Summary
Qui, presentiamo un protocollo per monitorare la sopravvivenza su una base di singola cellula e identificare le variabili che significativamente predicono la morte delle cellule.
Abstract
Saggi di citotossicità standard, che richiedono la raccolta di lisati o celle fisse a più punti di tempo, hanno limitato la sensibilità e la capacità di valutare i fattori che influenzano il destino di un neurone. Queste analisi richiedono l'osservazione di popolazioni separate delle cellule a intervalli di tempo discreti. Di conseguenza, le singole celle non possono essere seguite prospetticamente nel tempo, limitando gravemente la capacità di discriminare se subcellulari eventi, ad esempio puncta formazione o mislocalization di proteine, sono driver patogeni della malattia, le risposte omeostatiche, o fenomeni puramente coincidenti. Cella singola longitudinale microscopia supera queste limitazioni, che permette al ricercatore di determinare le differenze nella sopravvivenza tra popolazioni e disegnare relazioni causali con maggiore sensibilità. Questa video guida illustrerà un flusso di lavoro rappresentativo per gli esperimenti di sopravvivenza unicellulari di primaria neuroni corticali del ratto, che esprime un proteina fluorescente indicatore di misura. Lo spettatore sarà imparare a raggiungere ad alta efficienza transfezioni, raccogliere ed elaborare immagini consentendo il monitoraggio prospettico delle singole celle e confrontare la relativa sopravvivenza di popolazioni neuronali utilizzando analisi rischi proporzionali di Cox.
Introduction
Morte delle cellule anormali è un fattore trainante in molte malattie, compreso cancro, neurodegenerazione e corsa1. Saggi di robuste e sensibile per la morte delle cellule sono essenziali per la caratterizzazione di questi disordini, come pure lo sviluppo di strategie terapeutiche per estendere o ridurre la sopravvivenza cellulare. Attualmente esistono decine di tecniche per la misurazione di morte delle cellule, direttamente o tramite surrogati marcatori2. Ad esempio, morte delle cellule può essere valutata visivamente con l'ausilio di coloranti vitali che macchia selettivamente cellule morte o vita3, o controllando l'aspetto dei fosfolipidi specifici sulla membrana plasmatica4,5,6 . Misure di componenti intracellulari o di metaboliti cellulari rilasciati in media dopo la dissoluzione cellulare utilizzabile anche come proxy per cellule morte7,8. In alternativa, la vitalità cellulare può essere approssimata valutando attività metabolica9,10. Anche se questi metodi forniscono mezzi rapidi di valutare la sopravvivenza delle cellule, non sono senza avvertimenti. Ogni tecnica osserva la cultura come un'unica popolazione, rendendo impossibile distinguere tra le singole celle e loro unici tassi di sopravvivenza. Inoltre, tali dosaggi basati sulla popolazione sono in grado di misurare i fattori che possono essere importanti per la morte delle cellule, compreso la morfologia cellulare, l'espressione della proteina o localizzazione. In molti casi, queste analisi sono limitate ai punti di tempo discreto e non consentono l'osservazione continua delle cellule nel corso del tempo.
Al contrario, microscopia a fluorescenza longitudinale è una metodologia altamente flessibile che direttamente e continuamente controlla il rischio di morte su una singola cellula base11. In breve, microscopia a fluorescenza longitudinale consente a migliaia di singole celle per essere monitorati ad intervalli regolari per lunghi periodi di tempo, consentendo precise determinazioni di morte delle cellule e dei fattori che migliorano o sopprimono la morte delle cellule. Alla sua base, il metodo prevede la trasfezione transiente o trasduzione delle cellule con vettori codificanti proteine fluorescenti. Un unico fiduciario viene quindi stabilito, e la posizione di ogni cellule transfettate in relazione a questa pietra miliare consente all'utente di immagine e tenere traccia di singole cellule nel corso di ore, giorni o settimane. Quando queste immagini vengono visualizzate in sequenza, la morte delle cellule è contrassegnata da cambiamenti caratteristici in fluorescenza, la morfologia e la frammentazione del corpo cellulare, consentendo l'assegnazione di un tempo di morte per ogni cella. Il tasso di morte, determinata dalla funzione di rischio, calcolato può quindi essere quantitativamente rispetto tra le condizioni, o correlato per selezionare caratteristiche cellulari utilizzando monovariante o analisi multivariata rischi proporzionali di Cox12. Insieme, questi approcci consentono la discriminazione accurata e obiettiva dei tassi di morte delle cellule fra popolazioni cellulari e l'identificazione delle variabili che significativamente predicono la morte delle cellule e/o sopravvivenza (Figura 1).
Anche se questo metodo può essere utilizzato per monitorare la sopravvivenza in qualsiasi tipo di cellule post-mitotiche in una varietà di formati di placcatura, questo protocollo descriverà le condizioni per trasfezione e imaging neuroni corticali del ratto coltivati in una piastra a 96 pozzetti.
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Protocol
Tutto il lavoro degli animali vertebrato è stato approvato dal Comitato per l'uso e la cura degli animali presso l'Università del Michigan (protocollo n # PRO00007096). Gli esperimenti vengono pianificati attentamente per ridurre al minimo il numero di animali sacrificati. Incinta femmina wild-type (WT), non transgenica ratti lungo Evans (Rattus norvegicus) sono alloggiati singolarmente in camere dotate di arricchimento ambientale e curato dall'unità per laboratorio animale medicina (ULAM) presso l'Università del Michigan, in conformità con la Guida di NIH-supportato per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutti i ratti sono stati tenuti in custodia per il minor tempo possibile prima dell'eutanasia, coerenza con le raccomandazioni delle linee guida sull'eutanasia dell'associazione medica veterinaria americana e l'Università del Michigan metodi di eutanasia di routine Linee guida di specie.
1. materiale preparazione
- Sezionare i neuroni corticali da giorno embrionale 19 – 20 cuccioli del ratto e cultura ratto neuroni corticali a 0,5 x 106 cellule per millilitro sulle piastre rivestite con poli-D-lisina per 4 giorni in vitro, come descritto in precedenza13,14, 15,16,17,18,19.
- Preparare il plasmide DNA di interesse seguendo la procedura descritta da un isolamento di DNA plasmidico privo di endotossina kit (Vedi Tabella materiali). Quantificare il DNA risultante utilizzando uno spettrofotometro.
- Il giorno in vitro filtro aliquota, 4 (DIV4), sterilizzare e incubare i seguenti supporti a 37 ° c: 6 mL ridotto media del siero (RSM; ad es.., OptiMEM), 25 mL di un neurone media basale (NBM), 40 mL NBKY (NBM + acido chinurenico 1 mM + 10 mM MgCl2, regolato ad un pH di 7. 4), 10ml NBC (NBM + 1 x un neurone delle cellule supplemento cultura + 1 x supplemento di L-Glutammina + 1 x penna Strep).
Nota: Volumi elencati sono sufficienti per trasfettando una piastra a 96 pozzetti. Fare riferimento alla Tabella materiali per reagenti specifici.
2. transfezione dei neuroni corticali del ratto
- Modificare il fornito esempio foglio di transfezione (vedere Supplemental File 1) regolando il tipo di piastra, mappa di piastra, numero di DNAs, concentrazione del DNA e il numero di pozzetti (scatole verdi).
Nota: Il DNA totale somme a 0,2 µ g per bene, indipendentemente dal fatto se uno (es.., A DNA) o più (ad es., DNA B e C) costrutti di DNA vengono aggiunti a ciascun pozzetto. - Lavorando dal foglio di calcolo, combinare la quantità appropriata di RSM e DNA in una provetta. Combinare la quantità appropriata di RSM e transfezione reagente (ad es., Lipofectamine) in un tubo separato.
- Incubare a temperatura ambiente (TA) per 5 min.
- Unire i composti RSM reagente DNA e transfezione e incubare a temperatura ambiente per 20 min.
- Durante questa fase di incubazione, utilizzare una pipetta multicanale e depressioni di plastica sterile per lavare le cellule 2x con 100 µ l di NBM. Riserviamo il media condizionati (CM) e conservare a 37 ° C. Per questo e come segue, fare attenzione a ridurre al minimo la quantità di tempo che i neuroni sono esposti all'aria.
- Rimuovere il supporto NBM e sostituire con 100 µ l di NBKY.
- Sono trascorsi 20 minuti, aggiungere 50 µ l della miscela reagente/DNA transfezione goccia a goccia in ciascun pozzetto.
- Incubare le cellule con i complessi di DNA/reagente di transfezione per 20 min a 37 ° C.
- Sciacquare 2x con NBKY e sostituire con 100 µ l di CM e 100 µ l di NBC per pozzetto.
- Cellule trasfettate con successo devono essere visibile da microscopia di fluorescenza all'interno 16 – 24 h di transfezione. Per valutare l'efficienza, è necessario utilizzare un microscopio a fluorescenza per controllare la transfezione dopo una notte di incubazione a 37 ° C.
Nota: Questa tecnica si traduce in un'efficienza di trasfezione complessiva del 5-10%.
3. imaging
- Collocare la piastra su un microscopio a fluorescenza con un tavolino motorizzato e stabilire un fiduciario (per esempio, un interrogativo sul fondo del piatto) che permetterà all'utente di allineare la piastra ogni volta che si è ripreso. Salvare un'immagine di questo fiduciari per riferimento.
- Passare a un campo di interesse e le coordinate x-y relative l'intestazione fiduciaria di notare.
- Concentrarsi su cellule transfettate che esprimono un'etichetta fluorescente.
- Prendere immagini fluorescenti nel canale appropriato o canali (ad es., proteina fluorescente rossa proteina fluorescente [RFP], verde [GFP], 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), sia manualmente che in modo automatico. Prendendo diverse immagini a intervalli regolarmente distanziati, un montaggio del pozzo possa essere assemblato durante elaborazione dell'immagine (Vedi punto 4).
Nota: La spaziatura dipende da parecchi fattori, compreso l'ingrandimento, l'ottica del microscopio e le dimensioni del rivelatore. In generale, la spaziatura ottica tra le immagini adiacenti sarà tra 90 – 95% delle dimensioni di ogni immagine, per consentire un certo grado di sovrapposizione di immagine e sono dotate di allineamento. - Ripetere questo processo come spesso come richiesto, allineamento per la fiduciaria originale ogni volta. Per l'analisi di sopravvivenza, imaging avviene ogni 6 – 24 h, a seconda del tipo di cella e lo scopo dell'esperimento.
4. image Processing
Nota: A seguito di acquisizione di immagini, una serie di passaggi di elaborazione sono richiesti prima dell'analisi di immagine. Questi includono, ma non sono limitati a, impunture, accatastamento e sottrazione di sfondo (Figura 1). L'obiettivo della procedura è quello di produrre una serie di immagini, o serie temporali, in cui le cellule sono chiaramente distinguibili dal loro background e facile da seguire nel corso di più punti di tempo. Una macro dedicato di FIJI (Image_Processing.ijm, vedere Supplemental File 2), esegue la cucitura base, accatastamento e sottrazione di base. Nella sezione discussione è fornire una spiegazione di ogni passaggio e i parametri da prendere in considerazione durante l'elaborazione di immagine.
- Regolare i dati grezzi o directory di input per applicare la formattazione illustrato nella Figura 2.
- Se punti temporali non sono contigui (cioè, T1, T2, T3), rinominare queste cartelle in modo che essi sono. Questo passaggio è fondamentale per garantire che la macro Image_Processing non bloccarsi durante l'impilamento.
- Fare doppio clic sull'icona del Fiji per aprire il programma, quindi fare clic e trascinare la barra di Fiji la macro Image_Processing . Verrà aperta la macro all'interno di Fiji.
- Regolare le righe 2-7 della macro Image_Processing per specificare la directory di input contenente immagini, la directory di output desiderato per immagini cucite e impilate, il numero di punti temporali imaging, numero di canali fluorescente e formato del piatto.
- Determinare l'ordine in cui sono state acquisite le immagini. Per eseguire questo test, cucire manualmente un montaggio di immagini in FIJI manovrando per plugin drop down menu | Impunture | Collezione/grid impunture. Regolare le impostazioni all'interno dei menu a discesa tipo e ordine fino a quando non viene prodotta un'immagine con precisione cucita.
- Modificare le variabili GRID_TYPE e STITCH_ORDER in linee 8 e 9 della macro Image_Processing per abbinare queste selezioni.
- Specificare il numero di immagini per pozzetto regolando riga 10 della macro Image_Processing .
Nota: Per un montaggio di 2 x 2 di immagini, questa linea avrebbe letto DIM = 2. - Se è necessaria la sottrazione di sfondo, regolare linea 14 nella macro Image_Processing BGSUB = true.
- Impostare il raggio di rotolamento sfere regolando linea 15 nella macro Image_Processing .
Nota: Per risultati ottimali, impostate il raggio su almeno il diametro dell'oggetto in primo piano più grande nell'immagine. - Fare clic su Esegui per avviare la macro Image_Processing . Una volta avviato, Image_Processing avanzerà automaticamente attraverso cuciture, accatastamento e sottrazione di sfondo.
5. segnando la morte delle cellule
Nota: Vedere la sezione di discussione per ulteriori informazioni su dati censura e segnando la morte delle cellule.
- Individuare la serie di immagini prodotte dallo script Image_Processing . Aprire questi in FIJI.
- Utilizzare il punto strumento all'interno di FIJI per etichettare singolarmente ogni cella con un numero. Premendo t dopo ogni punto aggiungerà l'identificatore di cella con il Manager di ROI (regione d'interesse).
Nota: Gli identificatori possono essere visualizzati cliccando le caselle di controllo etichette e visualizzare tutto in gestione il ROI. -
Progresso attraverso i punti temporali in ogni serie di immagini e registrare il timepoint quando ogni cellula muore o ha bisogno di essere censurato nel file Survival_spreadsheet.csv (Vedi File supplementare 3).
- Ogni cella che occupa una singola riga nel foglio di calcolo, dove un identificatore univoco (ID) per ogni cella è costituito da suo corrispondente bene e ROI numero all'interno di quel pozzo. tp_death è l'ultimo punto di tempo che una cella è osservata per essere viva, mentre time_death rappresenta il tempo effettivo di morte in ore. Per ogni cella, questi dati di input. È fondamentale per mantenere questa struttura per l'analisi successiva usando sopravvivenza. R (vedere Supplemental File 4).
Nota: I criteri per determinare la morte delle cellule sono cruciali e possono variare a seconda del tipo di cella. Tre criteri principali sono utilizzati nell'identificazione dei neuroni morti11,20 (Figura 3): perdita di intensità di fluorescenza (ad es., il neurone 1 a 69 h), arrotondamento del corpo cellulare (ad esempio, il neurone 2 a 188 h) e la perdita di neuriti l'integrità o blebbing (ad esempio, il neurone 2 a 188 h).
- Ogni cella che occupa una singola riga nel foglio di calcolo, dove un identificatore univoco (ID) per ogni cella è costituito da suo corrispondente bene e ROI numero all'interno di quel pozzo. tp_death è l'ultimo punto di tempo che una cella è osservata per essere viva, mentre time_death rappresenta il tempo effettivo di morte in ore. Per ogni cella, questi dati di input. È fondamentale per mantenere questa struttura per l'analisi successiva usando sopravvivenza. R (vedere Supplemental File 4).
- Registrare lo stato di censore della cella nell'ultima colonna.
Nota: Qui, a causa di quella peculiare censura viene gestita da R, censurate celle sono contrassegnate da 0, mentre le cellule senza censure sono contrassegnate da 1. Si noti che tutte le cellule che vivono all'ultimo punto nel tempo sono censurate e pertanto contrassegnate come 0.
6. esecuzione proporzionale di Cox di rischi d'analisi e visualizzazione risultati
- Se necessario, scaricare R studio presso https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- Aprire R studio e fare doppio clic sull'icona per la sopravvivenza di . R script.
- Posizionare il cursore sulla linea 2 di sopravvivenza . R e fare clic sul pulsante Esegui nella finestra principale di R studio al fine di caricare la libreria di sopravvivenza.
- Modificare la riga 5 della sopravvivenza . R script per corrispondere la posizione del file Survival_spreadsheet.csv. Fare clic su Esegui per caricare i dati di sopravvivenza come un dataframe.
- Evidenziare le linee 8 e 9 e fare clic sul pulsante Esegui nella finestra di console di R studio al fine di eseguire analisi di rischi proporzionali di Cox. Risultati e statistiche di uscita vengono visualizzati nella finestra della console di studio R.
- Evidenziare linee 12-16 di sopravvivenza . R e premere il pulsante di esecuzione al fine di produrre un rischio cumulativo di morte plot, che apparirà nella scheda trame in studio di R. Questo file può essere salvato facendo clic sul pulsante Esporta sopra la trama.
- Se è auspicabile per tracciare i dati di sopravvivenza come una curva di Kaplan-Meier, evidenziare le righe 19-24 di sopravvivenza . R e premere il pulsante Esegui .
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Representative Results
Utilizzando la procedura di trasfezione descritta qui, neuroni corticali del ratto di DIV4 transfected con un plasmide che codifica la proteina fluorescente mApple. A partire dal post-transfezione 24h, cellule erano imaged da microscopia di fluorescenza ogni 24 h per 10 giorni consecutivi. Le immagini risultanti sono state organizzate come indicato in Figura 2, poi cucite, impilate e ha segnate per la morte delle cellule (Figura 1). La figura 3 Mostra un corso a tempo per 3 neuroni rappresentativi, due dei quali muoiono durante il corso dell'esperimento (neuroni 1 e 2) mentre il terzo sopravvive (Neuron 3).
Dati di sopravvivenza sono stati analizzati utilizzando lo script di R fornito (sopravvivenza. R) e i risultati riassunti nella Figura 4. La tabella generata al momento dell'esecuzione linee 7 e 8 della sopravvivenza . R codice fornisce un riepilogo delle Cox analisi proporzionale di rischi. Quattro statistiche particolarmente importante nella tabella sono evidenziate in Figura 4A. Il numero nella casella 1 rappresenta l'hazard ratio per il gruppo "Mutante" relativo "WT". Si noti che non è elencato il gruppo di "WT". Infatti, il gruppo "WT" serve come la popolazione di riferimento - il rischio di morte osservati in tutti gli altri gruppi viene paragonato a quella della popolazione di riferimento per calcolare il rapporto di rischio. I rapporti di rischio maggiori di 1 indicano un tasso più veloce di morte rispetto alla popolazione di riferimento e valori minori di 1 rappresentano quindi un'aliquota ridotta della morte. Nell'esempio fornito, le cellule mutanti visualizzano un hazard ratio di 2.2, che significa che sono morti di 2,2 volte più veloce rispetto alle cellule WT. Per impostazione predefinita, R organizzerà i gruppi in ordine alfanumerico, con il gruppo superiore che serve come la popolazione di riferimento. Immissione di numeri di fronte a nomi di gruppo è un modo semplice per stabilire l'ordine in cui vengono valutati. I valori nelle caselle 2 e 3 rappresentano i p-valori e gli intervalli di confidenza del 95% per i rapporti di rischio, rispettivamente, calcolato dall'analisi di rischi proporzionali di Cox. Nella casella 4, sono riportati i risultati del test log-rank. Questo test valuta se c'è una differenza statisticamente significativa nella sopravvivenza fra le popolazioni in fase di test, ma non descrivere quali gruppi sono diversi dagli altri e non calcola un ordine di grandezza per la differenza osservata.
Curve di Kaplan-Meier (Figura 4B) sono ampiamente utilizzate negli studi clinici per valutare gli effetti di un intervento sulla sopravvivenza del paziente. Per questo motivo, molti ricercatori hanno familiari con l'interpretazione dei dati di sopravvivenza visualizzati in questo modo. Nel contesto della singola cellula di sopravvivenza, queste trame raffigurano la frazione di cellule in vive nel tempo in ogni gruppo. Piuttosto che stampa la sopravvivenza delle cellule, un approccio alternativo è di rappresentare il tasso di morte delle cellule in ogni gruppo tramite un rischio cumulativo di morte plot (Figura 4). Nella maggior parte dei studi di sopravvivenza, il numero degli eventi non segue una progressione lineare; piuttosto, per un determinato tasso di morte un maggior numero di eventi è osservato alle epoche precedenti. Ad esempio, in una popolazione di 100 celle, se 20% delle cellule muoiono tra gli intervalli, quindi 20 celle saranno muore entro il primo intervallo, 16 durante l'intervallo di seconda, 13 durante l'intervallo di terza e così via. Questa tendenza logaritmica è concettualmente più semplice la visualizzazione utilizzando il rischio cumulativo di trame di morte, poiché l'asse y rappresenta la trasformazione di registro negativo di sopravvivenza cellulare. In alternativa, l'asse y del rischio cumulativo di morte plot può anche essere presentato come morte cellulare %, calcolata come 1-1/erischio cumulativo di morte. Queste trame abilitare anche semplici confronti del rischio di morte tra le popolazioni. La grandezza dell'hazard ratio riflette la pendenza del rischio cumulativo di morte plot per ogni popolazione, rispetto a quello del gruppo di riferimento.
Figura 1: Schema per un esperimento di sopravvivenza tipico. Neuroni corticali del ratto transfected presso DIV4 utilizzando la procedura descritta in questo articolo. A partire dal post-transfezione 24h, cellule sono imaging a intervalli regolarmente spaziati in conformità con i requisiti specifici dell'esperimento. Immagini sono cuciti e impilate prima morte delle cellule è segnata, e analisi di rischio proporzionale di Cox viene utilizzato per confrontare il rischio di morte tra le popolazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: struttura di file necessaria. La macro di FIJI fornita richiede che i dati grezzi vengono formattati in modo specifico. Per utilizzare Image_Processing, organizzare i dati grezzi come mostrato a sinistra. Un esperimento di esempio e struttura del file di accompagnamento è mostrato a destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: segnando la morte delle cellule in neuroni corticali del ratto trasfettate. Utilizzando i metodi descritti in questo articolo, neuroni corticali del ratto transfected con un plasmide che codifica la proteina fluorescente mApple. Le cellule erano imaged quindi circa ogni 24 ore, le immagini erano cucite e impilate e morte cellulare valutato con i criteri forniti. Morte delle cellule è indicata per il neurone 1 a 69 h, come evidenziato dalla perdita di fluorescenza. Neurone 2 muore a 188 h, come indicato dalla frammentazione dei processi e arrotondamento del corpo cellulare. Neurone 3 sopravvive per tutta la durata dell'esperimento. Si noti che alcune cellule diventano visibili soltanto in ritardo nell'esperimento, come evidenziato dalla comparsa di una nuova cella a 235 h. Solo le celle che sono visibili al momento iniziale di formazione immagine sono incluse nell'analisi successive. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: interpretazione di analisi di rischio proporzionale di Cox. (A) la sintesi di uscita comprende quattro importanti statistiche che vengono evidenziate in questa figura. Box 1 include l'hazard ratio del gruppo sperimentale rispetto al gruppo di controllo, mentre casella 2 e casella 3 mostrano i valori di p e intervallo di confidenza del 95% per ogni rapporto di rischio, rispettivamente. Box 4 mette in evidenza i risultati del test log-rank. Questi dati sono anche rappresentati tramite una Kaplan-Meier curva (B) e un rischio cumulativo di morte plot (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, è presentata una metodologia per monitorare direttamente la sopravvivenza di un neurone su base cella singola. Contrariamente ai tradizionali saggi per la morte delle cellule che sono limitati a intervalli di tempo discreti e intere popolazioni delle cellule, questo metodo consente la valutazione continua di una varietà di fattori quali la morfologia cellulare, l'espressione della proteina o localizzazione, e possibile determinare come ciascun fattore influenza la sopravvivenza cellulare in modo prospettico.
Questa metodologia possa essere modificata per soddisfare una vasta gamma di esigenze sperimentali. La frequenza e la durata di imaging può essere facilmente regolate, e tutta la proteina di interesse possa essere co-trasfettata con il marcatore fluorescente per modellare gli Stati di malattia o indagare proteina funzione13,14,15, 16,17,18,19. Anche se in questo articolo viene descritta la procedura ottima per trasfezione neuroni corticali del ratto, lo schema sperimentale può essere applicato a qualsiasi tipo di cellule post-mitotiche. Tuttavia, le condizioni ottimali di transfezione potrebbero essere necessario essere ottimizzato su una base di linea per cella, e substrati potrebbero essere necessario essere regolata per evitare che le cellule dai grumi o si muove troppo tenere traccia in modo affidabile.
Requisiti di elaborazione e analisi di immagine varierà a seconda dei parametri specifici di ogni esperimento di microscopia longitudinale. Una breve spiegazione di ogni passaggio critico è incluso di seguito per personalizzare il protocollo migliore corrispondenza alle esigenze di un esperimento.
Stitching: se è presa in un montaggio di immagini, cuciture possono essere eseguite per creare un'immagine singola, più grande per ogni campo di vista. Per la maggior parte delle applicazioni è preferibile eseguire cuciture prima dell'accatastamento. Se solo una sola immagine è presa per pozzetto, non esiste alcuna necessità di eseguire questo passaggio.
Accatastamento: Piuttosto che di monitoraggio delle cellule nel corso del tempo in file immagine separati, accatastamento può essere eseguita per allineare immagini consecutive in una serie singola volta, analoga all'animazione di un fotogramma di fermata. Con successo allineamento fiduciario, i singoli fotogrammi che comprende l'immagine impilata saranno strettamente allineati. Tuttavia, se ci sono notevoli spostamenti o rotazioni tra i fotogrammi, immagine registrazione è necessaria. La macro di Image_Processing esegue automaticamente la registrazione utilizzando il plugin di FIJI "MultiStackReg." Questo plugin consente di ridurre i piccoli disallineamenti tra le esecuzioni dell'imaging. Tuttavia, con le variazioni significative, manualmente ritaglio e riallineare le immagini può essere richiesti.
Sottrazione di sfondo (opzionale): è un potenziale problema che può sorgere durante l'acquisizione di immagini di illuminazione irregolare. Questo provocherà variazioni nell'intensità del segnale attraverso un'immagine che può confondere le stime di intensità di fluorescenza. In questi casi, variazioni di intensità possono essere eliminate mediante tecniche di sottrazione del fondo. Questi sono particolarmente rilevanti con segnale basso per rapporti di rumore, dove turni di intensità a causa di illuminazione irregolare possono essere paragonabili in grandezza al segnale del fluoroforo stessa. Esistono molti algoritmi di sottrazione di sfondo, molti dei quali hanno associato FIJI plugin. La scelta di quale algoritmo da utilizzare dipende dalle proprietà dell'immagine stessa e il segnale misurato. All'interno della macro di FIJI Image_Processing, l'utente è data la possibilità di eseguire "palla rotolante" sfondo sottrazione su un set in pila delle immagini (linea 14). In questo metodo, uno sfondo locale è determinato per ogni pixel in base all'intensità media di un cerchio che circonda quel pixel. Questo valore viene quindi sottratto il valore del pixel iniziale. Il valore ottimale per il raggio del cerchio utilizzato per sfondo locale stime differiranno basa il diametro dell'oggetto in primo piano più grande nell'immagine.
Segnando la morte delle cellule: Per operare un confronto tra popolazioni, è essenziale che i criteri sopra illustrati per identificare neuroni morti essere coerentemente applicate nell'intero set di dati. Inoltre, segnando la morte delle cellule per i gruppi sperimentali sotto inchiesta accecante gli individui elimina potenziali fonti di bias. In base ai criteri specifici e loro generalizzabilità, essi possono essere incorporati in algoritmi automatizzati per la valutazione imparziale di sopravvivenza cellulare15,16,17,18, 19.
Nel contesto dell'analisi della sopravvivenza e altre analisi di tempo-per-evento, ci sono tre possibili esiti. In primo luogo, si è verificato l'evento (morte cellulare), e il tempo in cui si è verificato l'evento viene registrato. In secondo luogo, l'evento non avvenne durante il lasso di tempo di osservazione. Queste osservazioni sono censurate al completamento dell'esperimento. In terzo luogo, l'evento potrebbe non essere segnato perché la cella si trasferì fuori del campo di vista, o è stata oscurata dalle cellule vicine. In questo caso, la cella è censurata quando non può essere accuratamente monitorato. Per il primo risultato, può essere difficile determinare il momento esatto della morte delle cellule basata sull'intervallo di formazione immagine. Per esempio, una cella che è vivo inizialmente, ma contrassegnato come morto 24 h più tardi potrebbe essere morto in qualsiasi punto entro tale periodo di 24 ore. Per essere conservatore, è buona norma registrare il tempo di morte come l'ultima volta che una cella può essere tranquillamente identificata come vivo (sinistra censura).
Analisi di rischi proporzionali di Cox esecuzione e visualizzazione risultati: lo script Survival.R accompagnamento consente il confronto del rischio di morte fra popolazioni e loro significatività statistica utilizzando rischi proporzionali di Cox analisi (Figura 4A) e anche la trama risultati come una curva di Kaplan-Meier (Figura 4B) o un rischio cumulativo di morte plot (Figura 4). Analisi di sopravvivenza, analisi di rischi proporzionali di Cox e il pacchetto di "sopravvivenza" in R sono descritti più dettagliatamente di Christensen12 e alle https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
Adattando le procedure descritte qui, una varietà di caratteristiche di un neurone può essere correlata alla sopravvivenza. Generazione di un ROI intorno al corpo cellulare e/o nucleo consente all'utente di monitorare longitudinalmente cella dimensioni e morfologia, livello di espressione della proteina e localizzazione o la formazione di strutture subcellulari quali puncta o proteina aggrega13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. cosa importante, perché ognuno di questi fattori è osservato in relazione alla morte delle cellule, è possibile determinare quantitativamente quanto bene fattori individuali predicono la sopravvivenza cellulare o morte durante il periodo di tempo determinato. Vie di metabolismo e cellulare proteica possono essere analizzate anche esprimendo reporter fluorescenti che forniscono misurazioni in tempo reale di fisiologia cellulare sottostante (ad esempio., gCaMP6f attività di test). Adottando questo approccio potente, fattori che guidano il cellulare manutenzione, funzione e disfunzione possono essere scoperto e studiato nel dettaglio, ispirando così nuove prospettive di indagine.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Steve Finkbeiner e membri del laboratorio Finkbeiner per pionieristico microscopia robotica. Ringraziamo anche Dan Peisach per costruzione il software iniziale necessaria per elaborazione di immagini e analisi di sopravvivenza automatizzata. Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto nazionale per i disordini neurologici e colpo (NINDS) R01-NS097542, University of Michigan Protein Folding malattia iniziativa e Ann Arbor attivo contro ALS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
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