Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לפקח על הישרדות על בסיס תא בודד ולזהות משתנים באופן משמעותי לחזות מוות של תאים.
Abstract
מבחני סטנדרט cytotoxicity, אשר דורשים את האוסף של lysates או תאים קבוע בנקודות זמן מרובים, מוגבלת הרגישות ויכולת להעריך גורמים המשפיעים על גורל עצביים. מבחני אלה דורשים התצפית של אוכלוסיות נפרדות של תאים בנקודות זמן בדידים. כתוצאה מכך, תאים בודדים לא יכול להיות במעקב פרוספקטיבי לאורך זמן, מגבילה מאוד את היכולת להבחין בין אם אירועים subcellular, כגון היווצרות puncta או חלבון mislocalization, הם פתוגניים הנהגים של המחלה, תגובות homeostatic, . או תופעות רק צירוף מקרים... מיקרוסקופ האורך תא בודד מתגבר על מגבלות אלו, ומאפשר החוקר לקבוע הבדלים הישרדות בין אוכלוסיות וצייר סיבתי קשרי גומלין עם רגישות משופרת. מדריך וידאו זה מתאר עבודה נציג לניסויים מדידה תא בודד ההישרדות של החולדה הנוירונים קורטיקלית הראשית המבטאת סמן חלבון פלואורסצנטי. הצופה למד כיצד להשיג יעילות גבוהה transfections, לאסוף, לעבד תמונות המאפשר איתור פוטנציאליים של תאים בודדים, ולהשוות את ההישרדות היחסי של אוכלוסיות עצביים באמצעות ניתוח סיכונים ביחס קוקס.
Introduction
מוות של תאים חריגים מהווה גורם המניע במחלות רבות, כולל סרטן, הקשורים ניוון מוחיים של קו1. מבחני רגישות ועמיד עבור מוות תאים חיוניים האפיון של הפרעות אלה, כמו גם הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות תוך הרחבה או צמצום הישרדות הסלולר. כיום יש עשרות טכניקות למדידת מוות של תאים, באופן ישיר או באמצעות פונדקאית סמני2. לדוגמה, מוות של תאים יכולים להידרש באופן חזותי עם העזרה של המשתמשות באופן סלקטיבי כתם תאים מתים או חיים3צבעים חיוני, או על-ידי ניטור את המראה של פוספוליפידים מסוימים קרום פלזמה4,5,6 . מדידות של רכיבים תאיים או הסלולר מטבוליטים שוחרר לתוך כלי התקשורת שנפרעו הסלולר יכול גם לשמש כאל שליחים לתא המוות7,8. לחלופין, הכדאיות הסלולר ניתן לקרב את ערכיהן על-ידי הערכת פעילות חילוף החומרים9,10. למרות ששיטות אלה מספקים אמצעי מהיר הערכת את הישרדות cell, הם לא בלי אזהרות. כל טכניקה מתבונן התרבות כאוכלוסייה אחת, טיוח זה בלתי. אפשרי להבחין בין תאים בודדים שלהם המחירים ייחודי של הישרדות. יתר על כן, מבחני מבוסס-אוכלוסייה כזו אינם יכולים למדוד גורמים שעשויים להיות חשוב עבור מוות של תאים, כולל מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה. במקרים רבים, מבחני אלה הן מוגבל לנקודות זמן בדידים, אינם מאפשרים את התצפית רציף של תאים לאורך זמן.
לעומת זאת, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך היא מתודולוגיה גמיש במיוחד ישירות ובאופן רצוף מפקח על הסיכון למוות תא בודד בסיס11. בקצרה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך מאפשר אלפי תאים בודדים כדי לאתר במרווחי זמן קבועים לתקופות ממושכות של זמן, ומאפשר האישושים מדויק של מוות של תאים, את הגורמים לשפר או לדכא את מות תאים. בבסיסו, השיטה כוללת של תרביות תאים ארעי או התמרה חושית של תאים עם וקטורים קידוד חלבונים פלורסנט. להחזרי ייחודי אז נוסדה, המיקום של כל תא transfected ביחס ציון זה מאפשר למשתמש תמונה ולעקוב אחר תאים בודדים במשך שעות, ימים או שבועות. כאשר תמונות אלה מוצגים ברצף, מוות של תאים מסומן על ידי שינויים אופייניים פלורסצנטיות, מורפולוגיה, פיצול בגוף התא, המאפשר את ההקצאה של שעת המוות עבור כל תא. הקצב מחושב של מוות, נקבעים על-ידי הפונקציה הזארד, שניתן לאחר מכן באופן כמותי בהשוואה בין תנאי או הקשורים בחר מאפיינים הסלולר באמצעות univariate או רב משתנית קוקס מפגעים פרופורציונלי ניתוח12. יחד, גישות אלה מאפשרים את האפליה מדויק ואובייקטיבי של שערי מוות תאי בקרב אוכלוסיות הסלולר, וזיהוי של משתנים באופן משמעותי לחזות מוות תאי ו/או הישרדות (איור 1).
אמנם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר הישרדות בכל סוג התא הפוסט-mitotic במגוון של תבניות ציפוי, פרוטוקול זה יתאר תנאים transfecting, הדמיה החולדה הנוירונים קורטיקלית תרבותי בצלחת 96-ובכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העבודה בעלי חוליות אושרה על ידי הוועדה על שימוש ו טיפול חיות ב אוניברסיטת מישיגן (פרוטוקול # PRO00007096). ניסויים מתוכננים בקפידה כדי למזער את מספר החיות הקריב. בהריון הנשי פראי-סוג (WT), אוונס ארוך שאינו הטרנסגניים חולדות (Rattus norvegicus) שוכנות ביחידים צ'יימברס מצויד עם העשרה סביבתית, המטופלים על ידי היחידה עבור רפואה חיות מעבדה (אולם) ב אוניברסיטת מישיגן, ב בהתאם המדריך הנתמכות על-ידי NIH על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. כל העכברושים הוחזקו בשגרת דיור כמו זמן קצר ככל האפשר לפני המתת חסד, בקנה אחד עם ההמלצות של המנחים על המתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית, אוניברסיטת מישיגן שיטות של המתת חסד על-ידי הנחיות מינים.
1. הכנה גשמי
- לנתח נוירונים בקליפת המוח מיום מתחלקים שהגורים עכברוש ותרבות 19 – 20 עכברוש נוירונים בקליפת המוח ב- 0.5 x 106 תאים למיליליטר על צלחות מצופה פולי-D-ליזין עבור 4 ימים במבחנה, כפי שתואר לעיל13,14, 15,16,17,18,19.
- להכין את פלסמיד-DNA של ריבית בהתאם לשלבים המפורטים על ידי בידוד של דנ א פלסמיד נטולת אנדוטוקסין קיט (ראה טבלה של חומרים). לכמת את תוצאות הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים.
- ביום במבחנה 4 (DIV4), aliquot, לעקר ומסנן דגירה המדיה הבאים ב- 37 ° c: 6 מ ל מופחת סרום מדיה (RSM; למשל., OptiMEM), 25 מ ל עצביים הבזליים מדיה (NBM), 40 מ"ל NBKY (NBM + חומצה kynurenic 1 מ מ + 10 מ מ MgCl2, יש להתאים ל- pH של 7. 4), 10 מ ל NBC (NBM + עצביים 1 x תא תרבות + 1 x תוספת-גלוטמין + 1 x עט דלקת).
הערה: אמצעי אחסון המפורטים מספיקים לצלחת 96-ובכן אחד transfecting. עיין בטבלה של חומרים עבור ריאגנטים ספציפיים.
2. תקנים של החולדה הנוירונים בקליפת המוח
- לשנות את סיפקה דוגמה תרביות תאים בגיליון (ראה 1 קובץ משלים) על-ידי התאמת סוג צלחת, צלחת מפה, מספר DNAs, ריכוז ה-DNA, ומספר של וולס (תיבות ירוק).
הערה: ה-DNA הכולל סיכום כדי µg 0.2 לכל טוב, ללא קשר אם אחד (למשל., דנ א) או מרובות (לדוגמה, ה-DNA B ו- C) DNA מבנים נוספים כדי מכל קידוח. - עובד מהגיליון, לשלב את הכמות המתאימה של RSM ו- DNA בצינור אחד. לשלב את הכמות המתאימה של RSM, תרביות תאים ריאגנט (למשל, Lipofectamine) בצינור נפרדים.
- דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
- לשלב תערובות RSM ריאגנט DNA ו תרביות תאים, דגירה-RT כעשרים דקות.
- במהלך שלב הדגירה, להשתמש פיפטה רב-ערוצי, שקתות פלסטיק סטרילית לשטוף תאים x 2 עם µL 100 לכל טוב של NBM. שמורת התקשורת ממוזגים (ס מ) ולאחסן ב 37 º C. על כך ועל ביצוע השלבים, לטפל כדי למזער את כמות הזמן הנוירונים חשופים לאוויר.
- מסיר את המדיה NBM והחלף µL 100 לכל טוב של NBKY.
- לאחר 20 דקות עברו, להוסיף 50 µL של תערובת מגיב/ה-DNA תרביות תאים dropwise כל טוב.
- דגירה תאים עם מתחמי מגיב/ה-DNA של תרביות תאים עבור 20 דקות ב 37 º C.
- לשטוף 2 x עם NBKY והחלף µL 100 ס מ ו- µL 100 של NBC לכל טוב.
- בהצלחה transfected תאים צריך להיות גלוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ בתוך 16-24 h של תרביות תאים. למדוד יעילות, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק תרביות של תאים לאחר דגירה לילה ב 37 º C.
הערה: טכניקה זו תוצאות יעילות תרביות תאים הכולל של 5-10%.
3. הדמיה
- מניחים את הצלחת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם שלב ממונע, ולהקים להחזרי (למשל, סימן על החלק התחתון של הצלחת) אשר יאפשרו למשתמש ליישר את הצלחת בכל פעם שזה הוא עם תמונה. לשמור תמונה של נאמנות זה לעיון.
- נווט אל שדה עניין ורשום הקואורדינטות x-y יחסית אפוטרופסות.
- מתמקדים transfected תאים המבטאים תווית פלורסנט.
- לקחת תמונות פלורסנט הערוץ המתאים או ערוצים (למשל, חלבון פלואורסצנטי חלבון פלואורסצנטי אדום [RFP], ירוק [GFP], 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [דאפי]), באופן ידני או באופן אוטומטי. על ידי לקיחת מספר תמונות במרווחי זמן שווים באופן קבוע, מצרף של הבאר יכול להיות התאספו במהלך עיבוד תמונה (ראה שלב 4).
הערה: המרווח תלויה במספר גורמים, כולל הגדלה, את המערכת האופטית של המיקרוסקופ, ואת גודל גלאי. באופן כללי, המרווח אופטי בין התמונות יהיה בין 90 עד 95 אחוז מגודלו של כל תמונה בנפרד, כדי לאפשר מידה קטן של התמונה חפיפה וכוללים יישור. - חזור על תהליך זה לעיתים קרובות ככל הנדרש, ושילוב כדי להחזרי המקורי בכל פעם. לצורך ניתוח הישרדות, הדמיה מתקיים כל 6 – 24 h, בהתאם לסוג התא ואת מטרת הניסוי.
4. עיבוד תמונה
הערה: בעקבות רכישת התמונה, סדרה של צעדים עיבוד נדרשים לפני ניתוח תמונות. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, תפרים, סידור בערימה ואת הרקע חיסור (איור 1). מטרת השלבים היא לייצר של אוסף תמונות, או סדרת הזמן, שבו תאים הם בבירור ניכר מהרקע שלהם וקלים למעקב על נקודות זמן מרובות. מאקרו פיג'י ייעודי (Image_Processing.ijm, ראו 2 קובץ משלים), מבצעת תפירה בסיסי, בערימה, ועל רקע חיסור. הסבר על כל שלב ואת הפרמטרים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע עיבוד תמונה מסופק במקטע דיון.
- להתאים את הנתונים הגולמיים או מדריך קלט כדי להתאים את העיצוב באיור 2.
- אם נקודות זמן אינם רציפים (קרי, T1, T2, T3), לשנות תיקיות אלה כך שיהיו. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כי המאקרו Image_Processing אינה מוחצת במהלך סידור בערימה.
- לחץ פעמיים על הסמל כדי לפתוח את התוכנית, ולאחר מכן לחץ וגרור את המאקרו Image_Processing הבר פיג'י פיג'י. פעולה זו תפתח את המאקרו בתוך פיג'י.
- להתאים שורות 2-7 של המאקרו Image_Processing כדי לציין קלט הספריה המכילה תמונות, את ספריית הפלט הרצוי עבור תמונות התפר ומוערם, מספר timepoints הדמיה, מספר ערוצים פלורסנט ותבנית צלחת.
- לקבוע את הסדר שבו נרכשו התמונות. כדי לבדוק את זה, לתפור ידנית מצרף תמונות בפיג'י על ידי תמרונים כדי תוספים הנפתחת | תפרים | רשת/אוסף סיכות. התאם את ההגדרות בתוך התפריטים הנפתחת סוג ואת הסדר עד תמונה תפור במדויק מופק.
- התאם את המשתנים GRID_TYPE ו- STITCH_ORDER שורות 8 ו-9 של המאקרו Image_Processing כדי להתאים בחירות אלה.
- ציין את מספר תמונות לכל טוב על-ידי התאמת קו 10 במאקרו Image_Processing .
הערה: עבור 2 x 2 מצרף תמונות, הקו הזה יקרא DIM = 2. - אם נדרש רקע חיסור, התאמת קו 14 במאקרו Image_Processing bgsub ב = true.
- הגדר את רדיוס הכדור מתגלגל על-ידי התאמת קו 15 במאקרו Image_Processing .
הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, הגדר את הרדיוס לפחות בקוטר של הקידמה הגדולה ביותר בתמונה. - לחץ על הפעל כדי להפעיל את המאקרו Image_Processing . מרגע שהתחלנו, Image_Processing יתקדמו באופן אוטומטי באמצעות תפרים בערימה, רקע חיסור.
5. הניקוד מוות תאי
הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת מידע נוסף על הניקוד מוות של תאים ונתונים הצנזורה.
- אתר את אוספי תמונות המופק באמצעות Image_Processing script. פתח את אלה בפיג'י.
- לתייג כל תא בנפרד עם מספר לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט של הצבע כלי בתוך פיג'י. הקשה על t אחרי כל נקודה יוסיף את מזהה תא למנהל (אזור-של-ריבית) של רועי.
הערה: ניתן לאבחן את מזהי בלחיצה על תוויות , הצג את כל תיבות הסימון במנהל ROI. -
ההתקדמות timepoints כל אוסף תמונות, שיא timepoint, כאשר כל תא מת או צריך להיות צנזורה בקובץ ה- Survival_spreadsheet.csv (ראה קובץ משלים 3).
- כל תא תופסת שורה בודדת בגיליון האלקטרוני, היכן מזהה ייחודי (ID) עבור כל תא מורכב המתאים טוב שלה ואת מספר רועי בתוך הבאר. tp_death הוא נקודת הזמן האחרון שתא נצפית בחיים, בעוד time_death מייצג את הזמן הממשי של מוות תוך שעות. עבור כל תא, קלט נתונים אלה. זה חיוני כדי לשמור על מבנה זה לצורך ניתוח מאוחר יותר באמצעות הישרדות . R (ראה 4 קובץ משלים).
הערה: הקריטריונים לקביעת מוות תאי מכריעים והם עשויים להשתנות בהתאם לסוג התא. שלושה קריטריונים עיקריים משמשים הזיהוי של נוירונים מתים11,20 (איור 3): איבוד עוצמת קרינה פלואורסצנטית (למשל, תא עצב 1-69 h), עיגול של הגוף תאים (למשל, תא עצב 2 ב 188 h), האובדן של neurite שלמות או blebbing (למשל, תא עצב 2 ב 188 h).
- כל תא תופסת שורה בודדת בגיליון האלקטרוני, היכן מזהה ייחודי (ID) עבור כל תא מורכב המתאים טוב שלה ואת מספר רועי בתוך הבאר. tp_death הוא נקודת הזמן האחרון שתא נצפית בחיים, בעוד time_death מייצג את הזמן הממשי של מוות תוך שעות. עבור כל תא, קלט נתונים אלה. זה חיוני כדי לשמור על מבנה זה לצורך ניתוח מאוחר יותר באמצעות הישרדות . R (ראה 4 קובץ משלים).
- לתעד את מצב הצנזור של התא בעמודה האחרונה.
הערה: כאן, בשל הדרך המיוחדת לצנזר את מטופלת על ידי R, תאים מצונזרים שסומנו על-ידי 0, בעוד לא מצונזר תאים מסומנים ב- 1. שים לב כי כל התאים שחיים האחרון נקודת זמן צונזר, לכן מסומן כ- 0.
6. ביצוע קוקס פרופורציונלי ובטיחותיים ניתוח ותוצאות להמחיש
- במידת הצורך, הורד סטודיו R ב- https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- לפתוח סטודיו R ולחץ פעמיים על הסמל של הישרדות . R סקריפט.
- מקם את הסמן על קו 2 של הישרדות . R , ולחץ על הלחצן הפעל בחלון הראשי של סטודיו R כדי לטעון את ספריית הישרדות.
- שינוי קו 5 של הישרדות . R סקריפט כדי להתאים את המיקום של קובץ ה- Survival_spreadsheet.csv. לחץ על הפעל כדי לטעון את נתוני הישרדות כמו dataframe.
- להאיר את שורות 8 ו-9, לחץ על לחצן הפעל בחלון המסוף סטודיו R על מנת לבצע ניתוח סיכונים ביחס קוקס. תוצאות וסטטיסטיקות פלט מופיעים בחלון המסוף של סטודיו R.
- הדגש שורות 12-16 של הישרדות . R וללחוץ על הכפתור הפעל כדי לייצר סיכון מצטבר של מוות מגרש, אשר תופיע בכרטיסיה ' חלקות ' בסטודיו R. ניתן לשמור את הקובץ על ידי לחיצה על הלחצן ' ייצוא ' שמעל העלילה.
- אם זה רצוי להתוות את הנתונים הישרדות כמו עיקול קפלן-מאייר, הדגש שורות 19-24 של הישרדות . R וללחוץ על הכפתור הפעל .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DIV4 החולדה הנוירונים בקליפת המוח באמצעות ההליך תרביות תאים המתואר כאן, היו transfected עם פלסמיד קידוד מאפל את חלבון פלואורסצנטי. החל 24 שעות שלאחר תרביות תאים, התאים היו עם תמונה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כל 24 שעות למשך 10 ימים רצופים. הדימויים הנובעת היו מאורגנים כמצוין איור 2, ואז תפור, מוערמים, הבקיע עבור מוות תאי (איור 1). איור 3 מראה קורס זמן עבור 3 נוירונים נציג, שניים אשר למות במהלך הניסוי (נוירונים 1 ו- 2) ואילו השלישי שורד (Neuron 3).
הישרדות הנתונים נותחו באמצעות התסריט R מסופקים (הישרדות. R), ואת התוצאות מסוכמות באיור4. הטבלה שנוצר בעת הפעלת קווים 7 ו-8 של הישרדות . R קוד מספק תקציר של קוקס ניתוח סיכונים פרופורציונלי. סטטיסטיקה חשוב במיוחד ארבעה בטבלה מסומנים באיור 4A. המספר 1 בתיבה מייצג את יחס סיכון עבור קבוצת "מוטציה" יחסית "WT". שים לב כי הקבוצה א"אינה מופיעה. זה בגלל הקבוצה א"משמש האוכלוסיה הפניה - הסיכון למוות שנצפו בכל קבוצות אחרות בהשוואה לזה של האוכלוסייה הפניה כדי לחשב את יחס סיכון. לכן, סיכון יחסי גדול יותר מאשר 1 מצביעים על קצב מהיר יותר של מוות לעומת האוכלוסייה הפניה וכן ערכים פחות מ 1 מייצגים שיעור מופחת של מוות. בדוגמה מסופקים, תאים מוטציה להציג יחס סיכון של 2.2, כלומר שהם מתו 2.2 x מהיר יותר WT תאים. כברירת מחדל, R יארגן את הקבוצות בסדר אלפביתי, עם קבוצת צמרת הגשה האוכלוסייה הפניה. הצבת המספרים רשומים שמות קבוצות היא דרך קלה כדי לקבוע את הסדר שבו הם מוערכים. הערכים בתיבות 2 ו- 3 מייצגים את ערכי p-95% מרווחי הביטחון יחס סיכון, בהתאמה, המחושב על-ידי ניתוח סיכונים ביחס קוקס. תיבת 4, מדווחים תוצאות הבדיקה יומן-דרגה. בדיקה זו מעריכה אם יש הבדל משמעותי סטטיסטית בהישרדות בקרב אוכלוסיות נבדק, אך אינו מתאר אילו קבוצות שונה מהאחרים, אינו מחשב של גודל עבור ההבדל שנצפו.
קפלן-מאייר עקומות (איור 4B) נמצאים בשימוש נרחב במחקרים קליניים להערכת השפעת התערבות על ההישרדות. מסיבה זו, חוקרים רבים מוכרים לפרש נתונים הישרדות דמיינו בדרך זו. בהקשר של תא יחיד הישרדות, חלקות אלה מתארים את השבר של תאים חיים לאורך זמן בכל קבוצה. במקום ההתוויה תא הישרדות, היא גישה חלופית כדי לתאר את הקצב של מוות של תאים בכל קבוצה באמצעות סיכון מצטבר של מוות מגרש (איור 4C). רוב המחקרים הישרדות, מספר האירועים לא אחרי התקדמות ליניארית; במקום זאת, על שיעור מסוים המוות מספר גדול של אירועים הוא ציין בתקופות קודמות. לדוגמה, בקרב אוכלוסיה של תאים 100, אם 20% של תאים מתים בין המרווחים, ואז 20 תאים למות בתוך המרווח הראשון, 16 במהלך מרווח השני, 13 במהלך מרווח שלישית, וכן הלאה. זו מגמה לוגריתמי קל מבחינה מושגית להמחיש באמצעות הסיכון המצטבר של מוות חלקות, מאחר ציר ה-y מייצג ההמרה יומן שלילי של הישרדות הסלולר. לחלופין, ניתן להציג ציר ה-y של הסיכון המצטבר של מוות מגרש גם כמו מוות של תאים %, מחושבת 1-1/eהמצטבר הסיכון למוות. חלקות אלה גם מאפשרים השוואות פשוטה של הסיכון למוות בין אוכלוסיות. סדר הגודל של היחס סיכון משקף את השיפוע של הסיכון המצטבר של מוות מגרש לכל האוכלוסייה, ביחס לזה של קבוצת התייחסות.
איור 1: סכימה עבור ניסוי הישרדות טיפוסי. החולדה הנוירונים בקליפת המוח הם transfected ב DIV4 באמצעות ההליך שתואר במאמר זה. החל 24 שעות שלאחר תרביות תאים, התאים הם צילמו במרווחי רווח קבוע בהתאם לדרישות ספציפיות של הניסוי. תמונות תפר, מוערמים לפני מות תאים הוא הבקיע ולאחר ניתוח סיכון יחסי קוקס משמש כדי להשוות את הסיכון למוות בין אוכלוסיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נדרש מבנה הקובץ. המאקרו פיג'י שסופקו דורש כי הנתונים הגולמיים המעוצבים באופן מסוים. כדי לנצל את Image_Processing, לארגן את הנתונים הגולמיים כפי המוצג בצד השמאל. ניסוי דוגמה וליווי מבנה הקובץ מוצג מימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניקוד מוות תאי בנוירונים בקליפת המוח transfected חולדה. שימוש בשיטות המתוארות במאמר זה, החולדה הנוירונים קורטיקלית היו transfected עם פלסמיד קידוד מאפל את חלבון פלואורסצנטי. התאים היו אז עם תמונה כ כל 24 שעות, התמונות היו תפור מוערמים ו מוות תאי הבקיע באמצעות הקריטריונים מסופקים. מוות של תאים הוא הצביע עבור נוירון 1-h 69, כפי שמעידים אובדן של זריחה. נוירון 2 מת ב 188 h, כמצוין על-ידי פיצול התהליכים, עיגול של גוף התא. נוירון 3 שורד משך זמן הניסוי. שימו לב כי כמה תאים להיות גלוי רק מאוחר לניסוי, כפי שמעידים את המראה של תא חדש ב- 235 h. רק תאים הגלויים בזמנו הראשונית של הדמיה כלולים בתוך ניתוחים שלאחר מכן. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: פרשנות של ניתוח סיכון יחסי קוקס. (א) הסיכום של הפלט כולל ארבעה נתונים סטטיסטיים חשובים המודגשים באיור זה. בוקס 1 כולל יחס סיכון של קבוצת הניסוי בהשוואה קבוצת הביקורת, בעוד תיבת 2 ו- 3 תיבת מציגות את ערכי p- ואת סמך 95% עבור כל יחס סיכון, בהתאמה. תיבת 4 מדגיש את התוצאות של הבדיקה יומן-דרגה. נתונים אלה הם גם מתוארים באמצעות קפלן-מאייר עקומה (B) סיכון מצטבר של מוות מגרש (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן מוצגת מתודולוגיה לעקוב ישירות אחר הישרדות העצבית על בסיס תא בודד. בניגוד מבחני מסורתי על מות תאים הנמצאים מוגבל זמן בדידים נקודות ועל אוכלוסיות שלמות של תאים, שיטה זו מאפשרת להערכה מתמשכת של מגוון גורמים כגון מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה, ו ניתן לקבוע כיצד כל גורם משפיע על הישרדות הסלולר באופן פרוספקטיבי.
מתודולוגיה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של צרכים ניסיוני. התדירות והמשך של הדמיה ניתן להתאים בקלות, כל חלבון עניין וניתן transfected שיתוף עם הסמן פלורסנט על מודל מצבי מחלה או לחקור חלבונים פונקציה13,14,15, 16,17,18,19. למרות המאמר מתאר את הפרוצדורה אופטימלית עבור transfecting החולדה הנוירונים קורטיקלית, ניתן להחיל את סכימת ניסיוני לכל סוג התא הפוסט-mitotic. עם זאת, התנאים אופטימליים תרביות תאים ייתכן שתצטרך להיות מותאם על בסיס קו לכל תא, מצעים עשוי צריכים להיות מותאמים כדי למנוע תאים clumping או זז יותר מדי לעקוב באופן אמין.
דרישות עיבוד וניתוח התמונה משתנה בהתאם הפרמטרים הספציפיים של כל ניסוי מיקרוסקופ האורך. הסבר קצר על כל שלב קריטי כלולה להלן כדי לעזור אישית של פרוטוקול כדי שיתאים יותר לדרישות של ניסוי.
Stitching: אם נלקח מצרף תמונות, ניתן לבצע תפרים כדי ליצור תמונה אחת, גדולה יותר עבור כל שדה ראייה. עבור מרבית היישומים עדיף לבצע תפרים לפני סידור בערימה. אם רק תמונה אחת נלקחת לכל טוב, שאין צורך לבצע שלב זה.
לערום: במקום מעקב אחר תאים לאורך זמן על פני קובצי תמונה נפרדים, ניתן לבצע כדי ליישר תמונות רצופות לתוך סדרה פעם, מקביל עצירה למסגרות הנפשה בערימה. עם יישור נאמנות מוצלחת, מסגרות בודדות הכוללת את התמונה מוערמים ייושר באופן הדוק. עם זאת, אם יש משמרות מורגש או סיבובים בין מסגרות, תמונות רישום צורך. המאקרו Image_Processing מבצעת באופן אוטומטי רישום באמצעות התוסף פיג'י "MultiStackReg." תוסף זה עוזר להפחית misalignments קטן בין פועל הדמיה. עם זאת, עם משמרות משמעותית, באופן ידני חיתוך, שינוי יישור תמונות עשוי להידרש.
רקע חיסור (אופציונלי): סוגיה אחת פוטנציאליים שעלולים להתעורר במהלך ייבוא תמונות היא תאורה לא אחידה. זה יגרום בווריאציות בעוצמת האות על פני תמונה זה יכול לבלבל הערכות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית. במקרים אלה, ניתן לסלק בעוצמה וריאציות על ידי טכניקות חיסור רקע. אלה הם רלוונטיים במיוחד עם אות נמוכה כדי יחסי הרעש, בו משמרות אינטנסיביות עקב תאורה לא אחידה ניתן להשוות גודל בין האות של fluorophore עצמו. ישנם אלגוריתמים חיסור רקע רבים, כמה מהם משויכות פיג'י תוספים. הבחירה באיזה אלגוריתם להשתמש תלוי במאפיינים של התמונה עצמה ואת האות הנמדדים. מתוך המאקרו פיג'י Image_Processing, ניתנת למשתמש את האפשרות לבצע "הכדור מתגלגל" רקע חיסור על מוערם קבוצת תמונות (שורה 14). בשיטה זו, רקע המקומי נקבע עבור כל פיקסל בהתבסס על ממוצע עוצמת מעגל המקיף בפיקסל הקטן הזה. ערך זה ואז יופחת מהערך ההתחלתי של הפיקסל. ערך אופטימלי עבור הרדיוס של המעגל המשמשת כרקע המקומי הערכות יהיו שונים בהתאם לקוטר של הקידמה הגדולה ביותר בתמונה.
הבקיע מות תאים: להשוואות מדויק בין אוכלוסיות, זה חיוני כי הקריטריונים שפורטו לעיל כדי לזהות נוירונים מתים להיות מיושם באופן עקבי לרוחב ערכת הנתונים כולו. יתר על כן, מעוור האנשים מוות תאי הבקיע לקבוצות ניסויית תחת חקירה מבטלת מקורות פוטנציאליים של דעה קדומה. בהתאם לקריטריונים ספציפיים generalizability שלהם, הם עשויים לשלב אלגוריתמים אוטומטית ההערכה לא משוחדת של הישרדות הסלולר15,16,17,18, 19.
בהקשר של ניתוח הישרדות וניתוחים זמן-כדי-אירוע אחר, ישנן שלוש תוצאות אפשריות. ראשית, התרחש האירוע (מוות של תאים), הזמן שבו התרחש האירוע נרשם. שנית, האירוע לא עלה במהלך מסגרת הזמן של התבוננות. תצפיות אלה הם צונזר בתום הניסוי. שלישית, לא יכול להיות הבקיע את האירוע כי התא עזב שדה הראיה, או הוסתר על ידי תאים סמוכים. במקרה זה, התא הוא צונזר כאשר ניתן כבר לא במדויק לעקוב. עבור התוצאה הראשונה, העיתוי המדויק של מוות של תאים ייתכן שיהיה קשה לקבוע בהתאם למרווח הדמיה. למשל, תא חי בתחילה אך מסומן מת 24 שעות מאוחר יותר אולי מת בשלב כלשהו במהלך התקופה הזו 24 שעות ביממה. להיות שמרן, זה תרגול טוב כדי להקליט את שעת המוות כמו בפעם שעברה שתא ניתן לזהות בביטחון כמו בחיים (שמאל הצנזורה).
ביצוע קוקס מפגעים פרופורציונלי ניתוח והצגה של תוצאות: התסריט Survival.R הנלווים מאפשרת ההשוואה של הסיכון למוות בקרב אוכלוסיות שלהם מובהקות סטטיסטית באמצעות מפגעים פרופורציונלי קוקס ניתוח (איור 4A), וגם עלילה תוצאות כמו עיקול קפלן-מאייר (איור 4B) או סיכון מצטבר של מוות מגרש (איור 4C). ניתוח הישרדות, ניתוח סיכונים ביחס קוקס, את החבילה "הישרדות" R מתוארים בפירוט רב יותר-כריסטנסן12 ו- https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
באמצעות התאמת ההליכים המתוארים כאן, מגוון רחב של תכונות עצביים יכול להיות קשור להישרדות. דור של רועי סביב תא גוף ו/או גרעין של מאפשר למשתמש לעקוב longitudinally גודל תא, מורפולוגיה, רמת ביטוי חלבון, לוקליזציה או היווצרות של מבנים subcellular כמו puncta או חלבון אגרגטים13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. חשוב לציין, כי כל הגורמים הללו הוא ציין ביחס מוות של תאים, זה אפשרי באופן כמותי לקבוע עד כמה גורמים בודדים לחזות הסלולר או מוות במהלך בהתחשב במסגרת הזמן. ייתכן גם לבדיקה משעולים חילוף החומרים וסלולר חלבון בהבעת כתבים פלורסנט המספקים מדידות בזמן אמת של פיסיולוגיה תאית כבסיס (למשל., gCaMP6f כדי assay פעילות). בהחלת גישה חזקה זו, גורמים לנהוג תחזוקה הסלולר פונקציה, תפקוד לקוי יכול להיות פרט חשפו ולמד ב, ובכך מעורר השראה דרכים חדשות של חקירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים סטיב Finkbeiner וחברי המעבדה Finkbeiner על חלוצית מיקרוסקופ רובוטית. אנו מודים גם דן Peisach לבניה הראשונית התוכנה הדרושות עבור עיבוד תמונה, אוטומטית ניתוח הישרדות. עבודה זו מומן על ידי המכון הלאומי עבור הפרעות נוירולוגיות R01 שבץ (NINDS)-NS097542, אוניברסיטת מישיגן חלבון מתקפלות המחלה יוזמה לבין אן ארבור פעיל נגד ALS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
