Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at overvåge overlevelse på grundlag af enkelt celle og identificere variabler, der væsentligt forudser celledød.
Abstract
Standard celletoksicitet assays, som kræver indsamling af lysates eller fast celler på flere tidspunkter, har begrænset følsomhed og evne til at vurdere faktorer, der påvirker neuronal skæbne. Disse assays kræver observation af adskilte populationer af celler i diskret tidspunkter. Som et resultat, kan ikke individuelle celler fulgt prospektivt over tid, alvorligt begrænser evne til at skelne om subcellulært begivenheder, såsom puncta dannelse eller protein mislocalization, er patogene førere af sygdom, homeostatiske svar, eller blot tilfældigt fænomener. Encellede langsgående mikroskopi overvinder disse begrænsninger, så forskeren til at bestemme forskellene i overlevelse mellem befolkninger og drage årsagssammenhænge med øget følsomhed. Denne video guide vil skitsere en repræsentativ arbejdsproces for eksperimenter måling encellede overlevelse af rotte primære kortikale neuroner at udtrykke en fluorescerende proteiner markør. Seeren vil lære at opnå høj effektivitet transfections, indsamle og behandle billeder gør det muligt for potentielle sporingen af individuelle celler, og sammenligne den relative overlevelse af neuronal befolkninger ved hjælp af Cox proportional farer analyse.
Introduction
Unormal celledød er en drivende faktor i mange sygdomme, herunder kræft, neurodegeneration og slagtilfælde1. Robust og følsom assays til celledød er afgørende for karakterisering af disse lidelser, samt udviklingen af terapeutiske strategier til udvidelse eller indskrænkning cellulære overlevelse. Der er i øjeblikket snesevis af teknikker til at måle celledød, enten direkte eller gennem surrogat markører2. For eksempel, kan celledød vurderes visuelt ved hjælp af vitale farvestoffer, der selektivt pletter døde eller levende celler3, eller ved at overvåge forekomsten af specifikke fosfolipider på plasma membran4,5,6 . Målinger af intracellulære komponenter eller cellulære metabolitter frigives i medierne på cellulære opløsning kan også bruges som proxies for celle død7,8. Alternativt, cellulære levedygtighed kan estimeres ved at vurdere metaboliske aktivitet9,10. Selv om disse metoder giver hurtig vurdering af celle overlevelse, er de ikke uden forbehold. Hver teknik bemærker kulturen som en enkelt population, gør det umuligt at skelne mellem enkelte celler og deres unikke satser for overlevelse. Desuden er sådan befolkningsbaseret assays ude af stand til at måle faktorer, der kan være vigtige for celledød, herunder cellulære morfologi, protein udtryk eller lokalisering. I mange tilfælde disse assays er begrænset til diskret tid point, og giver mulighed ikke for kontinuerlig observation af celler over tid.
Derimod er langsgående Fluorescens mikroskopi en yderst fleksibel metode, der direkte og løbende overvåger risikoen for død på en enkelt celle grundlag11. Kort sagt, giver langsgående Fluorescens mikroskopi tusindvis af individuelle celler kan spores med jævne mellemrum i længere tid, giver mulighed for præcis bestemmelse af celledød og de faktorer, der øger eller undertrykke celledød. På sin base indebærer metoden forbigående Transfektion eller transduktion af celler med vektorer kodning fluorescerende proteiner. En unik fiduciary oprettes derefter, og placeringen af hver transfected celle i forhold til denne skelsættende tillader brugeren at billede og spore individuelle celler i løbet af timer, dage eller uger. Når disse billeder vises sekventielt, er celledød præget af karakteristiske ændringer i fluorescens, morfologi og fragmentering af cellen kroppen, gør det muligt for tildelingen af en dødstidspunktet for hver celle. Den beregnede sats af død, bestemmes af funktionen fare kan derefter kvantitativt i forhold mellem betingelser, eller relateret til Vælg cellulære karakteristika ved hjælp af inputområdet eller flerdimensional Cox proportional farer analyse12. Sammen, aktiverer disse tilgange den præcise og objektive forskelsbehandling af satserne for celledød blandt cellulære populationer, og identifikation af variabler, der væsentligt forudser celledød og/eller overlevelse (figur 1).
Selv om denne metode kan bruges til at overvåge overlevelse i enhver post mitotiske celletype i en række fra plating formater, vil denne protokol beskriver betingelserne for transfecting og imaging rotte kortikale neuroner kulturperler i en 96-brønd plade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hvirveldyr animalske arbejde blev godkendt af Udvalget om brug og pleje af dyr på University of Michigan (protokol # PRO00007096). Eksperimenter er nøje planlagt til at minimere antallet af dyr ofres. Gravid kvinde wild-type (WT), ikke-transgene lang Evans rotter (Rattus norvegicus) er opstaldet enkeltvis i kamre udstyret med miljøberigelse, og plejes af enhed for Laboratory Animal medicin (ULAM) på University of Michigan, i overensstemmelse med guiden NIH-understøttet for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle rotter blev holdt i rutine boliger så lidt tid som muligt forud for eutanasi, i overensstemmelse med anbefalingerne i retningslinjerne om aktiv dødshjælp af den Amerikaner Veterinary lægeundersøgelse forening og University of Michigan metoder til aflivning af Arter retningslinjer.
1. materielle forberedelse
- Dissekere kortikale neuroner fra embryonale dag 19 – 20 rotte unger og kultur rotte kortikale neuroner på 0,5 x 106 celler pr. milliliter på poly-D-lysin belagte plader for 4 dage i vitro, som tidligere beskrevet13,14, 15,16,17,18,19.
- Forberede plasmid DNA af interesse følge trinene af en endotoxin-fri plasmid DNA isolering kit (Se Tabel af materialer). Kvantificere den resulterende DNA ved hjælp af et spektrofotometer.
- In vitro-dag 4 (DIV4), alikvot, filter sterilisere, og Inkuber følgende medier på 37 ° C: 6 mL reduceret serum medier (RSM, fx., OptiMEM), 25 mL neuronal basal medier (NBM), 40 mL NBKY (NBM + 1 mM kynurenic syre + 10 mM MgCl2, justeret til en pH på 7. 4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronal celle kultur tillæg + 1 x L-Glutamin supplement + 1 x Pen Strep).
Bemærk: Diskenheder angivet er tilstrækkelige for transfecting et 96-brønd plade. Henvises til Tabel af materialer til specifikke reagenser.
2. Transfektion af rotte kortikale neuroner
- Ændre den medfølgende eksempel Transfektion ark (Se supplerende fil 1) ved at justere plade type, plade kort, antallet af DNAs, DNA koncentration, og antallet af brønde (grønne kasser).
Bemærk: Den samlede DNA summer til 0,2 µg pr. brønd, uanset om man (e.g., DNA A) eller flere (f.eks. DNA B og C) DNA konstruktioner er tilføjet til hver brønd. - Arbejder fra regnearket, kombinere den passende mængde af RSM og DNA i en tube. Kombiner den passende mængde RSM og Transfektion reagens (f.eks. Lipofectamine) i en separat tube.
- Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
- Kombiner DNA og Transfektion reagens RSM blandinger og inkuberes ved RT i 20 min.
- Under denne inkubering skridt, brug en multikanalpipette og sterile plastik trug til at vaske celler 2 x med 100 µL pr. brønd af NBM. Reserve konditioneret medierne (CM) og opbevar ved 37 ° C. For dette, og næste foranstaltninger, sørge for at minimere mængden tid neuroner er udsat for luft.
- Fjern NBM medie og Udskift med 100 µL pr. brønd af NBKY.
- Efter 20 min, tilsæt 50 µL af Transfektion reagens/DNA blanding dråbevis til hver brønd.
- Inkuber celler med Transfektion reagens/DNA komplekser i 20 min. ved 37 ° C.
- Skyl 2 x med NBKY og erstatte med 100 µL af CM og 100 µL af NBC pr. brønd.
- Med held transfekteret celler skal være synlig ved Fluorescens mikroskopi inden for 16 – 24 h af Transfektion. For at måle effektivitet, bruge en fluorescerende mikroskop til at kontrollere Transfektion efter natten inkubation ved 37 ° C.
Bemærk: Denne teknik resulterer i en samlet Transfektion effektivitet på 5-10%.
3. billedbehandling
- Pladen anbringes på en fluorescerende mikroskop med en motoriseret fase, og etablere en fiduciary (f.eks. et mærke på bunden af pladen), der vil tillade brugeren at justere pladen hver gang det er afbildet. Gemme et billede af dette tillidsforhold til reference.
- Naviger til et område af interesse og Bemærk x-y-koordinater i forhold til fiduciary.
- Fokus på transfekteret celler, der udtrykker en fluorescerende etiket.
- Tage fluorescerende billeder i passende kanal eller kanaler (f.eks. rød fluorescerende protein [RFP], grøn fluorescerende protein [normal god landbrugspraksis], 4′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), enten manuelt eller i en automatiseret måde. Ved at tage flere billeder med regelmæssigt fordelte intervaller, en montage af brønden kan samles under billedbehandling (Se trin 4).
Bemærk: Afstanden afhænger af flere faktorer, herunder forstørrelse, optik af mikroskopet, og størrelsen detektor. Generelt, vil optisk afstanden mellem tilstødende billeder være mellem 90-95% af størrelsen på hvert enkelte billede for at give mulighed for en lille grad af billede overlapning og funktionen tilpasning. - Gentag denne proces så ofte som nødvendigt, tilpasse til den oprindelige fiduciary hver gang. For overlevelse analyse sted billedbehandling finder hver 6 – 24 h, afhængigt af typen celle og formålet med forsøget.
4. billed oparbejdelse
Bemærk: Efter billede erhvervelse, en række trin til behandling er nødvendig før billedanalyse. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, syninger, stabling og baggrunden subtraktion (figur 1). Målet med disse foranstaltninger er at producere en billedstak eller tidsserier, som cellerne er klart synlig fra deres baggrund og nem at følge over flere tidspunkter. En dedikeret FIJI makro (Image_Processing.ijm, se supplerende fil 2), udfører grundlæggende syninger, stabling, og baggrund subtraktion. En forklaring af hvert trin og parametre til at overveje, når du udfører billedbehandling er fastsat i afsnittet diskussion.
- Justere den rå data eller input register til at matche den formatering, der er vist i figur 2.
- Hvis tidspunkter ikke er sammenhængende (dvs, T1, T2, T3), omdøbe disse mapper, så de er. Dette trin er afgørende for at sikre, at makroen Image_Processing ikke går ned under stabling.
- Dobbeltklik på Fiji-ikonet for at åbne programmet, og derefter klikke og trække makroen Image_Processing på Fiji bar. Dette vil åbne makro i Fiji.
- Justere linjerne 2-7 i makroen Image_Processing til at angive de input mappe, der indeholder billeder, den ønskede output mappe til syet og stablet billeder, antallet af imaging timepoints, antallet af fluorescerende kanaler og plade format.
- Bestemme den rækkefølge, som billederne blev erhvervet. For at teste dette, manuelt sy en montage af billeder i FIJI ved manøvrering til Plugins drop down menu | Syning | Samlingen af DataGridColumnStyle/syninger. Justere indstillingerne i dropdown menuerne Type og rækkefølge , indtil et præcist syet billede er produceret.
- Justere variablerne GRID_TYPE og STITCH_ORDER i linje 8 og 9 i Image_Processing makroen til at matche disse valg.
- Angive antallet af billeder pr. brønd ved at justere linje 10 i makroen Image_Processing .
Bemærk: For en 2 x 2 montage af billeder, denne linje ville læse DIM = 2. - Hvis baggrunden subtraktion er påkrævet, justere linje 14 i makroen Image_Processing til BGSUB = true.
- Angiv det rullende kugle radius ved at justere linje 15 i makroen Image_Processing .
Bemærk: For optimale resultater, indstille radius til i det mindste diameter af største forgrundsobjektet i billedet. - Klik på Kør for at starte Image_Processing makro. Når først startet, vil Image_Processing automatisk videre gennem syninger, stabling og baggrunden subtraktion.
5. scoring celledød
Bemærk: Se diskussion sektion for mere information om scoring celledød og censurerende data.
- Find billedstakke produceret af Image_Processing script. Åbn disse i FIJI.
- Bruge den pege redskab inden for FIJI individuelt mærke hver celle med et antal. Tryk på t , efter hvert punkt vil tilføje celle-id til ROI (region af interesse) Manager.
Bemærk: Identifikatorerne kan visualiseres ved at klikke på etiketter og Vis alle afkrydsningsfelterne i ROI Manager. -
Fremskridt gennem timepoints i hver billedstak og post tidspunkt når hver celle enten dør eller skal censureres i filen Survival_spreadsheet.csv (Se supplerende fil 3).
- Hver celle optager en enkelt række i regnearket, hvor en unik identifikator (ID) for hver enkelt celle består af dens svarer godt og ROI nummer inden for at nå. tp_death er den sidste tid en celle er observeret for at være i live, mens time_death repræsenterer de faktiske dødstidspunktet i timer. Indtaste disse data for hver celle. Det er afgørende at bevare denne struktur til efterfølgende analyse ved hjælp af overlevelse. R (Se supplerende fil 4).
Bemærk: Kriterier for fastlæggelse af celledød er afgørende og kan variere afhængigt af celletype. Tre hovedkriterier er brugt i identifikation af døde neuroner11,20 (figur 3): tab af fluorescens intensitet (fx Neuron 1 på 69 h), afrunding af cellen kroppen (fx Neuron 2 på 188 h), og tab af neurite integritet eller blebbing (f.eks. Neuron 2 på 188 h).
- Hver celle optager en enkelt række i regnearket, hvor en unik identifikator (ID) for hver enkelt celle består af dens svarer godt og ROI nummer inden for at nå. tp_death er den sidste tid en celle er observeret for at være i live, mens time_death repræsenterer de faktiske dødstidspunktet i timer. Indtaste disse data for hver celle. Det er afgørende at bevare denne struktur til efterfølgende analyse ved hjælp af overlevelse. R (Se supplerende fil 4).
- Registrere censor status for cellen i den sidste kolonne.
Bemærk: Her, på grund af den særegne måde censurerer håndteres af R, censureret celler er markeret med 0, mens ucensureret celler er markeret med 1. Bemærk at alle celler, der lever til det sidste tidspunkt censureret, og derfor markeret som 0.
6. udføre Cox Proportional farer analyse og visualisere resultater
- Hvis det er nødvendigt, download R studio på https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- Åbne R studio og dobbeltklik på ikonet for overlevelse. R script.
- Placer markøren på linje 2 af overlevelse. R og klik på knappen run i R-studio hovedvinduet for at indlæse biblioteket overlevelse.
- Ændre linje 5 af overlevelse. R script til at matche placeringen af fil Survival_spreadsheet.csv. Klik på Kør at indlæse overlevelsesdata om som en dataframe.
- Fremhæve linje 8 og 9 og klik på knappen Kør i vinduet R Atelier konsol for at udføre Cox proportional farer analyse. Resultater og output statistik vises i konsolvinduet af R studio.
- Fremhæve linjer 12-16 af overlevelse. R og tryk på knappen Kør for at producere en kumulativ risiko for død plot, som vises i fanen parceller i R studio. Denne fil kan blive frelst ved at klikke på knappen Eksporter over plottet.
- Hvis det er ønskeligt at afbilde overlevelsesdata som en Kaplan-Meier-kurve, fremhæve linjer 19-24 af overlevelse. R og tryk på knappen Kør .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse af Transfektion proceduren beskrevet her, var DIV4 rat kortikale neuroner transfekteret med en plasmid kodning fluorescerende proteiner mApple. Start 24 h efter Transfektion, blev celler afbildet af Fluorescens mikroskopi hver 24 h i 10 på hinanden følgende dage. De resulterende billeder var organiseret som angivet i figur 2, så syet, stablet og scorede for celledød (figur 1). Figur 3 viser et tidsforløb for 3 repræsentative neuroner, to af hvilken dør i løbet af eksperimentet (neuroner 1 og 2) mens tredje overlever (Neuron 3).
Overlevelsesdata blev analyseret ved hjælp af R script leveres (overlevelse. R), og resultaterne opsummeres i figur 4. Tabel genereret ved kører linje 7 og 8 i overlevelse. R kode indeholder en oversigt over Cox proportional farer analyse. Fire særligt vigtige statistikker i tabellen er fremhævet i figur 4A. Nummeret i boksen 1 repræsenterer hazard ratio for gruppen "Mutant" i forhold til "WT". Bemærk, at gruppen "WT" ikke er angivet. Dette er fordi gruppen "WT" fungerer som referencebefolkning - risikoen for død observeret i alle andre grupper er sammenlignet med reference befolkningen til at beregne hazard ratio. Hazard ratio større end 1, angiver et hurtigere tempo af død i forhold til befolkningens reference, og værdier mindre end 1 repræsenterer derfor en reduceret sats af dødsfald. I eksemplet forudsat, vises muterede celler en hazard ratio af 2.2, hvilket betyder, at de døde 2,2 x hurtigere end WT celler. Som standard vil R arrangere grupperne i alfanumerisk rækkefølge, med den øverste gruppe der tjener som referencebefolkning. Placere tal foran gruppenavne er en nem måde at skabe den orden, hvori de evalueres. Værdierne i boksene 2 og 3 repræsenterer p-værdier og 95% konfidensintervaller for hazard nøgletal, henholdsvis, beregnet af Cox proportional farer analyse. I rubrik 4, er resultaterne af log-rank test rapporteret. Denne test vurderer, om der er en statistisk signifikant forskel i overlevelsen blandt befolkninger bliver testet, men ikke beskrive hvilke grupper er forskellige fra de andre, og beregner ikke en størrelsesorden til den observerede forskel.
Kaplan-Meier kurver (figur 4B) er udbredt i kliniske forsøg for at vurdere virkningerne af en intervention på patienternes overlevelse. Af denne grund er mange forskere fortrolig med fortolkning overlevelsesdata visualiseret på denne måde. I forbindelse med enkelt-celle overlevelse skildrer disse parceller brøkdel af celler i live over tid i hver gruppe. I stedet for at plotte celle overlevelse er en alternativ fremgangsmåde at skildre satsen af celledød i hver gruppe via en kumulativ risiko for død plot (figur 4 c). I de fleste undersøgelser, overlevelse følger antallet af begivenheder, ikke en lineær progression; i stedet for en given sats af død er et større antal begivenheder observeret på tidligere tidspunkter. For eksempel, i en population af 100 celler, vil hvis 20% af celler dør mellem intervaller, derefter 20 celler dø med det første interval 16 under det andet interval, 13 under det tredje interval, og så videre. Denne logaritmisk tendens er begrebsmæssigt nemmere at visualisere ved hjælp af kumulative risiko for død parceller, da y-aksen repræsenterer negative log transformeringen af cellulære overlevelse. Alternativt, y-aksen af den kumulerede risiko for død plot kan også blive præsenteret som % celledød, beregnes som 1-1/ekumulative risiko for død. Disse plots aktiverer også ligetil sammenligninger af risikoen for død mellem populationer. Omfanget af hazard ratio afspejler hældningen af kumulative risikoen for død plot for hver befolkning, i forhold til referencegruppen.
Figur 1: skema for en typisk overlevelse eksperiment. Rotte kortikale neuroner er transfekteret på DIV4 ved hjælp af den procedure, der er beskrevet i denne artikel. Start 24 h efter Transfektion, er celler afbildet med regelmæssigt fordelte intervaller i overensstemmelse med de særlige krav i eksperimentet. Billeder er syet og stablet før celledød er scoret, og Cox proportional hazard analysis bruges til at sammenligne risikoen for død mellem populationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kræves filstruktur. Den angivne FIJI makro kræver, at de rå data er formateret på en bestemt måde. For at udnytte organisere Image_Processing, de rå data som vist til venstre. Et eksempel eksperiment og ledsager filstrukturen er vist til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Scoring celledød i transfekteret rotte kortikale neuroner. Ved hjælp af de metoder, der beskrives i denne artikel, var rotte kortikale neuroner transfekteret med en plasmid kodning fluorescerende proteiner mApple. Celler blev derefter afbildet ca hver 24 h, billederne blev syet og stablet og celledød scorede ved hjælp af de anførte kriterier. Celledød er indiceret til Neuron 1 på 69 h, som det fremgår af tab af fluorescens. Neuron 2 dør på 188 h, som angivet af fragmentering af processerne og afrunding af cellen kroppen. Neuron 3 overlever for varigheden af forsøget. Bemærk, at nogle celler blive synlige kun sent i eksperimentet, som det fremgår af fremkomsten af en ny celle på 235 h. Kun celler, der er synlige på det oprindelige tidspunkt Imaging er inkluderet i efterfølgende analyser. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: fortolkning af Cox proportional hazard analysis. (A) output Resumé omfatter fire vigtige statistikker, der er fremhævet i denne figur. Boks 1 indeholder hazard ratio af den eksperimentelle gruppe i forhold til kontrolgruppen, mens rubrik 2 og rubrik 3 viser p-værdier og 95% konfidensinterval for hver hazard ratio, henholdsvis. Rubrik 4 fremhæver resultaterne af log-rank test. Disse data er også skildret via en Kaplan-Meier-kurve (B) og en kumulativ risiko for død plot (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenteres metode til direkte overvågning af neuronal overlevelse på grundlag af enkelt celle. I modsætning til traditionelle assays til celledød, der er begrænset til diskret tid point og hele populationer af celler, denne metode giver mulighed for kontinuerlig vurdering af en række faktorer såsom cellulære morfologi, protein udtryk eller lokalisering, og kan bestemme, hvordan hver faktor påvirker cellulære overlevelse i en fremadrettet måde.
Denne metode kan ændres så det passer til en bred vifte af eksperimentelle behov. Hyppighed og varighed af imaging nemt kan justeres, og enhver protein af interesse kan være co transfected med fluorescerende markør til model sygdomstilstande eller undersøge protein funktion13,14,15, 16,17,18,19. Selvom denne artikel beskriver den optimale procedure for transfecting rotte kortikale neuroner, kan eksperimentelle skemaet anvendes til enhver post mitotiske celletype. Dog de optimale Transfektion betingelser kan skal optimeres på pr. celle linje basis, og substrater kan skal justeres for at forhindre celler fra sammenklumpning eller flytte for meget pålideligt spore.
Billede behandling og analyse krav varierer afhængigt af de specifikke parametre for hver langsgående mikroskopi eksperiment. En kort forklaring af hver kritisk trin er medtaget nedenfor for at tilpasse protokollen til bedre match et eksperiment krav.
Syning: Hvis en montage af billeder er taget, syninger kan udføres for at oprette en enkelt, større billede for hver synsfelt. For de fleste programmer er det at foretrække at udføre syninger før stabling. Hvis kun ét billede er taget pr. brønd, er der ingen grund til at udføre dette trin.
Stabling: I stedet for sporing celler over tid på tværs af særskilte billedfiler, kan stabling udføres for at justere på hinanden følgende billeder i en enkelt gang serie, svarer til et stop billedanimation. Med vellykkede fiduciary justering, vil de enkelte frames bestående af stablede billedet blive nøje tilpasset. Men hvis der er mærkbar skiftehold eller rotationer mellem billeder, billede registrering er nødvendig. Makroen Image_Processing udfører automatisk registrering ved hjælp af FIJI plugin "MultiStackReg." Dette plugin hjælper med at reducere små forskydninger mellem imaging kører. Dog med betydelige forskydninger, manuelt beskæring og omlaegning billeder kan være påkrævet.
Baggrund subtraktion (valgfri): en potentiel spørgsmål, der måtte opstå under image erhvervelse er ujævn belysning. Dette vil resultere i variationer i signal intensitet på tværs af et billede, der kan forvirre estimater af fluorescens intensitet. I disse tilfælde kan intensitet variationer elimineres ved baggrund subtraktion teknikker. Disse er især relevante med lavt signal til støj forhold, hvor intensitet forskydninger på grund af ujævn belysning kan sammenlignes i størrelsesorden signal af fluorophore, sig selv. Der er mange baggrund subtraktion algoritmer, hvoraf flere har knyttet FIJI plugins. Valget af hvilken algoritme at bruge afhænger af egenskaberne af billedet selv og signalet måles. I FIJI makro Image_Processing, brugeren får mulighed for at udføre "rullende bold" baggrund subtraktion på et stablet sæt af billeder (linje 14). I denne metode bestemmes en lokale baggrund for hver pixel-baseret på den gennemsnitlige intensitet i en cirkel omkring, at pixel. Denne værdi er derefter trækkes fra den oprindelige pixelværdi. Den optimale værdi for radius for cirklen bruges til lokale baggrund skøn vil variere baseret på diameteren af den største forgrundsobjekt i billedet.
Scoring celledød: For nøjagtig sammenligninger mellem befolkninger er det vigtigt, at de kriterier, der er beskrevet ovenfor for at identificere døde neuroner anvendes konsekvent på tværs af hele datasættet. Derudover eliminerer blændende enkeltpersoner scoring celledød til de eksperimentelle grupper undersøgte potentielle kilder til bias. Afhængigt af de specifikke kriterier og deres generalizability, kan de blive indarbejdet i automatiserede algoritmer for uvildig vurdering af cellulære overlevelse15,16,17,18, 19.
I forbindelse med overlevelse analyse og andre tid til begivenhed analyser er der tre mulige udfald. Først, begivenheden (celledød) er opstået, og det tidspunkt, hvor hændelsen indtraf registreres. For det andet opstår hændelsen ikke under tidsramme for observation. Disse bemærkninger er censureret ved afslutningen af forsøget. For det tredje kunne hændelsen ikke scoret fordi cellen flyttede ud af synsfeltet, eller var skjult af nærliggende celler. I dette tilfælde, er cellen censureret når det kan ikke længere blive korrekt sporet. For det første resultat, kan den præcise timing af celledød være vanskeligt at bestemme baseret på den billeddiagnostiske interval. For eksempel kan en celle, der er i live i første omgang men markeret som døde 24 timer senere døde på ethvert tidspunkt inden for denne frist, 24 h. For at være konservativ, er det god praksis at registrere tidspunktet for døden som den sidste tid en celle trygt kan identificeres som alive (venstre censur).
Udfører Cox proportional farer analyse og visualisere resultater: scriptet ledsagende Survival.R muliggør sammenligning af risiko for dødsfald blandt befolkninger og deres statistiske betydning ved hjælp af Cox proportional farer analyse (figur 4A), og også plot resultater som enten en Kaplan-Meier-kurve (figur 4B) eller en kumulativ risiko for død plot (figur 4 c). Overlevelses analyse, Cox proportional farer analyse og pakken "overlevelse" i R er beskrevet mere detaljeret med Christensen12 og på https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
Ved at tilpasse de procedurer, der er skitseret her, kan en række neuronal funktioner være relateret til overlevelse. Generation af en ROI omkring cellen kroppen og/eller kerne kan brugeren langs overvåge Cellestørrelse og morfologi, protein udtryk niveau og lokalisering eller dannelsen af subcellulært strukturer såsom puncta eller protein aggregater13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. vigtigere, fordi hver af disse faktorer er observeret i forhold til celledød, det er muligt at kvantitativt afgøre, hvor godt enkelte faktorer forudsige cellulære overlevelse eller død under den givne tidsramme. Protein metabolisme og cellulære veje kan også analyseres ved at udtrykke fluorescerende journalister, der giver real-time målinger af underliggende cellulær fysiologi (e.g., gCaMP6f til assay aktivitet). Ved at ansætte denne kraftfulde tilgang, kan faktorer, der styrer cellulære vedligeholdelse, funktion og dysfunktion være afdækket og undersøgt i detaljer, dermed inspirerende nye veje til undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Steve Finkbeiner og medlemmer af Finkbeiner lab for banebrydende robot mikroskopi. Vi takker også Dan Peisach for bygning, den oprindelige software kræves til billedbehandling og automatiseret overlevelses analyse. Dette arbejde blev finansieret af National Institute for neurologiske lidelser og slagtilfælde (NINDS) R01-NS097542, University of Michigan Protein Folding sygdom initiativ og Ann Arbor aktivt mod ALS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
