Summary
Hier presenteren we een protocol om te controleren van de overleving op basis van de eencellige en identificeren van variabelen die aanzienlijk celdood voorspellen.
Abstract
Standaard cytotoxiciteit testen, waarvoor de collectie lysates of vaste cellen op meerdere tijdstippen, hebben beperkte gevoeligheid en capaciteit te beoordelen factoren die van invloed zijn neuronale lot. Deze tests vereisen de waarneming van afzonderlijke populaties van cellen in discrete tijd punten. Dientengevolge, kunnen niet afzonderlijke cellen prospectief na verloop van tijd ernstig beperken het vermogen om te discrimineren of subcellular gebeurtenissen, zoals de vorming van de puncta of eiwit mislocalization, pathogene bestuurders van ziekte, homeostatische reacties, worden gevolgd of louter toeval verschijnselen. Eencellige longitudinale microscopie overwint deze beperkingen, waardoor de onderzoeker om te bepalen van verschillen in overleving tussen populaties en tekenen van causale relaties met verbeterde gevoeligheid. Deze video-gids zal schetsen een representatieve workflow voor experimenten eencellige voortbestaan van rat primaire corticale neuronen uitdrukken van een fluorescente proteïne marker te meten. De kijker leert hoe bereiken hoogrenderende transfections, verzamelen en verwerken van beelden, waardoor de potentiële tracking van afzonderlijke cellen en vergelijken van de relatieve overleving van neuronale populaties met behulp van Cox proportionele gevaren analyse.
Introduction
Abnormale celdood is een drijvende factor in vele ziekten, waaronder kanker, neurodegeneratie en lijn1. Robuust en gevoelige testen voor de dood van de cel zijn essentieel voor de karakterisatie van deze aandoeningen, evenals de ontwikkeling van therapeutische strategieën tot verlenging of vermindering van de cellulaire overleven. Er zijn momenteel tientallen technieken voor het meten van celdood, ofwel rechtstreeks ofwel via surrogaat markeringen2. Bijvoorbeeld, kan celdood visueel worden beoordeeld met behulp van vitale kleurstoffen die selectief vlek dode of levende cellen3, of door de controle van het uiterlijk van specifieke fosfolipiden op het plasmamembraan4,5,6 . Metingen van intracellulaire componenten of cellulaire metabolieten vrijkomen van de media bij cellulaire ontbinding kunnen ook worden gebruikt als proxy's voor7,8van de dood van de cel. U kunt ook kan cellulaire levensvatbaarheid worden benaderd door metabole activiteit9,10te beoordelen. Al deze methoden snelle middel om de beoordeling overleving van de cel bieden, zijn zij niet zonder voorbehoud. Elke techniek merkt de cultuur als een enkele populatie, waardoor het onmogelijk is om te onderscheiden tussen afzonderlijke cellen en hun unieke tarieven van overleving. Bovendien zijn deze gehaltebepalingen bevolking gebaseerde kunnen factoren die belangrijk voor de dood van de cel zijn kunnen, met inbegrip van cellulaire morfologie, eiwit expressie of lokalisatie gemeten. In veel gevallen, deze tests zijn beperkt tot discrete tijd punten, en sta niet voor de continue waarneming van cellen na verloop van tijd.
In tegenstelling, is longitudinale fluorescentie microscopie een zeer flexibele methodologie die rechtstreeks en continu het risico van overlijden op een eencellige basis11 monitoren. Kortom, kunt longitudinale fluorescentie microscopie duizenden afzonderlijke cellen worden bijgehouden op regelmatige tijdstippen gedurende langere perioden van tijd, waardoor nauwkeurige metingen van celdood en de factoren die het versterken of onderdrukken van celdood. Aan de basis wordt bij deze methode de voorbijgaande transfectie of signaaltransductie van cellen met vectoren codering van fluorescente proteïnen. Een unieke fiduciaire is dan vastgesteld en de positie van elke transfected cel met betrekking tot deze mijlpaal kan de gebruiker image & bijhouden van afzonderlijke cellen in de loop van uren, dagen of weken. Als deze beelden opeenvolgend worden weergegeven, wordt celdood gekenmerkt door karakteristieke wijzigingen in fluorescentie, morfologie en versnippering van het lichaam van de cel, waardoor de toewijzing van een moment van overlijden voor elke cel. Het berekende percentage van de dood, bepaald door de gevaar-functie, kan vervolgens worden kwantitatief vergeleken tussen voorwaarden, of aan het selecteren van cellulaire kenmerken met behulp van univariate of multivariate Cox proportionele gevaren analyse12gerelateerde. Deze benaderingen kunnen samen de correcte en objectieve discriminatie van tarieven van celdood onder mobiele bevolkingsgroepen, en de identificatie van variabelen die aanzienlijk celdood en/of survival (Figuur 1 voorspellen).
Hoewel deze methode kan worden gebruikt om te overleven in een post mitotische celtype in een verscheidenheid van formaten plating controleren, zal dit protocol voorwaarden voor transfecting en corticale neuronen rat gekweekt in een 96-wells-plaat imaging beschrijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle gewervelde dieren werk werd goedgekeurd door de Commissie op het gebruik en de verzorging van dieren aan de Universiteit van Michigan (protocol # PRO00007096). Experimenten zijn zorgvuldig gepland om te minimaliseren van het aantal dieren geofferd. Zwangere vrouwen wild-type (WT), niet-transgene lange Evans ratten (Rattus norvegicus) zijn afzonderlijk ondergebracht in kamers uitgerust met milieu verrijking en verzorgd door de eenheid voor laboratorium dier geneeskunde (ULAM) aan de Universiteit van Michigan, in komstig de NIH-ondersteunde gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Alle ratten werden gehouden in routine huisvesting voor zo weinig mogelijk voorafgaand aan de euthanasie, conform de aanbevelingen van de richtsnoeren inzake euthanasie van de Amerikaanse veterinaire medische vereniging en de Universiteit van Michigan tijd methoden van euthanasie door Soorten richtsnoeren.
1. materiële voorbereiding
- Ontleden van corticale neuronen van embryonale dag die 19 – 20 rat pups en cultuur corticale neuronen op 0,5 x 106 cellen per milliliter op poly-D-lysine gecoate platen voor 4 dagen in vitro, rat zoals eerder beschreven13,14, 15,16,17,18,19.
- Voorbereiden van de plasmide DNA van belang na de stappen door een endotoxine-vrije plasmide DNA isolatie kit (Zie Tabel van materialen). Kwantificeren van de resulterende DNA met een spectrofotometer.
- Bij in vitro dag 4 (DIV4), aliquoot, filter steriliseren en Incubeer de volgende media op 37 ° C: 6 mL verminderd serum media (RSM; bijvoorbeeld., OptiMEM), 25 mL neuronale basale media (NBM), 40 mL NBKY (NBM + 1 mM kynurenic zuur + 10 mM MgCl2, aangepast aan een pH van 7. 4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronale cel cultuur supplement + 1 x L-glutamine supplement + 1 x Pen Strep).
Opmerking: Volumes vermeld zijn voldoende voor transfecting een 96-wells-plaat. Verwijzen naar de Tabel van de materialen voor specifieke reagentia.
2. de transfectie van Rat corticale neuronen
- Het gegeven voorbeeld transfectie blad wijzigen (Zie aanvullende bestand 1) door het aanpassen van de plaat type, plaat, kaart, aantal Ani, DNA-concentratie en aantal wells ("groene dozen").
Opmerking: Het totale DNA bedragen naar 0,2 µg per putje, ongeacht of men (bijv.., DNA-A) of meerdere (bijvoorbeeld DNA B en C) DNA-constructies worden toegevoegd aan elk putje. - Werken vanuit de spreadsheet, combineren de juiste hoeveelheid RSM en DNA in één buis. Het combineren van de juiste hoeveelheid RSM en transfectie reagens (bijvoorbeeld Lipofectamine) in een aparte buis.
- Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
- Combineren van het DNA en transfectie reagens RSM mengsels en Incubeer bij RT gedurende 20 min.
- Tijdens deze stap van de incubatie, gebruik maken van een meerkanaalspipet en steriele kunststof troggen te wassen 2 x met 100 µL per putje van NBM cellen. De geconditioneerde media (CM) reserveren en op te slaan bij 37 ° C. Voor dit en stappen uit te voeren, zorgen om te minimaliseren van de hoeveelheid tijd die neuronen worden blootgesteld aan lucht.
- Verwijder de NBM-media en vervang met 100 µL per putje van NBKY.
- Na 20 minuten verstreken zijn, voeg toe 50 µL van het mengsel van transfectie reagens/DNA ontkleuring aan elk putje.
- Incubeer de cellen met de transfectie reagens/DNA complexen gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
- Spoel 2 x met NBKY en vervangen door 100 µL van CM en NBC 100 µL per putje.
- Succesvol transfected cellen moeten zichtbaar door fluorescentie microscopie binnen 16 – 24 h van transfectie zijn. Te meten van efficiëntie, een fluorescente microscoop te gebruiken om te controleren van de transfectie na overnachting incubatie bij 37 ° C.
Opmerking: Deze techniek resulteert in een totaal rendement van de transfectie van 5 tot 10%.
3. beeldvorming
- Plaats de plaat op een fluorescente microscoop met een gemotoriseerde stadium, en stellen een fiduciaire (bijvoorbeeld een merk aan de onderkant van de plaat), waarmee de gebruiker naar het uitlijnen van de plaat telkens wanneer die het image is gemaakt. Een afbeelding van dit fiduciaire voor verwijzing opslaan.
- Navigeer naar een gebied van belang en Let op de x-en y-coördinaten ten opzichte van de fiduciaire.
- Focus op transfected cellen, uiting geven aan een fluorescerende label.
- Deelnemen aan fluorescerende afbeeldingen het juiste kanaal of kanalen (bijv. rood fluorescerende eiwit [RFP], groen fluorescent proteïne [GFP], 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] '), handmatig of op een geautomatiseerde manier. Door verschillende opnamen tussenpozen regelmatig regelafstand, een montage van de put tijdens beeldverwerking kan worden gemonteerd (zie stap 4).
Opmerking: De afstand is afhankelijk van verschillende factoren, zoals de vergroting, de optica van de Microscoop, en de grootte van de detector. In het algemeen zullen de optische afstand tussen aangrenzende afbeeldingen tussen 90-95% van de grootte van elke afzonderlijke afbeelding, voorzien van een kleine mate van overlapping van de afbeelding te voorzien van uitlijning. - Herhaal dit proces zo vaak als nodig, aanpassing aan de oorspronkelijke fiduciaire telkens. Voor de analyse van de overleving plaatsvindt imaging elke 6-24 h, afhankelijk van het celtype en het doel van het experiment.
4. de beeldverwerking
Opmerking: Na overname van de afbeelding moeten een reeks stappen worden verwerkt vóór beeldanalyse. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, stiksels, stapelmogelijkheden en achtergrond aftrekken (Figuur 1). Het doel van deze stappen is een afbeeldingsstapel, of tijdreeksen, waarin cellen zijn duidelijk waarneembaar is vanuit hun achtergrond en makkelijk te volgen over meerdere tijdstippen te produceren. Een toegewijde FIJI macro (Image_Processing.ijm, Zie aanvullende bestand 2) voert basic stiksels, stapelen, en achtergrond van aftrekken. Een uitleg van elke stap en de parameters te overwegen bij het uitvoeren van beeldverwerking vindt u in de sectie discussie.
- Pas de onbewerkte gegevens of input map overeenkomen met de opmaak die is afgebeeld in Figuur 2.
- Als tijdstippen niet aaneengesloten (dat wil zeggen, T1, T2, T3), deze namen van mappen wijzigen zodat ze zijn. Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de Image_Processing macro niet crasht tijdens het stapelen.
- Dubbelklik op het pictogram van de Fiji open het programma, vervolgens klikt u op en sleep de macro Image_Processing naar de Fiji. Hiermee opent u de macro in Fiji.
- Lijnen 2-7 van de Image_Processing macro opgeven van de input map met afbeeldingen, de folder van de gewenste output voor gestikte en gestapelde afbeeldingen, aantal imaging timepoints, aantal fluorescerende kanalen en plaat-indeling aanpassen.
- Bepaalt de volgorde waarin de beelden werden verworven. Om dit te testen, steek handmatig een montage van beelden in FIJI door manoeuvreren naar de Plugins vervolgkeuzemenu | Binddraad | Raster/collectie stiksel. Pas de instellingen binnen de dropdown menu's Type en volgorde totdat een nauwkeurig gestikte afbeelding wordt geproduceerd.
- Aanpassen van de variabelen van het GRID_TYPE en STITCH_ORDER in de regels 8 en 9 van de Image_Processing macro die overeenkomen met deze selecties.
- Geef het aantal beelden per putje door metrolijn 10 in de Image_Processing macro aan te passen.
Opmerking: Voor de montage van een 2 x 2 van beelden, deze regel zou luiden DIM = 2. - Als achtergrond aftrekken vereist is, passen lijn 14 van de macro Image_Processing BGSUB = true.
- Stel de rolstraal van de bal door lijn 15 in de Image_Processing macro aan te passen.
Opmerking: Stel de straal in te stellen op ten minste het voor optimale resultaten, diameter van de grootste object op de voorgrond in de afbeelding. - Klik op uitvoeren om te starten van de macro Image_Processing . Eenmaal gestart, zal de Image_Processing automatisch vooraf via stiksels, stapelmogelijkheden en achtergrond aftrekken.
5. scoren celdood
Opmerking: Zie de sectie discussie voor meer informatie over scoren celdood en censureert gegevens.
- Zoek de afbeeldingsstapels geproduceerd door het Image_Processing script. Open deze in FIJI.
- Kunt de wijs hulpprogramma binnen FIJI afzonderlijk label elke cel met een getal. Op t te drukken na elke punt de cel-id aan de ROI (regio-of-interest) Manager toevoegen zal.
Opmerking: De id's kunnen worden gevisualiseerd door te klikken op de etiketten en Toon alle selectievakjes in de Manager van de ROI. -
Vooruitgang door middel van de timepoints in elke afbeeldingsstapel en record het timepoint wanneer elke cel of sterft of moet worden gecensureerd in het bestand Survival_spreadsheet.csv (Zie aanvullende bestand 3).
- Elke cel is gevestigd in één rij in het werkblad, waarin een unieke identificatie (ID) voor elke cel bestaat uit haar goed overeenkomt en ROI getal in dat goed. tp_death is het laatste punt van de tijd dat een cel wordt waargenomen om te leven, terwijl time_death staat voor het werkelijke tijdstip van overlijden in uren. Voor elke cel, deze gegevens invoeren. Het is essentieel voor het handhaven van deze structuur voor latere analyse met behulp van de overleven. R (Zie aanvullende bestand 4).
Opmerking: De criteria voor het bepalen van de dood van de cel zijn van cruciaal belang en kunnen variëren afhankelijk van het celtype. Drie belangrijkste criteria worden gebruikt bij de identificatie van dode neuronen11,20 (Figuur 3): verlies van de intensiteit van de fluorescentie (bijvoorbeeld Neuron 1 bij 69 h), afronding van de cel lichaam (bijvoorbeeld Neuron 2 op 188 h), en het verlies van neurite integriteit of blebbing (bijvoorbeeld Neuron 2 op 188 h).
- Elke cel is gevestigd in één rij in het werkblad, waarin een unieke identificatie (ID) voor elke cel bestaat uit haar goed overeenkomt en ROI getal in dat goed. tp_death is het laatste punt van de tijd dat een cel wordt waargenomen om te leven, terwijl time_death staat voor het werkelijke tijdstip van overlijden in uren. Voor elke cel, deze gegevens invoeren. Het is essentieel voor het handhaven van deze structuur voor latere analyse met behulp van de overleven. R (Zie aanvullende bestand 4).
- De status van de censuur van de cel in de laatste kolom opnemen.
Opmerking: Hier, als gevolg van de eigenaardige manier censuur wordt behandeld door R, gecensureerde cellen zijn gemarkeerd door 0, terwijl ongecensureerde cellen zijn gemarkeerd door 1. Merk op dat alle cellen die naar het laatste tijdstip leven zijn gecensureerd en daarom gemarkeerd als 0.
6. het uitvoeren van Cox evenredige gevaren analyse en visualiseren van resultaten
- Indien nodig, R studio op https://cran.r-project.org/mirrors.html downloaden.
- Open R studio en dubbelklik op het pictogram voor het voortbestaan van de . R script.
- Plaats de cursor op regel 2 overleven. R en klik op uitvoeren in het hoofdvenster van de R-studio om het laden van de overleving library.
- Lijn 5 van het voortbestaan van de wijzigen R script om de locatie van het bestand Survival_spreadsheet.csv. Klik op uitvoeren om de gegevens van de overleving als een dataframe te laden.
- Markeer lijnen 8 en 9 en klik op uitvoeren in het consolevenster van R studio om Cox proportionele gevaren analyses uit te voeren. Resultaten en statistieken van de uitvoer weergegeven in het consolevenster van R-studio.
- Markeer lijnen 12-16 overleven. R en druk op de knop uitvoeren om te produceren een cumulatieve risico van dood perceel, die op het tabblad van de percelen in R-studio verschijnen zal. Dit bestand kan worden opgeslagen door te klikken op de knop exporteren boven de plot.
- Zo is het wenselijk om de gegevens van de overleving als een Kaplan-Meier curve uitzetten, markering lijnen 19-24 overleven. R en druk op de knop uitvoeren .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de procedure van de transfectie hier, waren DIV4 rat corticale neuronen transfected met een plasmide codering van de fluorescente proteïne mApple. Begin 24u na transfectie, werden cellen beeld door fluorescentie microscopie elke 24u voor 10 opeenvolgende dagen. De resulterende afbeeldingen werden georganiseerd zoals aangegeven in Figuur 2, dan gestikt, gestapeld en scoorde voor de dood van de cel (Figuur 1). Figuur 3 toont een tijdsverloop voor 3 representatieve neuronen, overleeft twee van die sterven in de loop van het experiment (neuronen 1en 2) terwijl de derde (Neuron 3).
Overleving gegevens werden geanalyseerd met behulp van de R script dat wordt geleverd (overleving. R), en de resultaten samengevat in Figuur 4. De tabel gegenereerd bij het uitvoeren van de lijnen 7 en 8 van het voortbestaan van de . R code geeft een samenvatting van de Cox proportionele gevaren analyse. Vier bijzonder belangrijke statistieken in de tabel zijn in figuur 4Agemarkeerd. Het getal in het vak 1 vertegenwoordigt de verhouding van de risico's voor de groep "Mutant" ten opzichte van "WT". Merk op dat de "WT"-groep niet wordt weergegeven. Dit is omdat de groep "WT" als de referentiepopulatie fungeert-het risico op overlijden waargenomen in alle andere groepen wordt vergeleken met die van de referentiepopulatie voor de berekening van de verhouding gevaren. Daarom vertegenwoordigen hazard ratio groter dan 1 geeft aan dat een hoger groeitempo dood ten opzichte van de referentiepopulatie en kleiner dan 1 waarden een verlaagd tarief van dood. In het voorbeeld, weergeven gemuteerde cellen een hazard ratio van 2.2, wat betekent dat ze stierf 2.2 x sneller dan WT cellen. Standaard zorgt R de groepen in alfanumerieke volgorde, met de bovenste groep bijeenkomen van de referentiepopulatie. Het plaatsen van getallen voor groepsnamen is een gemakkelijke manier om de volgorde waarin ze worden geëvalueerd. De waarden in de vakken 2 en 3 vertegenwoordigen de p-waarden en de 95%-betrouwbaarheidsintervallen voor de hazard ratio's, respectievelijk, berekend door Cox proportionele gevaren-analyse. In vak 4, worden de resultaten van de log-rank test gemeld. Deze test bepaalt of er een statistisch significant verschil in overleving tussen populaties wordt getest is, maar wordt hier niet beschreven welke groepen zijn anders dan de anderen, en niet een omvang voor het geobserveerde verschil berekend.
Kaplan Meier curves (figuur 4B) worden veel gebruikt in de klinische proeven voor de evaluatie van de effecten van een interventie op patiënten overleven. Om deze reden zijn veel onderzoekers vertrouwd met het interpreteren van gegevens van de overleving op deze manier gevisualiseerd. In het kader van eencellige overleven verbeelden deze percelen de breuk van cellen leven na verloop van tijd in elke groep. In plaats van plotting overleving van de cel is een alternatieve aanpak verbeelden het tarief van celdood in elke groep via een cumulatieve risico van dood plot (figuur 4C). In de meeste studies van de overleving volgt het aantal gebeurtenissen niet een lineaire progressie; Integendeel, voor een bepaald tarief van dood een groter aantal gebeurtenissen wordt waargenomen in vroegere tijden. Bijvoorbeeld, in een populatie van 100 cellen, zullen als 20% van de cellen sterven tussen intervallen, vervolgens 20 cellen sterven binnen de eerste interval, 16 tijdens het tweede interval, 13 tijdens het derde interval, enzovoort. Deze logaritmische trend is conceptueel eenvoudiger te visualiseren met behulp van cumulatieve risico van dood percelen, omdat de y-as de negatieve log-transformatie van cellulaire overleven vertegenwoordigt. Alternatief, kan de y-as van het cumulatieve risico van dood plot ook worden gepresenteerd als de dood van de cel van het %, berekend als 1-1/ecumulatieve risico van overlijden. Deze percelen kunnen ook eenvoudige vergelijkingen van het risico van overlijden tussen populaties. De omvang van de hazard ratio weerspiegelt de helling van het cumulatieve risico van dood perceel voor elk volk, ten opzichte van dat van de referentiegroep.
Figuur 1: Schema voor een typische overleving experiment. Rat corticale neuronen zijn transfected op DIV4 met behulp van de procedure in dit artikel beschreven. Begin 24u na transfectie, zijn cellen beeld regelmatig verdeelde tussenpozen overeenkomstig de specifieke vereisten van het experiment. Beelden zijn gestikt en gestapeld voordat celdood wordt gescoord, en Cox proportionele risicoanalyse wordt gebruikt voor het vergelijken van het risico van overlijden tussen populaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vereist bestandsstructuur. De meegeleverde FIJI macro vereist dat de onbewerkte gegevens op een bepaalde manier zijn opgemaakt. Voor het gebruik van organiseren Image_Processing, de onbewerkte gegevens zoals aan de linkerkant. Een voorbeeld-experiment en de bijbehorende bestandsstructuur wordt weergegeven aan de rechterkant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: scoren van celdood in transfected rat corticale neuronen. Met behulp van de methoden in dit artikel beschreven waren rat corticale neuronen transfected met een plasmide codering van de fluorescente proteïne mApple. Cellen werden vervolgens beeld ongeveer elke 24 h, de beelden werden gestikt en gestapeld en celdood Gescored met de criteria. Celdood wordt aangegeven voor Neuron 1 69 h, zoals blijkt uit verlies van fluorescentie. Neuron 2 sterft op 188 h, zoals aangegeven door de versnippering van de processen en de afronding van de cel lichaam. Neuron 3 overleeft voor de duur van het experiment. Merk op dat sommige cellen zichtbaar pas laat in het experiment worden, zoals blijkt uit de weergave van een nieuwe cel bij 235 h. Alleen de cellen die zichtbaar op het eerste moment voor imaging zijn wordt opgenomen in latere analyses. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: interpretatie van Cox proportionele risicoanalyse. (A) de uitgang samenvatting omvat vier belangrijke statistieken die gemarkeerd worden weergegeven in deze afbeelding. Vak 1 omvat de hazard ratio van de experimentele groep ten opzichte van de controlegroep, terwijl Box 2 en Box 3 de p-waarden en de 95%-betrouwbaarheidsinterval voor elk gevaar verhouding, respectievelijk tonen. Vak 4 wijst op de resultaten van de log-rank test. Deze gegevens zijn ook afgebeeld via een Kaplan-Meier kromme (B) en een cumulatieve risico van dood plot (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier, wordt methodologie rechtstreeks volgen neuronale overleven op basis van de eencellige gepresenteerd. In tegenstelling tot traditionele testen voor celdood die beperkt tot discrete tijd punten en de hele bevolking van cellen zijn, deze methode die geschikt is voor de continue beoordeling van een aantal factoren, zoals cellulaire morfologie, eiwit expressie of lokalisatie, en kunt bepalen hoe elke factor cellulaire overleving in een prospectieve wijze beïnvloedt.
Deze methode kan worden aangepast voor een breed scala aan de experimentele behoeften passen. De frequentie en duur van imaging gemakkelijk kunnen worden aangepast kan, en een proteïne van belang mede transfected met de fluorescerende markering model ziekte staten of eiwit functie13,14,15, onderzoeken 16,17,18,19. Hoewel dit artikel de optimale methode beschrijft voor het transfecting van de rat corticale neuronen, kan de experimentele schema worden toegepast op elke post mitotische celtype. Echter de optimale transfectie voorwaarden mogelijk moet worden geoptimaliseerd op basis van per-cel lijn en substraten wellicht worden aangepast om te voorkomen dat cellen van samendoen of teveel verhuizen naar betrouwbaar bijhouden.
Afbeelding verwerking en analyse vereisten kunnen verschillen, afhankelijk van de specifieke parameters van elk experiment longitudinale microscopie. Een korte uitleg van elke kritieke stap is om te helpen met het aanpassen van het protocol tot betere match een experiment eisen hieronder opgenomen.
Stitching: als een montage van foto's is genomen, stiksels kan worden uitgevoerd als u wilt maken van één grotere afbeelding voor elke gezichtsveld. Voor de meeste toepassingen is het beter uit te voeren stiksels voorafgaand aan stapelen. Als slechts één afbeelding per putje wordt genomen, is er niet nodig voor het uitvoeren van deze stap.
Stapelen: In plaats van het bijhouden van cellen na verloop van tijd over afzonderlijke afbeeldingsbestanden, kan stapelen worden uitgevoerd als u wilt uitlijnen van opeenvolgende beelden in een enkele tijdreeksen, analoog aan een stop-frameanimatie. Met succesvolle fiduciaire uitlijning, zal de individuele frames bestaande uit de afbeelding van de gestapelde nauw worden afgestemd. Echter als er opvallende verschuivingen of rotaties tussen frames, is beeldregistratie nodig. De Image_Processing macro automatisch uitgevoerd registratie met behulp van de FIJI-plugin "MultiStackReg." Deze plugin helpt verminderen kleine onjuiste wisselkoersenverhoudingen tussen imaging runs. Niettemin, met aanzienlijke verschuivingen, handmatig bijsnijden en uitlijnen van afbeeldingen kunnen worden verlangd.
Achtergrond aftrekken (optioneel): een potentieel probleem dat kan ontstaan tijdens Beeldacquisitie is ongelijke verlichting. Dit zal leiden tot variaties in signaalsterkte over een afbeelding die ramingen van de intensiteit van de fluorescentie verwarren kan. In dergelijke gevallen kunnen de intensiteit variaties worden opgetreden door achtergrond aftrekken technieken. Dit zijn met name ter met lage signaal ruisverhoudingen, waar de intensiteit verschuivingen te wijten aan de ongelijke verlichting kunnen in omvang vergelijkbaar met het signaal van de fluorophore zelf. Er zijn veel achtergrond aftrekken algoritmen, waarvan er verscheidene FIJI plugins hebt gekoppeld. De keuze van welke algoritme te gebruiken hangt af van de eigenschappen van de afbeelding zelf en het signaal wordt gemeten. Binnen de FIJI macro Image_Processing, krijgt de gebruiker de optie voor het uitvoeren van de "rollende bal" achtergrond aftrekken op een gestapelde set van beelden (regel 14). Bij deze methode wordt een lokale achtergrond bepaald voor elke pixel op basis van de gemiddelde intensiteit van een cirkel rond die pixel. Deze waarde wordt vervolgens afgetrokken van de initiële waarde van de pixel. De optimale waarde voor de straal van de cirkel gebruikt voor lokale achtergrond schattingen zal verschillen op basis van de diameter van de grootste object op de voorgrond in de afbeelding.
Scoren celdood: Voor de nauwkeurige vergelijkingen tussen populaties is het essentieel dat de criteria die hierboven beschreven te identificeren van dode neuronen consequent worden toegepast op de gehele dataset. Bovendien, verblindende van de individuen scoren dood van de cel aan de experimentele groepen onderzochte elimineert potentiële bronnen van bias. Afhankelijk van de specifieke criteria en hun dan, kunnen ze worden opgenomen in geautomatiseerde algoritmen voor de onbevooroordeelde beoordeling van cellulaire overleven15,16,17,18, 19.
In het kader van survival analyse en andere tijd-aan-event-analyses zijn er drie mogelijke uitkomsten. Eerst de gebeurtenis (de dood van de cel) heeft plaatsgevonden, en de tijd waarop de gebeurtenis heeft plaatsgevonden wordt geregistreerd. Ten tweede, de gebeurtenis zich niet heeft voorgedaan tijdens het tijdsbestek van de observatie. Deze opmerkingen zijn gecensureerd op de voltooiing van het experiment. Ten derde, de gebeurtenis kon niet gescoord worden omdat de cel uit het gezichtsveld verplaatst, of werd overschaduwd door de nabijgelegen cellen. In dit geval wordt de cel gecensureerd, wanneer het niet langer nauwkeurig kan worden bijgehouden. Voor het eerste resultaat, kan de precieze timing van celdood moeilijk zijn om te bepalen op basis van de beeldvorming interval. Bijvoorbeeld, kan een cel die in eerste instantie leeft, maar gemarkeerd als dood 24 h later zijn gestorven op elk punt binnen die periode van 24 uur. Om zijn conservatieve, is het verstandig om te registreren de tijd van de dood als de laatste keer dat een cel kan gerust worden geïdentificeerd als levend (linker censureren).
Uitvoeren van Cox proportionele gevaren analyse en visualiseren van de resultaten: het begeleidende Survival.R -script maakt het vergelijken van risico op overlijden onder de bevolkingen en hun statistische significantie, met behulp van proportionele gevaren Cox analyse (figuur 4A), en ook perceel resultaten als een Kaplan-Meier-curve (figuur 4B) of een cumulatieve risico van dood plot (figuur 4C). Survival analyse, Cox proportionele gevaren, en het pakket "overleven" in R worden meer gedetailleerd beschreven door Christensen12 en op https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
Door aanpassing van de procedures die hier worden beschreven, kan een aantal neuronale functies betrekking hebben op overleving. Generatie van een ROI rond de cel lichaam en/of de nucleus kan de gebruiker controleren lengterichting Celgrootte en morfologie, eiwit expressie niveau en lokalisatie of de vorming van subcellular structuren zoals puncta of eiwit aggregaten13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. belangrijker, omdat elk van deze factoren wordt waargenomen met betrekking tot de dood van de cel, is het mogelijk kwantitatief bepalen hoe goed de afzonderlijke factoren voorspellen cellulaire overlevings- of dood tijdens de bepaald tijdsbestek. Eiwit metabolisme en cellulaire trajecten kunnen ook worden bepaald met het uitspreken van fluorescerende verslaggevers waarmee real-time metingen van onderliggende cellulaire fysiologie (bv., gCaMP6f te assay activiteit). Door gebruik te maken van deze krachtige aanpak, kunnen factoren die de cellulaire onderhoud, functie en dysfunctie blootgelegd en bestudeerde in detail, aldus inspirerende nieuwe wegen van onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Steve Finkbeiner en leden van de lab Finkbeiner voor baanbrekende robotic microscopie. Wij danken ook Dan Peisach voor gebouw de eerste software vereist voor beeldverwerking en geautomatiseerde survival analyse. Dit werk werd gefinancierd door het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en Stroke (NINDS) R01-NS097542, de Universiteit van Michigan Protein Folding ziekte initiatief en Ann Arbor actief tegen ALS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
