Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 在单细胞的基础上监测生存情况, 并确定显著预测细胞死亡的变量。
Abstract
标准的细胞毒性检测, 需要收集裂解液或固定细胞在多个时间点, 有有限的敏感性和能力来评估影响神经元的命运因素。这些检测需要观察离散时间点的单独细胞群。因此, 随着时间的推移, 单个细胞不能前瞻性地跟踪, 严重限制了区分亚细胞事件 (如点状形成或蛋白质定位不当) 是否为疾病的致病性驱动因素、稳态反应的能力,或仅仅是巧合的现象。单细胞纵向显微镜克服了这些限制, 使研究人员能够确定种群之间的生存差异, 并以更高的灵敏度得出因果关系。本视频指南将概述一个具有代表性的工作流程, 用于测量表达荧光蛋白标记的大鼠原代皮质神经元单细胞存活情况的实验。观众将学习如何实现高效的转化, 收集和处理图像, 使单个细胞的前瞻性跟踪, 并使用 cox 比例危害分析比较神经元群的相对生存。
Introduction
异常细胞死亡是许多疾病的驱动因素, 包括癌症、神经退行性变和中风1。对细胞死亡进行可靠和敏感的检测对于这些疾病的描述以及扩大或降低细胞存活率的治疗策略的发展至关重要。目前有几十种技术可以直接或通过代理标记2测量细胞死亡。例如, 可以通过选择性染色死细胞或活细胞3的重要染料, 或通过监测血浆膜 4,5, 6上特定磷脂的外观, 从视觉上评估细胞死亡情况..细胞内成分或细胞代谢物在细胞溶解时释放到培养基中的测量也可用作细胞死亡的代名词 7,8。或者, 细胞活力可以通过评估代谢活动9,10近似。尽管这些方法提供了评估细胞存活的快速方法, 但它们并非没有警告。每种技术都将培养作为一个单一的群体来观察, 因此不可能区分单个细胞及其独特的存活率。此外, 这种基于人群的检测无法衡量可能对细胞死亡很重要的因素, 包括细胞形态、蛋白质表达或定位。在许多情况下, 这些检测仅限于离散的时间点, 不允许随着时间的推移对细胞进行连续观察。
相反, 纵向荧光显微镜是一种高度灵活的方法, 可在单细胞基础上直接和持续地监测死亡风险11。简单地说, 纵向荧光显微镜可以对数千个单个细胞进行长时间的跟踪, 从而精确地确定细胞死亡和增强或抑制细胞死亡的因素。在其基础上, 该方法涉及瞬态转染或转导细胞与矢量编码荧光蛋白。然后建立一个独特的信托, 每个转染细胞相对于这个地标的位置允许用户在几个小时、几天或几周的时间里对单个细胞进行成像和跟踪。当按顺序查看这些图像时, 细胞死亡的特征变化是细胞体的荧光、形态和碎片, 从而能够为每个细胞分配死亡时间。计算出的死亡率, 由危险函数确定, 然后可以定量比较条件之间, 或有关选择细胞特征使用单变量或多变量 cox 比例危害分析12。这些方法结合在一起, 可以准确和客观地识别细胞种群中的细胞死亡率, 并识别显著预测细胞死亡和存活的变量 (图 1)。
虽然这种方法可用于监测任何有丝分裂后细胞类型的存活在各种电镀格式, 该协议将描述条件转染和成像大鼠皮质神经元培养在96孔板。
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Protocol
密歇根大学动物使用和护理委员会批准了所有脊椎动物工作 (pro00007096 号议定书)。实验是经过精心策划的, 以尽量减少牺牲的动物数量。怀孕的女性野生类型 (wt), 非转基因长埃文斯大鼠 (北拉图斯) 单独被安置在配备了环境丰富的房间, 并由密歇根大学实验动物医学 (ulam) 单位 (ulam) 照顾,根据 nih 支持的实验动物护理和使用指南。根据美国兽医协会和密歇根大学安乐死方法的《安乐死准则》的建议, 所有老鼠在安乐死前都尽可能地减少了在常规住房中的关押。物种指南。
1. 材料制备
- 从胚胎日解剖皮质神经元19-20 大鼠幼崽和培养大鼠皮质神经元在 0.5 x 10 6 细胞每毫升在多 d-赖氨酸涂层板体外4天, 如前面所述的13,14, 15,16,17,18,19。
- 按照无内毒素质粒 dna 分离试剂盒 (见材料表) 概述的步骤制备感兴趣的质粒 dna。使用分光光度计对生成的 dna 进行定量。
- 在体外第4天 (div4), 脂肪, 过滤消毒, 并在37°c 下孵育以下培养基: 6 毫升减少血清培养基 (rsm; 例如 optimem), 25 ml 神经元基部介质 (nbm), 40 ml nbky (nbm + 1 mm kynurenic 酸 + 10 mm 2, 调整为 ph 值 7.4), 10 毫升 nbc (nbm + 1x 神经元细胞培养补充 + 1x l-谷氨酰胺补充 + 1x 笔链)。
请注意:列出的卷足以转染一个96孔板。有关特定试剂, 请参阅材料表。
2. 大鼠皮质神经元的转染
- 通过调整板类型、板图、dna 数量、dna 浓度和井数 (绿色框), 修改提供的示例转染表(请参阅补充文件 1)。
请注意:无论每口井添加一个 (例如 dna a) 还是多个 (例如dna b 和 c) dna 结构, dna 总量都达到 0. 2 微克。 - 从电子表格中工作, 将适当数量的 rsm 和 dna 组合在一个管中。将适量的 rsm 和转染试剂 (如脂质体胺) 合并在一个单独的试管中。
- 在室温下 (rt) 下孵化5分钟。
- 将 dna 和转染试剂 rsm 混合物结合, 在 rt 孵育20分钟。
- 在此孵化步骤中, 使用多通道移液器和无菌塑料槽, 以100μl 清洗每个 nbm 井的细胞2x。将有条件的介质 (cm) 保留在37°c。对于此步骤和以下步骤, 请注意最大限度地减少神经元暴露在空气中的时间。
- 取出 nbm 介质, 更换 100μl/井 nbky。
- 20分钟后, 将转染 reagentent/dna 混合物滴入每口井。
- 在37°c 条件下, 用转染 reagentent/dna 复合物培养细胞20分钟。
- 用 nbky 冲洗 2x, 每口用 100μl cm 和 100μl nbc 代替。
- 在转染16–24小时内, 荧光显微镜可以看到成功转染的细胞。为了测量效率, 使用荧光显微镜检查在37°c 隔夜孵育后的转染。
请注意:该技术的整体转染效率为5% 至10%。
3. 成像
- 将板材放置在具有机动级的荧光显微镜上, 并建立一个信托 (例如, 板底部的标记), 使用户能够在每次成像时对齐印版。保存此信托的图像以供参考。
- 导航到感兴趣的字段, 并记下相对于信托的 x-y 坐标。
- 专注于表达荧光标签的转染细胞。
- 手动或以自动化方式在适当的通道中拍摄荧光图像 (例如, 红色荧光蛋白 [rfp]、绿色荧光蛋白 [gfp]、4 '、6-二胺-2-苯基 [))。通过以正常间隔的间隔拍摄多个图像, 可以在图像处理过程中组装油井的蒙太奇 (请参见步骤 4)。
请注意:间距取决于几个因素, 包括放大倍率、显微镜的光学和探测器的尺寸。一般情况下, 相邻图像之间的光学间距将在每个图像大小的90–95% 之间, 以允许较小程度的图像重叠和要素对齐。 - 根据需要重复此过程, 每次都与原始信托进行对齐。对于生存分析, 成像每6-24小时进行一次, 具体取决于细胞类型和实验目的。
4. 图像处理
请注意:在图像采集之后, 需要在图像分析之前执行一系列处理步骤。其中包括但不限于缝合、堆叠和背景减法 (图 1)。这些步骤的目标是生成一个图像堆栈或时间序列, 在该堆栈中, 单元格可以清楚地从其背景中识别出来, 并且很容易在多个时间点上跟随。专用的 fiji 宏 (image _ 处理. ijm, 请参阅补充文件 2), 执行基本的拼接、堆叠和背景减法。讨论部分介绍了执行图像处理时要考虑的每个步骤和参数。
- 调整原始数据或输入目录以匹配图2所示的格式。
- 如果时间点不是连续的 (即 t1、t2、t3), 请重命名这些文件夹, 使其如此连续。此步骤对于确保image _ process宏不会在堆叠过程中崩溃至关重要。
- 双击 "斐济" 图标以打开该程序, 然后单击并将"图像 _ 处理" 宏拖到斐济栏上。这将在斐济境内打开宏。
- 调整image _ process宏的行 2-7, 以指定包含图像的输入目录、拼接和堆叠图像所需的输出目录、成像时间点的数量、荧光通道的数量和平板格式。
- 确定获取图像的顺序。为了测试这一点, 手动缝合蒙太奇的图像在 fiji 通过操纵插件下拉菜单缝合|格瑞德姆系列拼接。调整下拉菜单中的设置"类型" 和"顺序", 直到生成准确拼接的图像。
- 调整image _ 处理宏第8行和第9行中的grid _ type和stitch _ order变量, 以匹配这些选择。
- 通过调整image _ 处理宏中的第10行, 指定每口井的图像数。
请注意:对于 2 x 2 蒙太奇的图像, 这一行将读取 dim = 2。 - 如果需要背景减法,请将 image _ 处理宏中的第14行调整为 bgsub = true。
- 通过调整图像 _ 处理宏中的第15行设置滚动球半径。
请注意:为获得最佳结果, 请将半径至少设置为图像中最大前景对象的直径。 - 单击 "运行"启动图像 _ 处理宏. 一旦开始, image _ 处理将通过拼接、堆叠和背景减法自动推进。
5. 评分细胞死亡
请注意:有关评分细胞死亡和审查数据的详细信息, 请参阅讨论部分。
- 找到由 image _ 处理脚本生成的图像堆栈。在 fiji 打开这些。
- 使用 fiji中的点工具可以单独为每个单元格贴上一个数字的标签。在每个点之后按t将向 roi (兴趣区域) 管理器添加单元格标识符。
请注意:通过单击标签并显示投资回报率管理器中的所有复选框, 可以可视化标识符。 -
在每个图像堆栈中的时间点中进行进度, 并记录每个单元格死亡或需要在文件生存 _ s普及张. csv 中进行审查的时间点 (请参阅补充文件 3)。
- 每个单元格占据电子表格中的一行, 其中每个单元格的唯一标识符 (id) 由相应的井和该单元格中的 roi 数组成。死亡是细胞被观察到还活着的最后一个时间点, 而时间死亡代表实际死亡时间 (以小时为单位)。对于每个单元格, 输入这些数据。保持这种结构对于后续使用生存进行分析是至关重要的。r (请参阅补充文件 4)。
注: 确定细胞死亡的标准至关重要, 可能因细胞类型而异。在识别死亡神经元11、20 (图 3) 时使用了三个主要标准 (图 3): 荧光强度的损失 (例如 69 h 时的神经元 1)、细胞体的舍入 (例如, 188h 时的神经元 2) 和神经石的丢失完整性或出血 (例如, 神经元2在 188 h)。
- 每个单元格占据电子表格中的一行, 其中每个单元格的唯一标识符 (id) 由相应的井和该单元格中的 roi 数组成。死亡是细胞被观察到还活着的最后一个时间点, 而时间死亡代表实际死亡时间 (以小时为单位)。对于每个单元格, 输入这些数据。保持这种结构对于后续使用生存进行分析是至关重要的。r (请参阅补充文件 4)。
- 在最后一列中记录单元格的审查状态。
请注意:在这里, 由于审查由 r 处理的特殊方式, 审查单元格标记为0, 而未经审查的单元格标记为1。请注意, 所有活到最后一个时间点的单元格都将受到审查, 因此标记为0。
6. 执行 cox 比例危害分析和可视化结果
- 如有必要, 请在 https://cran.r-project.org/mirrors.html 下载 r 工作室。
- 打开 r 工作室, 双击图标以生存。r脚本。
- 将光标放在生存的第2行。r并单击主 r 工作室窗口中的运行按钮, 以便加载生存库。
- 更改生存的第5行。r脚本, 以匹配文件生存 _ xlexem. csv 的位置.单击运行以加载生存数据作为数据框。
- 突出显示第8行和第9行, 然后单击 r 工作室控制台窗口中的运行按钮, 以执行 cox 比例危害分析。结果和输出统计信息显示在 r 工作室的控制台窗口中。
- 突出显示生存的第12-16行。r并按下运行按钮, 以产生累积的死亡风险情节, 这将出现在 r 工作室的情节选项卡中。此文件可以通过点击绘图上方的导出按钮保存。
- 如果将生存数据绘制为卡普兰-梅耶尔曲线是可取的, 则突出显示19-24 线的生存。r , 然后按下运行按钮。
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Representative Results
利用本文所述的转染过程, div4 大鼠皮质神经元被编码为荧光蛋白 mapple 的质粒转染。从转染后24小时开始, 细胞连续10天每24小时用荧光显微镜成像。生成的图像如图 2所示进行了组织, 然后对细胞死亡进行拼接、堆叠和评分 (图 1)。图 3显示了3个有代表性神经元的时间过程, 其中两个神经元在实验过程中死亡 (神经元1和 2), 而第三个神经元存活 (神经元 3)。
使用提供的 r 脚本 (生存) 对生存数据进行了分析。r), 以及图 4中汇总的结果。在运行第7行和第8行的生存时生成的表。r代码提供了 cox 比例危害分析的摘要。表 4a 突出显示了四个特别重要的统计数据。方框 1中的数字表示 "突变体" 群体相对于 "wt" 的危险比率。请注意, 未列出 "wt" 组。这是因为 "wt" 群体是参考群体----在计算危险比率时, 将所有其他群体观察到的死亡风险与参考群体的死亡风险进行了比较。因此, 大于1的危险比率表明死亡率高于参考人口, 低于1的数值表明死亡率降低。在提供的示例中, 突变细胞的危险比为 2.2, 这意味着它们的死亡速度比 wt 细胞快2.2倍。默认情况下, r 将按字母数字顺序排列组, 顶部组作为参考填充。将数字放在组名称前面是确定其计算顺序的一种简单方法。方框 2和3中的值分别表示危险比率的 p 值和95% 的置信区间, 由 cox 比例危险分析计算。在方框4中, 报告了日志排名测试的结果。这项测试评估被测试人群的存活率是否存在统计上的显著差异, 但没有描述哪些群体与其他群体不同, 也没有计算观察到的差异的幅度。
卡普兰-梅耶尔曲线 (图 4b) 被广泛用于临床试验, 以评估干预措施对患者生存的影响。因此, 许多研究人员都熟悉以这种方式对生存数据进行可视化解释。在单细胞存活的背景下, 这些图描述了每个细胞随着时间的推移在每个组中的活细胞的比例。另一种方法不是绘制细胞存活图, 而是通过累积的死亡风险图来描述每个群体的细胞死亡率 (图 4c)。在大多数生存研究中, 事件的数量并不遵循线性级数;相反, 对于给定的死亡率, 在更早的时间观察到更多的事件。例如, 在100个细胞的群体中, 如果20% 的细胞在间隔之间死亡, 则20个细胞将在第一个间隔内死亡, 16个细胞在第二个间隔内死亡, 13个细胞在第三个间隔内死亡, 依此类推。这种对数趋势在概念上更容易想象使用死亡图的累积风险, 因为 y 轴表示细胞生存的负对数变换。或者, 死亡情节累积风险的 y 轴也可以显示为% 细胞死亡, 计算为1-半的累积死亡风险。这些情节还可以对人群之间的死亡风险进行直接比较。危险比的大小反映了每个人口的死亡图累积风险相对于参照组的坡度。
图 1: 典型生存实验的架构.鼠皮质神经元在 div4 使用本文中概述的程序转染。从转染后24小时开始, 细胞按照实验的具体要求, 按规则间隔进行成像。在对细胞死亡进行评分之前, 对图像进行拼接和堆叠, 并使用考克斯比例危险分析来比较人群之间的死亡风险。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 所需的文件结构.提供的 fiji 宏要求以特定的方式格式化原始数据。若要利用image _ 处理,请按照左侧所示组织原始数据。右侧显示了一个示例实验和附带的文件结构。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 转染大鼠皮质神经元的评分细胞死亡.利用本文所述的方法, 用编码荧光蛋白 mapple 的质粒对大鼠皮质神经元进行转染。然后大约每24小时对细胞进行一次成像, 对图像进行缝合和堆叠, 并使用提供的标准对细胞死亡进行评分。神经元1在69小时时显示细胞死亡, 荧光丢失就证明了这一点。神经元2在188小时死亡, 这表现在过程的碎片和细胞体的舍入上。神经元3在实验期间存活。请注意, 有些细胞在实验后期才会变得可见, 235 h 时出现的新细胞就证明了这一点。只有在成像初期可见的细胞才会包括在后续分析中。刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: cox 比例危险分析的解释.(a) 产出摘要包括本图中强调的四个重要统计数据。方框 1包括实验组相对于对照组的危险比,方框 2和方框 3分别显示每个危险比的 p 值和95% 置信区间。方框 4突出了日志排名测试的结果。这些数据也是通过卡普兰-梅耶尔曲线 (b) 和死亡情节 (c) 的累积风险来描述的。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
本文提出了在单细胞基础上直接监测神经元存活的方法。与传统的细胞死亡检测仅限于离散时间点和整个细胞群相比, 这种方法允许对多种因素进行持续评估, 如细胞形态、蛋白质表达或定位, 以及可以确定每个因素如何以一种前瞻性的方式影响细胞的存活。
这种方法可以修改, 以适应广泛的实验需求。成像的频率和持续时间可以很容易地调整, 任何感兴趣的蛋白质都可以与荧光标记共同转染, 以模拟疾病状态或调查蛋白质功能13,14, 15, 16,17,18,19。虽然本文介绍了移植大鼠皮质神经元的最佳程序, 但实验模式可应用于任何有丝分裂后的细胞类型。但是, 可能需要在每个细胞的基础上优化最佳转染条件, 并且可能需要调整基板, 以防止细胞聚集或移动太多, 以可靠地跟踪。
图像处理和分析要求将根据每个纵向显微镜实验的具体参数而有所不同。下面提供了每个关键步骤的简要说明, 以帮助自定义协议, 从而更好地满足实验的要求。
拼接: 如果拍摄蒙太奇图像, 可以进行拼接, 为每个视野创建一个更大的图像。对于大多数应用, 最好在堆叠之前执行拼接。如果每个很好只拍摄了一个图像, 则无需执行此步骤。
堆叠:可以执行堆叠, 将连续的图像与单个时间序列对齐, 类似于停止帧动画, 而不是在不同的图像文件中跟踪单元格。通过成功的信托对齐, 构成堆叠图像的各个帧将紧密对齐。但是, 如果帧之间有明显的移动或旋转, 则需要进行图像配准。图像 _ 处理宏使用 fiji 插件 "多斯塔克瑞格" 自动执行注册。此插件有助于减少成像运行之间的小错位。但是, 随着显著的变化, 可能需要手动裁剪和重新调整图像。
背景减法 (可选): 图像采集过程中可能出现的一个潜在问题是照明不均匀。这将导致图像上的信号强度发生变化, 从而混淆荧光强度的估计。在这些情况下, 背景减法技术可以消除强度变化。这些与低信噪比特别相关, 在低信噪比中, 由于照明不均匀而产生的强度变化在幅度上可与荧光体本身的信号相当。有许多背景减法, 其中一些有关联的 fiji 插件。使用哪种算法取决于图像本身的属性和被测量的信号。在 fiji 宏image _ 处理中,用户可以选择对堆叠的图像集执行 "滚动球" 背景减法 (第14行)。在此方法中, 根据该像素周围圆的平均强度确定每个像素的局部背景。然后从像素的初始值中减去此值。用于局部背景估计的圆半径的最佳值将根据图像中最大前景对象的直径而有所不同。
评分细胞死亡:为了准确地比较种群之间的差异, 必须在整个数据集中一致地应用上述识别死神经元的标准。此外, 将得分细胞死亡的个体致盲实验组, 消除了潜在的偏见来源。根据具体的标准及其通用性, 它们可能会被集成到自动算法中, 用于对细胞存活率进行无偏评估 15、16、17、18、19岁
在生存分析和其他事件时间分析的背景下, 有三种可能的结果。首先, 事件 (细胞死亡) 已经发生, 并且记录事件发生的时间。其次, 事件没有在观察的时间框架内发生。这些观察结果在实验结束时进行审查。第三, 由于细胞移出视野, 或者被附近的细胞遮挡, 因此无法对事件进行评分。在这种情况下, 当无法再准确跟踪单元格时, 将对其进行审查。对于第一个结果, 根据成像间隔可能很难确定细胞死亡的确切时间。例如, 最初存活但24小时后标记为死亡的细胞可能在24小时内的任何时候死亡。保守起见, 将死亡时间记录为最后一次可以自信地确定为活着的细胞 (左审查) 是很好的做法。
执行 cox 比例危害分析和可视化结果: 随附的幸存者. r 脚本可利用 cox 比例危害对人群中的死亡风险及其统计意义进行比较分析 (图 4a), 并将结果绘制为卡普兰-梅耶尔曲线 (图 4A) 或死亡图的累积风险 (图 4A)。生存分析, 考克斯比例危害分析, 和 "生存" 包在 r 更详细地描述由 christensen12和在 https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf。
通过调整这里概述的程序, 各种神经元功能可以与生存有关。围绕细胞体和细胞核生成 roi 使用户能够纵向监测细胞大小和形态、蛋白质表达水平和定位, 或形成亚细胞结构, 如点状或蛋白质集合13,14,15,16,17,18,19. 重要的是, 由于这些因素中的每一个都是与细胞死亡有关的, 因此可以定量确定个别因素在特定时间框架内预测细胞生存或死亡的情况。蛋白质代谢和细胞途径也可以通过表示荧光记者来检测, 这些荧光记者提供了对潜在细胞生理的实时测量 (例如, gmp6f 来检测活性)。通过采用这种强大的方法, 可以发现和研究驱动细胞维持, 功能和功能障碍的因素, 从而激发新的探索途径。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 steve finkbeiner 和 finkbeiner 实验室的成员, 感谢他们的开创性机器人显微镜。我们还感谢 dan peisach 构建了图像处理和自动生存分析所需的初始软件。这项工作是由国家神经疾病和中风研究所 (ninsds) r01-ns097542, 密歇根大学蛋白质折叠疾病倡议, 安阿伯积极反对 als 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
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