Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لرصد البقاء على قيد الحياة على أساس خلية واحدة وتحديد المتغيرات التي كثيرا التنبؤ بموت الخلايا.
Abstract
فحوصات سيتوتوكسيسيتي القياسية، التي تتطلب جمع ليساتيس أو الخلايا الثابتة في نقاط زمنية متعددة، حدت من الحساسية والقدرة على تقييم العوامل التي تؤثر على مصير الخلايا العصبية. وتتطلب هذه الاختبارات مراقبة السكان منفصلة من الخلايا عند نقاط زمنية منفصلة. كنتيجة لذلك، لا يمكن أن يتبع الخلايا الفردية مستقبلي مع مرور الوقت، الحد من شدة القدرة على تميز ما إذا كانت الأحداث سوبسيلولار، مثل تشكيل بونكتا أو ميسلوكاليزيشن البروتين، السائقين المسببة للمرض، وردود التماثل الساكن، أو الظواهر مجرد مصادفة. خلية واحدة طولية الفحص المجهري يتغلب على هذه القيود، يسمح للباحث تحديد الاختلافات في البقاء على قيد الحياة بين السكان ورسم العلاقات السببية مع زيادة حساسية. وسيتناول هذا الفيديو دليل سير عمل ممثل لتجارب قياس بقاء خلية واحدة من الفئران الخلايا العصبية القشرية الأولية معربا عن علامة نيون بروتين. المشاهد سوف تعلم كيفية تحقيق ترانسفيكشنز ذات الكفاءة العالية، وجمع ومعالجة الصور يتيح تتبع المحتملين من خلايا فردية، وقارن النسبي بقاء السكان الخلايا العصبية باستخدام تحليل المخاطر النسبية كوكس.
Introduction
موت الخلايا غير طبيعية عامل قيادة في العديد من الأمراض، بما في ذلك السرطان، نيوروديجينيريشن، والسكتة الدماغية1. فحوصات قوية وحساسة لموت الخلية ضرورية لتوصيف هذه الاضطرابات، فضلا عن وضع استراتيجيات علاجية لتمديد أو تقليص الخلوية البقاء على قيد الحياة. لا يوجد حاليا عشرات من أساليب لقياس موت الخلية، أما مباشرة أو من خلال علامات البديل2. على سبيل المثال، يمكن تقييم موت الخلية بصريا مع المساعدة من الأصباغ الحيوية التي وصمة بشكل انتقائي خلايا ميتة أو حية3، أو عن طريق رصد مظهر فوسفوليبيدات محددة على غشاء البلازما4،5،6 . يمكن أيضا استخدام القياسات للمكونات داخل الخلايا أو نواتج الأيض الخلوية تسربها إلى وسائل الإعلام عند انحلال الخلوية كوكلاء للخلية وفاة7،8. وبدلاً من ذلك، يمكن تقريبها صلاحية الخلوية بتقييم النشاط الأيضي9،10. على الرغم من أن هذه الأساليب توفير وسائل سريعة لتقييم بقاء الخلية، فليست دون محاذير. ويلاحظ كل تقنية الثقافة السكان واحدة، مما يجعل من المستحيل التمييز بين خلايا فردية وفريدة من نوعها معدلات البقاء على قيد الحياة. وعلاوة على ذلك، هذه الاختبارات المستندة إلى السكان غير قادر على قياس العوامل التي قد تكون هامة لموت الخلايا، بما في ذلك مورفولوجيا الخلوية أو تعبير البروتين أو التعريب. في كثير من الحالات، هذه فحوصات تقتصر على النقاط الزمنية المنفصلة، ولا تسمح للمراقبة المستمرة للخلايا على مر الزمن.
وفي المقابل، مجهرية الفلورية الطولية هو منهجية مرنة للغاية التي ترصد مباشرة واستمرار خطر الوفاة على أساس خلية واحدة11. وباختصار، مجهرية الفلورية الطولية تمكن آلاف خلايا الفردية لتعقب على فترات منتظمة لفترات طويلة من الزمن، والسماح بتحديدات دقيقة لموت الخلايا والعوامل التي تعزز أو منع موت الخلايا. عند قاعدته، ينطوي الأسلوب تعداء عابرة أو توصيل الخلايا مع ناقلات ترميز البروتينات الفلورية. ثم ينشأ من fiduciary فريدة من نوعها، وموضع كل الخلية transfected فيما يتعلق بهذا المعلم يسمح للمستخدم بالصورة، وتعقب الخلايا الفردية على مدى ساعات أو أيام أو أسابيع. عندما ينظر إلى هذه الصور تسلسلياً، موت الخلية يتسم بالتغيرات المميزة في الأسفار ومورفولوجيا وتجزؤ الجسم الخلية، مما يتيح تخصيص وقت الوفاة لكل خلية. معدل الوفيات، تحدد بواسطة الدالة المخاطر المحسوبة يمكن ثم كمياً مقارنة بين الشروط، أو تتصل بتحديد الخصائص الخلوية باستخدام وحيد المتغير أو المتغيرات تحليل المخاطر النسبية كوكس12. معا، تمكين هذه النهج بالتمييز دقيقة وموضوعية لمعدلات موت الخلية بين السكان الخلوية، وتحديد المتغيرات التي تنبئ بشكل ملحوظ موت الخلية و/أو البقاء على قيد الحياة (الشكل 1).
على الرغم من أن يمكن استخدام هذا الأسلوب لرصد البقاء على قيد الحياة في أي نوع الخلية بعد الانقسامية في مجموعة متنوعة من تنسيقات الطلاء، سيصف هذا البروتوكول شروط ترانسفيكتينج وتصوير الخلايا العصبية القشرية الفئران مثقف في صفيحة 96-جيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر جميع أعمال الحيوانات الفقارية اللجنة المتعلقة باستخدام ورعاية الحيوانات في جامعة ميشيغان (بروتوكول # PRO00007096). التجارب هي التخطيط بعناية التقليل من عدد الحيوانات التضحية. يتم إيواء الحوامل الإناث البرية من نوع (WT)، غير المعدلة وراثيا "إيفانز طويلة" الفئران (الجرذ النرويجي) منفردة في غرف مجهزة بالإثراء البيئي، والرعاية من قبل الوحدة للطب الحيوانات المختبرية (اولام) في جامعة ميشيغان، في وفقا لدليل المدعومة من المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وأبقى جميع الفئران في الإسكان لأقل وقت ممكن قبل القتل الرحيم، تمشيا مع التوصيات الواردة في المبادئ التوجيهية بشأن القتل الرحيم للجمعية الطبية البيطرية الأمريكية وجامعة ميشيغان أساليب القتل الرحيم بالروتين المبادئ التوجيهية للأنواع.
1-المواد من إعداد
- تشريح الخلايا العصبية القشرية من الجنينية يوم 19 – 20 الجراء الفئران وثقافة الفئران الخلايا العصبية القشرية في 0.5 × 106 خلايا في المليلتر على ألواح بولي-د-يسين المغلفة لمدة 4 أيام في المختبر، كما هو موضح سابقا1413،، 15،،من1617،،من1819.
- إعداد بلازميد الحمض النووي لمصلحة اتباع الخطوات الموضحة بعزل الحمض النووي بلازميد خالية من الذيفان كيت (انظر الجدول للمواد). تحديد كمية الحمض النووي الناتجة باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
- اليوم في المختبر 4 (DIV4)، الكوة، تصفية تعقيم، واحتضان الوسائط التالية في 37 ° c: 6 مل تقليل الوسائط المصل (RSM؛ على سبيل المثال.، أوبتيميم)، 25 مل العصبية القاعدية وسائط الإعلام (مولدوفا)، 40 مل نبكي (مولدوفا + 1 ملم حمض كينورينيك + 10 مم مجكل2، تعديل للرقم الهيدروجيني 7. 4)، 10 مل بي سي (مولدوفا + 1 x العصبية خلية الثقافة الملحق + 1 س لام الجلوتامين الملحق + 1 × بكتيريا القلم).
ملاحظة: سرد وحدات التخزين كافية للوحة 96-بئر واحدة ترانسفيكتينج. الرجوع إلى الجدول للمواد اللازمة الكواشف محددة.
2-تعداء الخلايا العصبية القشرية الفئران
- تعديل المثال تعداء الورقة المقدمة (انظر تكميلية ملف 1) عن طريق ضبط نوع اللوحة، لوحة خريطة، عدد من السلطات الوطنية المعينة، تركيز الحمض النووي، وعدد من الآبار (مربعات خضراء).
ملاحظة: الحمض النووي مجموع المبالغ إلى 0.2 ميكروغرام كل جيدا، بغض النظر عن ما إذا كان واحد (على سبيل المثال.أو بالحمض النووي) أو متعددة (مثل الحمض النووي ب وج) تتم إضافة ثوابت الحمض النووي لكل بئر. - العامل من جدول البيانات، الجمع بين المبلغ المناسب RSM والحمض النووي في أنبوب واحد. الجمع بين المبلغ المناسب لكاشف RSM وتعداء (مثلاً، ليبوفيكتاميني) في أنبوب منفصل.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
- والجمع بين الحمض النووي وتعداء كاشف RSM الخلائط واحتضانها في RT لمدة 20 دقيقة.
- أثناء هذه الخطوة حضانة، استخدام ماصة متعددة القنوات وأحواض بلاستيكية معقمة يغسل خلايا x 2 مع 100 ميليلتر كل من مولدوفا جيدا. حجز الوسائط مكيفة (سم) وتخزينها في 37 درجة مئوية. لهذا، واتباع الخطوات، الحرص على تقليل مقدار الوقت الخلايا العصبية ويتعرض للهواء.
- قم بإزالة الوسائط مولدوفا واستبدال 100 ميليلتر الواحدة من نبكي جيدا.
- بعد مرور 20 دقيقة، إضافة 50 ميليلتر من خليط كاشف/الحمض النووي تعداء dropwise لكل بئر.
- احتضان الخلايا مع المجمعات تعداء الكاشف/الحمض النووي لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- شطف x 2 مع نبكي واستبدال مع 100 ميليلتر من سم و 100 ميليلتر لشبكة أن بي سي كل بئر.
- خلايا ترانسفيكتيد بنجاح يجب أن تكون مرئية بالفحص المجهري الأسفار داخل ح 16-24 من تعداء. لقياس كفاءة استخدام مجهر فلوري للتحقق من تعداء بعد الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يؤدي هذا الأسلوب كفاءة تعداء عموما من 5 إلى 10%.
3-تصوير
- وضع اللوحة على مجهر فلوري مع مرحلة المزودة بمحركات، وإقامة fiduciary (مثلاً، علامة على الجزء السفلي من اللوحة) التي تسمح للمستخدم بمحاذاة اللوحة في كل مرة كان يتم تصويرها. حفظ صورة من هذا الائتمانية للرجوع إليها.
- انتقل إلى حقل اهتمام وملاحظة إحداثيات س ص بالنسبة إلى التعهدات.
- وتركز على transfected الخلايا معربا عن تسمية فلورسنت.
- التقاط صور مضيئة في المناسبة القناة أو القنوات (مثل البروتين البروتين الفلورسنت الأحمر [العروض]، أخضر نيون [بروتينات فلورية خضراء]، 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي [DAPI])، أما يدوياً أو بطريقة تلقائية. بأخذ العديد من الصور على فترات متباعدة بشكل منتظم، ويمكن تجميع مونتاج من البئر أثناء معالجة الصور (راجع الخطوة 4).
ملاحظة: التباعد يعتمد على عدة عوامل، بما في ذلك التكبير، والبصريات المجهر، وحجم الكاشف. بشكل عام، سوف تكون المسافات البصرية بين الصور المجاورة بين 90 – 95% حجم كل صورة فردية، للسماح بدرجة صغيرة من تداخل الصورة وميزة المحاذاة. - كرر هذه العملية كلما كان ذلك مطلوب، ومواءمة للمؤتمن الأصلي في كل مرة. لتحليل البقاء على قيد الحياة، يتم تصوير كل ح 6 – 24، تبعاً لنوع الخلية والغرض من هذه التجربة.
4. معالجة الصورة
ملاحظة: وبعد الحصول على الصور، سلسلة من خطوات معالجة مطلوبة قبل تحليل الصور. هذه تشمل، ولكنها لا تقتصر على، خياطة، التراص، وخلفية الطرح (الشكل 1). والهدف من هذه الخطوات هو ﻹحداث المكدس الصورة، أو السلاسل الزمنية، التي خلايا ملحوظ من خلفيتهم بوضوح وسهلة المتابعة عبر نقاط زمنية متعددة. ماكرو مخصص في فيجي (Image_Processing.ijm، انظر تكميلية ملف 2) ويقوم بخياطة الأساسية، التراص، وخلفية الطرح. ويرد شرح لكل خطوة والمعلمات لأخذها في الاعتبار عند القيام بمعالجة الصور في قسم مناقشة.
- ضبط البيانات الخام أو دليل الإدخال لمطابقة تنسيق هو مبين في الشكل 2.
- إذا كانت النقاط الزمنية غير المتجاورة (أي، T1، T2، T3)، إعادة تسمية هذه المجلدات بحيث تكون. تعد هذه الخطوة الحاسمة لضمان أن لا تحطم الماكرو Image_Processing خلال التراص.
- انقر نقراً مزدوجاً فوق الرمز فيجي لفتح البرنامج، ثم انقر واسحب الماكرو Image_Processing إلى شريط فيجي. سيؤدي هذا إلى فتح الماكرو في فيجي.
- ضبط أسطر الماكرو Image_Processing لتحديد إدخال الدليل الذي يحتوي على الصور، دليل الإخراج المطلوب للصور مخيط ومكدسة، وعدد من تيميبوينتس التصوير، عدد القنوات الفلورسنت وتنسيق لوحة 2-7.
- تحديد الترتيب الذي تم الحصول الصور. لاختبار هذا، يدوياً غرزة مونتاج للصور في فيجي بالمناورة الإضافات المنسدلة القائمة | خياطة | مجموعة شبكة/خياطة. ضبط الإعدادات الموجودة ضمن القوائم المنسدلة نوع و ترتيب حتى يتم إنتاج صورة مخيط بدقة.
- ضبط المتغيرات GRID_TYPE و STITCH_ORDER في البنود 8 و 9 من الماكرو Image_Processing لمطابقة هذه التحديدات.
- تحديد عدد الصور الواحدة وكذلك عن طريق ضبط السطر 10 في الماكرو Image_Processing .
ملاحظة: أن قراءة هذا السطر لمونتاج 2 × 2 من الصور، خافت = 2. - إذا كان الطرح الخلفية المطلوبة، ضبط السطر 14 في الماكرو Image_Processing إلى بجسوب = true.
- تعيين نصف قطر الكرة المتداول عن طريق ضبط السطر 15 في الماكرو Image_Processing .
ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج، بتعيين نصف قطرها على الأقل قطر الكائن الأمامي أكبر في الصورة. - انقر فوق تشغيل لبدء تشغيل الماكرو Image_Processing . متى بدأت، سوف تقدم Image_Processing تلقائياً عن طريق خياطة والتراص، والطرح الخلفية.
5-سجل موت الخلية
ملاحظة: راجع المقطع المناقشة للحصول على المزيد من المعلومات في التهديف موت الخلايا ومراقبة البيانات.
- قم بتحديد موقع رصات الصور التي ينتجها البرنامج النصي Image_Processing . فتح هذه في فيجي.
- استخدم النقطة أداة داخل فيجي لتسمية كل خلية على حدة مع عدد. الضغط على المفتاح t بعد كل نقطة سيتم إضافة المعرف الخاص بالخلية إلى المدير (المنطقة من الفائدة) العائد على الاستثمار.
ملاحظة: يمكن تصور المعرفات بواسطة النقر فوق تسميات و إظهار كافة خانات الاختيار في إدارة العائد على الاستثمار. -
التقدم من خلال تيميبوينتس في كل صورة المكدس وسجل تيميبوينت عند كل خلية يموت أو احتياجات يكون للرقابة في ملف Survival_spreadsheet.csv (انظر الملف الإضافي 3).
- ويحتل كل خلية صف واحد في جدول البيانات، حيث يتألف معرف فريد (معرف) لكل خلية من المقابلة جيدا وعدد دوروا داخل هذا البئر. tp_death هو آخر نقطة الوقت يلاحظ خلية على قيد الحياة، بينما يمثل time_death الوقت الفعلي للوفاة في ساعات. لكل خلية، إدخال هذه البيانات. من المهم الحفاظ على هذا الهيكل لتحليلها لاحقاً باستخدام البقاء على قيد الحياة. R (انظر 4 ملف إضافي).
ملاحظة: معايير تحديد موت الخلية ذات أهمية حاسمة، وقد تختلف تبعاً لنوع الخلية. وتستخدم ثلاثة معايير رئيسية في تحديد الخلايا العصبية الميت11،20 (الشكل 3): فقدان كثافة الفلورية (مثلاً العصبية 1 في ح 69)، التقريب من الجسم الخلايا (مثل الخلايا العصبية 2 في ح 188)، وفقدان نورت السلامة أو بلبينغ (مثلاً، 2 العصبية في ح 188).
- ويحتل كل خلية صف واحد في جدول البيانات، حيث يتألف معرف فريد (معرف) لكل خلية من المقابلة جيدا وعدد دوروا داخل هذا البئر. tp_death هو آخر نقطة الوقت يلاحظ خلية على قيد الحياة، بينما يمثل time_death الوقت الفعلي للوفاة في ساعات. لكل خلية، إدخال هذه البيانات. من المهم الحفاظ على هذا الهيكل لتحليلها لاحقاً باستخدام البقاء على قيد الحياة. R (انظر 4 ملف إضافي).
- سجل حالة الرقيب الخلية الموجودة في العمود الأخير.
ملاحظة: هنا، بسبب الطريقة التي تنفرد بها رقابة تتم معالجته بالبحث والتطوير، خلايا الرقابة تميزت 0، بينما تميزت 1الخلايا غير الخاضعة للرقابة. لاحظ أن كافة الخلايا التي تعيش إلى آخر نقطة الوقت للرقابة، وذلك وضع علامة ك 0.
6-أداء النسبي كوكس المخاطر تحليل وتصور النتائج
- إذا لزم الأمر، تحميل استوديو R في https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- فتح استوديو للبحث والتطوير، وانقر نقراً مزدوجاً فوق الرمز الخاص ببقاء . R البرنامج النصي.
- قم بوضع المؤشر على الخط 2 البقاء على قيد الحياة. R ، وانقر فوق الزر تشغيل في الإطار الرئيسي لاستوديو البحث والتطوير من أجل تحميل مكتبة البقاء على قيد الحياة.
- قم بتغيير السطر 5 من بقاء . R البرنامج النصي لمطابقة موقع الملف Survival_spreadsheet.csv. انقر فوق تشغيل لتحميل بيانات البقاء على قيد الحياة داتافرامي.
- تسليط الضوء على خطوط 8 و 9 وانقر فوق الزر تشغيل في إطار وحدة التحكم استوديو البحث والتطوير بغية إجراء تحليل كوكس للمخاطر النسبية. إحصاءات الإنتاج والنتائج تظهر في نافذة وحدة التحكم من استوديو R.
- تسليط الضوء على خطوط 12-16 البقاء على قيد الحياة. R وضرب على زر تشغيل من أجل إنتاج تراكمي خطر الموت الأرض، التي سوف تظهر في علامة التبويب المؤامرات في الاستوديو R. يمكن حفظ هذا الملف بالنقر فوق الزر تصدير أعلاه الأرض.
- إذا كان من المستصوب لرسم البيانات البقاء على قيد الحياة كمنحنى كابلان-ماير، تسليط الضوء على خطوط 19-24 البقاء على قيد الحياة. R وضرب على زر تشغيل .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام الإجراء تعداء الموصوفة هنا، DIV4 الفئران الخلايا العصبية القشرية تم transfected مع بلازميد ترميز mApple البروتين الفلورسنت. بدءاً من تعداء بعد 24 ساعة، تم تصويرها الخلايا بالميكروسكوب الأسفار كل 24 ساعة لمدة 10 أيام متتالية. الصور الناتجة كانت نظمت كما هو مبين في الشكل 2، ثم مخيط، مكدسة، وسجل لموت الخلية (الشكل 1). ويبين الشكل 3 دورة الساعة للخلايا العصبية الممثل 3، اثنين من الذي يموت أثناء التجربة (الخلايا العصبية 1 و 2) بينما الثالث على قيد الحياة (3 العصبية).
حللت بيانات البقاء على قيد الحياة باستخدام البرنامج النصي R قدم (البقاء على قيد الحياة. R)، والنتائج الملخصة في الشكل 4. الجدول التي تم إنشاؤها عند تشغيل خطوط 7 و 8 من بقاء . R التعليمات البرمجية يقدم موجزاً كوكس تحليل المخاطر النسبية. ويبرز الشكل 4Aأربعة إحصاءات هامة لا سيما في الجدول. ويمثل الرقم في المربع 1 نسبة المخاطر لمجموعة "المسخ" بالنسبة إلى "وزن". لاحظ أن مجموعة "وزن" غير مسرود. وهذا لأن مجموعة "وزن" بمثابة مرجع السكان-هو خطر الموت في جميع الفئات الأخرى مقارنة بالسكان المرجعية لحساب نسبة المخاطر. ولذلك، تمثل نسب المخاطر أكبر من 1 تشير إلى معدل أسرع من الموت بالمقارنة مع السكان المرجعية، وقيم أقل من 1 انخفاض معدل الوفيات. في المثال، عرض خلايا متحولة نسبة مخاطر 2-2، مما يعني أنهم ماتوا 2.2 x أسرع من الخلايا WT. بشكل افتراضي، سترتب R المجموعات في ترتيب هجائي رقمي، مع المجموعة الأعلى بمثابة مرجع السكان. وضع أرقام أمام أسماء المجموعة هو طريقة سهلة لتحديد الترتيب الذي يتم تقييمها. وتمثل القيم في الإطارين 2 و 3 فالقيم وفواصل الثقة 95% لنسب المخاطر، على التوالي، محسوبة بتحليل كوكس للمخاطر النسبية. في المربع 4، ترد نتائج اختبار رتبة سجل. يقيم هذا الاختبار ما إذا كان هناك اختلاف مهم إحصائيا في البقاء على قيد الحياة بين السكان يجري اختبارها، ولكنه لا يصف المجموعات التي تختلف عن الآخرين، ولا يحسب قوته الفارق الملحوظ.
منحنيات كابلان-ماير (الشكل 4) تستخدم على نطاق واسع في التجارب السريرية لتقييم آثار التدخل على بقاء المريض. لهذا السبب، العديد من الباحثين على علم بتفسير بقاء البيانات تصور بهذه الطريقة. في سياق البقاء وحيدة الخلية، تصور هذه المؤامرات جزء صغير خلايا حية على مر الزمن في كل مجموعة. بدلاً من رسم خلية البقاء على قيد الحياة، نهج بديل تصور أن معدل موت الخلايا في كل مجموعة عن طريق تراكمي خطر الموت الأرض (الشكل 4). في معظم الدراسات البقاء على قيد الحياة، وعدد الأحداث التي لا تتبع تقدم خطي؛ بدلاً من ذلك، لنسبة معينة من الموت هو لاحظ عدد أكبر من الأحداث في أوقات سابقة. على سبيل المثال، في عدد خلايا 100، إذا كان يموت 20% خلايا بين الفواصل الزمنية، ثم خلايا 20 سوف يموت خلال الفترة الأولى، 16 أثناء الفاصل الزمني الثاني، 13 أثناء الفاصل الزمني الثالث، وهلم جرا. وهذا الاتجاه اللوغاريتمي أسهل نظرياً تصور استخدام خطر التراكمي لمؤامرات الموت، حيث يمثل المحور الصادي تحويل سجل سلبي للبقاء على قيد الحياة الخلوية. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضا عرض المحور الصادي لخطر الموت الأرض التراكمي كموت الخلية %، تحسب ك 1-1/eالتراكمي خطر الموت. وتمكن هذه المؤامرات أيضا مقارنات مباشرة من خطر الوفاة بين السكان. وتعكس ضخامة نسبة الخطر منحدر خطر الموت في الأرض لكل السكان، بالنسبة للمجموعة المرجعية التراكمي.
رقم 1: مخطط لتجربة بقاء نموذجية- هي transfected الخلايا العصبية القشرية الفئران في DIV4 باستخدام الإجراءات الموضحة في هذه المقالة. بدءاً من تعداء بعد 24 ساعة، خلايا يتم تصويرها على فترات متباعدة بانتظام وفقا للمتطلبات المحددة للتجربة. صور مخيط ومكدسة قبل موت الخلية وهو سجل، وتحليل المخاطر النسبية كوكس يستخدم لمقارنة مخاطر الوفاة بين السكان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: يتطلب بنية الملف. الماكرو فيجي المقدمة يتطلب أن يتم تنسيق البيانات الخام بطريقة معينة. للاستفادة من Image_Processing، تنظيم البيانات الخام كما هو موضح على اليسار. تجربة مثال ويرافق بنية الملف يظهر على اليمين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: سجل موت الخلايا في الفئران transfected الخلايا العصبية القشرية. استخدام الطرق الموضحة في هذه المقالة، تم transfected الخلايا العصبية القشرية الفئران مع بلازميد ترميز mApple البروتين الفلورسنت. الخلايا ثم تم تصويرها تقريبا كل 24 ساعة ومخيط الصور ومكدسة، وموت الخلية وسجل استخدام المعايير المنصوص عليها. تتم الإشارة إلى موت الخلايا العصبية 1 في ح 69، كما يتضح ذلك من فقدان للأسفار. وفاة العصبية 2 ح 188، كما هو مبين بتجزئة العمليات والتقريب من جسم الخلية. 3 الخلايا العصبية على قيد الحياة طوال فترة التجربة. لاحظ أن بعض الخلايا تصبح مرئية فقط متأخراً في التجربة، كما يدل على ذلك ظهور خلية جديدة في ح 235. فقط الخلايا التي تكون مرئية في الساعة الأولى من تصوير مدرجة ضمن التحليلات اللاحقة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تفسير لتحليل المخاطر النسبية كوكس. (أ) ملخص الإخراج يتضمن أربعة الإحصاءات الهامة التي يتم تسليط الضوء في هذا الشكل. 1 مربع يتضمن نسبة المخاطر للمجموعة التجريبية مقارنة بمجموعة التحكم، بينما مربع 2 و 3 مربع إظهار قيم p وفاصل الثقة 95% لكل نسبة المخاطر، على التوالي. 4 مربع يسلط الضوء على نتائج اختبار رتبة سجل. هذه البيانات هي أيضا يصور عبر كابلان-ماير المنحنى (ب) وخطر الموت الأرض (ج) تراكمي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويرد هنا، منهجية لرصد مباشرة بقاء الخلايا العصبية على أساس خلية واحدة. على عكس الاختبارات التقليدية لموت الخلايا التي تقتصر على النقاط الزمنية المنفصلة ومجموعات سكانية بأكملها من الخلايا، يسمح هذا الأسلوب للتقييم المستمر لمجموعة متنوعة من العوامل مثل مورفولوجيا الخلوية أو تعبير البروتين التعريب، و ويمكن تحديد كيف يؤثر كل عامل من عوامل بقاء الخلوية بطريقة المحتملين.
يمكن تعديل هذه المنهجية لتناسب مجموعة واسعة من الاحتياجات التجريبية. تواتر ومدة التصوير ويمكن تعديلها بسهولة، والبروتين أي اهتمام يمكن أن يشترك transfected مع علامة مضيئة لنموذج الدول المرض أو التحقيق البروتين الدالة13،،من1415، 16،17،،من1819. على الرغم من أن توضح هذه المقالة الإجراء الأمثل ترانسفيكتينج الخلايا العصبية القشرية الفئران، قد يتم تطبيق المخطط التجريبي إلى أي نوع من الخلايا بعد الانقسامية. ومع ذلك، الظروف المثلى تعداء قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل على أساس خط كل خلية، وركائز قد تحتاج إلى تعديل لمنع الخلايا من التثاقل أو تتحرك كثيرا لتعقب موثوق بها.
متطلبات تجهيز وتحليل الصورة ستختلف تبعاً لمعايير محددة لكل تجربة الفحص المجهري طولية. يتم تضمين شرح مختصر لكل خطوة حاسمة أدناه للمساعدة في تخصيص بروتوكول المباراة أفضل المطالب لتجربة.
ستيتشينج: إذا اتخذ مونتاج للصور، يمكن إجراء خياطة لخلق صورة واحدة لكل حقل من عرض أكبر. لمعظم التطبيقات فمن الأفضل القيام بخياطة قبل التراص. إلا إذا اتخذ صورة واحدة كل جيدا، ليست هناك حاجة القيام بهذه الخطوة.
التراص: بدلاً من أن تتبع الخلايا مع مرور الوقت عبر ملفات صور منفصلة، يمكن أن يؤديها التراص لمحاذاة الصور متتالية في سلسلة زمنية واحدة، مشابهة لرسم متحرك بإطار توقف. مع محاذاة الائتمانية الناجحة، سيتم محاذاة الإطارات الفردية تضم صورة مكدسة عن كثب. ومع ذلك، إذا كان هناك تغيرات ملحوظة أو التناوب بين الإطارات، مطلوب تسجيل الصورة. الماكرو Image_Processing تلقائياً يقوم بالتسجيل باستخدام البرنامج المساعد فيجي "مولتيستاكريج." هذا البرنامج المساعد يساعد على تقليل اختلالات صغيرة بين يدير التصوير. ومع ذلك، مع تحولات كبيرة، يدوياً زراعة المحاصيل، وإعادة ترتيب الصور قد يكون مطلوباً.
خلفية الطرح (اختياري): هو إحدى المسائل المحتملة التي قد تنشأ أثناء الحصول على الصور الإضاءة متفاوتة. هذا سيؤدي إلى الاختلافات في كثافة الإشارات عبر صورة التي يمكن الخلط بين تقديرات كثافة الأسفار. وفي هذه الحالات، يمكن القضاء على الاختلافات كثافة بتقنيات الطرح الخلفية. هذه ذات الصلة لا سيما مع إشارة منخفضة بنسب الضوضاء، حيث يمكن أن تكون كثافة التحولات بسبب الإضاءة متفاوتة قابلة للمقارنة في حجم إلى الإشارة فلوروفوري نفسه. وهناك العديد من الخوارزميات الطرح الخلفية، العديد منها بإقران الإضافات فيجي. اختيار أي خوارزمية لاستخدام يعتمد على خصائص الصورة نفسها وإشارة الذي يتم قياسه. داخل الماكرو فيجي Image_Processing، يتم إعطاء المستخدم خيار تنفيذ "المتداول الكرة" خلفية الطرح على مجموعة مكدسة من الصور (سطر 14). في هذا الأسلوب، يتم تحديد خلفية محلية لكل بكسل استناداً إلى متوسط كثافة الدائرة المحيطة بتلك بكسل. ثم يتم طرح هذه القيمة من القيمة الأولية في بكسل. القيمة المثلى لنصف قطر الدائرة المستخدمة لخلفية المحلية سوف تختلف التقديرات استناداً إلى قطر الكائن الأمامي أكبر في الصورة.
سجل موت الخلية: لإجراء مقارنات دقيقة بين السكان، من الضروري أن يطبق المعايير المبينة أعلاه لتحديد الخلايا العصبية الميت دائماً عبر كامل مجموعة البيانات. وعلاوة على ذلك، المسببة للعمى الأفراد التهديف موت الخلية إلى مجموعات تجريبية قيد التحقيق يلغي مصادر محتملة لتحيز. اعتماداً على معايير محددة وعلى جينيراليزابيليتي، يمكن إدماجها في خوارزميات الآلي للتقييم غير متحيز للبقاء على قيد الحياة الخلوية15،16،،من1718، 19.
وفي سياق تحليل البقاء على قيد الحياة وتحليلات أخرى للوقت للحدث، هناك ثلاث نتائج ممكنة. أولاً، لقد حدث هذا الحدث (موت الخلية)، ويتم تسجيل الوقت الذي وقع فيه الحدث. وثانيا، لم يحدث هذا الحدث خلال الإطار الزمني للمراقبة. كما تخضع للرقابة هذه الملاحظات عند انتهاء التجربة. ثالثا، يمكن أن لا سجل الحدث لأن الخلية نقلها من مجال الرؤية، أو تم حجب بواسطة الخلايا المجاورة. وفي هذه الحالة، هو رقابة الخلية عند فإنه يمكن لم تعد دقة تتبع. النتيجة الأولى، التوقيت الدقيق لموت الخلية قد يكون من الصعب تحديد استناداً الفاصل الزمني للتصوير. على سبيل المثال، قد ماتوا خلية على قيد الحياة في البداية ولكن شهد ميتة 24 ساعة في وقت لاحق عند أي نقطة خلال تلك الفترة 24 ساعة. لأن المحافظ، أنها ممارسة جيدة لتسجيل وقت الوفاة كآخر مرة يمكن تحديد خلية ثقة أنه على قيد الحياة (رقابة الأيسر).
كوكس إجراء تحليل المخاطر النسبية وتصور النتائج: البرنامج النصي Survival.R المصاحبة يمكن المقارنة بين خطر الوفاة بين السكان وأهميتها الإحصائية استخدام المخاطر النسبية كوكس تحليل (الشكل 4 أ)، وكذلك نتائج المؤامرة كمنحنى كابلان-ماير (الشكل 4 باء) أو تراكمي خطر الموت الأرض (الشكل 4). ويرد تحليل البقاء على قيد الحياة، وتحليل المخاطر النسبية كوكس، والحزمة "البقاء" في البحث والتطوير بمزيد من التفصيل كريستنسن12 وفي https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
بتكييف الإجراءات الموضحة هنا، يمكن أن تتصل مجموعة متنوعة من ميزات الخلايا العصبية إلى البقاء على قيد الحياة. جيل دوروا جميع أنحاء جسم الخلية و/أو نواة تمكن المستخدم من طوليا رصد حجم خلية ومورفولوجيا، ومستوى التعبير البروتين والتعريب، أو تشكيل هياكل سوبسيلولار مثل بونكتا أو المجاميع البروتين13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19-الأهم من ذلك، لأن كل عامل من هذه العوامل لوحظ فيما يتعلق بموت الخلية، فمن الممكن لتحديد الكمية جيدا كيف التنبؤ بالعوامل الفردية الخلوية البقاء على قيد الحياة أو الموت خلال الإطار الزمني المحدد. كما قد تكون جزيئي البروتين مسارات الأيض والخلوية بالإعراب عن الصحفيين الفلورسنت التي توفر قياسات الفيزيولوجيا الخلوية الكامنة في الوقت الحقيقي (على سبيل المثال.، gCaMP6f الاعتداء النشاط). باستخدام هذا النهج قوية، يمكن أن تكون العوامل التي تدفع صيانة الخلوي والدالة، والخلل في كشف ودرس في التفصيل، مما الملهم سبلاً جديدة للتحقيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر ستيف فينكبينر وأعضاء في مختبر فينكبينر للرائد مجهرية الروبوتية. ونشكر أيضا دان بيساتش لبناء البرمجيات الأولية اللازمة لمعالجة الصور والآلي تحليل البقاء على قيد الحياة. تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية و "السكتة الدماغية" (NINDS) R01-NS097542، جامعة ميشيغان البروتين للطي المرض المبادرة، وأن أربور نشطة ضد المرض.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
