Summary
यहां, हम एक एकल सेल के आधार पर अस्तित्व की निगरानी और चर कि काफी सेल मौत की भविष्यवाणी की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ।
Abstract
मानक cytotoxicity परख है, जो एकाधिक समय बिंदुओं पर lysates या निश्चित कोशिकाओं के संग्रह की आवश्यकता है, सीमित संवेदनशीलता और कारकों का आकलन करने के लिए क्षमता है कि ंयूरॉंस भाग्य प्रभाव । इन परख असतत समय अंक में कोशिकाओं के अलग आबादी के अवलोकन की आवश्यकता है । एक परिणाम के रूप में, व्यक्तिगत कोशिकाओं को समय के साथ संभावित रूप से पीछा नहीं किया जा सकता, बुरी तरह puncta गठन या प्रोटीन स्थानीयकरण के रूप में उपसेलुलर घटनाओं, कि भेदभाव करने की क्षमता सीमित, रोग के रोगजनक ड्राइवरों, समस्थिति प्रतिक्रियाओं, या महज संयोग की घटनाएं । एकल सेल अनुदैर्ध्य माइक्रोस्कोपी इन सीमाओं पर काबू पा, शोधकर्ता आबादी के बीच अस्तित्व में मतभेद निर्धारित करने के लिए और बढ़ाया संवेदनशीलता के साथ कारण संबंधों को आकर्षित करने के लिए अनुमति देता है । इस वीडियो गाइड एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर व्यक्त चूहे प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स के एकल सेल अस्तित्व को मापने प्रयोगों के लिए एक प्रतिनिधि कार्यप्रवाह रूपरेखा होगी. दर्शक सीखना होगा कि कैसे उच्च दक्षता transfections प्राप्त करने के लिए, इकट्ठा करने और प्रक्रिया छवियों व्यक्तिगत कोशिकाओं के संभावित ट्रैकिंग को सक्षम करने, और ंयूरॉंस के सापेक्ष अस्तित्व की तुलना आबादी कॉक्स आनुपातिक खतरों विश्लेषण का उपयोग कर ।
Introduction
असामान्य कोशिका मृत्यु कैंसर, neurodegeneration सहित कई रोगों में एक ड्राइविंग कारक है, और1स्ट्रोक. मजबूत और संवेदनशील सेल मौत के लिए परख इन विकारों के लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विस्तार या सेलुलर अस्तित्व को कम करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास । वर्तमान में सेल मौत को मापने के लिए तकनीक के दर्जनों रहे हैं, या तो सीधे या किराए मार्करों2के माध्यम से । उदाहरण के लिए, कोशिका मृत्यु नेत्रहीन महत्वपूर्ण रंजक है कि चुनिंदा दाग मृत या जीवित कोशिकाओं3, या प्लाज्मा झिल्ली4,5,6 पर विशिष्ट फॉस्फोलिपिड की उपस्थिति की निगरानी द्वारा की मदद से मूल्यांकन किया जा सकता . intracellular घटकों या सेलुलर विघटन पर मीडिया में जारी चयापचयों की माप भी सेल मौत7,8के लिए परदे के नीचे के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, सेलुलर व्यवहार्यता चयापचय गतिविधि9,10का आकलन करके अनुमानित किया जा सकता है । हालांकि इन तरीकों सेल अस्तित्व का आकलन करने के तेजी से साधन प्रदान करते हैं, वे निरंतर बिना नहीं कर रहे हैं । प्रत्येक तकनीक एक ही आबादी के रूप में संस्कृति का निरीक्षण, यह असंभव को व्यक्तिगत कोशिकाओं और अस्तित्व के अपने अद्वितीय दरों के बीच अंतर प्रतिपादन । इसके अलावा, इस तरह की आबादी आधारित परख कारकों है कि सेल मौत के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, सेलुलर आकृति विज्ञान, प्रोटीन अभिव्यक्ति, या स्थानीयकरण सहित उपाय करने में असमर्थ हैं । कई मामलों में, इन परख असतत समय अंक तक ही सीमित हैं, और समय के साथ कोशिकाओं की सतत अवलोकन के लिए अनुमति नहीं है ।
इसके विपरीत, अनुदैर्ध्य प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक अत्यधिक लचीली पद्धति है जो सीधे और लगातार11एकल-कोशिका आधार पर मृत्यु के जोखिम पर नज़र रखता है । संक्षेप में, अनुदैर्ध्य प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी समय की विस्तारित अवधि के लिए नियमित अंतराल पर ट्रैक किया जा करने के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं के हजारों सक्षम बनाता है, सेल मौत के सटीक निर्धारण और कारकों है कि बढ़ाने या सेल मौत को दबाने की अनुमति. इसके आधार पर, विधि क्षणिक अभिकर्मक या कोशिकाओं के transductioning वैक्टर फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंकोडिंग के साथ शामिल है । एक अनूठा प्रत्यई तो स्थापित है, और इस ऐतिहासिकता के संबंध में प्रत्येक transfected सेल की स्थिति उपयोगकर्ता छवि के लिए अनुमति देता है और घंटे, दिन, या सप्ताह के पाठ्यक्रम पर व्यक्तिगत कोशिकाओं को ट्रैक । जब इन छवियों को क्रमिक रूप से देखा जाता है, कोशिका मृत्यु प्रतिदीप्ति, आकृति विज्ञान, और कोशिका शरीर के विखंडन में विशिष्ट परिवर्तन द्वारा चिह्नित है, प्रत्येक कोशिका के लिए मृत्यु के एक समय के असाइनमेंट को सक्षम करने. मौत की गणना की दर, जोखिम समारोह द्वारा निर्धारित, तो मात्रात्मक शर्तों के बीच तुलना में किया जा सकता है, या सेलुलर विशेषताओं का चयन करने के लिए संबंधित univariate या बहुभिंनरूपी कॉक्स आनुपातिक खतरों12विश्लेषण । एक साथ, इन दृष्टिकोण सेलुलर आबादी के बीच सेल मौत की दरों का सही और उद्देश्य भेदभाव सक्षम है, और चर की पहचान है कि काफी सेल मौत की भविष्यवाणी और/
हालांकि इस विधि को चढ़ाना प्रारूपों के एक किस्म में किसी भी पोस्ट-mitotic सेल प्रकार में अस्तित्व पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल transfecting और इमेजिंग चूहे cortical एक ९६-अच्छी तरह से थाली में कल्चरित ंयूरॉंस के लिए शर्तों का वर्णन करेंगे ।
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Protocol
सभी हड्डीवाला पशु काम मिशिगन विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल # PRO00007096) में पशुओं के उपयोग और देखभाल पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । प्रयोगों को ध्यान से बलिदान पशुओं की संख्या को कम करने की योजना बनाई है । गर्भवती महिला जंगली-प्रकार (WT), गैर ट्रांसजेनिक लंबे इवांस चूहों (Rattus norvegicus) पर्यावरण संवर्धन से सुसज्जित कक्षों में अकेले रखे हैं, और मिशिगन विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु चिकित्सा (ुलाम) के लिए इकाई द्वारा परवाह है, में NIH-देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड समर्थित के साथ अनुसार । सभी चूहों को नियमित आवास में इच्छामृत्यु से पहले संभव के रूप में कम समय के लिए रखा गया था, अमेरिकी पशु चिकित्सा एसोसिएशन की इच्छामृत्यु पर दिशा निर्देशों की सिफारिशों के अनुरूप है और द्वारा इच्छामृत्यु के मिशिगन तरीकों विश्वविद्यालय प्रजातियों के दिशा निर्देशों ।
1. सामग्री की तैयारी
- काटना cortical न्यूरॉन्स भ्रूण दिवस 19 से-20 चूहे पिल्ले और संस्कृति चूहे cortical ंयूरॉंस में ०.५ x 10 milliliter प्रति6 कोशिकाओं पर पाली-डी-lysine 4 दिनों के लिए लेपित प्लेटें इन विट्रो में, के रूप में पहले वर्णित13,14, 15,16,17,18,19.
- एक endotoxin मुक्त प्लाज्मिड डीएनए आइसोलेशन किट द्वारा उल्लिखित चरणों के बाद ब्याज की प्लाज्मिड डीएनए तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें). एक spectrophotometer का उपयोग कर परिणामी डीएनए को बढ़ाता है ।
- On in विट्रो दिन 4 (DIV4), aliquot, फिल्टर निष्फल, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर निंनलिखित मीडिया मशीन: 6 मिलीलीटर कम सीरम मीडिया (आरएसएम; जैसे, OptiMEM), 25 मिलीलीटर न्यूरॉनिक बेसल मीडिया (एनबीएम), ४० मिलीलीटर NBKY (एनबीएम + 1 मिमी kynurenic एसिड + 10 मिमी MgCl2, 7 के एक पीएच करने के लिए समायोजित. 4), 10 मिलीलीटर एनबीसी (एनबीएम + 1x न्यूरॉन सेल संस्कृति अनुपूरक + 1x एल-glutamine अनुपूरक + 1x पेन Strep) ।
नोट: सूचीबद्ध वॉल्यूंस transfecting १ ९६-well थाली के लिए पर्याप्त हैं । विशिष्ट रिएजेंट के लिए सामग्री की तालिका का संदर्भ लें ।
2. चूहे Cortical न्यूरॉन्स की अभिकर्मक
- संशोधित प्रदान उदाहरण अभिकर्मक शीट ( पूरक फ़ाइल 1देखें) प्लेट प्रकार, प्लेट नक्शा, DNAs की संख्या, डीएनए एकाग्रता, और कुओं की संख्या (हरे बक्से) का समायोजन करके ।
नोट: कुल ०.२ µ g प्रति अच्छी तरह से डीएनए राशियां, चाहे एक (जैसे,डीएनए एक) या एकाधिक (जैसे, डीएनए बी और सी) डीएनए के निर्माण के लिए एक अच्छी तरह से जोड़ रहे हैं । - स्प्रेडशीट से काम करना, एक ट्यूब में आरएसएम और डीएनए की उचित मात्रा में गठबंधन । आरएसएम और अभिकर्मक रिएजेंट (उदा., Lipofectamine) की उचित मात्रा को एक अलग ट्यूब में संयोजित करें ।
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर मशीन ।
- डीएनए और अभिकर्मक रिएजेंट आरएसएम मिश्रण और आर टी पर 20 मिनट के लिए मशीन गठबंधन ।
- इस गर्मी कदम के दौरान, एक मल्टीचैनल पिपेट और बाँझ प्लास्टिक के गर्त का उपयोग करने के लिए एनबीएम के प्रति अच्छी तरह से १०० µ एल के साथ 2x कोशिकाओं धोने । वातानुकूलित मीडिया (सेमी) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । इस और निंनलिखित चरणों के लिए ध्यान रखना समय की मात्रा को कम करने के लिए ंयूरॉंस हवा के संपर्क में हैं ।
- एनबीएम मीडिया निकालें और NBKY के प्रति अच्छी तरह से १०० µ एल के साथ बदलें ।
- 20 मिनट बीत जाने के बाद, एक अच्छी तरह से अभिकर्मक एजेंट/डीएनए मिश्रण dropwise के ५० µ एल जोड़ें ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अभिकर्मक एजेंट/डीएनए परिसरों के साथ गर्मी कोशिकाओं ।
- NBKY के साथ 2x कुल्ला और सेमी के १०० µ एल के साथ बदलने और १०० µ एल एन बी के प्रति अच्छी तरह से ।
- सफलतापूर्वक transfected कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा 16 के भीतर दिखाई जानी चाहिए – 24 अभिकर्मक के एच. दक्षता गेज करने के लिए, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर की मशीन के बाद अभिकर्मक की जांच ।
नोट: इस तकनीक का एक समग्र अभिकर्मक दक्षता में परिणाम 5 से 10% ।
3. इमेजिंग
- एक मोटर की अवस्था के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर प्लेट प्लेस, और एक प्रत्यई स्थापित (उदाहरण के लिए, प्लेट के तल पर एक निशान) है कि उपयोगकर्ता प्लेट हर बार यह imaged है संरेखित करने की अनुमति देगा । संदर्भ के लिए इस प्रत्यई की कोई छवि सहेजें ।
- रुचि के किसी फ़ील्ड पर नेविगेट करें और प्रत्यई के सापेक्ष x-y निर्देशांकों को नोट करें.
- transfected एक फ्लोरोसेंट लेबल व्यक्त कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित ।
- उपयुक्त चैनल या चैनल में फ्लोरोसेंट छवियों ले लो (जैसे, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन [आरएफपी], ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन [GFP], 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), या तो मैंयुअल रूप से या एक स्वचालित तरीके से । नियमित रूप से दूरी अंतराल पर कई छवियों को लेकर, अच्छी तरह से एक असेंबल छवि प्रसंस्करण के दौरान इकट्ठा किया जा सकता है (चरण 4 देखें) ।
नोट: रिक्ति आवर्धन, माइक्रोस्कोप के प्रकाशिकी, और डिटेक्टर आकार सहित कई कारकों पर निर्भर करता है । सामांय में, आसंन छवियों के बीच ऑप्टिकल रिक्ति 90 के बीच होगा-प्रत्येक व्यक्ति की छवि के आकार का 95%, छवि ओवरलैप और सुविधा संरेखण की एक छोटी सी डिग्री के लिए अनुमति देते हैं । - इस प्रक्रिया को प्रायः आवश्यकतानुसार दोहराएं, प्रत्येक बार मूल प्रत्यई से संरेखित करें । अस्तित्व विश्लेषण के लिए, इमेजिंग हर 6-24 एच जगह लेता है, सेल प्रकार और प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है ।
4. छवि प्रसंस्करण
नोट: छवि अधिग्रहण के बाद, प्रसंस्करण कदम की एक श्रृंखला के लिए छवि विश्लेषण से पहले की आवश्यकता है । ये शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, सिलाई, स्टैकिंग, और पृष्ठभूमि घटाव (चित्रा 1) । इन कदमों का लक्ष्य है एक छवि ढेर, या समय श्रृंखला है, जो कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से अपनी पृष्ठभूमि और आसान से कई समय अंक पर पालन करने के लिए कर रहे है उत्पादन के लिए है । एक समर्पित फिजी मैक्रो (Image_Processing. ijm, पूरक फ़ाइल 2देखें), मूल सिलाई, स्टैकिंग, और पृष्ठभूमि घटाव करता है । प्रत्येक चरण का स्पष्टीकरण और छवि संसाधन निष्पादित करते समय विचार करने के लिए पैरामीटर्स चर्चा अनुभाग में प्रदान किया गया है ।
- चित्र 2में दिखाए गए स्वरूपण से मेल खाने के लिए raw डेटा या इनपुट निर्देशिका समायोजित करें ।
- यदि समय अंक निरंतर (यानी, T1, टी 2, T3) नहीं हैं, तो इन फ़ोल्डरों का नाम बदलें ताकि वे कर रहे हैं । यह चरण स्टैकिंग के दौरान Image_Processing मैक्रो क्रैश नहीं कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
- प्रोग्राम खोलने के लिए फिजी चिह्न पर डबल-क्लिक करें, फिर क्लिक करें और Image_Processing मैक्रो को फिजी बार पर खींचें । इससे फिजी के भीतर का मैक्रो खुलेगा ।
- छवियों, सिले और खड़ी छवियों, इमेजिंग timepoints, फ्लोरोसेंट चैनलों और प्लेट प्रारूप की संख्या की संख्या के लिए वांछित उत्पादन निर्देशिका युक्त इनपुट निर्देशिका को निर्दिष्ट करने के लिए Image_Processing मैक्रो की पंक्तियाँ 2-7 समायोजित करें ।
- वह क्रम निर्धारित करें जिसमें छवियां प्राप्त की गई थीं । इस परीक्षण के लिए, मैंयुअल रूप से Plugins ड्रॉप डाउन मेनू के लिए पैंतरेबाज़ी द्वारा फिजी में छवियों की एक असेंबल सिलाई । सिलाई | /ग्रिड संग्रह सिलाई। एक सही सिले छवि का उत्पादन किया है जब तक ड्रॉपडाउन मेनू प्रकार और आदेश के भीतर सेटिंग्स समायोजित करें ।
- GRID_TYPE और STITCH_ORDER चर पंक्तियों में 8 और 9 Image_Processing मैक्रो के इन चयनों से मेल करने के लिए समायोजित करें ।
- Image_Processing मैक्रो में पंक्ति 10 समायोजित करके प्रति अच्छी तरह से छवियों की संख्या निर्दिष्ट करें ।
नोट: छवियों के एक 2 x 2 असेंबल के लिए, इस लाइन मंद = 2 पढ़ा होगा । - यदि पृष्ठभूमि घटाव की आवश्यकता है, तो पंक्ति 14 को Image_Processing मैक्रो में BGSUB = true को समायोजित करें ।
- Image_Processing मैक्रो में लाइन 15 का समायोजन करके रोलिंग गेंद त्रिज्या सेट करें ।
नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, त्रिज्या को छवि में सबसे बड़ा अग्रभूमि ऑब्जेक्ट का व्यास कम करने के लिए सेट करें । - क्लिक करें, चलाएं Image_Processing मैक्रो को प्रारंभ करने के लिए । एक बार शुरू, Image_Processing स्वचालित रूप से सिलाई के माध्यम से अग्रिम होगा, stacking, और पृष्ठभूमि घटाव ।
5. स्कोरिंग सेल मौत
नोट: स्कोरिंग सेल मौत और सेंसर डेटा के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें ।
- Image_Processing स्क्रिप्ट द्वारा उत्पादित छवि स्टैक का पता लगाएँ । फिजी में ये खोलें.
- प्रत्येक कक्ष को किसी संख्या से अलग लेबल करने के लिए फिजी में पॉइंट टूल का उपयोग करें. प्रत्येक बिंदु के बाद टी दबाव रॉय (क्षेत्र के हित) प्रबंधक को सेल पहचानकर्ता जोड़ देगा ।
नोट: पहचानकर्ताओं को लेबल्स पर क्लिक करके और ROI प्रबंधक में सभी चेकबॉक्स दिखाए जाने की कल्पना की जा सकती है. -
प्रत्येक छवि स्टैक में timepoints के माध्यम से प्रगति और timepoint रिकॉर्ड जब प्रत्येक कोशिका या तो मर जाता है या फ़ाइल Survival_spreadsheet. csv में सेंसर करने की जरूरत है (पूरक फ़ाइल 3 देखें) ।
- प्रत्येक कक्ष स्प्रेडशीट में एक ही पंक्ति में जाता है, जहां प्रत्येक कक्ष के लिए एक अनंय पहचानकर्ता (ID) उसकी संगत अच्छी तरह से और ROI संख्या में अच्छी तरह से होते हैं । tp_death अंतिम समय बिंदु एक कोशिका को जीवित होने के लिए मनाया जाता है, जबकि time_death घंटे में मौत का वास्तविक समय का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक कक्ष के लिए, ये डेटा इनपुट करें । यह बाद में अस्तित्व का उपयोग विश्लेषण के लिए इस संरचना को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । आर ( पूरक फ़ाइल देखें 4) ।
नोट: सेल मौत निर्धारित करने के लिए मानदंड महत्वपूर्ण है और सेल के प्रकार के आधार पर भिंन हो सकते हैं । तीन मुख्य मानदंड मृत न्यूरॉन्स की पहचान में इस्तेमाल किया जाता है11,20 (चित्रा 3): प्रतिदीप्ति तीव्रता के नुकसान (जैसे, ंयूरॉन 1 पर ६९ ज), सेल शरीर के गोलाई (जैसे, ंयूरॉन 2 पर १८८ ज), और neurite का नुकसान वफ़ादारी या blebbing (जैसे, ंयूरॉन 2 पर १८८ ज) ।
- प्रत्येक कक्ष स्प्रेडशीट में एक ही पंक्ति में जाता है, जहां प्रत्येक कक्ष के लिए एक अनंय पहचानकर्ता (ID) उसकी संगत अच्छी तरह से और ROI संख्या में अच्छी तरह से होते हैं । tp_death अंतिम समय बिंदु एक कोशिका को जीवित होने के लिए मनाया जाता है, जबकि time_death घंटे में मौत का वास्तविक समय का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक कक्ष के लिए, ये डेटा इनपुट करें । यह बाद में अस्तित्व का उपयोग विश्लेषण के लिए इस संरचना को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । आर ( पूरक फ़ाइल देखें 4) ।
- अंतिम स्तंभ में कक्ष की सेंसर स्थिति रिकॉर्ड है ।
नोट: यहां, अजीब तरह से सेंसर आर द्वारा नियंत्रित किया जाता है के कारण, सेंसर कोशिकाओं 0द्वारा चिह्नित हैं, जबकि बिना सेंसर कोशिकाओं 1द्वारा चिह्नित कर रहे हैं. ध्यान दें कि अंतिम समय बिंदु पर रहने वाले सभी कक्षों को सेंसर किया गया है, और इसलिए 0के रूप में चिह्नित किया गया है.
6. प्रदर्शन कॉक्स आनुपातिक खतरों विश्लेषण और visualizing परिणाम
- यदि आवश्यक हो, https://cran.r-project.org/mirrors.html पर आर स्टूडियो डाउनलोड करें ।
- आर स्टूडियो खोलें और अस्तित्व के लिए आइकन पर डबल क्लिक करें । आर स्क्रिप्ट ।
- अस्तित्व की रेखा 2 पर कर्सर प्लेस । आर और अस्तित्व पुस्तकालय लोड करने के क्रम में मुख्य आर स्टूडियो विंडो में रन बटन पर क्लिक करें ।
- अस्तित्व की रेखा 5 बदलें । Survival_spreadsheet. csv फ़ाइल के स्थान से मेल करने के लिए R स्क्रिप्ट । भागो पर क्लिक करें एक dataframe के रूप में अस्तित्व डेटा लोड करने के लिए ।
- 8 और 9 पंक्तियाँ हाइलाइट करें और कॉक्स आनुपातिक खतरों विश्लेषण करने के लिए आदेश में R studio कंसोल विंडो में चलाएँ बटन क्लिक करते हैं । परिणाम और आउटपुट आँकड़े R स्टूडियो के कॉनसोल विंडो में दिखाई देते हैं ।
- अस्तित्व के 12-16 लाइनों पर प्रकाश डाला । आर और भागो बटन हिट के लिए मौत की साजिश है, जो आर स्टूडियो में भूखंडों टैब में दिखाई देगा की एक संचई जोखिम का उत्पादन । इस फाइल को प्लॉट के ऊपर एक्सपोर्ट बटन पर क्लिक करने से बचाया जा सकता है ।
- यह एक कापलान-Meier वक्र के रूप में अस्तित्व डेटा प्लॉट करने के लिए वांछनीय है, तो अस्तित्व के 19-24 लाइनों पर प्रकाश डाला । आर और भागो बटन मारा ।
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Representative Results
अभिकर्मक प्रक्रिया का प्रयोग यहां वर्णित है, DIV4 चूहा cortical ंयूरॉंस एक प्लाज्मिड फ्लोरोसेंट प्रोटीन mApple एंकोडिंग के साथ transfected थे । 24 घंटे के बाद अभिकर्मक, कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा 10 लगातार दिनों के लिए हर 24 घंटे imaged थे । परिणामी छवियों का आयोजन किया गया के रूप में चित्रा 2में संकेत दिया, तो सिले, खड़ी, और सेल मौत (चित्रा 1) के लिए रन बनाए । चित्रा 3 3 प्रतिनिधि ंयूरॉंस के लिए एक समय पाठ्यक्रम से पता चलता है, जिनमें से दो प्रयोग के दौरान मर जाते है (ंयूरॉंस 1 और 2), जबकि तीसरे जीवित (ंयूरॉन 3) ।
जीवन रक्षा डेटा आर स्क्रिप्ट (जीवन रक्षा प्रदान का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। R), और परिणाम 4 चित्रामें संक्षेप । लाइनों 7 और 8 अस्तित्व के चलने पर उत्पंन तालिका । आर कोड कॉक्स आनुपातिक खतरों विश्लेषण का एक सारांश प्रदान करता है । तालिका में चार विशेष रूप से महत्वपूर्ण आँकड़े चित्र 4aमें हाइलाइट किए गए हैं. बॉक्स 1 में संख्या "WT" के सापेक्ष समूह "उत्परिवर्ती" के लिए जोखिम अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है । ध्यान दें कि "WT" समूह सूचीबद्ध नहीं है । इसका कारण यह है कि "WT" समूह संदर्भ जनसंख्या के रूप में कार्य करता है-अंय सभी समूहों में मनाया मृत्यु का जोखिम संदर्भ जनसंख्या की तुलना में खतरा अनुपात की गणना करने के लिए है । इसलिए, जोखिम अनुपात 1 से अधिक संदर्भ जनसंख्या की तुलना में मृत्यु की एक तेज दर का संकेत है, और मान 1 से कम मृत्यु की दर कम प्रतिनिधित्व करते हैं । प्रदान की उदाहरण में, उत्परिवर्ती कोशिकाओं २.२ के एक जोखिम अनुपात प्रदर्शित करते हैं, जिसका अर्थ है कि वे मर 2.2 WT कोशिकाओं की तुलना में तेजी से एक्स । डिफ़ॉल्ट रूप से, R संदर्भ जनसंख्या के रूप में सेवारत शीर्ष समूह के साथ, अल्फ़ांयूमेरिक क्रम में समूहों को व्यवस्थित करेगा । समूह के नाम के सामने नंबर देने के क्रम में वे मूल्यांकन कर रहे है स्थापित करने के लिए एक आसान तरीका है । बक्से में मान 2 और 3 पी मूल्यों और जोखिम अनुपात के लिए ९५% विश्वास अंतराल, क्रमशः, कॉक्स आनुपातिक खतरों विश्लेषण द्वारा गणना प्रतिनिधित्व करते हैं । बॉक्स 4में लॉग-रैंक टेस्ट के परिणाम बताया है । इस परीक्षण का मूल्यांकन करता है कि क्या वहां आबादी के बीच अस्तित्व में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर का परीक्षण किया जा रहा है, लेकिन वर्णन नहीं है जो समूह दूसरों से अलग हैं, और मनाया अंतर के लिए एक परिमाण की गणना नहीं है ।
कापलान-Meier curves (चित्रा 4B) व्यापक रूप से रोगी अस्तित्व पर एक हस्तक्षेप के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए नैदानिक परीक्षणों में प्रयोग किया जाता है । इस कारण से, कई शोधकर्ताओं ने इस तरह visualized अस्तित्व डेटा की व्याख्या के साथ परिचित हैं । एकल कोशिका अस्तित्व के संदर्भ में, इन भूखंडों प्रत्येक समूह में समय पर जीवित कोशिकाओं के अंश को दर्शाती है । के बजाय साजिश रचने सेल अस्तित्व, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण को मौत की साजिश के एक संचई जोखिम के माध्यम से प्रत्येक समूह में सेल मौत की दर को दर्शाती है (आंकड़ा 4c) । सबसे जीवन रक्षा अध्ययनों में, घटनाओं की संख्या एक रैखिक प्रगति का पालन नहीं करता है; बल्कि, मृत्यु की दी गई दर की घटनाओं की अधिक से अधिक संख्या के लिए पहले समय में मनाया जाता है । उदाहरण के लिए, १०० कोशिकाओं की आबादी में, अगर कोशिकाओं के 20% अंतराल के बीच मर जाते हैं, तो 20 कोशिकाओं को पहले अंतराल के भीतर मर जाएगा, दूसरे अंतराल के दौरान 16, तीसरे अंतराल के दौरान 13, और इतने पर । यह लघुगणकीय रुझान मौत के भूखंडों के संचयी जोखिम का उपयोग करते हुए कल्पना करना आसान है, क्योंकि y-अक्ष सेलुलर उत्तरजीविता के नकारात्मक लॉग रूपांतर का प्रतिनिधित्व करता है । वैकल्पिक रूप से, y-अक्ष की मृत्यु भूखंड के संचयी जोखिम के रूप में भी प्रस्तुत किया जा सकता% सेल मृत्यु, की गणना के रूप में 1-1/eमृत्यु के संचयी जोखिम. इन भूखंडों भी आबादी के बीच मौत के जोखिम की सीधी तुलना सक्षम । जोखिम अनुपात की भयावहता प्रत्येक जनसंख्या, संदर्भ समूह के सापेक्ष के लिए मौत की साजिश के संचई जोखिम की ढलान को दर्शाता है ।
चित्रा 1: एक ठेठ अस्तित्व के प्रयोग के लिए स्कीमा । चूहे cortical न्यूरॉन्स इस लेख में उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग कर DIV4 पर transfected हैं. 24 घंटे के बाद अभिकर्मक, कोशिकाओं के प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार नियमित रूप से स्थान अंतराल पर imaged हैं । चित्र सिले और सेल मौत से पहले खड़ी है रन बनाए है, और कॉक्स आनुपातिक जोखिम विश्लेषण के लिए आबादी के बीच मौत के जोखिम की तुलना किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: आवश्यक फ़ाइल संरचना । प्रदान किए गए फिजी मैक्रो के लिए आवश्यक है कि raw डेटा किसी विशिष्ट तरीके से स्वरूपित हो. Image_Processing का उपयोग करने के लिए , raw डेटा को बाईं ओर दिखाए गए के रूप में व्यवस्थित करें । एक उदाहरण प्रयोग और साथ फ़ाइल संरचना दाईं ओर दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: transfected चूहा cortical ंयूरॉंस में स्कोरिंग सेल मौत । इस लेख में वर्णित तरीकों का प्रयोग, चूहे cortical ंयूरॉंस एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन mApple एंकोडिंग प्लाज्मिड के साथ transfected थे । कोशिकाओं को तो लगभग हर 24 एच imaged थे, छवियों और सिले stacked थे, और कोशिका मृत्यु प्रदान मापदंड का उपयोग कर बनाए । कोशिका मृत्यु ६९ एच पर ंयूरॉन 1 के लिए संकेत दिया है, के रूप में प्रतिदीप्ति के नुकसान का सबूत है । ंयूरॉन 2 १८८ एच में मर जाता है, के रूप में प्रक्रियाओं और कोशिका शरीर के गोलाई के विखंडन द्वारा संकेत दिया । न्यूरॉन 3 प्रयोग की अवधि के लिए जीवित रहता है. ध्यान दें कि कुछ कोशिकाओं को प्रयोग में केवल देर से दिखाई देते हैं, के रूप में एक नए सेल की उपस्थिति के द्वारा सबूत २३५ ज । केवल इमेजिंग के आरंभिक समय में दिखाई देने वाले कक्ष अनुवर्ती विश्लेषणों में शामिल किए जाते हैं. स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: कॉक्स आनुपातिक जोखिम विश्लेषण की व्याख्या । (क) इस आंकड़े में हाइलाइट किए गए चार महत्वपूर्ण आँकड़ों में आउटपुट सारांश शामिल है. बॉक्स 1 में नियंत्रण समूह के सापेक्ष प्रयोगात्मक समूह का जोखिम अनुपात शामिल है, जबकि बॉक्स 2 और बॉक्स 3 p-मान और प्रत्येक जोखिम अनुपात के लिए ९५% विश्वास अंतराल क्रमशः दिखाते हैं । बॉक्स 4 लॉग-रैंक परीक्षण के परिणामों पर प्रकाश डाला गया । इन आंकड़ों को भी एक कापलान-Meier वक्र (ख) और मौत की साजिश का एक संचई जोखिम के माध्यम से चित्रित कर रहे है (सी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां, पद्धति को सीधे एक एकल कोशिका आधार पर ंयूरॉंस अस्तित्व पर नजर रखने के लिए प्रस्तुत किया है । कोशिका मृत्यु कि असतत समय अंक और कोशिकाओं की पूरी आबादी तक ही सीमित है के लिए पारंपरिक परख के विपरीत, इस विधि सेलुलर आकृति विज्ञान, प्रोटीन अभिव्यक्ति, या स्थानीयकरण के रूप में कारकों की एक किस्म के सतत आकलन के लिए अनुमति देता है, और कैसे प्रत्येक कारक एक संभावित तरीके से सेलुलर अस्तित्व को प्रभावित करता है निर्धारित कर सकते हैं ।
इस पद्धति के लिए प्रयोगात्मक जरूरतों की एक विस्तृत सरणी फिट संशोधित किया जा सकता है । आवृत्ति और इमेजिंग की अवधि आसानी से समायोजित किया जा सकता है, और ब्याज की किसी भी प्रोटीन मॉडल रोग राज्यों के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ सह-transfected जा सकता है या प्रोटीन समारोह13,14,15की जांच, 16,17,18,19. यह आलेख transfecting रैट cortical न्यूरॉन्स के लिए इष्टतम प्रक्रिया का वर्णन करता है, हालांकि प्रयोगात्मक स्कीमा किसी भी पोस्ट-mitotic कक्ष प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है । हालांकि, इष्टतम अभिकर्मक स्थितियों एक प्रति-सेल लाइन के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है, और सब्सट्रेट करने के लिए मज़बूती से ट्रैक करने के लिए या बहुत ज्यादा बढ़ रहा से कोशिकाओं को रोकने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण आवश्यकताओं प्रत्येक अनुदैर्ध्य माइक्रोस्कोपी प्रयोग के विशिष्ट मापदंडों के आधार पर भिन्न हो जाएगा. एक प्रयोग की मांगों को बेहतर करने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में मदद के लिए प्रत्येक महत्वपूर्ण चरण का संक्षिप्त विवरण नीचे शामिल किया गया है ।
सिलाई: यदि छवियों की एक असेंबल लिया जाता है, सिलाई के लिए देखने के प्रत्येक क्षेत्र के लिए एक एकल, बड़ा छवि बनाने के लिए किया जा सकता है । सबसे अनुप्रयोगों के लिए यह stacking करने से पहले सिलाई प्रदर्शन करने के लिए बेहतर है । यदि केवल एक छवि प्रति अच्छी तरह से लिया जाता है, तो इस चरण को निष्पादित करने की कोई आवश्यकता नहीं है ।
स्टैकिंग: बल्कि अलग छवि फ़ाइलों के पार समय पर कोशिकाओं पर नज़र रखने से, स्टैकिंग एक एकल समय श्रृंखला, एक बंद फ्रेम एनीमेशन के अनुरूप में लगातार छवियों संरेखित करने के लिए किया जा सकता है । सफल प्रत्यई संरेखण के साथ, स्टैक्ड छवि वाले व्यक्तिगत फ़्रेम बारीकी से संरेखित होंगे । हालांकि, यदि फ्रेम के बीच में नजर पाली या घुमाव हैं, छवि पंजीकरण की जरूरत है । Image_Processing मैक्रो स्वचालित रूप से फिजी प्लगइन का उपयोग कर पंजीकरण करता है "MultiStackReg." इस प्लगइन इमेजिंग रन के बीच छोटे ग़लत संरेखण को कम करने में मदद करता है । हालांकि, महत्वपूर्ण बदलाव के साथ, मैन्युअल रूप से काट-छांट करना और छवियों को फिर से संरेखित करना आवश्यक हो सकता है.
पृष्ठभूमि घटाव (वैकल्पिक): छवि अधिग्रहण के दौरान पैदा हो सकता है कि एक संभावित मुद्दा असमान रोशनी है । यह एक छवि है कि प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुमान को मिल सकता है भर में संकेत तीव्रता में बदलाव का परिणाम होगा । इन उदाहरणों में, तीव्रता विविधताओं पृष्ठभूमि घटाव तकनीकों के द्वारा समाप्त किया जा सकता है । ये शोर अनुपात के लिए कम संकेत के साथ विशेष रूप से प्रासंगिक हैं, जहां तीव्रता असमान रोशनी के कारण बदलाव fluorophore ही के संकेत को परिमाण में तुलनीय किया जा सकता है । कई पृष्ठभूमि घटाव एल्गोरिदम, जिनमें से कई फिजी plugins जुड़े हुए हैं । जो की पसंद एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए छवि के गुणों पर ही निर्भर करता है और संकेत मापा जा रहा है । फिजी स्थूल Image_Processing के भीतर , उपयोगकर्ता के लिए छवियों का एक खड़ी सेट (लाइन 14) पर "रोलिंग बॉल" पृष्ठभूमि घटाव प्रदर्शन का विकल्प दिया जाता है । इस विधि में, एक स्थानीय पृष्ठभूमि हर पिक्सेल कि पिक्सेल आसपास के एक सर्कल की औसत तीव्रता के आधार पर के लिए निर्धारित किया जाता है । यह मान फिर पिक्सेल के आरंभिक मान से घटाया जाता है. स्थानीय पृष्ठभूमि का अनुमान के लिए इस्तेमाल किया सर्कल की त्रिज्या के लिए इष्टतम मूल्य छवि में सबसे बड़ा अग्रभूमि वस्तु के व्यास पर आधारित अलग होगा ।
स्कोरिंग सेल मौत: आबादी के बीच सटीक तुलना के लिए, यह आवश्यक है कि ऊपर उल्लिखित मानदंड मृत न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए पूरे डेटासेट में लगातार लागू किया जा. इसके अलावा, जांच के तहत प्रयोगात्मक समूहों के लिए सेल मौत स्कोरिंग व्यक्तियों अंधा पूर्वाग्रह के संभावित स्रोतों को समाप्त । विशिष्ट मानदंडों और उनकी सामांयीकरण के आधार पर, वे सेलुलर जीवन रक्षा के निष्पक्ष मूल्यांकन के लिए स्वचालित एल्गोरिदम में शामिल किया जा सकता है15,16,17,18, 19. शी.
अस्तित्व विश्लेषण और अंय समय के संदर्भ में घटना का विश्लेषण करती है, वहां तीन संभावित परिणाम हैं । सबसे पहले, घटना (सेल मौत) हुई है, और जिस पर घटना हुई उस समय दर्ज की गई है । दूसरा, घटना निरीक्षण की समय सीमा के दौरान नहीं हुई । इन टिप्पणियों के प्रयोग के पूरा होने पर सेंसर किया जाता है । तीसरा, ईवेंट को रन नहीं किया जा सका क्योंकि कक्ष दृश्य के फ़ील्ड से बाहर चला गया था, या आस-पास के कक्षों द्वारा छिप गया था । इस मामले में, सेल सेंसर जब यह अब सही ट्रैक किया जा सकता है । पहले परिणाम के लिए, कोशिका मृत्यु के सटीक समय इमेजिंग अंतराल के आधार पर निर्धारित करने के लिए मुश्किल हो सकता है । उदाहरण के लिए, एक सेल है कि शुरू में जीवित है, लेकिन मृत के रूप में 24 घंटे के रूप में चिह्नित है कि 24 घंटे की अवधि के भीतर किसी भी बिंदु पर मर सकता है । रूढ़िवादी होने के लिए, यह अच्छा अभ्यास के लिए अंतिम बार एक सेल के रूप में विश्वास की पहचान की जा सकती है के रूप में मौत के समय रिकॉर्ड है जिंदा (सेंसर छोड़ दिया) ।
कॉक्स आनुपातिक खतरों विश्लेषण और परिणाम visualizing प्रदर्शन: साथ अस्तित्व । आर स्क्रिप्ट आबादी और उनके सांख्यिकीय महत्व कॉक्स आनुपातिक खतरों का उपयोग कर के बीच मौत के जोखिम की तुलना में सक्षम बनाता है विश्लेषण (4a चित्रा), और भी एक कापलान-Meier वक्र (चित्रा 4B) या मौत की साजिश का एक संचई जोखिम (चित्रा 4c) के रूप में परिणाम साजिश । अस्तित्व विश्लेषण, कॉक्स आनुपातिक खतरों विश्लेषण, और "अस्तित्व" आर में पैकेज और अधिक विस्तार में12 Christensen द्वारा और https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf में वर्णित हैं ।
यहां उल्लिखित प्रक्रियाओं को रूपांतरित करके, कई प्रकार की न्यूरॉनल सुविधाओं से बचने के लिए संबंधित हो सकते हैं । सेल शरीर और/या नाभिक के आसपास एक रॉय के उत्पादन उपयोगकर्ता longitudinally मॉनिटर सेल आकार और आकृति विज्ञान, प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर और स्थानीयकरण, या जैसे puncta या प्रोटीन समुच्चय13 के रूप में उपसेलुलर संरचनाओं के गठन के लिए सक्षम बनाता है , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. महत्वपूर्ण बात, क्योंकि इन कारकों में से प्रत्येक कोशिका मृत्यु के संबंध में मनाया जाता है, यह मात्रा में कितनी अच्छी तरह व्यक्तिगत कारकों सेलुलर अस्तित्व या दिए गए समय सीमा के दौरान मौत का अनुमान निर्धारित करने के लिए संभव है । प्रोटीन चयापचय और सेलुलर रास्ते भी फ्लोरोसेंट पत्रकारों कि अंतर्निहित सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान (जैसे, परख गतिविधि के लिए gCaMP6f) की वास्तविक समय माप प्रदान व्यक्त द्वारा परख हो सकती है । इस शक्तिशाली दृष्टिकोण को रोजगार, कारकों है कि ड्राइव सेलुलर रखरखाव, समारोह, और शिथिलता का पर्दाफाश किया जा सकता है और विस्तार से अध्ययन, जिससे जांच के नए रास्ते प्रेरणादायक ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम अग्रणी रोबोट माइक्रोस्कोपी के लिए स्टीव Finkbeiner और Finkbeiner लैब के सदस्यों को धंयवाद । हम भी प्रारंभिक छवि प्रसंस्करण और स्वचालित अस्तित्व विश्लेषण के लिए आवश्यक सॉफ्टवेयर के निर्माण के लिए दान Peisach धंयवाद । इस काम के लिए राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के लिए संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया (NINDS) R01-NS097542, मिशिगन प्रोटीन तह रोग पहल के विश्वविद्यालय, और एन आर्बर ALS के खिलाफ सक्रिय ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
