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Single-produção complementares técnicas analíticas de alta resolução para caracterização de misturas complexas de matéria orgânica Natural

doi: 10.3791/59035 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve uma única taxa de transferência de técnicas complementares, analíticas e omics, culminando em uma caracterização-pareado de matéria orgânica natural e proteomics microbiana nos diferentes ecossistemas. Esta abordagem permite comparações robustas para a identificação de vias metabólicas e transformações importantes para descrever a produção de gás de efeito estufa e prevendo respostas a mudanças ambientais.

Abstract

Matéria orgânica natural (NOM) é composta por uma mistura altamente complexa de milhares de compostos orgânicos que, historicamente, revelou-se difícil caracterizar. No entanto, para entender os termodinâmicos e cinéticos de controles na produção de gás (dióxido de carbono [CO2] e [CH4] de metano) com efeito de estufa resultantes da decomposição de NOM, uma caracterização do nível molecular juntamente com microbiana análises de Proteome é necessário. Além disso, clima e mudanças ambientais são esperadas para perturbar os ecossistemas naturais, potencialmente perturbador interações complexas que influenciam tanto o fornecimento de substratos matéria orgânica e microorganismos realizando as transformações. Uma detalhada caracterização molecular da matéria orgânica, proteomics microbiana e os caminhos e transformações pelo qual a matéria orgânica é decomposta será necessária prever a direção e a magnitude dos efeitos das mudanças ambientais. Este artigo descreve um throughput metodológica para caracterização do metabólito abrangente em uma única amostra por injeção direta de Fourier transform íon cíclotron ressonância espectrometria de massa (FTICR-MS), espectrometria de massa de cromatografia gasosa (GC-MS), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) e análise proteômica. Essa abordagem resulta em um conjunto de dados totalmente emparelhados que melhora a confiança estatística para inferir caminhos de decomposição de matéria orgânica, a resultante de CO2 e taxas de produção de4 CH e suas respostas a perturbação ambiental. Aqui apresentamos os resultados da aplicação deste método para NOM amostras coletadas de turfeiras; no entanto, o protocolo é aplicável para qualquer amostra NOM (por exemplo, turfa, solos florestais, sedimentos marinhos, etc.).

Introduction

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Globalmente, as zonas húmidas são estima-se que contêm Pg 529 de carbono (C), principalmente como orgânico C enterrado em depósitos de turfa1. Atualmente, tais turfeiras atuam como uma líquido C pia, sequestrando 29 Tg C y-1 na América do Norte sozinho1. No entanto, perturbações ambientais tais como drenagem, incêndios, seca e temperaturas mais quentes podem compensar esse coletor C, aumentando a decomposição de matéria orgânica, resultando em aumento C perdas através de gases de efeito estufa (dióxido de carbono [CO2] e 1,de produção metano [CH4])2. Mudança climática pode contribuir para a perda de C se temperaturas mais quentes ou secador condições estimulam mais rápido C decomposição por microorganismos. Alternativamente, umas mais altas temperaturas e concentrações no ar de CO2 podem estimular a produção primária para sequestrar mais CO2 como carbono orgânico (OC). Em que medida e rapidez que OC é então decomposta em CO2 e CH4 depende de interações complexas entre os substratos de doador de elétron, a disponibilidade de aceitadores de electrões e os microorganismos que medeiam a transformação. Em muitos casos, os mecanismos não são bem caracterizados, assim, sua resposta a perturbações ambientais não é bem restrita e ainda não está claro qual será o resultado da mudança climática no balanço de carbono em turfeiras ecossistemas.

A natureza complexa da matéria orgânica natural (NOM) tem feito mesmo identificando os compostos orgânicos presentes nas misturas NOM historicamente difícil. Avanços recentes têm melhorado muito nossa capacidade de caracterizar compostos que tradicionalmente e, em certa medida continuam a ser, considerado como recalcitrantes húmicos ou fúlvico compostos3,4,5. Agora entendemos que muitos destes compostos são na verdade amostras disponíveis e podem ser decompostos se um aceptor de elétron terminal apropriado (TEA) feito disponível6,7. Calcular o estado de oxidação nominal do carbono (NOSC) para um composto fornece uma métrica para predizer o potencial de decomposição e o rendimento energético do chá exigido. No entanto, requer uma caracterização do nível molecular da matéria orgânica7. NOSC é calculado a partir da fórmula molecular através da seguinte equação7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, onde z é a carga líquida. NOSC está correlacionada com a termodinâmica condução força8, em que compostos com maior NOSC são mais fáceis de degradar, enquanto compostos com menor NOSC exigem cada vez mais enérgicos chás para ser reduzido. Compostos com NOSC menos do que − 2 exigem uma alta energia produzindo chás como O2, nitrato ou MnIVe não pode ser degradados por ocorrem comumente baixa energia produzindo chás como FeIII ou sulfato de7. Esta é uma consideração importante nas condições anóxica alagadas encontrados em zonas húmidas onde O2 e outra alta energia produzindo chás são escassos9 e, portanto, a degradação de compostos NOSC inferiores sob essas condições são termodinamicamente limitada. Perturbações ambientais podem influenciar o estado termodinâmico do ecossistema por mudanças hidrológicas que influenciam O2 (o aceptor de elétron mais energético), alterações em substratos orgânicos e aceitadores de electrões disponibilizados pela primária produção e em menor grau pela temperatura. Um exemplo importante dos efeitos da temperatura em sistemas de zonas húmidas ocorre no que diz respeito a troca que ocorre entre homoacetogenesis (ou seja, produção de acetato de CO2 e H2) e hydrogenotrophic metanogênese ( ou seja, produção de4 CH de CO2 e H2). A baixas temperaturas, parece que esse homoacetogenesis é ligeiramente favorecida, enquanto temperaturas mais quentes favorecem CH4 produção10. Este efeito da temperatura pode ter implicações importantes para a resposta dos ecossistemas às mudanças climáticas, como CH4 é um gás de efeito estufa muito mais forte do que o CO211 e, consequentemente, aumento da produção de CH4 , às custas de CO2 em temperaturas mais quentes podem contribuir para um feedback positivo com aquecimento climático.

Turfeiras produzem globalmente significativas quantidades de CO2 e CH46via microbiana respiração de ocorrência natural orgânico importa. O NOSC de substratos orgânicos carbono determina a proporção relativa de CO2: CH4 produzido que é um parâmetro crítico devido a força radioativa maior de CH4 comparado com CO211, mas também porque esforços de modelagem identificaram esta relação como um parâmetro crítico para estimar o fluxo de C em turfeiras12. Na ausência de aceitadores de electrões terminal diferente de CO2, pode ser mostrado pelo saldo de elétron que os substratos orgânicos C com vontade de > 0 NOSC produzem CO2: CH4 > 1, C orgânico com NOSC = 0 produz CO2 e CH4 em proporção equimolar e C orgânico com NOSC < 1 produzirá CO2: CH4 < 113. Decomposição de OC em ecossistemas naturais é mediada por microorganismos, para que mesmo quando a degradação de um composto específico é termodinamicamente possível, é cineticamente limitada pela atividade de enzimas microbianas e, sob condições anóxica, pelo termodinâmico força (ou seja, NOSC)7. Até agora tem sido desafiador para caracterizar plenamente a matéria orgânica, porque a diversidade de compostos presentes requer diferentes técnicas complementares para a sua caracterização. Recentes avanços tem fechado o intervalo; utilizando um conjunto de técnicas analíticas podemos analisar uma grande variedade de compostos orgânicos, proporcionando a caracterização molecular-nível e, em alguns quantificação de casos, de pequenos metabolitos primários como glicose até 800 Da poli-heterocíclicos. Anteriormente tais moléculas grandes e complexas que foram caracterizadas simplesmente como lignina como ou como tanino e assumiu ter sido recalcitrantes. Caracterização molecular-nível, no entanto, permite o cálculo do NOSC mesmo essas grandes moléculas complexas. Esses valores NOSC são linearmente correlacionadas com a força motriz termodinâmica, permitindo uma avaliação da qualidade da matéria orgânica disponível para a decomposição, que, em muitos casos, revela que estas moléculas complexas podem ser bacteriana degradável, mesmo sob as condições anóxica que prevalecem nas zonas húmidas.

Desde que a introdução de O2 permite que a matéria orgânica de quase todos os valores NOSC naturalmente observados para ser decomposto, neste documento, focamos em mudanças na matéria orgânica e proteomics microbiana que possam ser os drivers primários no Pantanal (i.e., sistemas de limitado O2). No entanto, todas as técnicas que iremos discutir podem ser aplicadas a matéria orgânica de qualquer ecossistema. Comumente, medições em massa com base em óptica e análises de fluorescência têm sido utilizadas para avaliar a qualidade de matéria orgânica3,14. Quando usando medições em massa tais como estes, no entanto, detalhes são perdidos como um grande número de moléculas é categorizado juntos em termos genéricos, como humics ou fulvics. As definições destas categorias não são bem restrita e, na verdade, podem variar de estudo para estudo fazendo comparações impossíveis. Além disso, medidas em massa não fornecem os detalhes moleculares necessários para o cálculo da termodinâmica que regem o sistema e aquém, portanto, verdadeiramente, avaliação de qualidade de matéria orgânica15.

Técnicas individuais como Fourier transform íon cíclotron ressonância espectrometria de massa (FTICR-MS), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), cromatografia gasosa (GC-MS) de espectrometria de massa, e fazer de espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) fornece tais detalhes no nível molecular. Enquanto cada uma dessas técnicas apresenta suas próprias limitações, eles também trazem suas próprias forças que podem ser aproveitadas em uma abordagem integrada para alcançar os detalhes moleculares necessários para quantificar a qualidade da matéria orgânica em um rigoroso sentido termodinâmico . GC-MS é útil para a identificação de metabolitos pequenos críticos que são susceptíveis de ter influência proximal em CO2 e a produção de4 CH (por exemplo, glicose, acetato, etc.); no entanto, GC-MS requer verificação contra um padrão e, portanto, é limitada aos já conhecidos compostos presentes no banco de dados impedindo a identificação de novos compostos. Além disso, GC-MS é uma técnica qualitativa semi permitindo inferência sobre as alterações na concentração relativa, mas não fornecendo as informações reais de concentração necessárias para calcular as energias livres de Gibb, por exemplo. Finalmente, GC-MS exige derivatização de moléculas antes da análise, que limita a resolução menor do que o Da ~ 400 compostos e álcoois voláteis são perdidos durante a etapa de secagem.

Unidimensional (1D) 1H estado líquido NMR permite a caracterização altamente quantitativa de metabólitos pequenas (incluindo metabolitos primários peso molecular pequeno e voláteis como álcoois, acetato, acetona, formiato, piruvato, ácido succínico, ácidos graxos de cadeia curta, bem como uma variedade de carboidratos notoriamente ausentes ou comprometidos de métodos baseados em MS) e suas concentrações são particularmente úteis para cálculo dos parâmetros termodinâmicos. Ainda, como GC-MS, 1D NMR de misturas complexas requer padronização em relação a um banco de dados e, portanto, sozinho não permite a fácil identificação de novos compostos que são susceptíveis de ser abundante em complexos ecossistemas naturais e em constante mudanças. Além disso, NMR é menos sensível do que as técnicas baseadas em MS e, portanto, de perfil quantitativo metabólito é conseguida apenas acima de 1 µM, usando sistemas de NMR equipados com hélio-refrigeração frio-sondas. Não muito apreciado, algum frio NMR-sondas são sal-tolerante e permitam análise ambiental mistura na presença de concentrações milimolar de sal quando usado em menor diâmetro (diâmetro exterior de < 3 mm) tubos de amostra16. No entanto, uma outra complicação de NMR é que quantidades elevadas de paramagnéticos metais e minerais (por exemplo, Fe e Mn acima de 1-3 wt %), que pode ser abundante em solos de terra firme, pode ampliar características espectrais e complicar a interpretação dos espectros NMR . Usando a extração de fase sólida (SPE) pode auxiliar na interpretação de NMR e baseados em MS metabolomics métodos reduzindo os sais minerais e aumentando a qualidade espectral.

FTICR-MS por injecção directa é uma técnica altamente sensível capaz de detectar a dezenas de milhares de metabólitos de uma única amostra, mas não captura os metabolitos pequenos críticos como acetato, piruvato e succinato e é notoriamente difícil de Use para açúcares e outros carboidratos17, nem fornecer informações quantitativas. No entanto, ao contrário de outras técnicas, FTICR-MS é excelente em identificar e atribuir a fórmula molecular de novos compostos e, portanto, identifica o maior número de compostos, fornecendo informações moleculares mais do que qualquer das outras técnicas descritas. Isso é útil, porque a informação molecular fornecida pelo FTICR-MS (e outras técnicas) pode ser usada para calcular NOSC que está relacionada com a força motriz termodinâmica que regem a probabilidade de certas reações8 e suas tarifas em certas condições7. Além disso, pelo acoplamento FTICR-MS com técnicas de separação, tais como LC juntamente com tandem MS, informações quantitativas estruturais podem ser alcançadas, compensando algumas das desvantagens desta técnica. LC-MS é útil para identificar compostos lipídicos, como e outros metabolitos que não são bem caracterizados por qualquer um dos outros métodos. Acoplamento FTICR de LC-MS ou LC-MS com um coletor de fração e coletando frações de incógnitas específicas de interesse para a elucidação estrutural por estado de líquido bidimensional (2D) NMR é a situação ideal para identificação e quantificação dos compostos desconhecidos18 ,19. No entanto, este é um passo muito demorado que poderia ser usado se e quando necessário. Tomadas individualmente, cada uma dessas técnicas fornecem um instantâneo diferente da matéria orgânica, e integrando-os, nós pode alcançar uma compreensão mais completa do que usando qualquer uma das técnicas isoladamente.

Enquanto as considerações termodinâmicas definir as restrições de finais sobre quais transformações são possíveis em um sistema, decomposição de matéria orgânica é mediada por microorganismos cujas actividades enzimáticas controlam taxas de reação. Assim, entender completamente os controles na decomposição de matéria orgânica e, finalmente, a produção de gás (CO2 e CH4) estufa de zonas húmidas exige uma abordagem integrada omics para caracterizar as atividades da enzima microbiana, bem como os metabólitos. Neste artigo, descrevemos um método para a realização de uma análise abrangente de uma única amostra, utilizando uma abordagem sequencial que resulta em uma análise totalmente emparelhada. Esta abordagem expande o metabolito, proteína e protocolo de extração (mplexas) de lipídios na qual proteomics foi acoplado com GC-MS e LC-MS20 para identificar pequenos metabólitos, proteínas e lipídios, incorporando informações quantitativas metabólito através NMR e identificação dos maiores metabólitos secundários através de FTICR-Sra. ligeiramente diferente do mplexas, começamos o protocolo com uma extração de água e depois uso sequencial extração com solventes não-polares cada vez mais. Todas as extrações são feitas em uma única amostra que conserva a amostra quando volumes são limitados ou difíceis de obter e diminui o erro experimental introduzido através da variação entre alíquotas de matrizes de amostra heterogênea (por exemplo, o solo e turfa) ou diferenças nas condições de armazenamento e duração.

Finalmente, pelo acoplamento das análises de OM com proteomics análises da comunidade microbiana, podemos construir redes metabólicas que descrevem os caminhos e a transformação da decomposição de matéria orgânica. Isto permite-nos testar hipóteses específicas sobre como as perturbações ao sistema influenciará final de CO2 e a produção de4 CH através de alteração para os substratos orgânicos disponíveis, aceitadores de electrões e as comunidades microbianas mediando as reações através da atividade de catalisadores de enzima.

O objetivo geral deste método é fornecer um protocolo único de taxa de transferência para a análise de metabólitos, lipídios e proteínas microbianas de uma única amostra, criando um conjunto de dados totalmente pareado para a construção de redes metabólicas enquanto erros analíticos a restrição .

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Protocol

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1. sequencial extração de matéria orgânica do solo, sedimentos ou turfa

  1. Coletar o solo, sedimentos ou turfa através do dielétrico e dividir os núcleos de acordo com a hipótese que está sendo testado (por exemplo, profundidade). Loja de amostras em politetrafluoretileno revestido recipientes e congelam a-80 ° C para armazenamento antes da análise.
    Nota: Aproximadamente 25 mg C é necessária para este protocolo. Para turfa (normalmente 45% C), 50 mg de turfa seca é necessária. Maiores quantidades de amostra podem ser necessária para baixas amostras orgânicas como solos minerais ou florestais planaltos dependendo o C (até 5 g) de conteúdo. Extração com solventes orgânicos, atraiem qualquer polietileno glicol (PEG) para os extratos, o que afetarão negativamente a ionização durante a etapa de 2.4, é importante evitar permitindo amostras entrar em contato com o plástico em qualquer ponto durante a coleta, armazenamento ou extração.
  2. Quando estiver pronto para analisar as amostras, congelar seca até peso constante e, em seguida, moer as amostras em um moinho de esfera de alta velocidade usando bolas de moagem de aço inoxidável para homogeneizar e terminar qualquer agregados.
    Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e o material armazenado a-80 ° C.
  3. Usando um utensílio de aço inoxidável de etanol-lavado, alíquota 50 mg de cada uma das amostras secas dentro dos frascos de vidro de 2ml individuais. Estas amostras serão sequencialmente extraídas usando uma série de solventes para extrair consecutivamente metabolitos cada vez mais não-polares de cada amostra. Adicionar 1 mL de água destilada, libertos (H2O) para cada amostra, tampar os frascos e agitar durante 2 h em uma tabela de agitador.
  4. Após agitação permitir as soluções repousar à temperatura ambiente (RT) por 20 min, em seguida, centrifugar 15.000 x g por 30 min, decantar e salvar o sobrenadante de cada um.
    Nota: Estas soluções serão injetadas para o FTICR-MS por injeção direta.
  5. Conduta uma extração Folch21 (também conhecido como mplexas20) sobre o agora água resíduos extraídos, repetindo as etapas 1.3 e 1.4 substituindo 1 mL de a-20 ° C mistura de clorofórmio: metanol de 4:3 para a água na etapa 1.3.
    Cuidado: Clorofórmio e metanol são altamente inflamáveis e tóxicos. Use equipamento de protecção adequado (EPI) para evitar o contacto com a pele e evitar chama aberta.
  6. Separe com cuidado os dois resultando solvente camadas, que serão visualmente diferenciável, para uma análise separada por FTICR-MS, por meio de uma separação de funil ou simplesmente remover a camada superior pipetando cuidado.
    Nota: A fração contendo clorofórmio será no fundo enquanto a fração contendo metanol é menos densa e estará no topo.
  7. Dilua o extrato clorofórmio (passo 1.6) 1:1 no metanol e o extrato de água (etapa 1.4) 2:1 no metanol para melhorar a eficiência de ionização (ESI) electrospray para FTICR-MS por injeção direta.
    Nota: A fração contendo metanol da etapa 1.7 não precisa ser diluído em metanol. A camada de metanol será executada por injecção directa sobre a FTICR-MS.

Análise de 2.FTICR-MS

  1. Calibrar o espectrômetro FTICR injetando diretamente 100 µ l de uma solução de ajuste (ver Tabela de materiais) abrangendo uma gama de massa de aproximadamente 100-1.300 para o FTICR-MS.
  2. Preparar o Suwannee River Fulvic ácido padrão (veja a Tabela de materiais), fazendo uma 1 mg mL-1 de solução em água ultrapura filtrada e em seguida, diluindo a solução resultante de 20 µ g mL-1 em metanol.
  3. Direto injeta 23 µ l desta solução final à fonte ESI acoplada ao espectrômetro a FTICR através de uma bomba de seringa, definida como um caudal de 3,0 μL min-1. Definir a tensão de agulha para +4.4 kV, Q1 a 150 m/z e vidro capilar a 180 ° C. Inspecione os espectros resultantes usando o software de análise (consulte a Tabela de materiais) para confirmar a qualidade dos dados.
  4. Use metanol de grau HPLC antes de executar amostras e em toda a amostragem para monitorar reporte. Introduza 23 μL de cada extrato através de injeção direta à fonte ESI acoplada ao espectrômetro a FTICR através de uma bomba de seringa, definida como um caudal de 3,0 μL min-1. Definir a tensão de agulha para +4.4 kV, Q1 a 150 m/z e vidro capilar a 180 ° C.
  5. Ajuste o tempo de acumulação de iões (IAT) para cada amostra ou grupo de amostras para contabilizar a variação na concentração de C. Valores típicos estão entre as varreduras de 0.1 a 0.3 s. 144 recolher para cada amostra, média, os exames e em seguida realizar uma calibração interna usando homóloga CH2 (ou seja, 14 Da separação) série.
    Nota: Após a análise de FTICR-MS, a decisão pode ser feita também combinar a água e frações metanol extraído a fim de racionalizar as etapas restantes ou as frações podem ser mantidas separadas em toda as etapas subsequentes. As vantagens e desvantagens de cada abordagem são descritas detalhadamente na discussão. Se fazê-lo, combine a água e frações extraídas por meio de metanol.
  6. Seque usando um concentrador de extratos e salvar o restante dos extratos (~ 1 mL) para subsequente GC-MS (água, metanol ou água + metanol), LC-MS (clorofórmio) e análise de NMR (água + metanol).
    Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e o material armazenado a-20 ° C.

3. processamento de dados FTICR-MS

  1. Co alinhe todas as listas de pico de amostra para o dataset inteiro para reduzir os deslocamentos em massa e padronizar as atribuições de pico usando Formularity software22 à frente de atribuição de fórmula.
  2. Use o software de Formularity22 para atribuir a fórmula molecular usando um sinal à relação de ruído superior a 7, massa medição erro < 1 ppm e permitindo que C, H, O, N, S e P, excluindo todos os outros elementos.
  3. Se várias fórmulas de candidato são retornadas para uma determinada massa (frequentes acima Da 500) impor restrições consistentes com o material a ser amostrado. Por exemplo, em turfa, restrições típicas incluem: erro de massa mais baixo, menor número de heteroátomos (N, S, P), e quando presentes, P deve ser na forma oxidada (ou seja, deve haver pelo menos 4 átomos de O para cada átomo de P na fórmula).

4. química derivatização para GC-MS

  1. Prepare as amostras de controle em branco de hexano grau HPLC de frascos de mostruário de GC-MS23. Dissolver 100 mg ésteres metílicos (FAMEs: C8 - C28) tempo de retenção de mistura padrão em 200 µ l de hexano.
  2. Para proteger os grupos carbonila, adicione 20 μL de cloridrato de methoxyamine de-1 mg 30 mL de piridina para cada uma das metanol extratos e água extratos (ou extractos combinados de metanol/água se usando) da etapa 2.6, espaços em branco e fama de amostras de calibração23. Selar os frascos com as tampas.
    Cuidado: Piridina é altamente tóxico e inflamável. Use EPI apropriado para prevenir a pele ou contato de olho e evitar chama aberta. Além disso, a piridina volatilizes no RT, causando a contaminação do ar prejudiciais. Trabalha apenas em espaços bem ventilados sob uma coifa.
  3. Vórtice extrai por 20 s. extratos de Sonicate por 60 s. Em seguida, incube extratos em uma centrífuga a 37 ° C por 90 min a 100 x g.
    Nota: Uma quantidade excessiva de hidratos de carbono ou sais pode causar metabolitos a crystalize após serem secos para baixo. Sonicating amostras de irá ajudar a reconstituir os metabolitos cristalizados no reagente de derivatizing.
  4. Após a incubação, adicionar 80 μL de N-metil - N-(trimetilsilil) trifluoroacetamide com trimetilclorosilano de 1% para cada amostra, vórtice extrai por 20 s. extratos de Sonicate por 60 s e incubar extratos novamente em uma centrífuga a 37 ° C por 30 min a 100 x g.
  5. Extratos de cool para RT (20-24 ° C), depois transferir para frascos de mostruário de GC-MS.

5. análise por CG-em

  1. Ajustar e calibrar o MS de acordo com as recomendações do fornecedor (ver Tabela de materiais) antes da análise para certificar-se da máquina leia MS dados corretamente. Verifique a pressão do gás hélio está dentro da tolerância especificada.
  2. Metabólitos polares separados em uma coluna de GC (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Defina o protocolo de temperatura do forno da seguinte maneira: (1) inicial temperatura de 60 ° C por 1 min, (2) rampa a 325 ° C, a uma taxa de 10 ° C min-1e (3) Segure a 325 ° C por 5 min.
  3. Analisar extractos usando um GC acoplado a um quadrupolo único MS. Set temperatura de Porto de injeção para uma constante e 250 ° C. Injete 1 μL de cada extrato pyrazole no modo splitless.

6. processamento de dados GC-MS

  1. Inspecione todos os arquivos de dados para garantir que eles foram capturados corretamente. Prestar atenção ao potenciais turnos em relação a tempos de retenção padrão interno e intensidades para confirmar que os dados foi capturados consistentemente ao longo da análise.
  2. Converta o formato de dados do fornecedor específico MS para um formato geral de MS se necessário. Arquivos de dados brutos do processo usando MetaboliteDetector24 calibrando os índices de retenção baseados nos padrões internos de fama. Depois de alinhar os tempos de retenção de todos os arquivos de dados, continuam com deconvolução e, finalmente, a identificação do metabólito combinando os índices de retenção e espectros de GC-MS contra o FiehnLib polar metabólito biblioteca25.
  3. Verifica o restante metabólitos não identificados contra a biblioteca NIST14 GC-MS usando a correspondência de espectral. Valide as identificações individualmente para eliminar falsas identificações e reduzir erros de deconvolução.

7. análise de NMR estado líquido

  1. Diluir o restante dos extratos de água (~ 300 µ l) de 10% (vol/vol) com um padrão interno 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 de 5 mM. Alternativamente, combine água e metanol extrai da etapa 1 resubstitute então na água. Ao fazê-lo no entanto, alguns dos compostos voláteis podem ser perdidos durante a etapa de liofilização. Volumes de amostra final típicos estão na faixa de 180-300 µ l.
  2. Transfira a mistura para um tubo de vidro de borosilicato NMR alta qualidade 3 mm diâmetro externo (OD).
  3. Colete espectros usando um espectrômetro de NMR (idealmente pelo menos 600 MHz), equipado com uma sonda de frio sal tolerante com ressonância triplo de 5 mm e um pré-amplificador de frio-carbono.
  4. Colete espectros de 1H 1D usando uma 1 D nuclear Overhauser efeito espectroscopia (NOESY) presaturation experiência a 298 K, com um tempo de aquisição de s 4, 1.5 s reciclar atraso, 65.536 pontos complexos e 512 varreduras.
  5. Colete 2D 1H -13C heteronuclear single-quântica correlação (HSQC) e espectros de correlação total (TOCSY)1H 1H - para ajudar na atribuição de metabolitos e validação.
  6. Processo, atribuir e analisar todos os espectros usando o software de análise de NMR (consulte a Tabela de materiais) para quantificar as intensidades em relação ao padrão interno. Identifica metabólitos combinando informação química de turno, J-acoplamento e intensidade nas amostras contra a biblioteca.
    Nota: A biblioteca é reforçada por padrões metabólito alvo personalizado e adições de metabólito feitas em uma base regular. O protocolo pode ser interrompido neste ponto e o material armazenado a-20 ° C.

8. LC-MS Lipidomics análise

  1. Rewet o extrato de clorofórmio secadas gerado durante a etapa 2.5 com 200 μL de metanol.
  2. Injecte 10 μL de cada extrato em um cromatógrafo líquido ultra desempenho acoplado a um espectrômetro de massa Orbitrap usando uma fase reversa cobrada coluna de superfície híbrida (tamanho de partícula do 3,0 mm × 150 mm × 1.7 μm). Definir um gradiente de 34-min (fase móvel r: acetonitrilo/H2O (40: 60), contendo acetato de amônio 10 mM; fase móvel b: acetonitrilo/isopropanol (10:90) contendo acetato de amônio 10 mM) com um caudal de 250 µ l/min. utilização positiva e negativa modos de ionização com dissociação de colisão de alta energia e colisão induzida por dissociação.
    Cuidado: Acetonitrilo é um irritante respiratório, pele e olhos. Use os EPI adequado. Além disso, acetonitrilo é combustível. Não deixe de entrar em contato com agentes oxidantes, gases tóxicos podem ser produzidos durante a queima.
  3. Carregar os arquivos de dados raw LC-MS/MS em líquido junto com o arquivo de destino (ou seja, lista de espécies de lipídios > 25.000) para o modo de ionização respectivos (positivo ou negativo). Processe o arquivo raw. Manualmente valide as identificações resultantes examinando os espectros de MS/MS para a presença de iões de diagnóstico, se a massa de íons de fragmento correspondente aplicável (por exemplo, cadeias acilo gordo), separação isotópica, erro de ppm de precursores e o tempo de retenção. Exporte a lista resultante de lipídios confiàvel identificados como um arquivo de TSV.
    Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e armazenar o material a-20 ° C.

9. análise proteômica

  1. Extrai as proteínas de acordo com o protocolo de mplexas20 do restante da fase metanol resultantes da etapa 2.4, lavando o extrato com 20 vezes o volume do extrato de metanol adicionais frio (-20 ° C).
  2. Use a 1 mL/50 mg baseada em sílica adsorvente (ver Tabela de materiais) para colunas de SPE C18 condição com 3 mL de metanol, 2 mL de 0,1% ácido trifluoroacético (TFA) na água, seguido pela adição do extrato de passo 9.1 a uma taxa não superior a 1 mL/min.
  3. Após a adição da amostra, lavar a coluna com 4 mL de água de 95:4.9:0.1: acetonitrile:TFA e, em seguida, deixe-a secar. Coloque um tubo de 1,5 mL coleção sob a coluna SPE e eluir a amostra com 1 mL de metanol: água: TFA do 80:19.9:0.1.
  4. Concentrado de extratos de 100 µ l sob vácuo-assistida congelam secador, em seguida medir a concentração de proteína por bicinchoninic ácido (BCA) ensaio colorimetric26 no comprimento de onda de 562 nm.
  5. Centrífuga extrai a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Descartar o sobrenadante resultante e a pelota restante sob vácuo a seco por 5 min. resuspenda o pellet de proteína em água a uma concentração final de 0,1 µ g peptídeo por µ l.
  6. Adicionar ditiotreitol para uma concentração final de 5 mM e incubar a 60 ° C durante 30 min. Diluir 10-fold com solução de ureia 100mm NH4HCO38 M e incubar a 37 ° C por 3 h na presença de 1 mM CaCl2 e porcina tripsina a um 01:50 enzima proteína relação.
    Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e armazenar o material a-20 ° C.
  7. Extratos separadas através de cromatografia líquida usando um gradiente exponencial de um 0,1% de ácido fórmico na fase móvel água (A) e um 0,1% de ácido fórmico na fase móvel acetonitrila (B) para kpsi 10 e 500 nL min-1.
  8. Introduza o eluente resultante em um espectrômetro de massa acoplado ESI coletando espectros de 400-2.000 m/z com 100.000 resolução em m/z 400 em um espectrômetro de massa Orbitrap linear ion trap (LTQ).
  9. Converta arquivos RAW espectros para o formato de mzML usando msConvert ou ProteoWizard, aceitando todos os parâmetros padrão. Use a ferramenta de pesquisa de banco de dados universal MSGFPlus para pesquisar resultante proteomes contra um banco de dados da proteína alvo de sequências de proteínas, prevista a partir de genomas de relevante metagenome montado.
  10. Acrescentar os contaminantes comuns (por exemplo, tripsina, queratina, albumina) e remover todas as sequências de proteínas exatamente duplicado para melhorar as estatísticas do jogo do peptide-de-massa-espectro. Avalie os escores de probabilidade espectral MSGF resultantes para determinar qual combinação de peptídeo-de-massa-espectro é melhor. Use o Q-valor de MSGFPlus para filtrar a pilha de dados inteira à taxa de 1% falsa descoberta (FDR).

10. Metabolomics análise e construção de rede metabólica

  1. Compile todos os fórmula molecular de metabólito identificados nas etapas 3, 6, 7 e 8 em um único banco de dados de metabólitos presentes nas amostras. Combine estes metabolitos com as enzima (CE) da Comissão ou homologia KEGG (KO) números de enzimas identificadas na etapa 9. Pesquise Este dataset combinada contra banco de27 KEGG, seção de vias metabólicas.
  2. Manualmente avalie resultados para identificar caminhos mais prováveis e integrar em um modelo metabólico.

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Representative Results

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Realizamos o protocolo descrito análise complementar e comparado a turfa com profundidade no pântano S1 no site Spruce e turfeiras resposta sob mudando ambientes (SPRUCE) em Minnesota, EUA. Estes resultados são comparados aos de um pântano de permafrost e fen do norte da Suécia, para mostrar como sites podem variar em atividades metabólito e enzima. Nós identificamos 3.312 enzimas na análise proteômica. Uma análise das atividades enzimas com profundidade revela que o número de enzimas declina acentuadamente entre 15cm e 45cm no pântano abeto (Figura 1).

Enquanto os resultados de proteomics indicam que as proteínas são expressas, os dados metabólicos mostram quais reações ocorrem na verdade. Em geral, identificamos 67.040 metabolitos (incluindo lipídios) em todas as amostras de turfa da combinação de FTICR-MS, NMR, GC-MS e análises de LC-MS. Destes, fomos capazes de atribuir a fórmula molecular para 15.385 compostos (Figura 2). Os dados metabólicos combinados abrange uma gama de Estados de oxidação, massas e classes de compostos.

Isto normalmente é visualizado através da utilização de um diagrama de van Krevelen, em que os rácios de H/C atômicos da fórmula identificado são plotados contra sua atômica/c rácios28. Nós incluímos uma nova dimensão para o típico formato 2D, retratando NOSC através da cor de codificação os símbolos que representam a fórmula individual (Figura 3 e Figura 4). Com o aumento da profundidade no pântano abeto vermelho, há um aumento no número total de metabólitos secundários grandes identificado por FTICR-MS, especificamente em altamente condensado (inferior esquerdo da trama van Krevelen) e hidrogenados fórmulas (topo da trama) (Figura 4 ). Sobre as mesmas profundidades há uma diminuição do número de pequenos compostos altamente energéticos, identificado por GC-MS e em lipídeos (Figura 5). Isto poderia sugerir que os lipídios e pequenos metabólitos são consumidos em turfa a superfície antes de atingir as profundezas mais profundas ou que as taxas de decomposição em turfa profunda são mais rápidas do que na superfície tais que descendente compostos advecting são consumidos rapidamente. Diferenciação entre estas duas hipóteses concorrentes requer uma compreensão do processo-nível do ciclismo no site C. Tal compreensão nível de processo só pode ser adquirida pelo acoplamento da metabolómica e proteomics datasets. Podemos fazer isso, Cruz-Validando o combinado FTICR-MS, GC-MS, LC-MS, e NMR identificados metabólitos contra o banco de dados KEGG. Ao fazê-lo, encontramos que os compostos identificados são envolvidas vias em comum metabólicas como o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), glicólise e metabolismo do açúcar. Desde que metabólitos individuais podem estar envolvidos na confirmação de caminhos múltiplos com as enzimas aumenta nossa confiança na atribuição de vias (Figura 6).

Através deste mapeamento, encontramos provas de metabolismo de sacarose e amido em turfa a superfície, enquanto nas profundezas mais profundas piruvato e outros produtos de fermentação constroem (Figura 6). Estes resultados são consistentes com a primeira hipótese que açúcares e outros metabólitos energéticos são degradados em turfa a superfície e não atingem as profundezas mais profundas de turfa. Como pode ser visto na Figura 5, açúcares (NOSC = 0) e aminoácidos (0 < NOSC < 1) são consumidos na turfa em superfície, enquanto lipídios (-2 < NOSC < -1) parecem acumular-se com profundidade. Isto é consistente com as expectativas com base nos valores NOSC que maior NOSC compostos são mais facilmente degradados enquanto baixa NOSC compostos persistem na altamente anaeróbias (isto é, chá-limitada) condições de turfa de subsuperfície. Esta abordagem também com sucesso distingue entre tipos de solos de diferentes ambientes. Por exemplo, a matéria orgânica do solo de turfeiras boreal aparenta ser em termos de composição diferente do permafrost turfeiras, bem como dentro fen e pântano dentro da região de permafrost. Estes resultados são consistentes com um estudo anterior que mostrou diferenças em geoquímica local entre estes habitats29, sugerindo que geoquímica do local tem um grande efeito na degradação microbiana de C abaixo do solo.

Figure 1
Figura 1 : Análise proteômica indica estratificação de profundidade forte no número de enzimas. As barras indicam as médias e as barras de erro indicam um desvio padrão de abundâncias. Isto sugere que os microrganismos são mais ativos na superfície de turfa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : O número de compostos identificados por cada técnica na superfície turfa (< 30 cm) de cada habitat, bem como o médio (45cm) e turfa (87 cm) de profundidade de abeto pântano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : The van Krevelen diagrama (H/C atômica vs s/c de cada identificado fórmula molecular) para a superfície (15 cm) SPRUCE atolar profundidade para demonstrar a cobertura de compostos caracterizada por cada técnica. FTICR-MS permite-nos identificar o maior número de compostos (pequenos círculos), enquanto o GC-MS (triângulos) é bom para diferenciar e identificar açúcares (H/C = 2 e s/c = 1). Espectroscopia RMN (praças) fornece informações quantitativas sobre energeticamente importantes Compostos como açúcares, aminoácidos, piruvato, etc. LC-MS (diamantes) fornece informações sobre lipídios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : The van Krevelen diagrama (atômica H/C vs s/c de cada identificado fórmula molecular) para o fundo (87 cm) SPRUCE atolar profundidade para demonstrar a cobertura de compostos caracterizada por cada técnica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : A fração relativa de diferentes classes químicas identificadas através as várias técnicas nas diferentes profundidades. Bares são plotados como médias para cada profundidade ± um desvio padrão. Classes plotadas incluem aminoácidos, esfingolipídeos (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diacilglicerol (DG), triglicérides (TG) e açúcares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 6
Figura 6 : Combinando resultados para criar uma rede metabólica. Distribuições de profundidade dos metabolitos identificados por NMR (um) e GC-MS (b) e um mapa metabólico simplificado (c) mostrando um seleto número de transformações identificadas no pântano de abeto. Caixas verdes indicam metabolitos que diminuem com caixas de profundidade, marrom indicam metabolitos que aumentam com a profundidade. Setas verdes conexão indicam enzima identificada em nosso dataset que medeiam a transformação indicada (números de CE de enzima indicados ao lado de setas). Cinza conexão setas indicam transformações para que as enzimas não foram identificadas em nosso dataset. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O single-produção, fluxo de análise totalmente acoplados usado para caracterizar metabólitos e o proteome fornece insights sobre os caminhos pelos qual C ciclismo está ocorrendo em um complexo ecossistema. Solo e a turfa são matrizes heterogêneas, e, portanto, uma das etapas críticas desse método ocorre nos primeiros passos no sentido de garantir que a partida de turfa ou material de solo é altamente homogênea. É preferível moer a amostra, bem como agregados podem reduzir a eficiência de extração. Este é um problema particular para agregados de solos e solos com baixa C e alto conteúdo mineral que pode exigir o uso de um moinho de bola de aço inoxidável para homogeneizar adequadamente. Porque a heterogeneidade espacial dos solos e turfa dentro de um site experimental pode ser alta, réplicas biológicas são altamente recomendadas.

Este método utiliza três solventes: água, metanol e clorofórmio, que influenciar os tipos de compostos, é possível extrair. Em princípio, este método de extração sequencial deve solubilizar compostos cobrindo uma escala larga de polaridade. No entanto, estes solventes não são otimizados para extracção de complexos organo-mineral ou complexos altamente estabilizados. se tais compostos são de interesse, solventes mais duras, tais como ácidos fortes e bases são preferidos, mas os processos de extração mais duros podem alterar a química das amostras. Incorporar os solventes no final da sequência de extração pode minimizar esse efeito. Além disso, clorofórmio irá inativar solo clinicamente importante e turfa bactérias e patógenos virais e outros agentes biológicos patogénicos causadores de doenças, dissolvendo os lipídios de membrana celular. Assim, incorporar o clorofórmio no protocolo de extração reduzirá os riscos envolvidos em estudos de biologia de amostras potencialmente infectados por patógenos de diferentes regiões do mundo. Se há preocupações sobre células microbianas mortas, detritos ou partículas em extração, os extratos de filtragem através de um filtro de fibra de vidro 0,2 µm é recomendado.

Para agilizar o processo, a água e o metanol extratos poderiam ser combinados para análise de GC-MS durante a etapa 4.1. No entanto, esses extratos devem permanecer separados para análise de FTICR-MS, devido a problemas de eficiência de ionização com a fonte ESI. A vantagem de operar o extracto combinado com o GC-MS é que serão identificados mais metabólitos (abrangendo uma gama maior de polaridade). A desvantagem de combinar os extractos neste ponto é que um dos principais metabólitos importantes na transformação microbiana da matéria orgânica é metanol. Vestígios de metanol permanecerá sempre na amostra combinada, mesmo após a secagem, então se o metanol é um metabólito de interesse, o extrato de água deve ser executado separadamente. Ter bons controles com nenhum analitos também irá ajudar na identificação de potencial contaminação nas amostras.

Na etapa 7.1 da preparação dos extractos para análise de NMR, como a análise de GC-MS, também o extrato de água sozinho ou combinada água e extratos de metanol podem ser usados. As desvantagens de se fazer isso são semelhantes aos enumerados no parágrafo anterior. A vantagem de combinar os extratos de metanol e água é que alguns dos metabolitos menos polares que são solubilizados na fração metanol serão identificado. No entanto, devido a etapa de liofilização, muitos compostos mais voláteis serão perdidos. Esta é uma desvantagem particular, se a quantificação dos ácidos graxos voláteis é um componente crítico do experimento.

Neste procedimento para a identificação de proteômica, único totalmente tryptic peptídeos são pesquisados, assim endógeno peptidase atividade e fragmentações de código-fonte serão perdidas. Por outro lado, metionina oxidada pode ser considerada como uma modificação borne-translational para os candidatos do peptide essa modificação ocorre geralmente durante o processamento e manuseamento de amostragem. Quantificação de enzimas usando áreas de eluição de peptídeo pode ser feita, mas está fora do escopo deste projeto.

Muitos avanços recentes na análise dos parâmetros microbianos e NOM estão fornecendo uma grande variedade de técnicas para a compreensão de C orgânico ciclismo. Combinando essas técnicas em um único protocolo simplificado, ganhamos uma novela vista dos processos que estão ocorrendo. Acoplamento a análise proteômica com as análises metabólicas fornece evidências corroborativas que uma reação está ocorrendo realmente convincentes. Análise de metabólica é limitado em que nos informa quais metabólitos são maior ou menor concentração nas comparações entre sites ou após um efeito de tratamento, mas não consegue discernir as causas para essas alterações. Por exemplo, identificamos as concentrações de açúcar em declínio com profundidade no pântano, mas sem maiores informações não está claro se o declínio com profundidade é devido a entradas lentas ou rápida degradação em turfa profunda. Análise da proteoma e a expressão da enzima em declínio com profundidade nos permite rejeitar a segunda hipótese. Prefiro nossos resultados são consistentes com degradação do açúcar rápido nas entradas turfa superfície limitante para as profundezas mais profundas. Esses insights particulares são apenas possível quando todas as técnicas são consideradas em conjunto como cada um oferece uma única, mas uma peça fundamental do puzzle. de ciclismo C

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer ajuda a recolha de amostras de turfa J.P. Chanton, J.E. Kostka e Kolton M.M. Partes deste trabalho foram conduzidos do laboratório de ciências ambientais Molecular, um DOE escritório de ciência instalação patrocinada pelo escritório de biológicos e pesquisa ambiental. PNNL é operado pela Battelle para o DOE sob contrato DE-AC05-76RL01830. Este trabalho foi apoiado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência e pesquisa do escritório de biológico e ambiental (concede: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE SC0012088 e DE-SC0014416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methoxyamine hydrochloride Sigma Aldrich 226904 derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe  Bruker instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) Agilent AG19091S-433 instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) ThermoFisher instrumentation
2 mL glass vials VWR International 46610-722 sample vials
autosampler vials VWR International 97055-324; 9467671 sample vials
Chloroform VWR International JT9174-3 solvent
Ethanol VWR International BDH67002.400 solvent
methanol VWR International BDH85681.400 solvent
pyridine VWR International BDH67007.400 solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 Sigma Aldrich 178837 standard
C8-C24 fatty acid methyl ester Sigma Aldrich CRM18918 standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide Sigma Aldrich 24589-78-4 standard
Suwanee River Fulvic Acid standard International Humic Substances Society 2S101F standard
trimethylchlorosilane Sigma Aldrich 89595 standard
Tuning Solution Agilent
FTICR-MS analysis software Bruker Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software Pacific Northwest National Laboratory Formularity available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS Agilent Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent Phenomenex (Torrance, CA) Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 VWR International KT897820-0008 NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer  Varian Inova Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3 Chenomx Chenomx NMR Suite NMR software
ultra-performance liquid chromatograph  waters Aquity UPLC H  liquid chromatograph 
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer  ThermoFisher Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer 

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References

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Tfaily, M. M., Wilson, R. M., Brewer, H. M., Chu, R. K., Heyman, H. M., Hoyt, D. W., Kyle, J. E., Purvine, S. O. Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures. J. Vis. Exp. (143), e59035, doi:10.3791/59035 (2019).

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