Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

doi: 10.3791/59035 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Bu iletişim kuralı tek bir üretim için doğal organik madde ve mikrobiyal proteomik farklı ekosistemleri içinde tam olarak eşleştirilmiş karakterizasyonu sonuçlanan tamamlayıcı analitik ve omics teknikleri açıklar. Bu yaklaşım sağlam karşılaştırmalar metabolik yollar ve sera gazı üretim tanımlamak ve çevresel değişimin yanıt tahmin için önemli dönüşümleri tanımlamak için izin verir.

Abstract

Doğal organik madde (NOM) organik bileşikler, tarihsel olarak karakterize etmek zor oldu binlerce son derece karmaşık bir karışımı oluşur. Ancak, NOM ayrışma kaynaklanan sera gazı (karbondioksit [CO2] ve metan [CH4]) üretim termodinamik ve kinetik denetimlere anlamak için bir düzey Moleküler Karakterizasyonu mikrobiyal birleştiğinde Proteom analizleri gereklidir. Ayrıca, iklim ve çevre değişiklikleri doğal ekosistemler, potansiyel olarak organik madde yüzeylerde temini ve dönüşümleri gerçekleştiren mikroorganizmalar etkisi karmaşık etkileşimler üzücü huzursuz bekleniyor. Organik madde, mikrobiyal proteomik ve yollar ve hangi tarafından organik madde decomposed dönüşümleri detaylı Moleküler Karakterizasyonu yönü ve büyüklüğü çevresel değişikliklerin etkisini tahmin etmek gerekli olacaktır. Tek bir örnek kapsamlı metaboliti karakterizasyonu için metodolojik çıkışını direkt enjeksiyon Fourier dönüşümü iyon cyclotron rezonans kütle spektrometresi (FTICR-MS), gaz kromatografi kütle spektrometresi (GC-MS), tarafından bu makalede nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, sıvı kromatografi kütle spektrometresi (LC-MS) ve proteomik analizi. Bu yaklaşım yolları organik madde ayrışma, ortaya çıkan CO2 ve CH4 üretim oranları ve çevre pertürbasyon yanıtlarını çıkarım için istatistiksel güven geliştirir, tam olarak eşleştirilmiş bir veri kümesi oluşturur. Burada peatlands toplanan NOM örnekleri bu yöntem uygulama sonuçları sunmak; Ancak, herhangi bir NOM örnek (Örneğin, turba, ormanlık toprak, deniz çökeller vb.)ilgili protokoldür.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Genel olarak, sulak karbon (C), 529 Pg içerecek şekilde çoğunlukla organik C turba mevduat1içinde gömülü olarak tahmin edilir. Şu anda, böyle peatlands Kuzey Amerika tek başına129 Tg C y-1 iyon bir net C lavabo olarak hareket ederler. Ancak, boşaltma, yangınlar, kuraklık ve sıcak sıcaklıklar gibi çevre rahatsızlık artan C kayıp ile sera gazı içinde kaynaklanan organik madde ayrışma artırarak bu C lavabo ofset olabilir (karbon dioksit [CO2] ve metan [CH4]) üretim1,2. Daha sıcak sıcaklık ya da kurutma makinesi koşulları daha hızlı C ayrışma mikroorganizmalar tarafından teşvik Eğer iklim değişikliği C kaybına. Alternatif olarak, daha yüksek sıcaklık ve hava CO2 konsantrasyonu organik karbon (OC) daha fazla CO2 çekilmek için birincil üretim teşvik edebilir. Ne ölçüde ve ne kadar hızlı o OC CO2 ' ye sonra ayrıştırılır ve CH4 elektron verici yüzeylerde, elektron alıcısı kullanılabilirliğini ve arabuluculuk mikroorganizmaların arasındaki karmaşık etkileşimler bağlıdır dönüştürme. Birçok durumda, mekanizmaları iyi karakterize değildir, böylece onların yanıt-e doğru çevre tedirginlikler iyi kısıtlı değildir ve net sonucu iklim değişikliği, karbon denge peatland ekosistemler üzerinde olacak belirsizdir.

Doğal organik madde (NOM) karmaşık doğası bile NOM karışımları tarihsel zor mevcut organik bileşikler tanımlama yaptı. Son gelişmeler bileşikler bu geleneksel olarak karakterize bir ölçüde inatçı hümik veya Fulvik bileşikler3,4,5kabul edilebilir devam, bizim yetenek ve büyük ölçüde iyileştirilmiştir. Şimdi bu bileşiklerin çoğunun aslında microbially kullanılabilir ve uygun elektron alıcısı (çay) kullanılabilir6,7yapılırsa, çürümüş anlıyoruz. Bir bileşik için karbon (NOSC) nominal oksidasyon durumunu hesaplama bir ölçüsü ayrışma ve gerekli çay enerji verim potansiyeli tahmin için sağlar. Ancak, organik madde7düzey Moleküler Karakterizasyonu gerektirir. NOSC moleküler formülü üzerinden aşağıdaki denklem7hesaplanır: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, z net ücret nerede. NOSC neyin daha yüksek NOSC ile alt NOSC bileşikler azaltılması için giderek daha enerjik çaylar gerektirirken aşağılamak daha kolay bileşiklerdir termodinamik itici kuvvet8ile ilişkilidir. NOSC −2 daha az bileşikler O2, nitrat veya MnIVgibi çaylar verimli bir yüksek enerji gerektiren ve sık meydana gelen tarafından bozulmuş olamaz düşük FeIII gibi çaylar verimli enerji veya7sülfat. Bu su anoksik şartlarda nerede O2 ve diğer yüksek enerji verimli çaylar kıt9 ve bu nedenle bu koşullar altında alt NOSC bileşikler bozulması sulak bulundu önemli bir noktadır thermodynamically sınırlı. Çevre pertürbasyon ekosistem O2 (en enerjik elektron alıcısı), organik yüzeylerde ve elektron alıcısı kullanılabilir duruma değişiklikler etkisi hidrolojik değişiklikleri ile termodinamik durumunu etkileyebilir İlköğretim tarafından üretim ve sıcaklık tarafından daha küçük ölçüde. Homoacetogenesis (yani, asetat üretimi CO2 ve H2) ve hydrogenotrophic methanogenesis () arasında oluşan ticaret-off açısından sulak sistemlerindeki sıcaklık etkileri önemli bir örnek oluşur yani, CH4 üretim CO2 ve H2). Düşük sıcaklıklarda bu sıcak sıcaklıkları CH4 üretim10lehine iken o homoacetogenesis biraz, tercih edilir görünür. CH4 CO211 ve böylece artan üretim CH4 pahasına daha çok daha güçlü bir sera gazı olduğu gibi bu sıcaklık etkisi önemli etkileri iklim, değişen ekosistemler için belgili tanımlık yanıt olabilir CO2 sıcak sıcaklıklarda iklim ısınma ile olumlu bir geri bildirim için katkıda bulunabilir.

Peatlands CO2 genel olarak önemli miktarlarda üretmek ve doğal organik oluşma CH46üzerinden mikrobiyal solunum önemli. Organik Karbon yüzeyler NOSC CO2göreli oranı belirler: CH4 üretilen CO211' e, ama aynı zamanda çünkü karşılaştırıldığında CH4 / daha yüksek ışınımsal zorlama nedeniyle kritik bir parametre olduğu modelleme çabaları bu oran peatlands12C akı tahmin etmek için kritik bir parametre olarak belirledik. Elektron alıcısı CO2dışında olmaması durumunda, bu elektron denge tarafından organik C yüzeylerde NOSC > 0 will ile CO2üretmek gösterilebilir: CH4 > 1, NOSC ile organik C = 0 üretir CO2 ve CH4 ekimolar oranı ve NOSC ile organik C < 1 CO2üretecek: CH4 < 113. OC ayrışma doğal ekosistemler, mikroorganizmalar tarafından aracılı böylece belirli bir bileşik bozulma thermodynamically mümkün olsa bile, bu kinetically ile mikrobiyal enzimlerin ve anoksik şartlarda aktivite ile sınırlıdır Termodinamik sürüş kuvvet (Örneğin, NOSC)7. Şimdiye kadar bu çeşitlilik mevcut bileşiklerin onların karakterizasyonu için farklı tamamlayıcı teknikleri gerektirdiğinden organik madde tam olarak karakterize etmek için zor oldu. Son gelişmeler boşluk kapalı; a maiyet-in analitik teknikler kullanarak organik bileşikler düzey Moleküler Karakterizasyonu sağlayan ve glikoz en fazla 800 Da poli-heterocycles gibi küçük birincil metabolitleri gelen bazı durumlarda miktar büyük bir dizi analiz edebilirsiniz. Daha önce böyle büyük karmaşık moleküller sadece kadar lignin gibi veya tanen benzeri ve inatçı olduğu kabul edilen karakterize. Düzey Moleküler Karakterizasyonu, ancak, hatta bu büyük karmaşık molekülleri NOSC hesaplanmasında sağlar. Bu NOSC değerler doğrusal olarak bırakmak için organik madde ki birçok durumda bu karmaşık moleküller aslında microbially olabilir ortaya koymaktadır ayrıştırma için mevcut kalitesini bir değerlendirmesini termodinamik itici güç ile ilişkili anoksik şartlarda bile sulak hakim parçalanabilir.

O2 giriş çürümüş için neredeyse tüm değerlerin doğal olarak gözlenen NOSC organik madde sağlar beri burada organik madde ve sulak alan (Örneğin, birincil sürücüleri olması muhtemeldir mikrobiyal proteomik değişiklikler ele sınırlı O2) sistemleri. Ancak, biz tartışacağız tüm teknikleri için organik madde herhangi bir ekosistem uygulanabilir. Yaygın, optik dayalı toplu ölçüleri ve floresan analizleri organik madde kalite3,14değerlendirmek için kullanılmaktadır. Çok sayıda molekülleri birlikte humics veya fulvics gibi genel şartlar altında kategorize edilir gibi toplu ölçümleri bu gibi kullanırken, ancak, ince detayları kaybolur. Bu kategoriler tanımların iyi kısıtlı değildir ve aslında, çalışma çalışma yapma karşılaştırmalar imkansız değişiklik gösterebilir. Ayrıca, toplu ölçümler değil sistem yöneten termodinamik hesaplamak için gerekli moleküler ayrıntı sağlar ve bu nedenle gerçekten organik madde kalite15değerlendirirken kısa düşmek.

İyon cyclotron rezonans kütle spektrometresi (FTICR-MS), nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi bireysel teknikleri gibi Fourier dönüşümü, gaz kromatografi kütle spektrometresi (GC-MS) ve sıvı kromatografi kütle spektrometresi (LC-MS) yapmak Bu moleküler düzeyde ayrıntı sağlar. Bu tekniklerin herbirini kendi sınırlamaları sunuyor olsa da, onlar da ince moleküler detay titiz termodinamik duygusu kalitesinde organik madde miktarının için gerekli elde etmek için entegre bir yaklaşım içinde kaldıraçlı kendi güçlü getirmek . GC-MS CO2 ve CH4 üretim (Örneğin, glikoz, asetat, vb); proksimal etkisi olması muhtemeldir kritik küçük metabolitleri tanımlamak için yararlıdır Ancak, GC-MS karşı bir standart doğrulama gerektirir ve bu nedenle zaten bilinen bileşikler kimliği roman bileşiklerin önlenmesi veritabanında mevcut sınırlıdır. Ayrıca, GC-MS kesmesi değişikliklerle ilgili göreli konsantrasyonlarda izin ama gerçek konsantrasyon Gibb'ın serbest enerjileri örneğin hesaplamak için gerekli bilgileri sağlamak değil yarı nitel bir teknik olduğunu. Son olarak, GC-MS derivatization bileşikler ~ 400 Da küçük çözünürlüklü sınırlayan analiz önce moleküllerin gerektirir ve uçucu alkoller kurutma adımı sırasında kaybolur.

Tek boyutlu (1D) 1H sıvı devlet NMR (birincil küçük molekül ağırlıklı metabolitleri ve tenler alkoller, asetat, aseton, format, pyruvate, süksinat, gibi gibi küçük metabolitleri son derece nicel karakterizasyonu sağlar kısa zincirli yağ asitleri gibi karbonhidrat Rootkitler yok ya da güvenliği aşılmış MS tabanlı yöntemleri bir dizi) ve onların konsantrasyonları termodinamik parametreler hesaplamak için özellikle yararlıdır. Henüz, GC-MS gibi karmaşık karışımlar 1D NMR standardizasyon göre bir veritabanı gerektirir ve bu nedenle yalnız kolay kimliği roman bileşiklerin karmaşık doğal ve değişen ekosistemler bol olması muhtemeldir izin vermez. Ayrıca, NMR MS tabanlı teknikleri daha az hassas olduğunu ve bu nedenle, nicel metaboliti profil oluşturma yukarıda sadece 1 µM helyum soğutmalı soğuk-probları ile donatılmış NMR sistemleri kullanılarak elde edilir. Yaygın olarak takdir, bazı NMR soğuk-sonda tuz dayanıklı ve çevre karışımı analizi daha küçük çapı (< 3 mm dış çap) örnek tüpler16içinde kullanıldığında millimolar tuz konsantrasyonları huzurunda izin. Ancak, bir başka komplikasyon NMR böyle paramagnetic metaller ve mineraller yüksek miktarda (Örneğin, Fe ve Mn upland topraklarda bol olabilir, 1-3 wt %), spektral özellikleri genişletmek ve karmaşık hale NMR spectra yorumlanması . Katı faz ayıklama (SPE) kullanarak yapabilirsiniz Yardımcısı NMR ve MS tabanlı metabolomics yorumlanması içinde mineral tuzları azaltılması ve spektral kalite artırma yöntemleri.

FTICR-MS direkt enjeksiyon tarafından son derece hassas teknik tek bir örnek üzerinden metabolitleri, on binlerce algılama yeteneğine sahip, ancak asetat, pyruvate ve süksinat gibi kritik küçük metabolitleri yakalamaz ve Rootkitler zor şeker ve diğer karbonhidratlar17için kullanın, ne de nicel bilgi sağlamamaktadır. Ancak, diğer teknikleri aksine FTICR-MS belirlenmesi ve moleküler formülü roman bileşikler için atama, üstünlük sağladı ve bu nedenle bileşikler açıklanan diğer tekniklerden herhangi birini daha fazla moleküler bilgi sağlayan en büyük numarasını tanımlar. Bu yararlıdır, çünkü moleküler bilgi FTICR-MS (ve diğer teknikleri) tarafından sağlanan bazı tepkiler8 ve onların oranları belirli olasılığını yöneten termodinamik itici güç ile ilgili NOSC hesaplamak için kullanılabilir koşullar7. Ayrıca, LC tandem MS, birlikte gibi ayırma teknikleri ile FTICR-MS kaplin nicel yapısal bilgiler, bu teknik dezavantajları mahsup elde edilebilir. LC-MS lipid benzeri bileşikler ve diğer yöntemlerden birini tarafından iyi karakterize olmayan diğer metabolitler belirlemek için kullanışlıdır. LC FTICR-MS veya LC-MS bir kesir toplayıcı ve iki boyutlu (2D) sıvı devlet NMR belirlenmesi ve bilinmeyen bileşikleri18 miktarının ideal bir durumdur tarafından kesirler yapısal aydınlatma için ilgi belirli bilinmeyen toplama ile kaplin ,19. Ancak, Eğer ve ne zaman gerekli kullanılabilir çok zaman alan bir adım bu. Ayrı ayrı ele alındığında, bu tekniklerin herbirini organik madde başka bir anlık görüntüye sağlamak ve onları entegre ederek, biz yalıtım modunda tekniklerden herhangi birini kullanarak daha kapsamlı bir anlayış elde edebilirsiniz.

Termodinamik konuları ne dönüşümleri bir sistemde mümkün üzerinde nihai sınırlamalarını ayarlamak iken, organik madde ayrışma reaksiyonu oranları olan enzim faaliyetleri kontrol mikroorganizmalar tarafından aracılık ettiği. Böylece, tamamen organik madde ayrışma ve sonuçta sera gazı (CO2 ve CH4) üretiminden sulak alanlar üzerinde denetimleri anlama mikrobiyal enzim aktiviteleri karakterize bir entegre omics yaklaşım gerektirir yanı sıra metabolitleri. Bu makalede, biz öyle a etraflı çözümleme tam olarak eşleştirilmiş bir analiz sonuçları sıralı bir yaklaşım kullanarak tek bir örnek üzerinden ulaşmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım metaboliti, protein ve hangi proteomik nicel metaboliti bilgi dahil ederek küçük metabolitleri, proteinler ve yağlar belirlemek için GC-MS ve LC-MS20 ile birleştiğinde lipid ayıklama (karmaşık) protokolü üzerinde genişletir yolu ile NMR ve tanımlaması daha büyük sekonder metabolitler ile FTICR-Bayan biraz karmaşık için farklı, biz su çıkarma ve giderek polar çözücüler ile kullanım sıralı ayıklama kuralıyla başlar. Tüm çekimi hangi birimleri sınırlı veya zor elde etmek çalışırken örnek korur ve deneysel hata ile aliquots arasında varyasyon türdeş olmayan örnek matrisler (Örneğin, toprak ve turba) tanıttı azalır tek bir örnek yapılır veya saklama koşulları ve süresi farklılıkları.

Son olarak, OM analizleri mikrobiyal toplumun proteomik analizleri ile kaplin tarafından yolları ve dönüşüm organik madde çürüme tarif metabolik ağlar inşa edebilirsiniz. Bu tedirginlikler sistemine ultimate CO2 ve CH4 üretim yoluyla değişiklik mevcut organik yüzeylerde, elektron alıcısı ve mikrobiyal topluluklar nasıl etkiler hakkında belirli hipotezler test için bize izin verir reaksiyonlar ile enzim katalizörler etkinlik arabuluculuk.

Bu yöntem genel amacı metabolitleri, lipidler ve böylece analitik hatalar zorlayıcı süre metabolik ağ oluşturmak için tam olarak eşleştirilmiş bir veri kümesi oluşturma tek bir örnek üzerinden mikrobiyal protein analiz etmek için bir tek işlem hacmi protokol sağlamaktır .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. organik madde sıralı çekme--dan toprak, çökeller veya turba

  1. Toprak, çökeller veya turba üzerinden asitleme toplamak ve test edilen hipotez (Örneğin, derinlik) göre çekirdek bölün. Mağaza örnekleri Politetrafloroetilen kapsayıcılar kaplı ve analiz önce depolama için-80 ° C'de dondurmak.
    Not: Yaklaşık 25 mg C bu iletişim kuralı için gereklidir. Turba (genellikle % 45 C) için kurutulmuş turba 50 mg gereklidir. Mineral veya ormanlık uplands topraklar bağlı olarak C (ilâ 5 g) içerik gibi örnek daha büyük miktarlarda düşük organik örnekleri için gerekli olabilir. Toplama, depolama sırasında herhangi bir noktada plastik başvurma örnekleri izin önlemek önemli çünkü ayıklama organik çözücüler ile herhangi bir Polietilen glikol (PEG) 2.4. adımı iyonlaşma olumsuz etkiler, özleri çeker veya çıkarma.
  2. Örnekleri analiz etmek hazır olduğunuzda sabit ağırlık-e doğru kuru dondurmak, sonra homojenize ve herhangi bir toplamları kadar kırmak için paslanmaz çelik topları kullanarak bir yüksek hızlı top fabrikası örneklerinde eziyet.
    Not: Bu noktada protokol duraklatılmış ve malzeme-80 ° C'de depolanan
  3. Bir paslanmaz çelik kap etanol yıkanmış, aliquot 50 mg her birinin kurutulmuş örnekleri bireysel 2 mL Cam şişe kullanarak. Bu örnekler sırayla art arda her örnekten giderek kutup metabolitleri çıkartmak için solventler bir dizi kullanarak elde edilebilir. Her örnek için 1 mL distile, degassed su (H2O) eklemek, şişeleri kap ve bir shaker tablo 2 h için sallamak.
  4. Sallayarak izin sonra 20 dk sonra 30 dak için 15.000 x g, santrifüj için oda sıcaklığında (RT) durmak çözümler, dikkatle boşaltmak ve süpernatant herbirinden kaydedebilirsiniz.
    Not: Bu çözümleri tarafından direkt enjeksiyon FTICR-MS eklenecek.
  5. Kuralları bir Folch ayıklama21 (olarak da bilinen karmaşık20) Şimdi adım 1.3 suda için 4:3 kloroform: metanol karışımı 1.3 ve 1.4-20 ° c 1 mL yerine adımları yineleyerek ayıklanan artıkları su.
    Dikkat: Kloroform ve metanol hem son derece yanıcı ve zehirli. Cilt temasından kaçının ve açık alev önlemek için uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanın.
  6. Dikkatli bir şekilde görsel olarak ayırt edilebilir, bir ayrılık kullanarak FTICR-MS göre ayrı analiz için olacak katmanları huni veya sadece dikkatli pipetting tarafından üst katmanı kaldırın solvent sonuçlanan iki ayrı.
    Not: metanol içeren kesir daha az yoğun ve üst olacak iken kloroform içeren kesir en altında olacaktır.
  7. Kloroform özü (adım 1.6) 11: metanol içinde ve su özü (adım 1.4) 2:1 tarafından direkt enjeksiyon FTICR-MS için electrospray iyonlaşma (ESI) verimliliği artırmanın metanol oranında seyreltin.
    Not: Adım 1.7 metanol içeren kesir seyreltilmiş gerekmez daha metanol. Metanol katman tarafından direkt enjeksiyon FTICR-MS üzerinde çalışır.

2.FTICR-MS Analizi

  1. Doğrudan ayarlama bir çözeltinin 100 µL enjekte edilerek FTICR Spektrometre kalibre ( Tablo malzemelerigörmek) yaklaşık 100-1300 Da kitlesel bir dizi FTICR-MS kapsayan.
  2. Suwannee nehir fulvik asit standart hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) 1 mg mL-1 çözüm ultrasaf filtrelenmiş su içinde yapım ve metanol 20 µg mL-1 için elde edilen çözüm sulandrarak.
  3. Doğrudan FTICR Spektrometre 3.0 μL min-1debi için ayarla bir şırınga pompa ile birleştiğinde ESI kaynak bu nihai çözüm 23 µL enjekte et. +4.4 için iğne gerilim ayarla kV, 150 m/z ve cam 180 ° C'de kapiller Q1 Elde edilen spectra analiz yazılımı kullanarak kontrol edin (verilerin kalitesini doğrulamak için Malzemeler tablobkz:).
  4. HPLC sınıf metanol örnekler çalıştırmadan önce ve örnekleme boyunca ertelenmiş izlemek için kullanın. Her özü ile doğrudan enjeksiyon FTICR Spektrometre 3.0 μL min-1debi için ayarla bir şırınga pompa ile birleştiğinde ESI kaynağına 23 μL tanıtmak. +4.4 için iğne gerilim ayarla kV, 150 m/z ve cam 180 ° C'de kapiller Q1
  5. Her örnek veya örnekleri için C toplama varyasyon hesap grubu için iyon birikimi zamanını (IAT) ayarlayın. Tipik değerler arasında 0,1-0,3 s. 144 toplamak inceden inceye gözden geçirmek her örnek, ortalama için tarar ve homolog CH2 kullanarak bir iç kalibrasyon yapmak (yani, 14 Da ayırma) serisi.
    Not: FTICR-MS analiz sonra karar ya su birleştirin yapılabilir ve kalan adımları hızlandırmak amacıyla çıkarılan metanol kesirleri veya kesirler sonraki adımları ayrı tutulabilir. Avantajları ve dezavantajları her yaklaşımın uzun uzadıya tartışmaaçıklanmıştır. Bunu yaparken, su ve metanol elde kesirler birleştirir.
  6. Kuru bir yoğunlaştırıcı kullanarak özleri ve özleri kalan kaydetmek (~ 1 mL) sonraki GC-MS (su, metanol veya su + metanol), LC-MS (kloroform) ve NMR (su + metanol) çözümleme.
    Not: Bu noktada protokol duraklatılmış ve malzeme-20 ° C'de depolanan

3. FTICR-MS veri işleme

  1. Tüm örnek tepe listeleri kitle vardiya azaltmak ve Formularity yazılım22 formül atama öncesinde kullanarak en yüksek atamaları standartlaştırmak tüm veri kümesi için ortak hizalayın.
  2. Formularity yazılım22 moleküler formülü bir sinyal kullanarak atamak için kullanın 7'den büyük gürültü oranı için ölçüm hata < 1 ppm kitle ve C, H, O, N, S ve P ise hariç diğer tüm öğeleri sağlar.
  3. Birden fazla aday formüller için belirli bir kitle (500 Da sık) döndürülmezse örnek malzeme ile tutarlı kısıtlamalar empoze. Örneğin, turba, tipik kısıtlamaları içerir: en düşük fiyat yığın hata, heteroatoms (N, S, P), en düşük fiyat sayısı ve varsa, P oksitlenmiş biçiminde olması gerekir (yani, en az 4 O atomlar her P atom formül için olması gerekir).

4. GC-MS için kimyasal Derivatization

  1. GC-MS Otomatik Örnekleyici şişeleri23yılında HPLC sınıf hekzan boş denetim örnekleri hazırlayın. 100 mg yağ asit metil esterleri dağıtılması (alevlerini: C8 - C28) karışımı tutma zamanı hekzan 200 µL içinde standart.
  2. Karbonil grupları korumak için 30 mg mL-1 methoxyamine hidroklorür pyridine içinde 20 μL her metanol özleri ve su özleri (veya kullanıyorsanız kombine metanol/su özleri) adım 2.6, boşluklar ve şöhret kalibrasyon örnekleri23ekleyin. Şişe kapakları kapatın.
    Dikkat: Hem son derece toksik ve yanıcı Pyridine var. Cilt ve göz teması önlemek ve açık alev önlemek için uygun KKE giymek. Buna ek olarak, zararlı hava kirlenmesine neden RT pyridine volatilizes. Sadece iyi havalandırılmış alanlarda duman başlık altında çalışır.
  3. Girdap ayıklar için 20 s. Sonicate özler 60 s. O zaman, 37 ° C'de 100 x g de 90 dk santrifüj özler kuluçkaya.
    Not: Aşırı miktarda karbonhidrat veya tuzları metabolitleri aşağı kurutulduktan sonra kristal neden olabilir. Örnekleri sonicating saptırma reaktifi crystalized metabolitleri reconstitute için yardımcı olacaktır.
  4. N 80 μL kuluçka sonra eklemek-metil - N-(trimethylsilyl) her örnek için % 1 trimethylchlorosilane ile trifluoroacetamide, girdap ayıklar için 20 s. Sonicate özler 60 s ve özleri 37 ° C'de santrifüj için 100 x g, 30 dk içinde yeniden kuluçkaya.
  5. RT (20-24 ° C), serin özleri sonra GC-MS Otomatik Örnekleyici tüpleri aktarın.

5. GC-MS Analizi

  1. Ayarlamak ve MS satıcı önerileri göre kalibre ( Tablo malzemelerigörmek) emin olmak için analiz daha önce makine MS veri doğru okumak. Helyum gaz basıncı belirtilen tolerans içinde olup olmadığını denetleyin.
  2. Bir GC sütunda (30 m × 0,25 mm × 0,25 mikron) ayrı kutup metabolitleri. Fırın sıcaklığı protokolü aşağıdaki gibi ayarlayın: (1) ilk sıcaklığını 60 ° C için 1 dk, Rampa (2) 325 ° c 10 ° C min-1ve 5 min için 325 ° C'de tutun (3) oranında.
  3. Tek quadrupole MS. Set enjeksiyon bağlantı noktası sıcaklığı sabit 250 ° c için birleştiğinde bir GC kullanarak özleri analiz Her derivatized özü splitless modunda 1 μL enjekte.

6. GC-MS veri işleme

  1. Doğru yakalandılar emin olmak için tüm veri dosyalarını inceleyin. Verileri sürekli olarak boyunca ele geçirildi potansiyel vardiya ile ilgili iç standart saklama kez ve yoğunluklarda onaylamak için dikkat analizi.
  2. Satıcı belirli MS veri biçimi gerekirse genel bir MS biçimine dönüştürün. Şöhret iç standartlarını temel saklama dizinleri ayarlama MetaboliteDetector24 kullanarak işlem ham veri dosyaları. Tüm veri dosyaları saklama zamanlarında hizalama sonra deconvolution ve son olarak metaboliti kimlik ile saklama endeksleri ve GC-MS spectra FiehnLib kutup metaboliti Kütüphane25karşı eşleştirerek devam.
  3. Spektral eşleştirme kullanarak NIST14 GC-MS Kütüphane karşı kimliği belirsiz metabolitleri kalan kontrol edin. Tek tek sahte kimlikleri ortadan kaldırmak ve deconvolution hataları azaltmak için kimlikleri doğrulamak.

7. sıvı devlet NMR Analizi

  1. Su özleri kalan seyreltik (~ 300 µL) (vol/vol) 10 oranında bir 5 mM 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 iç standart. Alternatif olarak, su birleştirin ve metanol adımından suda 1 sonra resubstitute ayıklar. Ancak böylece, bazı uçucu bileşiklerin freeze-drying adımı sırasında kaybolabilir. Tipik son örnek birimleri 180-300 µL aralığında bulunmaktadır.
  2. Karışımı bir yüksek kaliteli 3 mm dış çap (OD) borosilikat cam NMR tüp içine aktarın.
  3. 5 mm çift rezonans tuz dayanıklı soğuk sonda ve soğuk-karbon ön amfi ile donatılmış bir NMR spektrometresi (ideal olarak en az 600 MHz) kullanarak spectra toplamak.
  4. 298 k 4 s edinme vakit, 1,5 s geri dönüşüm gecikme, 65.536 karmaşık puan ve 512 inceden inceye gözden geçirmek ile bir 1 D nükleer Overhauser etkisi spektroskopisi (NOESY) presaturation deneyi kullanarak 1 D 1H spectra toplamak.
  5. 2D 1H -13C heteronuclear tek-kuantum korelasyon (HSQC) ve 1H -1H metabolitleri ve doğrulama atama yardımcı olmak için toplam korelasyon (TOCSY) spectra toplamak.
  6. Yürütmek, atayın ve tüm spectra NMR analizi yazılımı kullanarak analiz (görmek Tablo reçetesiyoğunluklarda dahili standart göre ölçmek için). Metabolitleri örneği Kütüphane karşı kimyasal değişme, J-kaplin ve şiddeti bilgilerinde eşleştirerek tanımlayın.
    Not: Kütüphane daha da özel hedeflenmiş metaboliti standartlar ve düzenli olarak yapılan metaboliti eklemelerle tarafından geliştirilmiştir. Protokol bu noktada durdu ve malzeme-20 ° C'de depolanan

8. LC-MS Lipidomics Analizi

  1. Adımında metanol 2.5 200 μL ile oluşturulan kurutulmuş kloroform özü rewet.
  2. 10 μL her ekstresinin bir Orbitrap kütle spektrometre için yüzey karma sütun (3.0 mm × 150 mm × 1.7 mikron partikül büyüklüğü) kullanılıyorsa bir ters faz kullanarak birleştiğinde bir ultra performanslı sıvı Kromatograf içine enjekte. 34-min degrade (mobil faz A: Asetonitril/H2O (40:60) 10 mM amonyum asetat içeren; mobil faz B: Asetonitril/isopropanol (10:90) 10 mM amonyum asetat içeren) 250 µL/dk. kullanım debi negatif ve pozitif ayarla iyonlaşma modu daha yüksek enerjili çarpışma ayrılma ve çarpışma ile ayrılma indüklenen.
    Dikkat: Asetonitril bir göz, cilt ve solunum tahriş edici değil. Uygun KKE giymek. Buna ek olarak, Asetonitril yanıcı. Zehirli gazlar yanma sırasında üretilen, oksitleyici ajanlar başvurun için izin vermez.
  3. Ham LC-MS/MS veri dosyaları sıvıya ilgili iyonlaşma modu (pozitif veya negatif) için (yani, > 25.000 lipid türleri listesi) ile birlikte hedef dosyasını yükleyin. Süreç raw dosya. Uygulanabilir, eşleşen parça iyonları (örneğin, yağlı asil zincirleri), izotopik ayırma, ppm hata öncüleri ve tutma zamanı kitle el ile elde edilen tanımlamaları tanılama iyonların varlığı için MS/MS spectra inceleyerek doğrulayın. Güvenle tanımlanan lipidler listesinde .tsv dosyası olarak verin.
    Not: Protokol bu noktada durdu ve malzeme-20 ° C'de depolayın

9. proteomik analizi

  1. Proteinler göre karmaşık iletişim kuralı20 adım 2.4, özü 20 kez özü hacmi ek soğuk (-20 ° C) metanol ile yıkayarak kaynaklanan metanol faz kalan ayıklamak.
  2. Bir 1 mL/50 mg silis tabanlı jelleştirici (bakınız Tablo reçetesi) koşulu C18 SPE sütunlarla 3 mL metanol, % 0,1 trifluoroacetic asit (TFA) su, adım 9.1 1 mL/dk büyük bir oranda ayıklamak ilavesi ardından 2 mL için kullanın.
  3. Aşağıdaki örnek ek, sütun 95:4.9:0.1 su: acetonitrile:TFA 4 mL ile yıkayın sonra kurumasını sağlar. SPE sütununun altında 1,5 mL toplama tüpü yerleştirin ve 80:19.9:0.1 metanol: su: TFA 1 mL ile örnek elute.
  4. Vakum Yardımlı altında 100 µL özleri donma kurutma makinesi, konsantre sonra bir dalga boyu 562, bicinchoninic asit (BCA) Renkölçer tahlil26 tarafından protein konsantrasyonu ölçmek nm.
  5. 10.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de santrifüj ayıklar Elde edilen süpernatant atın ve 5 dk. Resuspend için su µL başına 0.1 µg peptid son bir konsantrasyon için protein Pelet vakum altında kalan Pelet Makinası.
  6. Dithiothreitol 5 mM son bir konsantrasyon ekleyin ve 30 dk. Dilute 60 ° C'de 10 kat kuluçkaya ile 100 mM NH4HCO38 M üre çözüm ve 3 h 1 mM CaCl2 ve domuz tripsin için 37 ° C'de 1:50, kuluçkaya enzim protein oranı.
    Not: İletişim kuralı şu anda duraklatılmış ve malzeme-20 ° C'de depolayın
  7. Üstel bir degrade %0,1 formik asitin su mobil faz (A) ve %0,1 formik asit Asetonitril mobil faz (B), 10 kpsi ve 500 nL min-1kullanma ayrı özleri ile sıvı kromatografi.
  8. Elde edilen eluent bir ESI birleştiğinde kütle spektrometre spectra 400-2.000 m/z m/z 400 doğrusal iyon kapanı (LTQ) Orbitrap kütle spektrometre içinde 100.000 çözünürlük ile toplama içine tanıtmak.
  9. HAM spectra dosyaları msConvert veya ProteoWizard tüm varsayılan parametreleri kabul kullanarak mzML biçimine dönüştürün. Evrensel veritabanı arama aracı MSGFPlus elde edilen proteomes ilgili metagenome monte genleri tahmin protein sıralarının bir hedeflenen protein veritabanında arama yapın.
  10. Ortak kirletici maddeler (Örneğin, tripsin, keratin, albümin) ekleyin ve peptid için kitle spektrum maç istatistikleri geliştirmek için tüm tam olarak çoğaltılan protein dizilerini kaldırmak. Hangi peptid için kitle spektrum maçı en iyi olduğunu belirlemek için elde edilen MSGF spektral olasılık puanlarını değerlendirmektedir. MSGFPlus Q değerinden % 1'yanlış bulma oranı (FDR) için tüm veri yığın filtre uygulamak için kullanın.

10. Metabolomics Analizi ve metabolik ağ Binası

  1. Tüm metaboliti moleküler formülü metabolitleri örnekleri mevcut tek bir veritabanı içine 3, 6, 7 ve 8 adımda tanımlanan derleyin. Bu metabolitler enzim Komisyonu (AK) veya KEGG Orthology (KO) numaraları 9 adımda belirlediğiniz enzim ile birleştirir. Bu kombine veri kümesi KEGG27 veritabanıyla metabolik yollar bölüm arayın.
  2. El ile en olası yolları tanımlamak ve metabolik manken entegre sonuçları değerlendirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biz açıklanan tamamlayıcı Çözümleme Protokolü gerçekleştirilen ve turba Minnesota, ABD Ladin ve Peatlands yanıt altında değişen ortamlar (Ladin) sitedeki S1 bataklığındaki derinliği ile karşılaştırıldığında. Bu sonuçlar bu permafrost bataklık ve fen siteleri metaboliti ve enzim faaliyetlerinde nasıl değişebilir göstermek için Kuzey İsveç'ten karşılaştırılır. Biz proteomik analizde 3,312 enzimler tespit. Enzimler faaliyetleri ile derinlik analizi enzimler sayısı keskin 15 cm ve ladin bataklığındaki (Şekil 1) 45 cm arasında düşüşler ortaya koymaktadır.

Hangi proteinler ifade edilir proteomik sonuçlar gösterir, metabolik veri hangi tepkileri aslında meydana gelen gösterir. Genel olarak, biz 67,040 metabolitleri (lipidler dahil olmak üzere) tüm FTICR-MS, NMR, arada turba örneklerin tespit GC-MS ve LC-MS analizleri. Bunlar biz moleküler formülü 15,385 bileşikler (Şekil 2) atamak başardık. Kombine metabolik veriler oksidasyon durumları, kitleler ve bileşik sınıfları bir dizi yayılmıştır.

Bu tipik olarak tanımlanan formül atomik H/C oranları onların atomik yarıştırabilir oranları28karşı çizilen bir van Krevelen diyagramı aracılığıyla görüntülenmiştir. NOSC tek tek formül (Şekil 3 ve Şekil 4) temsil eden simgeler kodlama rengi aracılığıyla tasvir tipik 2D biçimine, eklenen bir boyut dahil ettik. Ladin bataklığındaki derinliği artan, işte büyük ikincil metabolit toplam sayısı artış FTICR-MS, özellikle de son derece yoğun (sol alt köşesinde van Krevelen arsa) ile tanımlanan ve hidrojene formüller (üst Arsa) (Şekil 4 ). Aynı denizin üzerinde bir düşüş GC-MS tarafından tanımlanan küçük son derece enerjik bileşikler sayısı ve lipidler (Şekil 5) vardır. Bu lipidler ve küçük metabolitleri yüzey turba daha derin derinliklerinde ulaşmadan önce tüketilen veya aşağıya doğru advecting bileşikler hızla tüketilen öyle ki derin turba fiyatlarına ayrışma yüzey daha hızlı olan hatırlatıyoruz. Bu iki rakip hipotezler arasında differentiating sitesinde Bisiklete binme C bir işlem düzeyinde anlamak gerekir. Böyle bir işlem düzeyinde anlayış sadece metabolomics ve proteomik veri kümeleri kaplin tarafından elde edilebilir. Biz bunu çapraz-kombine FTICR-MS, GC-MS, LC-MS doğrulayarak gerçekleştirmek ve NMR metabolitleri KEGG veritabanıyla teşhis etti. Bunu yaparken, biz tespit bileşikleri tricarboxylic asit (TCA), glikoliz ve şeker metabolizma gibi ilgili ortak metabolik yollar olduğunu öğrenin. Bireysel metabolitleri dahil bu yana enzimler ile birden çok yolları onay yolları (Şekil 6) atanmasında güveni artırır.

Daha derin derinliklerinde pyruvate ve diğer fermantasyon ürünleri (Şekil 6) inşa ederken bu haritalandırma yöntemiyle Biz yüzey turba sukroz ve nişasta metabolizma delil bulamadı. Bu sonuçlar şekerler ve enerjik diğer metabolitler yüzey turba bozulmuş ve daha derin turba derinliklerine ulaşmak olmayan ilk hipotez ile tutarlıdır. Şekil 5' te görüldüğü gibi şekerli (NOSC = 0) ve amino asitler (0 < NOSC < lipidler sırasında yüzey turba içinde tüketilen 1) (-2 < NOSC < -1) ile derinlik birikir görünüyor. Bu alt NOSC bileşikler yüksek anaerobik devam ederken daha yüksek NOSC bileşikler daha kolay bozulmuş NOSC değerlere göre beklentileri ile tutarlıdır (yani, çay-limited) yeraltı turba şartları. Bu yaklaşım da başarıyla toprak türleri farklı ortamlardan ayırt eder. Örneğin, toprak organik madde boreal peatland üzerinden bileşimsel fen ve bataklık permafrost bölge içinde yanı sıra, permafrost peatland daha farklı gibi görünüyor. Bu sonuçlar sitesi Jeokimya bu site Jeokimya düşündüren bu habitatları29, arasındaki farkları aşağıda yer C mikrobiyal bozulması üzerinde büyük bir etkisi var gösterdi bir önceki çalışma ile uyumludur.

Figure 1
Resim 1 : Proteomik analiz güçlü derinlik yükselmesiz enzimler sayısını gösterir. Çubuklar ortalamalar gösterir ve hata çubukları zenginliği olan bir standart sapma gösterir. Bu mikroorganizmaların en turba yüzey aktif olduğunu göstermektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Yüzey turba (< 30 cm) her Habitat yanı sıra Orta (45 cm) ve derin (87 cm) turba Ladin bataklık üzerinden her tekniği ile tanımlanan bileşikler sayısı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Van Krevelen diyagramı (atomik H/C vs yarıştırabilir her tanımlanan moleküler formülü) yüzey (15 cm) Ladin için kapsama her tekniği ile karakterize bileşiklerin göstermek için derinlik bataklık. FTICR-MS bırakmak bizi bileşikler (küçük daire), en fazla sayıda tanımlamak GC-MS (üçgen) ayırt ve şekerler belirlenmesi için iyi olsa (H/C = 2 ve yarıştırabilir = 1). (Kare) NMR spektroskopisi şekerler, amino asitler, pyruvate vb.gibi enerjik önemli bileşikler Niceliksel bilgileri sağlar. LC-MS (elmas) lipidler üzerinde bilgi sağlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Van Krevelen diyagramı (atomik H/C vs yarıştırabilir her tanımlanan moleküler formülü) derin (87 cm) Ladin için kapsama her tekniği ile karakterize bileşiklerin göstermek için derinlik bataklık. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Kimyasal sınıfa tespit göreli kısmını yolu ile çeşitli teknikler farklı derinliklerinde. Barlar Ortalamalar için her derinlik ± bir standart sapma olarak çizilir. Çizilen sınıfları amino asitler, organizmalardandır (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diacylglycerol (DG), triacylglycerols (TG) ve şeker içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 6
Şekil 6 : Metabolik bir ağ oluşturmak için sonuçları birleştirerek. Derinlik NMR (bir) ve GC-MS (b) ve dönüşümleri Ladin bog anda tanımlanan belirli bir sayıda gösterilen bir metabolik Basitleştirilmiş harita (c) tanımlanan metabolitleri dağılımları. Yeşil kutuları derinlik, kahverengi kutularıyla azaltmak metabolitleri ile arttırmak metabolitleri gösterir gösterir. Yeşil bağlantı okları enzim belirtilen dönüşüm (enzim EC numaraları yanındaki okları belirtilen) arabuluculuk bizim veri kümesi tanımlanan gösterir. Gri bağlantı okları dönüşümler için bizim veri kümesi içinde enzimler tespit edilmiştir değil gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tek-den geçerek hangi C tarafından karmaşık bir ekosistem içinde oluştuğunu bisiklet yolları anlayışlar metabolitleri ve Proteom karakterize etmek için kullanılan tam birleştiğinde analiz akışı sağlar. Toprak ve turba heterojen matrisler ve bu nedenle, bu yöntemin önemli adımlardan biri başlangıç turba veya toprak malzeme son derece homojen sağlanmasında ilk adımda oluşur. Toplamları ayıklama verimliliği de azaltabilir gibi örnek öğütmek için tercih edilir. Bu düşük C ve bir paslanmaz çelik topu değirmeni yeterince homojenize kullanımını gerektirebilir yüksek mineral içeriği ile toplanan toprak ve toprak için belirli bir sorun var. Toprak ve turba deneysel bir site içinde kayma heterojen yüksek olduğu için biyolojik çoğaltır kesinlikle önerilir.

Bu yöntem üç çözücüler kullanır: su, metanol ve kloroform, hangi bileşikleri ayıklamak mümkün olduğunu tür önyargı. Prensip olarak, bu sıralı ayıklama yöntemi bileşikleri geniş polarite aralığı kapsayan solubilize. Ancak, bu maddeleri organo-mineral kompleksleri veya son derece stabil kompleksleri ayıklamak için optimize edilmiş değildir. Böyle bileşikler ilgi varsa, kuvvetli asitler ve bazlar gibi sert çözücüler tercih edilir ancak sert çıkarma işlemleri örnekleri Kimya değişiklik. Böyle solvent ekstraksiyon sıra sonundaki birleştiren bu etkiyi en aza indirmek. Ayrıca, kloroform klinik olarak önemli toprak ve turba bakteriyel ve viral patojenler ve hastalığa neden olan patojen diğer biyolojik ajanlar hücre zarı lipidler çözülerek devre dışı. Böylece, kloroform ayıklama protokolündeki birleşmeyle potansiyel olarak dünyanın farklı bölgelerinden patojenler tarafından enfekte örneklerinin biyoloji çalışmalarda riskleri azaltır. Ölü mikrobiyal hücreleri, enkaz veya ayıklama takip tanecikleri konusunda endişeleriniz varsa, özleri 0.2 µm cam elyaf filtre ile filtre uygulama önerilir.

İşlem, su ve metanol düzene özleri GC-MS analiz için adımı sırasında 4.1 kombine edilebilir. Ancak, bu özleri ESI kaynak ile iyonlaşma verimlilik sorunları nedeniyle FTICR-MS analizi için ayrılmış kalır gerekir. GC-MS kombine özü çalıştıran avantajı daha fazla metabolitleri (polarite daha geniş bir aralığı kapsayan) tespit olmasıdır. Özler bu noktada birleştiren dezavantajı büyük metabolitleri organik madde mikrobiyal işleme için önemli birini metanol olmasıdır. Metanol bir metaboliti ilgi ise, su özü ayrı ayrı çalıştırılması gerekir bu yüzden metanol izleri her zaman kombine örnekte bile kuruduktan sonra kalacaktır. Hiçbir analitler iyi denetimleriyle sahip aynı zamanda potansiyel kirlilik örneklerde teşhis etmek için yardımcı olacaktır.

Adım 7.1 özleri NMR analizi, GC-MS analizi, olduğu gibi ya yalnız su özü hazırlama veya kombine su've metanol özleri kullanılabilir. Bunun dezavantajları önceki paragrafta numaralandırılan benzer. Metanol ve su özleri birleştirerek avantajı metanol kesir çözündürüldükten daha az kutup metabolitleri bazıları tespit edilecektir var. Ancak, freeze-drying adım nedeniyle pek çok daha fazla uçucu bileşikler kaybolacak. Bu belirli bir dezavantajı ise uçucu yağ asitleri miktarının denemenin kritik bileşenidir.

Proteomik tanımlamak için bu yordamdaki tek tam tryptic peptidler aranan, böylece endojen peptidaz aktivite ve kaynak fragmentations özleyeceğiz. Bu değişiklik genellikle işleme ve işleme örnekleme sırasında gerçekleştiği sırada öte yandan, oksitlenmiş metiyonin peptid adayları translasyonel modifikasyon düşünülebilir. Miktar enzimler peptit elüsyon alanları kullanarak yapılabilir ama bu proje kapsamı dışındadır.

Son gelişmeler birçok: NOM ve mikrobiyal parametreleri Analizi teknikleri çok sayıda organik C anlamak için are-mek şartıyla Bisiklete binme. Tek bir akıcı protokolü bu teknikleri birleştirerek, biz yer alan işlemlerin yeni bir görünüm kazanmak. Proteomik analizi metabolik analizleri ile kaplin bir tepki aslında meydana gelen beğenmeden kanıt zorlayıcı sağlar. Bize hangi metabolitleri daha yüksek veya düşük konsantrasyon karşılaştırmaları siteler arasında veya bir tedavi etkisi sonra, ama belgili tanımlık neden için bu değişiklikleri ayırt edemez bildirir metabolik analiz yalnız sınırlı olmamasıdır. Örneğin, azalan şekeri konsantrasyonları bataklığındaki derinlik ile tanımlanan, ama daha fazla bilgi düşüş ile derinlik yavaş girişleri veya derin turba hızlı bozulma nedeniyle olup olmadığı belli değil. Proteom ve derinliği ile azalan enzim ifade analizi ikinci hipotezi reddetmek için bize izin verir. Daha doğrusu sonuçlarımız yüzey turba sınırlayıcı girdileri daha derin derinliklere hızlı şeker bozulması ile uyumludur. Bu belirli yorumlara her biri benzersiz bir sağlar gibi tüm teknikleri tandem kabul edilir zaman mümkün, ancak kritik parça puzzle. Bisiklete binme C olduğunu

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

JP Chanton, J.E. Kostka ve mm Kolton torf örnekleri toplama ile yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser bölümlerini çevre moleküler Bilimleri Laboratuvarı, bir DOE ofis, bilim Kullanıcı Office biyolojik ve çevresel araştırma tarafından desteklenen tesis yapılmıştır. PNNL için sözleşme DE-AC05-76RL01830 altında DOE Battelle tarafından işletilmektedir. Bu eser ABD Enerji Bakanlığı, Office Bilim ve Office biyolojik ve çevresel araştırma tarafından desteklenmiştir (verir: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE-SC0012088 ve DE-SC0014416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methoxyamine hydrochloride Sigma Aldrich 226904 derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe  Bruker instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) Agilent AG19091S-433 instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) ThermoFisher instrumentation
2 mL glass vials VWR International 46610-722 sample vials
autosampler vials VWR International 97055-324; 9467671 sample vials
Chloroform VWR International JT9174-3 solvent
Ethanol VWR International BDH67002.400 solvent
methanol VWR International BDH85681.400 solvent
pyridine VWR International BDH67007.400 solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 Sigma Aldrich 178837 standard
C8-C24 fatty acid methyl ester Sigma Aldrich CRM18918 standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide Sigma Aldrich 24589-78-4 standard
Suwanee River Fulvic Acid standard International Humic Substances Society 2S101F standard
trimethylchlorosilane Sigma Aldrich 89595 standard
Tuning Solution Agilent
FTICR-MS analysis software Bruker Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software Pacific Northwest National Laboratory Formularity available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS Agilent Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent Phenomenex (Torrance, CA) Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 VWR International KT897820-0008 NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer  Varian Inova Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3 Chenomx Chenomx NMR Suite NMR software
ultra-performance liquid chromatograph  waters Aquity UPLC H  liquid chromatograph 
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer  ThermoFisher Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26, (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122, (2), 387-404 (2017).
  3. Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21, (4), 2035-2051 (2017).
  4. Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
  5. Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83, (11), e00645-e00617 (2017).
  6. Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528, (7580), 60-68 (2015).
  7. Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127, (2-3), 157-171 (2016).
  8. LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75, (8), 2030-2042 (2011).
  9. Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
  10. Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
  11. Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18, (6), 1000-1013 (2015).
  12. Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122, (11), 2841-2861 (2017).
  13. Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28, (3), 193-202 (1999).
  14. Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123, (2), 591-609 (2018).
  15. Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123, (6), 1790-1795 (2018).
  16. Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115, (28), E6585-E6659 (2018).
  17. Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15, (10), 1416-1423 (2004).
  18. Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8, (1), 8 (2018).
  19. Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54, (12), 998-1003 (2016).
  20. Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).
  21. Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  22. Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89, (23), 12659-12665 (2017).
  23. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).
  24. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81, (9), 3429-3439 (2009).
  25. Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81, (24), 10038-10048 (2009).
  26. Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33, (11), 1744-1746 (2017).
  27. Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
  28. Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
  29. Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (16), 5819-5824 (2014).
Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tfaily, M. M., Wilson, R. M., Brewer, H. M., Chu, R. K., Heyman, H. M., Hoyt, D. W., Kyle, J. E., Purvine, S. O. Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures. J. Vis. Exp. (143), e59035, doi:10.3791/59035 (2019).More

Tfaily, M. M., Wilson, R. M., Brewer, H. M., Chu, R. K., Heyman, H. M., Hoyt, D. W., Kyle, J. E., Purvine, S. O. Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures. J. Vis. Exp. (143), e59035, doi:10.3791/59035 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter