Summary
여기, 선물이 단일 셀 기준 생존을 모니터링 하 고 크게 세포 죽음을 예측 하는 변수를 식별 하는 프로토콜.
Abstract
표준 세포 독성 분석 실험, 여러 시간 점에서 고정된 세포 lysates의 필요, 감도 및 신경 운명에 영향을 주는 요소를 평가 하는 능력을 제한 했다. 이 분석 실험 개별 시간 포인트에서 세포의 별도 인구의 관찰을 해야합니다. 그 결과, 개별 셀 지켜질 수 없다 prospectively subcellular 이벤트, puncta 형성 등 단백질 mislocalization, 질병, 병원 성 드라이버 homeostatic 응답 인지를 구별할 수 있는 능력을 가혹 하 게 제한 하는 시간이 지남에 또는 단순히 우연 현상입니다. 단일 셀 경도 현미경 연구원 인구 사이 생존에 차이 확인 하 여 향상 된 감도와 인과 관계를 그릴 수 있도록 이러한 한계를 극복 한다. 이 비디오 가이드는 형광 단백질 마커를 표현 하는 쥐 주 대뇌 피 질의 뉴런의 단일 세포 생존을 측정 하는 실험에 대 한 대표적인 워크플로 개요 것입니다. 뷰어는 transfections 높은 효율을 달성, 수집 및 개별 셀의 예비 추적을 사용 하면 이미지를 처리 하는 방법을 배울 것 이다 고 신경 인구 콕스 비례 위험 분석을 사용 하 여의 상대 생존 됩니다.
Introduction
비정상적인 세포 죽음은 암, 뇌졸중1, neurodegeneration, 등 많은 질병에 영향을 미치는. 세포 죽음에 대 한 강력 하 고 중요 한 분석 확장 하거나 세포 생존을 감소 시키기 위한 치료 전략의 개발으로 서 이러한 장애의 특성에 필수적입니다. 현재 직접 또는 대리 마커2세포 죽음을 측정 하기 위한 기법의 수십 있습니다. 예를 들어 세포 죽음 평가 될 수 있다 시각적으로 또는 특정 인지질 원형질 막4,5,6의 모습을 모니터링 하 여 중요 한 염료를 선택적으로 죽 었 거 나 살아있는 세포3, 얼룩의 도움으로 . 측정 세포내 구성 요소 또는 셀룰러 산시 미디어로 출시 세포 대사 산물의 세포 죽음7,8에 대 한 프록시 사용할 수 있습니다. 또는, 세포 생존 수 수 직선 근사 줄 대사 활동9,10를 평가 하 여. 비록 이러한 방법을 세포 생존 평가의 빠른 수단을 제공, 그들은 경고 없이 되지 않습니다. 각 기술은 단일 인구, 개별 셀 및 생존의 그들의 독특한 속도 사이의 구별을 불가능 렌더링으로 문화를 관찰 합니다. 또한, 이러한 인구 기반 분석 실험 세포 형태학, 단백질 표정, 또는 지역화를 포함 하 여 세포의 죽음에 대 한 중요 한 될 수 있는 요소를 측정할 수 없습니다. 대부분의 경우에서 이러한 분석 개별 시간 포인트 제한 되며 시간이 지남에 셀의 연속 관측에 대 한 허용 하지 않습니다.
대조적으로, 경도 형광 현미경 검사 법은 직접 그리고 지속적으로 단일 셀 기준11에 죽음의 위험을 모니터링 하는 매우 유연한 방법입니다. 간단히, 경도 형광 현미경 세포 죽음 및 강화 하거나 세포 죽음 억제 하는 요인의 정확한 결심을 허용 하는 시간의 연장된 기간에 대 한 정기적 추적을 개별 셀의 수천 수 있습니다. 그것의 기초에는 방법은 형광 단백질을 인코딩 벡터와 과도 transfection 또는 셀의 변환 포함 한다. 고유한 신탁 설립 다음 하며이 랜드마크에 관하여 각 transfected 세포의 위치 이미지를 시간, 일, 또는 주에 걸쳐 개별 셀을 추적 하는 사용자 보면 이러한 이미지는 순차적으로, 형광, 형태학, 및 각 셀에 대 한 죽음의 시간 할당을 사용 하면 세포 체의 분열에서 세포 죽음 특성 변화에 의해 표시 됩니다. 죽음, 위험 함수에 의해 결정의 계산된 속도 수 있습니다 다음 양적 조건 사이의 비교 또는 일변량 또는 복수 콕스 비례 위험 분석12를 사용 하 여 셀룰러 특징 선택 관련. 함께, 이러한 접근 세포 인구 가운데 세포 죽음의 비율 그리고 크게 세포 죽음 및 생존 (그림 1)를 예측 하는 변수 식별의 정확 하 고 객관적인 차별 가능
이 메서드는 형식 도금의 다양 한 모든 포스트 mitotic 세포 종류에 생존을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다, 하지만이 프로토콜 transfecting 및 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 96 잘 접시에 배양 이미징에 대 한 조건을 설명 합니다.
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Protocol
모든 척추 동물 작업 사용 및 미시간 대학 (프로토콜 # PRO00007096)에서 관리 동물에 위원회에 의해 승인 되었다. 실험 동물 희생의 수를 최소화 하기 위해 신중 하 게 계획 된다. 임신 여성 야생-타입 (WT), 유전자 변형 비 긴 에반스 쥐 (Rattus norvegicus)는 실 환경 풍부 및에 단위에 대 한 실험 동물 의학 (ULAM) 미시간 대학에 의해를 걱정에서 홀로 지 내게 따라 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 게 NIH 지원 가이드 모든 쥐 안락사, 안락사의 미국 수의 의학 협회 그리고 미시간 대학에 대 한 지침의 권고와 일치 하기 전에 가능한 짧은 시간에 의해 안락사의 방법 하우징 루틴에 보관 했다 종 지침입니다.
1. 재료 준비
- 19-20 쥐 새끼와 문화13,14, 이전에 설명 된 대로 x 106 셀 4 일에서 생체 외에서폴 리-D-리 코팅된 판에 밀리 리터 당 0.5에서 대뇌 피 질의 뉴런 쥐 배아 일에서 대뇌 피 질의 신경 해 부 15,,1617,,1819.
- 내 무료 플라스 미드 DNA 분리 하 여 설명 하는 단계에 따라 관심의 DNA 플라스 미드 준비 키트 ( 재료의 표참조). 분 광 광도 계를 사용 하 여 결과 DNA 계량.
- 생체 외에서 날 4 (DIV4), aliquot, 필터, 소독 하 고 37 ° c: 6 mL에 다음 미디어를 품 어 감소 (RSM; 예를 들어., OptiMEM), 혈 청 미디어 25 mL 신경 기저 미디어 (NBM) 40 mL NBKY (NBM + 1 mM kynurenic 산 + 10 m m MgCl2, 7의 pH를 조정 합니다. 4) 10 mL NBC (NBM + 1 x 신경 세포 문화 보충 + L-글루타민 보충 x 1 + 1 x 펜 Strep).
참고: 나열 된 볼륨은 transfecting 한 96 잘 접시에 대 한 충분 한. 특정 약에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
2입니다. 쥐 대뇌 피 질의 신경 세포의 transfection
- 제공 된 예제 transfection 시트 수정 ( 추가 파일 1참조) 판형, 플레이트 지도, DNAs, 수를 조정 하 여 DNA 농도 및 우물 (녹색 상자)의 수.
참고: 여부 한 총 DNA의 관계 없이 잘, 당 0.2 µ g을 요약 (예:., DNA A) 이상의 (예를 들어, DNA B와 C) DNA 구조 추가 됩니다 각 잘 하. - 스프레드시트에서 작업 한 튜브에 RSM 및 DNA의 적절 한 금액을 결합 합니다. RSM 및 transfection 시 약 (예, Lipofectamine)는 별도 관에서의 적절 한 금액을 결합 합니다.
- 5 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어.
- DNA와 transfection 시 RSM 혼합물을 결합 하 고 20 분 동안 RT에서 품 어.
- 멀티 채널 피 펫 사용이 인큐베이션 단계 및 세척 살 균 플라스틱 골짜기 셀 NBM의 당 100 µ L 2 x. 바른된 미디어 (CM)를 예약 하 고 37 ° c.에 저장 이 다음 단계에 대 한 뉴런 공기에 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 주의.
- NBM 미디어를 제거 하 고 NBKY의 당 100 µ L를 바꿉니다.
- 20 분 후에 각 잘 transfection 시 약/DNA 혼합물의 50 µ L dropwise 추가 합니다.
- Transfection 시 약/DNA 단지 37 ° c.에 20 분에 대 한 셀을 품 어
- NBKY 2 x 린스와 CM의 100 µ L와 잘 당 NBC의 100 µ L를 바꿉니다.
- 성공적으로 transfected 세포 transfection의 16-24 h 안에 형광 현미경 검사 법에 의해 표시 되어야 합니다. 효율성을 측정 하기 위해를 사용 하 여 형광 현미경 transfection 37 ° c.에 하룻밤 부 화 후
참고: 이 기술은 5 ~ 10%의 전반적인 transfection 효율 발생합니다.
3입니다. 영상
- 자동화 한 무대, 형광 현미경에 접시를 놓고 접시 몇 군데는 각 시간에 맞게 사용자 수 있도록 수 탁자 (예: 접시의 하단에 표시)을 설정 합니다. 이 참조에 대 한 수 탁자의 이미지를 저장 합니다.
- 이동의 관심 분야 하 고는 탁자에 상대적인 x y 좌표를 참고.
- 형광 라벨 표현 transfected 세포에 초점.
- 수동으로 또는 자동화 된 방식으로 적절 한 채널 또는 채널 (예: 빨간색 형광 단백질 [RFP] 녹색 형광 단백질 [GFP], 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), 형광 이미지를 가져가 라. 정기적으로 간격으로 여러 개의 이미지를 복용 하 여 우물의 몽타주 이미지 처리 하는 동안 조립 될 수 있다 (4 단계 참조).
참고: 간격 확대, 광학 현미경, 및 감지기 크기 등 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 인접 한 이미지의 광학 간격 작은 정도의 이미지 중복 허용 및 정렬 기능을 각 개별 이미지의 크기의 90-95% 사이 여야 합니다. - 이 프로세스는 필요한, 원래 수 탁자에 정렬 자주 때마다 반복 합니다. 생존 분석, 이미징 일어난다 셀 종류와 실험의 목적에 따라 모든 6-24 h.
4. 이미지 처리
참고: 이미지 수집, 다음 단계 처리의 시리즈는 이미지 분석 전 필요한. 이 포함 되지만, 바느질, 스택 및 배경 빼기 (그림 1)에 국한 되지 않습니다. 이 단계의 목표 이미지 스택, 또는 시계열, 셀 하 명확 하 게 그들의 배경에서 인지할 수 하 고 여러 시간 점에 따라 하기 쉬운입니다. 전용된 피지 매크로 (Image_Processing.ijm, 보충 파일 2참조), 기본 바느질, 스태킹, 수행 및 배경 빼기. 이미지 처리를 수행할 때 고려해 야 할 매개 변수 및 각 단계에 대 한 설명은 토론 섹션에서 제공 됩니다.
- 그림 2에 표시 된 형식에 맞게 입력된 디렉터리 또는 원시 데이터를 조정 합니다.
- 시간 포인트는 연속 하는 경우 (즉, T1, T2, T3), 이름을이 폴더를. 이 단계는 Image_Processing 매크로 충돌 하지 않습니다 보장 하기 위해 중요 한 누적 하는 동안.
- 프로그램을 열고 다음 클릭 하 고 피지 바 Image_Processing 매크로 끌어 피지 아이콘 두 번 누릅니다. 이 피지 내에서 매크로 열 것 이다.
- 2-7 개의 이미지, 봉합 및 스택 이미지에 대 한 원하는 출력 디렉터리, 이미징 timepoints의 수, 형광 채널 및 플레이트 형식 수를 포함 하는 입력된 디렉터리를 지정 하려면 Image_Processing 매크로 조정 합니다.
- 이미지 인수 했다 순서를 결정 합니다. 이 테스트 하려면 수동으로 플러그인 드롭다운 메뉴 | 를 기동 하 여 피지에 이미지의 몽타주를 스티치 바느질 | 그리드/컬렉션 바느질. 정확 하 게 맞춘된 이미지 생성 됩니다 때까지 드롭다운 메뉴 유형 및 순서 내에서 설정을 조정 합니다.
- 8, 9이이 선택에 맞게 Image_Processing 매크로의 라인에서 GRID_TYPE 및 STITCH_ORDER 변수를 조정 합니다.
- Image_Processing 매크로에 선 10을 조정 하 여 잘 당 이미지 수를 지정 합니다.
참고: 이미지의 2 x 2 몽타주에 대 한이 줄 DIM 읽을 것 = 2. - 배경 빼기 필요한 경우 조정 BGSUB Image_Processing 매크로에 선 14 = true.
- Image_Processing 매크로에 선 15를 조정 하 여 롤링 볼 반지름을 설정 합니다.
참고: 최적의 결과 얻으려면, 적어도로 반지름 설정 이미지에서 가장 큰 전경 개체의 직경. - Image_Processing 매크로 시작 하려면 실행 을 클릭 합니다. 일단 시작 하 고, Image_Processing 자동으로 바느질, 스택 및 배경 빼기를 통해 사전 것입니다.
5. 점수 세포 죽음
참고: 득점 세포 죽음 및 검열 데이터에 대 한 자세한 토론 섹션 참조.
- Image_Processing 스크립트에 의해 생성 하는 이미지 스택을 찾습니다. 피지에서 엽니다.
- 개별적으로 각 셀 번호와 분류 하는 도구를 가리킨 피지 내를 사용 합니다. T 를 누르면 각 포인트 ROI (지역 관심) 관리자에 셀 식별자를 추가 합니다.
참고: 식별자는 ROI 관리자에서 레이블 및 모두 표시 확인란을 클릭 하 여 구상 될 수 있다. -
각 이미지 스택과 기록 timepoint 각 세포 사망 또는 파일 Survival_spreadsheet.csv (보조 파일 3 참조)에서 검열을 요구 하는 경우에 timepoints 통해 진행.
- 각 셀 스프레드시트, 잘 대응을 잘 내 투자 수익 번호 각 셀에 대 한 고유 식별자 (ID)로 구성 되어 단일 행을 차지 합니다. tp_death 셀 살아있을, time_death 시간에 죽음의 실제 시간을 나타냅니다 동안 관찰은 마지막 시간입니다. 각 셀에 대 한 이러한 데이터를 입력 합니다. 그것은 생존을 사용 하 여 후속 분석을 위해이 구조를 유지 하기 위해 중요 한입니다. R ( 보조 파일 4참조).
참고: 세포 죽음을 결정 하기 위한 기준을 중요 한와 셀 유형에 따라 다를 수 있습니다. 세 가지 주요 기준 죽은 신경11,20 (그림 3)의 식별에 사용 됩니다: 형광 강도 (예: 신경 1 69 h)의 손실의 셀 (예: 신경 2 188 h), 몸과 neurite의 손실 무결성 또는 blebbing (예: 신경 2 188 h).
- 각 셀 스프레드시트, 잘 대응을 잘 내 투자 수익 번호 각 셀에 대 한 고유 식별자 (ID)로 구성 되어 단일 행을 차지 합니다. tp_death 셀 살아있을, time_death 시간에 죽음의 실제 시간을 나타냅니다 동안 관찰은 마지막 시간입니다. 각 셀에 대 한 이러한 데이터를 입력 합니다. 그것은 생존을 사용 하 여 후속 분석을 위해이 구조를 유지 하기 위해 중요 한입니다. R ( 보조 파일 4참조).
- 마지막 열에 있는 셀의 검열 상태를 기록 합니다.
참고: 여기에, 독특한 방법에의 한 검열은 처리 R에 의해 검열 된 셀에 의해 표시 된다 0, 무수정된 셀 1에 의해 표시 되는 동안. Note는 마지막 시간 포인트 사는 모든 셀 검열, 고 따라서 0로 표시.
6. 수행 콕스 비례 위험 분석 및 시각화 결과
- 필요한 경우, https://cran.r-project.org/mirrors.html에서 R 스튜디오를 다운로드 합니다.
- 연구 스튜디오를 열고 생존에 대 한 아이콘을 두 번 클릭 합니다. R 스크립트.
- 생존의 2 줄에 커서를 놓습니다. R 생존 라이브러리를 로드 하려면 주요 R 스튜디오 창에서 실행 버튼을 클릭 합니다.
- 생존의 5 줄을 변경 합니다. R 스크립트 파일의 위치를 일치 하도록 Survival_spreadsheet.csv. dataframe로 생존 데이터 로드를 실행 을 클릭 하십시오.
- 8-9 라인을 강조 하 고 콕스 비례 위험 분석을 수행 하기 위해 R 스튜디오 콘솔 창에서 실행 버튼을 클릭 합니다. 결과 및 출력 통계 R 스튜디오의 콘솔 창에 나타납니다.
- 12-16 생존의 라인을 강조 표시 합니다. R R 스튜디오에서 플롯 탭에 표시 됩니다 죽음 플롯의 누적 위험을 생성 하기 위해 실행 버튼을 누르십시오. 작 위에 있는 내보내기 단추를 클릭 하 여이 파일을 저장할 수 있습니다.
- 카 플 란-마이어 곡선으로 생존 데이터를 플롯 하는 것이 바람직합니다, 19-24 생존의 라인을 강조 표시 합니다. R 실행 버튼을 누르십시오.
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Representative Results
여기 설명 된 transfection 절차를 사용 하 여, DIV4 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 형광 단백질 mApple 인코딩 플라스 미드와 페 했다. 시작 24 시간 후 transfection, 세포 했다 몇 군데 형광 현미경 검사 법 모든 24 h에 의해 10 일 연속. 결과 이미지 다음 그림 2에 표시 된 대로 구성 했다 물 렸 다, 스택, 및 세포 죽음 (그림 1)에 대 한 득점. 그림 3 은 시간 코스 3 대표 뉴런에 대 한 세 번째 동안 실험 (신경 1과 2)의 과정을 다이의 두 통과 (신경 3).
생존 데이터 (생존 제공 하는 R 스크립트를 사용 하 여 분석 했다. R), 그리고 결과 그림 4에 요약. 라인 7과 8 생존의 실행에 따라 생성 하는 테이블. R 코드 요약 콕스 비례 위험 분석을 제공 합니다. 그림 4A4 개의 특히 중요 한 통계 테이블에 강조 표시 됩니다. 상자 1 에 숫자 그룹 "WT" 상대적 "돌연변이"에 대 한 위험 비율을 나타냅니다. "WT" 그룹 나열 되지 않습니다 알 수 있습니다. 이 때문에 "WT" 그룹 역할 참조 인구-다른 모든 그룹에서 관찰 하는 죽음의 위험 위험 비율을 계산 하는 기준 인구에 비해. 따라서, 위험 비율 1 참조 인구에 비해 죽음의 빠른 속도 표시 하 고 값을 1 보다 작은 보다 큰 죽음의 감소 속도를 나타냅니다. 제공 된 예제에서 돌연변이 세포 2.2, 그들은 WT 셀 보다 더 빠른 x 2.2 사망 의미의 위험 비율을 표시 합니다. 기본적으로 R 기준 인구도 상위 그룹과 영숫자 순서로 그룹을 배열할 것 이다. 그룹 이름 앞에 숫자 배치 평가 되는 순서를 설정 하는 쉬운 방법입니다. 박스 2 와 3 에서 값 p-값 및 위험 비율에 대 한 95% 신뢰 간격 각각 나타냅니다, 콕스 비례 위험 분석에 의해 계산. 상자 4, 로그-순위 테스트 결과 보고 합니다. 이 테스트 테스트 되 고, 인구 가운데 생존에 통계적으로 유의 한 차이가 있는지를 평가 하지만 그룹은 다른 사람과 다른, 그리고 관찰 된 차이 대 한 크기를 계산 하지 않습니다 설명 하지 않습니다.
카 플 란-마이어 곡선 (그림 4B) 환자 생존에 개입의 효과 평가 하기 위한 임상 시험에 널리 사용 됩니다. 이러한 이유로, 많은 연구 자들은 생존 데이터 시각화이 이런식으로 해석 잘 알고 있다. 단일 세포 생존의 맥락에서이 플롯 각 그룹에서 시간이 지남에 살아있는 세포의 일부를 묘사. 플로팅 세포 생존, 다른 접근은 죽음 플롯 (그림 4C)의 누적 위험을 통해 각 그룹에 있는 세포 죽음의 비율 묘사를 둡니다. 대부분 생존 연구, 이벤트 수가 따르지 않는다 선형 진행; 오히려, 죽음의 주어진된 속도 대 한 이벤트의 더 많은 수 더 이른 시간에서 관찰 됩니다. 예를 들어 100 셀의 인구, 셀의 20% 사이 간격, 죽으면 20 셀 것 이다 간격 내에 첫 번째, 두 번째 간격, 3 간격 동안 13 16 죽을 그리고에. 이 로그 추세 때문에 y 축 세포 생존의 부정적인 로그 변환을 나타냅니다 죽음 플롯의 누적 위험을 사용 하 여 시각화를 개념적으로 쉽습니다. 또는, 죽음 플롯의 누적 위험 y 또한 % 세포 죽음, 1-1/e죽음의 누적 위험으로 계산 제시하실 수 있습니다. 이 플롯 또한 인구 사이 죽음의 위험의 간단 비교를 사용합니다. 위험 비율의 크기는 참조 그룹의 기준으로 각 인구를 위한 죽음 플롯의 누적 위험의 기울기를 반영합니다.
그림 1: 일반적인 생존 실험에 대 한 스키마. 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 DIV4에서 페는이 문서에 설명 된 절차를 사용 하 여. 시작 24 시간 후 transfection, 세포 실험의 특정 요구 사항에 따라 정기적으로 간격으로 몇 군데. 이미지 물 렸 다 고 쌓아 전에 세포 죽음을 득점 하 고 콕스 비례 위험 분석은 인구 사이 죽음의 위험을 비교 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 파일 구조 필요. 제공 된 피지 매크로 원시 데이터를 특정 방식으로 포맷 해야 합니다. 활용을 Image_Processing, 왼쪽에 표시 된 원시 데이터를 구성 합니다. 예를 들어 실험 및 파일 구조를 동반 오른쪽에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: transfected 쥐 대뇌 피 질의 신경 세포 죽음 점수. 이 문서에 설명 된 방법을 사용 하 여, 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 형광 단백질 mApple 인코딩 플라스 미드와 페 했다. 셀 다음 24 시간에 약을 몇 군데 했다, 이미지 되었다 꿰 스택, 그리고 세포 죽음 득점 제공 기준을 사용 하 여. 신경 1 형광의 손실에 의해 입증 69 h 세포 죽음을 가리킨다. 신경 2 셀 바디의 프로세스의 분열에 의해 표시 된 대로 188 h에서 죽는다. 3 신경 실험 하는 동안 살아 난다. Note는 일부 셀 표시 되만 늦게 실험에서 235 h에 새로운 셀의 외관에 의해 입증. 화상의 초기 시간에 표시 되는 유일한 셀 후속 분석 내에서 포함 되어 있습니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 콕스 비례 위험 분석의 해석. (A) 출력 요약이이 그림에서 강조 표시 되는 4 개의 중요 한 통계를 포함. 상자 1 상자 2 , 상자 3 표시 p-값과 각 위험 비율에 대 한 95% 신뢰 구간을 각각 컨트롤 그룹을 기준으로 실험 그룹의 위험 비율을 포함 한다. 상자 4 로그-순위 테스트의 결과 강조 표시합니다. 이 데이터는 또한 묘사를 통해 카 플 란-마이어 곡선 (B) 및 죽음 플롯 (C)의 누적 위험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 직접 단일 셀 기준 신경 생존을 모니터링 하는 방법론을 제시 합니다. 이 방법은 다양 한 세포 형태학, 단백질 표정, 지역화 등 요인의 지속적인 평가 대 한 수 있는 전통적인 분석 실험 세포 죽음에 대 한 개별 시간 포인트 및 셀의 전체 인구는, 달리 고 어떻게 각 요소 잠재 방식으로 세포 생존에 영향을 확인할 수 있습니다.
이 방법론은 다양 한 실험적인 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 주파수 및 이미징의 기간 쉽게 조정 될 수 있다, 그리고 관심의 모든 단백질 단백질 기능13,,1415, 조사 하거나 질병 상태를 형광 표시와 함께 공동 transfected 수 16,17,,1819. 이 문서에서는 transfecting 쥐 대뇌 피 질의 뉴런에 대 한 최적의 절차 설명, 비록 실험 스키마 어떤 포스트 mitotic 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 그러나, transfection 최적의 조건 당 세포 선으로, 최적화를 할 수 있습니다 그리고 기판 응집 또는 안정적으로 추적을 너무 많이 이동에서 세포를 방지 하기 위해 조정 해야 할 수 있습니다.
이미지 처리 및 분석 요구 사항은 각 종 현미경 실험의 특정 매개 변수에 따라 달라 집니다. 각 중요 한 단계에 대 한 간략 한 설명은 아래 실험의 요구 더 나은 일치 프로토콜을 사용자 지정할 수 있도록 포함 되어 있습니다.
바느질: 몽타주 이미지의 경우, 바느질 수행할 수 보기의 각 필드에 대 한 단일, 더 큰 이미지를 만들. 대부분의 응용 프로그램에 대 한 누적 이전 바느질을 수행 하는 것이 좋습니다입니다. 하나의 이미지를 잘 당 수행 하는 경우에이 단계를 수행할 필요가 있다.
스태킹: 별도 이미지 파일을 통해 시간이 지남에 세포를 추적 하는 대신 스태킹는 단일 시계열, 유사한 정지 프레임 애니메이션으로 연속 이미지에 맞게 수행할 수 있습니다. 성공적인 수 탁자 맞춤으로 스택된 이미지를 구성 하는 개별 프레임 밀접 하 게 정렬 됩니다. 그러나, 눈에 띄는 교대 또는 프레임 회전 경우 이미지 등록 필요 합니다. 자동으로 피지 플러그인 "MultiStackReg"를 사용 하 여 등록을 수행 하는 Image_Processing 매크로 이 플러그인은 이미지 실행 사이의 작은 부정합을 감소 도움이 됩니다. 그러나, 중요 한 교대, 수동으로 자르기와 이미지를 재조정 해야 합니다.
배경 빼기 (선택 사항): 이미지 중 발생할 수 있는 하나의 잠재적인 문제는 고르지 못한 조명. 형광 강도의 견적을 혼동 수 있습니다 이미지를 통해 신호 강도 변화에 따라서 됩니다. 이러한 경우에 강도 변화 배경 빼기 기법에 의해 제거할 수 있습니다. 이들은 특히 관련이 낮은 신호 잡음 비율 때문에 고르지 못한 조명 강도 교대 자체 fluorophore의 신호 크기에 비교 될 수 있는. 많은 배경 빼기 알고리즘, 피지 플러그인 연결의 몇 가지 있다. 자체 및 측정 되는 신호를 사용 하는 알고리즘의 이미지의 속성에 따라 선택. 피지 매크로 Image_Processing, 내 사용자 "압 연 공"을 수행 하는 옵션을 주어는 배경 이미지 (14 라인)의 스택된 집합에 빼기. 이 방법에서는, 현지 배경 모든 픽셀이 주변 픽셀의 평균 강도에 따라 결정 됩니다. 그런 다음이 값을 픽셀의 초기 값에서 뺍니다. 견적 다 로컬 백그라운드에 사용 되는 원의 반지름에 대 한 최적의 값 이미지에 가장 큰 전경 개체의 직경에 기초.
세포 죽음 점수: 인구 사이 정확한 비교를 위해 죽은 신경 세포를 식별 하기 위해 위에서 설명한 기준 전체 데이터 집합에 걸쳐 일관 되 게 적용 될 필수적 이다. 또한, 개인 눈부신 득점 세포 죽음 조사 실험 그룹에 편견의 잠재적인 출처를 삭제 한다. 특정 기준에 따라 그들의 generalizability, 그들은 세포 생존15,,1617,18, 의 공평된 평가 대 한 자동된 알고리즘에 통합 될 수 있습니다. 19.
생존 분석의 맥락과 다른 시간에 이벤트 분석, 3 가능한 결과가 있다. 먼저, 이벤트 (세포 죽음), 발생 하 고 이벤트가 발생 한 시간 기록. 둘째, 이벤트는 관찰의 기간 동안 발생 하지 않았다. 이러한 관측 실험의 완료에 검열 된다. 셋째, 이벤트 셀 보기의 필드 밖으로 이동 또는 가까운 세포에 의해 가려진 했다 때문에 득점 하지 않을 수 있습니다. 이 경우에 때 그것은 더 이상 정확 하 게 추적할 수 없습니다 셀 검열 이다. 첫 번째 결과 대 한 세포 죽음의 정확한 타이밍 어려울 수 있습니다 확인 하려면 이미징 간격에 따라. 예를 들어, 처음 살아있다 하지만 나중으로 죽은 24 h를 표시 하는 셀 언제 든 지 그 24 시간 기간 내에 사망 수 있습니다. 보수적인 것, 그것은 셀 자신 있게 살아 (왼쪽 검열)으로 확인 될 수 있다 마지막으로 죽음의 시간을 기록 하는 것이 좋습니다.
수행 콕스 비례 위험 분석 및 시각화 결과: 동반 Survival.R 스크립트 사용 인구와 콕스 비례 위험을 사용 하 여 그들의 통계적 의미 사이에서 죽음의 모험의 비교 분석 (그림 4A), 그리고 또한 카 플 란-마이어 곡선 (그림 4B) 또는 죽음 플롯 (그림 4C)의 누적 위험으로 플롯 결과. 생존 분석, 콕스 비례 위험 분석, 및 R에 "생존" 패키지 설명 자세히 크리스텐슨12 와 https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf에서 합니다.
여기에 설명 된 절차를 적용 하 여 다양 한 신경 기능 생존 관련이 있을 수 있습니다. 세포 체 및 핵 주위 ROI의 세대 수 경도 셀 크기와 형태, 단백질 식 수준 및 지역화, 또는 puncta 같은 subcellular 구조 형성을 모니터링할 사용자 또는 단백질13 를 집계합니다 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. 중요 한 것은, 이러한 각 요인의 세포 죽음에 관하여 관찰 된다, 때문에 그것은 양적 개별 요인 세포 생존 또는 주어진된 기간 동안 죽음을 예측 하는 얼마나 잘 확인할 수. 단백질 물질 대사 및 세포 경로 또한 기본 세포 생리학의 실시간 측정을 제공 하는 형광 기자를 표현 하 여 분석 수 있습니다 (예:., 활동을 시험 하는 gCaMP6f). 이 강력한 접근 방식을 채용 하 여 셀룰러 유지 보수, 기능, 및 장애 요인 함으로써 영감을 탐구의 새로운 길을 발견 하 고 공부에 자세히 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 스티브 Finkbeiner 및 로봇 현미경 선구적인 Finkbeiner 연구소의 회원을 감사 합니다. 우리는 또한 초기 소프트웨어 이미지 처리에 필요한 및 생존 분석 자동화를 구축 하기 위한 댄 Peisach 감사 합니다. 이 작품은 신경 성 질환 및 치기 (NINDS) R01-NS097542, 미시간 대학 단백질 폴딩 질병 이니셔티브, 및 앤아버 활성에 대 한 ALS를 위한 국립 연구소에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
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