늘 전압 설정 kV, 1 분기 150 m/z 와 유리 180 ° c.에서 모 세관
  5. 각 샘플 또는 C 농도 변화에 대 한 계정에 샘플의 그룹에 대 한 이온 축적 시간 (IAT)를 조정 합니다. 전형적인 값 각 샘플, 평균 0.1 0.3 미 수집 144 검사 사이 스캔 되며 다음 동종 c h 2를 사용 하 여 내부 캘리브레이션을 실시 (즉, 14 다 분리) 시리즈.
    참고: FTICR MS 분석 후 결정 만들 수 있습니다 하거나 물을 결합 하 고 나머지 단계를 간소화 하기 위해 메탄올 추출 분수 이나 분수는 후속 단계에 걸쳐 별도 유지 될 수 있다. 각 방법의 장단점 토론에서 길이 설명 합니다. 만약 그렇게 하 고, 물과 메탄올 추출 분수를 결합 합니다.
  6. 건조 집중 장치를 사용 하 여 추출 하 고 추출의 나머지를 저장 (~ 1 mL) (물, 메탄올 또는 물 + 메탄올) 후속 GC MS, LC-MS (클로 프롬) 및 NMR (물 + 메탄올) 분석에 대 한.
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다이 시점에서,-20 ° c.에 저장 된 자료

3. FTICR MS 데이터 처리

  1. 공동 대량 교대를 줄이고 수식 할당 앞서 Formularity 소프트웨어22 를 사용 하 여 피크 할당 표준화를 전체 데이터 집합에 대 한 모든 샘플 피크 목록을 정렬 합니다.
  2. 22 Formularity 소프트웨어 사용 하 여 신호를 사용 하 여 분자 수식을 할당 7 보다 큰 잡음 비율, 질량 측정 오류 < 1 ppm, 및 다른 모든 요소를 제외 하는 동안 C, H, O, N, S 및 P를 허용.
  3. 여러 후보 수식 (500 다 위에 자주) 주어진된 질량에 대 한 반환 되는 경우 부과 제약 샘플링 되는 자료와 일치. 예,이 탄, 일반 제약 조건 포함: 최저 대량 오류, 낮은 수가 heteroatoms (N, S, P), 그리고 현재, P 해야 산화 형태로 (, 4 O 원자 수식에 각 P 원자에 대 한 있어야 합니다).

4. 화학 Derivatization GC-MS에 대 한

  1. GC-MS autosampler 튜브23헥 산 HPLC 급의 빈 제어 샘플을 준비 합니다. 100 mg 지방산 메 틸 에스테 르 분해 (FAMEs: C8-C28) 혼합물 보존 시간 헥 산의 200 µ L에 표준.
  2. 카보닐기 그룹을 보호, 추가 pyridine에 30 mg mL-1 methoxyamine 염 산 염의 20 μ 메탄올 추출 물 및 물 추출 물 (또는 결합 된 메탄올/물 추출 물을 사용 하는 경우)의 각 단계 2.6, 공백 및 명성 교정 샘플23에서. 모자와 튜브 인감.
    주의: Pyridine 모두 매우 유독 하 고 가연성 이다. 피부 또는 눈 접촉을 방지 하 고 오픈 화 염 방지 하려면 적절 한 보호구를 착용 하십시오. 또한, pyridine RT 일으키는 유해 공기 오염에 volatilizes. 증기 두건에서 통풍이 잘되는 공간 에서만 작동 합니다.
  3. 소용돌이 60 20 s. Sonicate 추출 물에 대 한 추출 s. 그런 다음, 100 x g에서 90 분 동안 37 ° C에서 원심 분리기 추출 물 품 어.
    참고: 과도 한 양의 탄수화물 이나 소금 metabolites 아래로 마른 후 정보를 발생할 수 있습니다. 샘플 sonicating crystalized metabolites derivatizing 시 약으로 다시 구성 하는 데 도움이 됩니다.
  4. 인큐베이션, 후 추가 80 μ n-메 틸-N-(trimethylsilyl) 각 샘플을 1 %trimethylchlorosilane trifluoroacetamide, 소용돌이 60 20 s. Sonicate 추출 물에 대 한 추출 s 품 어 100 x g에서 30 분 동안 37 ° C에서 원심 분리기에 다시 추출 하 고.
  5. Rt (20-24 ° C), 멋진 추출 다음 GC-MS autosampler 튜브로 전송.

5. GC-MS 분석

  1. 조정 및 공급 업체의 권장 사항에 따라 MS를 보정 ( 재료의 표참조) 분석 있는지 확인 하기 전에 기계 올바르게 MS 데이터 읽기. 지정 된 허용 오차 내에서 헬륨 가스 압력 인지 확인 합니다.
  2. GC 열 (30 m × 0.25 m m × 0.25 μ m)에 별도 극 지 대사 산물. 오븐 온도 프로토콜을 다음과 같이 설정: 1 분 동안 60 ° C, (2) 경사 10 ° C min-1고 (3) 5 분 325 ° C에서의 속도로 325 ° C로 (1) 초기 온도.
  3. 단일 4 중 극 양 세트 주입 포트 온도 상수 250 ° c.를 결합 하는 GC를 사용 하 여 추출 물 분석 Splitless 모드에서 각 derivatized 추출의 1 μ 주사.

6. GC-MS 데이터 처리

  1. 그들은 제대로 캡처된 되도록 모든 데이터 파일을 검사 합니다. 주의 데이터에 걸쳐 지속적으로 캡처된 내부 표준 보존 시간과 농도 것인지에 관하여 잠재적인 변화를 분석.
  2. 필요한 경우 공급 업체 특정 MS 데이터 형식 일반 MS 형식으로 변환 합니다. 프로세스 raw 데이터 파일 MetaboliteDetector24 보존 인덱스 명성 내부 표준에 따라 보정을 사용 하 여. 후 모든 데이터 파일의 보존 시간을 맞춰서, 계속 deconvolution 그리고 마지막 대사 산물 식별 보존 및 FiehnLib 극 지 대사 산물 도서관25에 대 한 GC-MS 스펙트럼 일치 하 여.
  3. 크로스-스펙트럼 일치를 사용 하 여 NIST14 GC-MS 라이브러리에 대 한 미확인된 metabolites 남아 확인 합니다. 개별적으로 거짓 식별 제거 하 deconvolution 오류를 줄이기 위해 신원 확인.

7. 액체 상태 NMR 분석

  1. 물 추출 물의 나머지를 희석 (~ 300 µ L) 10% (vol/vol) 5mm 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 내부 표준. 또는 결합 물 및 메탄올 추출 단계에서 물에 1 다음 resubstitute. 그러나 이렇게, 휘발성 화합물의 일부 있을 수 있습니다 손실 동결 단계. 일반적인 최종 샘플 볼륨 180-300 µ L 범위에 있습니다.
  2. 높은-품질 3 m m 외부 직경 (마약) 붕 규 산 유리 NMR 튜브에 혼합물을 전송 합니다.
  3. NMR 분 광 계 (이상적으로 이상 600mhz) 5mm 트리플 공명 소금 관대 감기 프로브와 감기-탄소 프리 앰프를 사용 하 여 스펙트럼을 수집 합니다.
  4. 1 D 1H 스펙트럼 4 s 수집 시간, 1.5 s 재활용 지연, 65536 복잡 한 포인트와 512 검사 298 K에는 1 일 핵 Overhauser 효과 분광학 (NOESY) presaturation 실험을 사용 하 여 수집 합니다.
  5. 2D 1H-13C heteronuclear 단일 양자 상관 관계 (HSQC)와 1H-1H 총 상관 관계 (TOCSY) 스펙트럼 할당 대사 산물 및 유효성 검사의 도움을 수집 합니다.
  6. 처리 하 고, 할당, NMR 분석 소프트웨어를 사용 하 여 모든 스펙트럼 분석 ( 재료의 표참조) 내부 표준 기준 농도 계량 하기. 라이브러리에 대 한 샘플에서 화학 변화, J-커플링 및 강도 정보를 일치 하 여 대사 산물을 식별 합니다.
    참고: 라이브러리 추가 사용자 지정 대상된 대사 산물 표준 정기적으로 만든 대사 산물 추가 의해 향상 됩니다. 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다 및-20 ° c.에 저장 된 자료

8. LC-MS Lipidomics 분석

  1. 메탄올의 200 μ 2.5 단계 중에 생성 된 말린된 클로 프롬 추출 rewet
  2. 울트라 고성능 액체 크로마 토 그래프는 Orbitrap 질량 분 서 계는 반전된 단계 표면 하이브리드 열 (3.0 m m × 150 m m × 1.7 μ m 입자 크기)을 청구를 사용 하 여 결합에 각 추출의 10 μ를 삽입할. 부정적이 고 긍정적인 250 µ L/분 사용의 유량에 34 분 그라데이션 (10 m m 염화 아세테이트를 포함 하는 모바일의 단계 a: 이기/H2O (과), 모바일 단계 b: 이기/소 프로 파 놀 (10:90) 10mm 암모늄 아세테이트를 포함)을 설정 이온화는 높은 에너지 충돌 분리와 충돌 유도 된 분리 모드.
    주의: 이기는 눈, 피부, 호흡기 자극. 적절 한 보호구를 착용 하십시오. 또한, 이기는 가연성 이다. 산화 에이전트에 게 연락 하는 허용 하지 않습니다, 그리고 유독 가스를 점화 하는 동안 생성 될 수 있습니다.
  3. (양수 또는 음수) 각각 이온화 모드에 대 한 (, > 25000 지질 종의 목록) 대상 파일 함께 액체에 원시 LC-MS/MS 데이터 파일 업로드할. Raw 파일을 처리 합니다. 수동으로 유효성 검사 결과 식별 진단 이온의 존재에 대 한 MS/MS 스펙트럼을 검사 하 여 경우 해당, 일치 조각 이온 (예를 들어, 지방 acyl 체인), 동위 원소 분리, 질량의 선구자, 그리고 보존 기간 ppm 오류. 자신 있게 확인 된 지질 결과 목록.tsv 파일으로 내보냅니다.
    참고: 프로토콜이 시점에서 일시 중지 하 고-20 ° c.에 있는 자료를 저장

9. Proteomics 분석

  1. 2.4 단계에서 발생 하는 20 배 추가 감기 (-20 ° C) 메탄올 추출 볼륨 추출 물 세척에 의해 메탄올 위상의 나머지에서 MPLEx 프로토콜20 에 따라 단백질을 추출 합니다.
  2. 조건 C18 SPE 열 3 mL 메탄올, 물, 1 mL/min 보다 더 큰 비율로 9.1 단계에서 추출의 추가 의해 뒤에 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA)의 2 개 mL를 1 mL/50 밀리 그램 실리 카 기반 매 (참조 테이블의 재료)를 사용 합니다.
  3. 샘플의 추가 따라 95:4.9:0.1 물: acetonitrile:TFA의 4 mL와 열 세척 후 건조 허용. SPE 열 아래 1.5 mL 컬렉션 튜브를 배치 하 고 80:19.9:0.1 메탄올: 물: TFA의 1 mL과 샘플을 elute.
  4. 집중 진공 기반에서 100 µ L 추출 물에서 동결 건조 하 고, bicinchoninic 산 (BCA) 색도계 분석 결과26 562의 파장에 의해 단백질 농도 측정 nm.
  5. 4 ° c.에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심 분리기 추출 결과 상쾌한 삭제 하 고 5 분 Resuspend µ L 당 0.1 µ g 펩 티 드의 최종 농도에 물에 단백질 펠 릿에 대 한 진공에서 나머지 펠 릿을 건조.
  6. 5mm의 최종 농도에 dithiothreitol를 추가 하 고 30 분 Dilute 60 ° C에서 10 배 품 어 100mm NH4HCO38 M 요소 솔루션 1시 50분에 3 h 1 m m CaCl2 와 돼지 트립 신 존재에 대 한 37 ° C에서 품 어와 단백질 효소 비율입니다.
    참고:이 시점에서 일시 중지 될 수 있습니다 프로토콜과-20 ° c.에 자료를 저장
  7. 별도 추출 물을 통해 액체 크로마토그래피 10 kpsi와 500 nL 분-1(B)에서 모바일 단계 이기에에서 물 모바일 단계 (A) 및 0.1% 개미 산에 0.1% 개미 산의 지 수 그라디언트를 사용 하 여.
  8. 결과 eluent는 ESI 결합 질량 분 서 계는 선형 이온 함정 (LTQ) Orbitrap 질량 분석기에서 m/z 400에서 100000 해상도 400-2000 m/z 에서 스펙트럼을 수집에 소개.
  9. MsConvert 또는 ProteoWizard 수락 모든 기본 매개 변수를 사용 하 여 mzML 형식으로 원시 스펙트럼 파일을 변환 합니다. MSGFPlus 범용 데이터베이스 검색 도구를 사용 하 여 검색 결과 proteomes 단백질 시퀀스 조립 관련 metagenome 유전자에서 예측의 타겟된 단백질 데이터베이스에 대해.
  10. 일반적인 오염 물질 (, 트립 신, 각 질, 알 부 민)을 추가 하 고 펩 티 드-질량 스펙트럼 일치 통계를 향상 시키기 위해 모든 정확 하 게 중복된 단백질 시퀀스를 제거 합니다. 일치 하는 펩 티 드-질량 스펙트럼은 최고의 결정 결과 MSGF 스펙트럼 확률 점수를 평가 합니다. MSGFPlus에서 Q 값을 사용 하 여 1% 틀린 발견 비율 (FDR) 전체 데이터 파일을 필터링 할.

10. 대사체학 분석 및 대사 네트워크 구축

  1. 모든 대사 산물 분자 공식 샘플에 대사 산물의 단일 데이터베이스에 3, 6, 7, 및 8 단계에서 확인 된 컴파일하십시오. 이 대사를 결합 하 여 9 단계에서 확인 된 효소의 효소 위원회 (EC) 또는 KEGG Orthology (코) 숫자와 함께. KEGG27 데이터베이스, 대사 경로 섹션에 대해이 결합 된 데이터 집합을 검색 합니다.
  2. 수동으로 평가 결과 가능성이 가장 높은 경로 식별 하 고 신진 대사 모델에 통합 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

우리는 설명된 보완 분석 프로토콜을 수행 하 고 미네소타, 미국에서에서 가문비나무와 Peatlands 응답 아래 변경 환경 (가문비나무) 사이트에서 S1 수렁에 깊이 가진 토 탄을 비교. 이러한 결과 영구 동 토 층 늪지와 펜에서 사이트 대사 산물 및 효소 활동에 다를 수 있습니다 방법을 보여 북부 스웨덴에서 비교 됩니다. 우리는 proteomics 분석에 3,312 효소 발견. 깊이와 효소 활동의 분석 효소의 수 15 cm와 가문비나무 늪지 (그림 1)에서 45 cm 사이 급격히 하락을 보여준다.

Proteomics 결과 표시는 단백질 표현, 하는 동안 대사 데이터는 실제로 발생 하는 어떤 반응을 보여준다. 전반적으로, 우리 모든 FTICR-MS, NMR의 조합에서 토 탄 샘플의 67,040 대사 산물 (를 포함 하 여 지질) 식별 GC-MS와 LC MS 분석. 이들의 분자 공식 15,385 화합물 (그림 2)을 할당할 수 있었습니다. 결합 된 대사 데이터 산화 상태, 질량, 및 복합 클래스의 범위에 걸쳐.

이것은 일반적으로 그들의 원자 말 비율28에 대 한 확인 된 공식의 원자 H/C 비율 그려집니다 반 Krevelen 다이어그램 사용 시각. 컬러 코딩을 개별 수식 (그림 3그림 4)를 나타내는 기호에 의하여 NOSC를 묘사한 전형적인 2D 형식 추가 차원을 포함 시켰습니다. 가문비나무 수렁에 깊이 증가 함께 큰 이차 대사 산물의 총 수 증가 FTICR-MS, 특히 높은 압축된 (왼쪽 아래 반 Krevelen 작의)에 의해 식별 및 공식 (작 위)를 소화한 (그림 4 ). 같은 깊이 이상 감소 GC-MS에 의해 식별 된 작은 높게 정력적 인 화합물의 수 및 지질 (그림 5)에 있다. 이 지질과 작은 metabolites 깊은 깊이 도달 하기 전에 표면 토 탄에서 소비는 또는 그 분해 깊은 토 탄에 요금은 표면에서 보다 빠른 하향 advecting 화합물 급속 하 게 소비 하는 것이 좋습니다 수 있습니다. 이 두 개의 경쟁 가설 사이 차별화 C 사이트에서 자전거의 프로세스 수준 이해를 필요 합니다. 이러한 프로세스 수준의 이해만 대사체학 및 단백질 데이터 집합을 결합 하 여 기록하실 수 있습니다. 우리 결합된 FTICR-MS, GC-MS, LC-MS, 크로스 확인 하 여이 작업을 수행할 고 NMR KEGG 데이터베이스에 대 한 대사. 이렇게, 우리는 우리가 발견 하는 화합물 tricarboxylic 산 (TCA) 사이클, 분해, 설탕 물질 대사 등 관련된 공통 대사 경로 찾으십시오. 이후 개별 대사에 관련 될 수 있는 효소와 여러 경로 확인 경로 (그림 6)을 할당에 우리의 자신감을 증가 합니다.

이 매핑을 통해 보면 자당 및 전 분 대사의 증거 표면 물에 깊이 깊이 pyruvate 및 기타 발효 제품 (그림 6)를 구축 하는 동안. 이러한 결과 설탕과 다른 에너지 대사 표면 토 탄에 저하 고 깊은 토 탄 깊이 도달 하지 않습니다 첫 번째 가설과 일치. 그림 5에서 볼 수 있듯이 설탕 (NOSC = 0)과 아미노산 (0 < NOSC < 지질 동안 표면 토 탄에 소비 1)는 (-2 < NOSC <-1) 깊이와 축적을 나타납니다. 이것은 더 낮은 NOSC 화합물 높은 혐 기성에 유지 하는 동안 더 높은 NOSC 화합물 더 쉽게 저하는 NOSC 값에 따라 기대와 일치 (, 차 제한) 표면 토 탄의 조건. 이 방법은 또한 성공적으로 서로 다른 환경에서 토양 유형을 구분합니다. 예를 들어 아 peatland에서 토양 유기 물 compositionally 펜 및 늪지 지역 내에서 영구 동 토 층 내에서 뿐만 아니라 영구 peatland 보다 다른 것 처럼 보인다. 이러한 결과 이전의 연구는 이러한 서식 지29, 제안 그 사이트 지구 화학 지구 화학 사이트 차이 지 C의 미생물 저하에 큰 영향을 미칠와 일치.

Figure 1
그림 1 : Proteomics 분석 효소의 수에 있는 강한 깊이 계층을 나타냅니다. 바 평균 나타내고 오차 막대 나타났는데 한 표준 편차를 표시 합니다. 이 미생물은 가장 활성 탄 표면에서 나왔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 표면 토 탄 (< 30 cm) 각 서식 지의 뿐만 아니라 중반 (45 cm)와 가문비나무 늪지에서 깊은 (87 cm) 토 탄에서 각 기술에 의해 식별 된 화합물의 수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 :에 반 Krevelen 다이어그램 (원자 H/C 말 각의 식별 분자 공식) 표면 (15 cm) 가문비나무 화합물 각 기술에 의해 특징의 범위를 설명 하기 위해 깊이 늪지. FTICR MS 화합물 (작은 원)의 가장 큰 번호를 수 있습니다 GC-MS (삼각형)는 차별화 하 고 설탕을 식별에 대 한 좋은 (H/C 2와 말 = = 1). (사각형) NMR 분광학 설탕, 아미노산, pyruvate, 정력적으로 중요 한 화합물에 정량적 인 정보를 제공합니다. LC-MS (다이아몬드) 지질에 정보를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 :에 반 Krevelen 다이어그램 (원자 H/C 각의 말 식별 분자 공식) 딥 (87 cm) 가문비나무 화합물 각 기술에 의해 특징의 범위를 설명 하기 위해 깊이 늪지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 다른 화학 클래스 식별의 상대적인 분수 통해 는 다른 깊이에 다양 한 기법. 바 각 깊이 ± 1 표준 편차에 대 한 평균으로 그려집니다. 플롯 클래스 포함 아미노산, sphingolipids (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diacylglycerol (DG), triacylglycerols (TG), 및 설탕. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 6
그림 6 : 결과 대사 네트워크를 만들 결합. NMR () GC-MS (b), 그리고 변환 가문비나무 늪지에서 식별 선택 번호를 보여주는 간단한 대사 지도 (c)로 식별 되는 대사 산물의 깊이 분포. 녹색 상자 metabolites 깊이, 갈색 상자와 함께 감소 하는 깊이 함께 증가 하는 대사 산물 나타냅니다 나타냅니다. 녹색 연결 화살표 표시 변환 (효소 EC 번호 옆에 화살표 표시)를 중재 하는 우리의 데이터 집합에서 확인 된 효소를 나타냅니다. 회색 연결 화살표는 효소 우리의 데이터 집합에서 식별 되지 했다 변환을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

단일-처리량, 대사와는 프로테옴을 특성화 하는 데 사용 하는 완전히 결합 분석 스트림 경로 c 사이클에서 발생 하는 복잡 한 생태계에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 토양 및 토 탄은 이기종 행렬, 그리고 따라서,이 방법의 중요 한 단계 중 하나 시작 토 탄 또는 토양 물자는 높게 균질 성 확보에 초기 단계에서 발생 합니다. 그것은 뿐만 집계 추출 효율을 줄일 수 있습니다 샘플을 분쇄 하는 것이 좋습니다. 이것은 낮은 C와 적절 하 게 균질를 스테인리스 볼 분쇄기를 사용 하 여 필요할 수 있습니다 높은 미네랄 내용을 집계 토양과 토양에 대 한 특정 문제. 토양 및 토 탄 실험 사이트 내에서 공간이 높을 수 있습니다, 때문에 생물 복제는 매우 것이 좋습니다.

이 방법을 활용 하 여 3 개의 용 매: 물, 메탄올, 및 클로 프롬, 편견을 추출 수는 화합물의 종류. 원칙적으로,이 연속 추출 방법을 극성 넓은 범위를 커버 하는 화합물을 solubilize 해야. 그러나,이 용 매는 유기-미네랄 복합물 또는 매우 안정된 단지 추출 최적화 하지. 이러한 화합물의 경우에, 강한 산 및 기초와 같은 엄격한 용 매, 하지만 엄격한 추출 프로세스 샘플의 화학 작용을 변경할 수 있습니다. 같은 용 매 추출 시퀀스의 끝에 통합이 효과 최소화할 수 있습니다. 또한, 클로 프롬 세포 막 지질을 용 해 하 여 임상적으로 중요 한 토양 및 토 탄 박테리아 및 바이러스 성 병원 체 및 다른 병원 성 질병을 일으키는 생물 학적 에이전트 비활성화 됩니다. 따라서, 클로 프롬 적 출 프로토콜에서 통합 샘플 잠재적으로 세계의 다른 지역에서 병원 균에 의해 감염의 생물학 연구에 관련 된 위험을 줄일 것입니다. 죽은 미생물 세포, 파편, 또는 미 립 자 추출 다음에 대 한 우려는, 추출 물 0.2 µ m 유리 섬유 필터를 통해 필터링 하는 것이 좋습니다.

합리화 과정, 물과 메탄올 추출 단계 4.1 GC-MS 분석에 대 한 결합 수 있었다. 그러나, 이러한 추출 ESI 소스와 이온화 효율 문제로 FTICR MS 분석에 대 한 분리 유지 되어야 합니다. GC-MS에 결합 된 추출 실행의 장점은 더 많은 대사 산물 (극성의 더 큰 범위를 커버 하는) 확인 될 것입니다. 이 시점에서 추출 물 결합의 단점은 주요 대사 산물 중요 한 유기 물질의 미생물 처리에의 한 메탄올은. 메탄올의 항상 유지 됩니다 결합된 샘플도 건조 후, 메탄올의 대사 산물 이면 물 추출을 별도로 실행 해야 합니다. 아니 analytes와 좋은 컨트롤을가지고 또한 샘플에서 잠재적인 오염 식별에 도움이 됩니다.

7.1 준비 추출 물을 GC-MS 분석에서 NMR 분석 중 혼자 물 추출 또는 결합된 물 단계에서 그리고 메탄올 추출 물 사용 될 수 있다. 이렇게 불리는 전 항에 열거 된 것과 유사한. 물과 메탄올 추출 물 결합의 장점은 메탄올 분수에서 solubilized 덜 극 지 대사 산물의 일부 식별 됩니다. 그러나, 동결 단계 때문에 많은 더 휘발성 화합물 손실 됩니다. 이 실험의 중요 한 구성 요소는 휘발성 지방산을 측정 하는 경우 특정 단점입니다.

Proteomics 식별이 절차에만 완전히 tryptic 펩 티 드 검색, 따라서 생 peptidase 활동 있으며 소스 fragmentations 놓친 것입니다. 다른 한편으로, 산화 메티오닌 고려 될지도 모른다 포스트 번역 상 수정으로 펩 티 드 후보에 대 한이 수정 샘플링 처리 하 고 처리 하는 동안 일반적으로 발생 합니다. 펩 티 드 차입 영역을 사용 하 여 효소의 정량화 할 수 있습니다, 하지만이 프로젝트의 범위를 벗어납니다.

NOM 및 미생물 매개 변수 분석에서 많은 최근 발전 유기 C를 이해 하기 위한 다양 한 기법을 제공 하는 자전거. 단일 유선형된 프로토콜에 이러한 기술을 결합 하 여 우리는 일어나 고 있는 프로세스의 새로운 보기를 얻을. 대사 분석 proteomics 분석 커플링 실제로 발생 하는 반응 하는 확증 적인 증거를 경쟁력을 제공 합니다. 그는 대사 산물 높거나 낮은 농도 비교 사이트 또는 치료 효과 후에 그 변경에 대 한 원인을 분별 수 없습니다 우리에 게 알립니다 대사 분석만 제한 됩니다. 예를 들어 우리는 늪지에 깊이 떨어지는 설탕 농도 확인 하지만 추가 정보 없이 그것은 불분명 깊이 감소 느린 입력 또는 깊은 토 탄의 빠른 저하 때문 인지. 두 번째 가설을 거부 하는 프로테옴 분석 깊이 감소 효소 식 수 있습니다. 오히려 우리의 결과 더 깊은 깊이에 표면 탄 제한 입력에 빠른 설탕 저하와 일치 합니다. 이러한 특정 통찰력은 가능한 모든 기술을 각자 독특한, 제공에서 고려 될 때만 자전거 퍼즐. C의 중요 한 부분

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 일본 Chanton, J.E. Kostka, mm은 Kolton 물 샘플을 수집에 대해 감사 하 고 싶습니다. 이 작품의 일부는 환경 분자 과학 연구소, 암컷 사무실의 과학 사용자 시설 사무실의 생물학과 환경 연구의 후원에서 실시 했다. PNNL는 Battelle 계약 드 AC05 76RL01830 아래 DOE에 대 한에 운영 됩니다. 이 작품은 미국 에너지 부, 과학, 및 사무실의 생물학과 환경 연구에 의해 지원 되었다 (부여: 드-AC05-00OR22725, DE SC0004632, DESC0010580, 드-SC0012088, 및 드-SC0014416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methoxyamine hydrochloride Sigma Aldrich 226904 derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe  Bruker instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) Agilent AG19091S-433 instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) ThermoFisher instrumentation
2 mL glass vials VWR International 46610-722 sample vials
autosampler vials VWR International 97055-324; 9467671 sample vials
Chloroform VWR International JT9174-3 solvent
Ethanol VWR International BDH67002.400 solvent
methanol VWR International BDH85681.400 solvent
pyridine VWR International BDH67007.400 solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 Sigma Aldrich 178837 standard
C8-C24 fatty acid methyl ester Sigma Aldrich CRM18918 standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide Sigma Aldrich 24589-78-4 standard
Suwanee River Fulvic Acid standard International Humic Substances Society 2S101F standard
trimethylchlorosilane Sigma Aldrich 89595 standard
Tuning Solution Agilent
FTICR-MS analysis software Bruker Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software Pacific Northwest National Laboratory Formularity available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS Agilent Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent Phenomenex (Torrance, CA) Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 VWR International KT897820-0008 NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer  Varian Inova Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3 Chenomx Chenomx NMR Suite NMR software
ultra-performance liquid chromatograph  waters Aquity UPLC H  liquid chromatograph 
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer  ThermoFisher Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26, (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122, (2), 387-404 (2017).
  3. Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21, (4), 2035-2051 (2017).
  4. Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
  5. Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83, (11), e00645-e00617 (2017).
  6. Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528, (7580), 60-68 (2015).
  7. Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127, (2-3), 157-171 (2016).
  8. LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75, (8), 2030-2042 (2011).
  9. Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
  10. Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
  11. Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18, (6), 1000-1013 (2015).
  12. Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122, (11), 2841-2861 (2017).
  13. Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28, (3), 193-202 (1999).
  14. Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123, (2), 591-609 (2018).
  15. Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123, (6), 1790-1795 (2018).
  16. Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115, (28), E6585-E6659 (2018).
  17. Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15, (10), 1416-1423 (2004).
  18. Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8, (1), 8 (2018).
  19. Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54, (12), 998-1003 (2016).
  20. Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).
  21. Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  22. Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89, (23), 12659-12665 (2017).
  23. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).
  24. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81, (9), 3429-3439 (2009).
  25. Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81, (24), 10038-10048 (2009).
  26. Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33, (11), 1744-1746 (2017).
  27. Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
  28. Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
  29. Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (16), 5819-5824 (2014).
복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tfaily, M. M., Wilson, R. M., Brewer, H. M., Chu, R. K., Heyman, H. M., Hoyt, D. W., Kyle, J. E., Purvine, S. O. Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures. J. Vis. Exp. (143), e59035, doi:10.3791/59035 (2019).More

Tfaily, M. M., Wilson, R. M., Brewer, H. M., Chu, R. K., Heyman, H. M., Hoyt, D. W., Kyle, J. E., Purvine, S. O. Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures. J. Vis. Exp. (143), e59035, doi:10.3791/59035 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter