Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para monitorar a sobrevivência em uma única célula base e identificar variáveis que predizem significativamente a morte celular.
Abstract
Ensaios de citotoxicidade padrão, que exigem a coleção de lisados ou células fixas em vários pontos de tempo, limitaram a sensibilidade e a capacidade para avaliar os fatores que influenciam o destino neuronal. Estes ensaios exigem a observação de populações isoladas de células em pontos de tempo discreto. Como resultado, as células individuais não podem ser seguidas prospectivamente ao longo do tempo, limitando severamente a capacidade de discriminar se subcellular eventos, tais como formação de partitura ou mislocalization de proteína, são drivers patogênicos da doença, respostas homeostáticas, ou mera coincidência fenômenos. Microscopia de célula única longitudinal supera estas limitações, permitindo que o pesquisador determinar diferenças na sobrevivência entre populações e desenhar relações causais com sensibilidade melhorada. Este guia de vídeo irá delinear um fluxo de trabalho representativo para experimentos de medição única célula sobrevivência de neurônios corticais preliminares rato, expressando uma proteína fluorescente. O espectador vai aprender a alcançar alta eficiência transfections, coletar e processar imagens, permitindo o acompanhamento prospectivo de células individuais e comparar a sobrevivência relativa das populações neuronais usando análise de riscos proporcionais de Cox.
Introduction
Morte celular anormal é um fator determinante em muitas doenças, incluindo câncer, neurodegeneração e derrame1. Ensaios de robustos e sensíveis para a morte celular são essenciais para a caracterização desses distúrbios, bem como o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para estender ou reduzir a sobrevivência celular. Atualmente existem dezenas de técnicas para medir a morte celular, diretamente ou através de de marcadores de substituto2. Por exemplo, morte celular pode ser avaliado visualmente com a ajuda de corantes vitais que mancham seletivamente células mortas ou vivas3, ou monitorando o aparecimento de específicos fosfolipídios da membrana plasmática,4,5,6 . Medições de componentes intracelulares ou metabolitos celulares lançados na mídia sob dissolução celular também podem ser usadas como proxies para célula morte7,8. Alternativamente, a viabilidade celular pode ser aproximada por avaliar a atividade metabólica9,10. Embora esses métodos fornecem meios rápidos de avaliação de sobrevivência celular, eles não são sem ressalvas. Cada técnica observa a cultura como uma única população, tornando-se impossível distinguir entre células individuais e as suas taxas únicas de sobrevivência. Além disso, tais ensaios baseados em população são incapazes de medir fatores que podem ser importantes para a morte celular, incluindo a morfologia celular, expressão da proteína ou localização. Em muitos casos, estes ensaios são limitados a pontos de tempo discreto, em não permitem a observação contínua de células ao longo do tempo.
Em contraste, a microscopia de fluorescência longitudinal é uma metodologia altamente flexível que diretamente e continuamente monitora o risco de morte em uma única célula base11. Em breve, a microscopia de fluorescência longitudinal permite que milhares de células individuais a serem controladas em intervalos regulares durante longos períodos de tempo, permitindo que as determinações precisas de morte celular e os fatores que melhorar ou suprimem a morte celular. Em sua base, o método envolve a transfecção transiente ou transdução de células com vetores codificação de proteínas fluorescentes. Um fiduciário exclusivo é então estabelecido, e a posição de cada célula transfectada em relação a este marco permite que o usuário para a imagem e a faixa de células individuais ao longo de horas, dias ou semanas. Quando essas imagens são exibidas em sequência, morte celular é marcado por mudanças características em fluorescência, morfologia e fragmentação do corpo celular, permitindo a atribuição de um tempo de morte para cada célula. A taxa calculada de morte, determinado pela função do perigo, pode então ser quantitativamente comparada entre condições ou relacionada para selecionar características celulares usando univariada ou de análise de riscos proporcionais de Cox multivariada12. Juntos, essas abordagens permitem a discriminação precisa e objectiva das taxas de morte celular em populações celulares e a identificação das variáveis que predizem significativamente a morte celular e/ou sobrevivência (Figura 1).
Embora esse método pode ser usado para monitorar a sobrevivência em qualquer tipo de célula pós mitóticas em uma variedade de formatos de chapeamento, este protocolo irá descrever condições para transfecting e imaging neurônios corticais de rato cultivados em uma placa de 96 poços.
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Protocol
Animal vertebrado todo o trabalho foi aprovado pelo Comité sobre o uso e cuidado dos animais, da Universidade de Michigan (protocolo # PRO00007096). Experimentos são cuidadosamente planejados para minimizar o número de animais sacrificados. Grávida fêmea tipo selvagem (WT), ratos de longa Evans não-transgênicos (Rattus norvegicus) são alojados individualmente em câmaras equipadas com enriquecimento ambiental e cuidadas pela unidade de medicina Animal de laboratório (ULAM) da Universidade de Michigan, em acordo com o guia de NIH-suportado para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Todos os ratos foram mantidos em rotina de habitação para tão pouco tempo quanto possível antes da eutanásia, consistente com as recomendações das orientações sobre a eutanásia da associação americana de medicina veterinária e da Universidade de Michigan métodos de eutanásia por Diretrizes da espécie.
1. material preparação
- Dissecar neurônios corticais de embrionário dia que 19 – 20 filhotes e cultura rato neurônios corticais em 0,5 x 106 células por mililitro na poli-D-lisina placas revestidas para 4 dias em vitro, conforme descrito anteriormente no1413,, 15,16,17,18,19.
- Preparar o plasmídeo de DNA de interesse, seguindo as etapas descritas por um isolamento de DNA de plasmídeo livre de endotoxinas kit (veja a Tabela de materiais). Quantificar o DNA resultante usando um espectrofotômetro.
- In vitro dia 4 (DIV4), filtro de alíquota, esterilizar e incube as seguintes mídias em 37 ° c: 6 mL reduzidos meios de soro (RSM; ex.., OptiMEM), 25 mL neuronal mídia basal (NBM), 40 mL NBKY (NBM + ácido cinurênico de 1 mM + 10 mM MgCl2, ajustado a um pH de 7. 4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronal da pilha suplemento Cultura + 1 x suplemento de L-glutamina + 1 x caneta Strep).
Nota: Volumes listados são suficientes para transfecting uma placa de 96 poços. Consulte a Tabela de materiais para reagentes específicos.
2. a transfeccao de neurônios corticais de rato
- Modificar o fornecido folha de Transfeccao de exemplo (ver arquivo suplementar 1) ajustando o tipo de placa, o mapa de placa, o número de DNAs, concentração de DNA e o número de poços (caixas verdes).
Nota: O DNA total soma de 0,2 µ g por bem, independentemente de se uma (ex.., DNA A) ou múltiplos (por exemplo, DNA-B e C) construções de DNA são adicionadas a cada poço. - Trabalhar a partir da planilha, combine a quantidade adequada de RSM e DNA em um tubo. Combine a quantidade adequada de RSM e transfecção reagente (por exemplo, Lipofectamine) em um tubo separado.
- Incube a temperatura ambiente (RT) por 5 min.
- Combine os DNA e a transfeccao reagente RSM as misturas e incubar a RT por 20 min.
- Durante esta etapa de incubação, usar uma pipeta multicanal e bebedouros de plástico estéril para lavar as células 2x com 100 µ l por alvéolo de NBM. Reservar os meios condicionados (CM) e armazenar a 37 ° C. Para ver este e todos os passos a seguir, ter cuidado para minimizar a quantidade de tempo que os neurônios são expostos ao ar.
- Remova a mídia NBM e substituir com 100 µ l por alvéolo de NBKY.
- Depois de 20 min, adicione 50 µ l da mistura de DNA/reagente de transfeccao gota a gota a cada poço.
- Incubar as células com os complexos de DNA/reagente de transfeccao por 20 min a 37 ° C.
- Lave 2 x com NBKY e substitua com 100 µ l de CM e 100 µ l de NBC por bem.
- Células transfectadas com sucesso devem ser visíveis por microscopia de fluorescência dentro 16 – 24 h do transfection. Para medir a eficiência, use um microscópio fluorescente para verificar o transfeccao após incubação durante a noite a 37 ° C.
Nota: Esta técnica resulta em uma eficiência global de Transfeccao de 5 a 10%.
3. imagem latente
- Colocar a placa em um microscópio fluorescente com um palco motorizado e estabelecer um fiduciário (por exemplo, uma marca na parte inferior da placa) que permitirá que o usuário alinhe a placa de cada vez que é fotografada. Salve uma imagem neste fiduciária para referência.
- Navegue até um campo de interesse e anote as coordenadas x-y, em relação ao fiduciário.
- Concentre-se em células transfectadas, expressando uma etiqueta fluorescente.
- Ter imagens fluorescentes no respectivo canal ou canais (por exemplo, proteína fluorescente proteína fluorescente vermelha [RFP], verde [GFP], 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), manualmente ou de forma automatizada. Ao tomar várias imagens em intervalos regularmente espaçados, uma montagem do poço pode ser montada durante o processamento de imagem (consulte a etapa 4).
Nota: O espaçamento depende de vários fatores, incluindo a ampliação, a óptica do microscópio e o tamanho do detector. Em geral, o óptico espaçamento entre imagens adjacentes será entre 90 a 95% do tamanho de cada imagem individual, para permitir um pequeno grau de sobreposição de imagem e apresentam o alinhamento. - Repita este processo tantas vezes quantas forem necessárias, alinhando para o fiduciário original cada vez. Para análise de sobrevivência, de imagem ocorre cada 6 – 24 h, dependendo do tipo de célula e a finalidade do experimento.
4. processamento de imagem
Nota: Aquisição de imagem, na sequência de uma série de etapas de processamento são necessários antes da análise de imagem. Estes incluem, mas não estão limitados a, costura, empilhamento e subtração de fundo (Figura 1). O objetivo dessas etapas é produzir uma pilha de imagem, ou séries temporais, em que as células são claramente discerníveis de seus antecedentes e fáceis de seguir sobre vários pontos de tempo. Uma macro dedicada de FIJI (Image_Processing.ijm, ver arquivo suplementar 2), executa costura básica, empilhamento e subtração de fundo. Uma explicação de cada etapa e os parâmetros a considerar ao realizar processamento de imagem é fornecida na seção de discussão.
- Ajuste os dados brutos ou entrada de diretório para coincidir com a formatação, mostrado na Figura 2.
- Se os pontos de tempo não são contíguos (i.e., T1, T2, T3), renomear essas pastas para que eles sejam. Esta etapa é fundamental para assegurar que a macro Image_Processing não funcionar durante o empilhamento.
- Clique duas vezes no ícone para abrir o programa, em seguida, clique e arraste a macro Image_Processing para a barra de Fiji Fiji. Isto irá abrir a macro dentro Fiji.
- Ajuste linhas 2-7 da macro Image_Processing para especificar o diretório de entrada que contém imagens, o diretório de saída desejada para imagens costuradas e empilhados, o número de momentos de imagem, número de canais fluorescentes e formato da placa.
- Determine a ordem em que as imagens foram adquiridas. Para testar isso, costure manualmente uma montagem de imagens em FIJI por manobras para Plugins menu drop-down | Costura | Grade/coleção costura. Ajuste os parâmetros dentro dos menus dropdown tipo e ordem até que uma imagem com precisão costurada é produzida.
- Ajuste as variáveis GRID_TYPE e STITCH_ORDER nas linhas 8 e 9 de Image_Processing macro para coincidir com essas seleções.
- Especifica o número de imagens por bem, ajustando a linha 10 na macro Image_Processing .
Nota: Para uma montagem de imagens de 2 x 2, esta linha leria DIM = 2. - Se a subtração de fundo é necessária, ajustar a linha 14 na macro Image_Processing para BGSUB = true.
- Defina o raio de bola rolando, ajustando a linha 15 na macro Image_Processing .
Nota: Para obter melhores resultados, definir o raio pelo menos o diâmetro o maior objeto de primeiro plano na imagem. - Clique em executar para iniciar a macro Image_Processing . Uma vez iniciado, Image_Processing avançará automaticamente através de costura, empilhamento e subtração de fundo.
5. marcar a morte celular
Nota: Consulte a seção de discussão para obter mais informações sobre a pontuação morte celular e dados de censurando.
- Localize as pilhas de imagem produzidas pelo script Image_Processing . Abri-las em FIJI.
- Use a ferramenta de ponto dentro FIJI rotular individualmente cada célula com um número. Tecla t após cada ponto irá adicionar o identificador da célula para o Gerenciador de ROI (região de interesse).
Nota: Os identificadores podem ser visualizados clicando as Rótulos e Mostrar todas as caixas de seleção no Gerenciador de ROI. -
Progresso através de momentos em cada pilha de imagem e registro o commit quando cada célula morre ou precisa ser censurado no arquivo Survival_spreadsheet.csv (ver arquivo suplementar 3).
- Cada célula ocupa uma única linha na planilha, onde um identificador exclusivo (ID) para cada célula consiste de seu correspondente bem e número ROI dentro tão bem. tp_death é o último ponto de tempo, que observa-se uma célula de estar vivo, enquanto time_death representa o tempo real da morte em horas. Para cada célula, estes dados de entrada. É fundamental para manter esta estrutura para posterior análise utilizando de sobrevivência. R (ver 4 de arquivo suplementar).
Nota: Os critérios para determinar a morte celular são cruciais e podem variar dependendo do tipo de célula. Três critérios principais são usados na identificação de neurônios mortos11,20 (Figura 3): perda da intensidade de fluorescência (por exemplo, neurônio 1 a 69 h), arredondamento do corpo celular (por exemplo, 2 neurônio a 188 h) e a perda do axônio integridade ou blebbing (por exemplo, 2 neurônio a 188 h).
- Cada célula ocupa uma única linha na planilha, onde um identificador exclusivo (ID) para cada célula consiste de seu correspondente bem e número ROI dentro tão bem. tp_death é o último ponto de tempo, que observa-se uma célula de estar vivo, enquanto time_death representa o tempo real da morte em horas. Para cada célula, estes dados de entrada. É fundamental para manter esta estrutura para posterior análise utilizando de sobrevivência. R (ver 4 de arquivo suplementar).
- Registre o status de censor da célula na última coluna.
Nota: Aqui, devido à forma peculiar como censurar é tratada por R, censurou as células são marcadas por 0, enquanto as células sem censura são marcadas por 1. Observe que todas as células que vivem para o último ponto do tempo são censuradas e, portanto, marcadas como 0.
6. realização de Cox proporcional perigos, análise e visualização de resultados
- Se necessário, baixe studio R em https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- Abra o studio R e clique duas vezes no ícone para a sobrevivência de . R script.
- Coloque o cursor na linha 2 de sobrevivência . R e clique no botão executar na janela principal do studio R para carregar a biblioteca de sobrevivência.
- Altere a linha 5 da sobrevivência . R script para coincidir com o local do arquivo Survival_spreadsheet.csv. Clique em executar para carregar os dados de sobrevivência como um dataframe.
- Destacar linhas 8 e 9 e clique no botão executar na janela de console R studio para realizar análise de riscos proporcionais de Cox. Resultados e estatísticas de saída aparecem na janela do console do studio R.
- Destaca linhas 12-16 de sobrevivência . R e clique no botão executar para produzir um risco cumulativo de trama de morte, que será exibido na guia parcelas no studio R. Este arquivo pode ser salvo, clicando no botão Exportar acima o enredo.
- Se é desejável para plotar os dados de sobrevivência como uma curva de Kaplan-Meier, destaca linhas 19 a 24 de de sobrevivência. R e aperte o botão executar .
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Representative Results
Usando o procedimento de transfeccao descrito aqui, DIV4 neurônios corticais de rato foram transfectados com um plasmídeo codificação da proteína fluorescente mApple. A partir do pós-transfection 24 h, células foram fotografadas por microscopia de fluorescência cada 24 h durante 10 dias consecutivos. As imagens resultantes foram organizadas conforme indicado na Figura 2, em seguida, costuradas, empilhadas e marcou para a morte celular (Figura 1). A Figura 3 mostra um curso de tempo para 3 neurônios representante, dois dos qual morrem durante o curso do experimento (neurônios 1 e 2) enquanto o terceiro sobrevive (neurônio 3).
Dados de sobrevivência foram analisados usando o script de R fornecido (sobrevivência. R) e os resultados resumidos na Figura 4. A tabela gerada após executando linhas 7 e 8 da sobrevivência . R código fornece um resumo de Cox a análise de riscos proporcionais. 4 estatísticas particularmente importantes na tabela são destacadas na Figura 4A. O número na caixa 1 representa a relação de risco para o grupo "Mutante" relativo "WT". Observe que o grupo "WT" não está listado. Isto é porque o grupo "WT" serve como a população de referência - o risco de morte observado em todos os outros grupos é comparado com a da população de referência para calcular a taxa de risco. Portanto, rácios de risco maiores do que 1 indicam uma taxa mais rápida de morte em comparação com a população de referência e valores de menos de 1 representam uma taxa reduzida de morte. No exemplo fornecido, as células mutantes exibem um índice de risco de 2.2, significando que eles morreram 2.2 x mais rápido que as células do WT. Por padrão, R irá organizar os grupos em ordem alfanumérica, com o grupo superior, servindo como a população de referência. Colocando os números na frente de nomes de grupo é uma maneira fácil de estabelecer a ordem em que eles são avaliados. Os valores em caixas de 2 e 3 representam os valores de p e intervalos de confiança de 95% para os rácios de risco, respectivamente, calculada pela análise de riscos proporcionais de Cox. Na caixa 4, são relatados os resultados do teste log-rank. Este teste avalia se há uma diferença estatisticamente significativa na sobrevida em populações sendo testado, mas não descreve quais grupos são diferentes dos outros e não calcular uma magnitude para a diferença observada.
Curvas de Kaplan-Meier (Figura 4B) são amplamente utilizadas em ensaios clínicos para avaliar os efeitos de uma intervenção na sobrevida do paciente. Por esta razão, muitos pesquisadores estão familiarizados com interpretação de dados de sobrevivência visualizados desta forma. No contexto de uma única célula de sobrevivência, estes gráficos retratam a fração de células vivas ao longo do tempo em cada grupo. Ao invés de plotagem sobrevivência da célula, uma abordagem alternativa é para retratar a taxa de morte celular em cada grupo através de um risco cumulativo do enredo de morte (Figura 4). Na maioria dos estudos de sobrevivência, o número de eventos não segue uma progressão linear; pelo contrário, para uma determinada taxa de morte um maior número de eventos é observado em umas épocas mais adiantadas. Por exemplo, em uma população de 100 células, se 20% das células morrem entre intervalos, então 20 células irão morrer dentro do primeiro intervalo, 16 durante o intervalo de segundo, 13, durante o intervalo de terceiro e assim por diante. Esta tendência logarítmica é conceitualmente mais fácil visualizar usando o risco cumulativo de tramas de morte, desde que o eixo y representa a transformação de log negativo da sobrevivência celular. Alternativamente, o eixo y do risco cumulativo de morte plot pode também ser apresentado como a morte de célula %, calculada como 1-1/erisco cumulativo de morte. Estes gráficos também permitem comparações simples do risco de morte entre as populações. A magnitude da relação de risco reflecte a inclinação do risco cumulativo de trama de morte para cada população, em relação ao que o grupo de referência.
Figura 1: esquema para uma experiência de sobrevivência típico. Neurônios corticais de rato são transfectados em DIV4 usando o procedimento descrito neste artigo. A partir do pós-transfection 24 h, células são fotografadas em intervalos regularmente espaçados em conformidade com os requisitos específicos do experimento. Imagens são costuradas e empilhadas antes de morte celular é marcado, e análise de riscos proporcionais de Cox é usada para comparar o risco de morte entre as populações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: necessária estrutura de arquivo. A macro de FIJI fornecida requer que os dados brutos são formatados de uma maneira específica. Para utilizar Image_Processing, organizar os dados brutos, como mostrado à esquerda. Um experimento de exemplo e que acompanha a estrutura do arquivo é mostrado à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: marcando a morte celular em neurônios corticais rato transfectadas. Usando os métodos descritos neste artigo, os neurônios corticais de rato foram transfectados com um plasmídeo codificação da proteína fluorescente mApple. As células foram então fotografadas aproximadamente a cada 24 h, as imagens foram costuradas e empilhadas e morte celular marcou usando os critérios fornecidos. Morte celular é indicado para o neurônio 1 a 69 h, como evidenciado pela perda da fluorescência. Neurônio 2 morre em 188 h, conforme indicado pela fragmentação dos processos e arredondamento do corpo celular. Neurônio 3 sobrevive para a duração do experimento. Note que algumas células se tornam visíveis somente tarde no experimento, como evidenciado pelo aparecimento de uma nova célula a 235 h. Apenas células visíveis no momento inicial da imagem são incluídas dentro análises subsequentes. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: interpretação da análise de riscos proporcionais de Cox. (A) o resumo de saída inclui quatro estatísticas importantes que são destaque nesta figura. Caixa 1 inclui a taxa de risco do grupo experimental em relação ao grupo controle, enquanto 2 caixa e caixa 3 mostram os valores de p e intervalo de confiança de 95% para cada relação de risco, respectivamente. Caixa 4 destaca os resultados do teste log-rank. Estes dados também são retratados através de um Kaplan-Meier curva (B) e um risco cumulativo do enredo de morte (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, é apresentada a metodologia para monitorar diretamente a sobrevivência neuronal em uma base de célula única. Em contraste com os tradicionais ensaios para a morte celular que são limitados a pontos de tempo discreto e populações inteiras de células, este método permite a avaliação contínua de uma variedade de fatores tais como a morfologia celular, expressão da proteína ou localização, e pode determinar como cada fator influencia a sobrevivência celular de forma prospectiva.
Esta metodologia pode ser modificada para caber uma ampla gama de necessidades experimentais. A frequência e a duração das imagens podem ser facilmente ajustadas, e qualquer proteína do interesse pode ser co transfectada com o marcador fluorescente modelo Estados de doença ou investigar proteínas função13,14,15, 16,17,18,19. Embora este artigo descreve o procedimento ideal para transfecting os neurônios corticais de rato, o esquema experimental pode ser aplicado a qualquer tipo de célula pós mitóticas. No entanto, as condições ideais de transfeccao podem precisar ser otimizado em uma base de linha por célula, e substratos podem precisar ser ajustada para evitar que as células de aglutinação ou movendo-se muito confiável de rastrear.
Requisitos de processamento e análise de imagem irão variar dependendo dos parâmetros específicos de cada experimento longitudinal de microscopia. Uma breve explicação de cada passo crítico é incluída abaixo para ajudar a personalizar o protocolo para melhor adequação as exigências de um experimento.
Costura: se é levada a uma montagem de imagens, a costura pode ser realizada para criar uma única imagem para cada campo de visão maior. A maioria dos aplicativos é preferível realizar costuras antes de empilhamento. Se apenas uma imagem é tirada por bem, não há nenhuma necessidade para executar essa etapa.
De empilhamento: Ao invés de acompanhamento células ao longo do tempo em arquivos de imagem separados, o empilhamento pode ser realizada para alinhar imagens consecutivas em uma série de tempo simples, semelhante a uma animação de quadro de parada. Com alinhamento fisuciário bem sucedido, os quadros individuais, compreendendo a imagem guardada serão estreitamente alinhados. No entanto, se houver mudanças perceptíveis ou rotações entre quadros, registo de imagem é necessário. A macro Image_Processing executa automaticamente o registro usando o plugin de FIJI "MultiStackReg." Este plugin ajuda a reduzir pequenos desalinhamentos entre as execuções de imagem. No entanto, com mudanças significativas, manualmente corte e realinhamento de imagens podem ser necessárias.
Subtração de fundo (opcional): um problema potencial que possam surgir durante a aquisição de imagens é iluminação desigual. Isto irá resultar em variações na intensidade de sinal através de uma imagem que pode confundir as estimativas da intensidade de fluorescência. Nestes casos, as variações de intensidade podem ser eliminadas por técnicas de subtração de fundo. Estas são particularmente relevantes com sinal baixo para rácios de ruído, onde mudanças de intensidade devido à iluminação desigual podem ser comparáveis em magnitude para o sinal do fluoróforo propriamente dito. Existem muitos algoritmos de subtração de fundo, vários dos quais têm associado plugins de FIJI. A escolha de qual algoritmo usar depende das propriedades da imagem em si e o sinal que está sendo medido. Dentro da macro de FIJI Image_Processing, o usuário terá a opção de executar a "bola rolando" fundo subtração em um conjunto empilhada de imagens (linha 14). Neste método, um fundo local é determinado para cada pixel com base na intensidade média de um círculo que rodeia esse pixel. Esse valor é depois subtraído o valor do pixel inicial. O valor ideal para o raio do círculo usado para segundo plano local estimativas diferirão baseado o diâmetro o maior objeto de primeiro plano na imagem.
Marcando a morte celular: Para comparações precisas entre populações, é essencial que os critérios descritos acima para identificar os neurônios mortos ser aplicado consistentemente em todo o conjunto de dados. Além disso, cegando os indivíduos Pontuação morte celular aos grupos experimentais sob investigação elimina potenciais fontes de viés. Dependendo dos critérios específicos e sua generalização, eles podem ser incorporados em algoritmos automatizados para a avaliação imparcial de sobrevivência celular15,16,17,18, 19.
No contexto da análise de sobrevivência e outras análises de tempo-para-evento, existem três resultados possíveis. Primeiro, ocorreu o evento (morte celular), e o tempo em que ocorreu o evento é registrado. Em segundo lugar, o evento não ocorreu durante o período de tempo de observação. Estas observações são censuradas após a conclusão do experimento. Em terceiro lugar, o evento não poderia ser marcou porque a célula movido fora do campo de visão, ou foi obscurecida por células vizinhas. Neste caso, a célula é censurada quando ele já não pode ser controlado com precisão. Para o primeiro resultado, o momento exato da morte celular pode ser difícil determinar com base no intervalo de imagens. Por exemplo, uma célula que está vivo, inicialmente, mas marcado como morto 24h mais tarde pode ter morrido em qualquer momento dentro desse período de 24 h. Para ser conservador, é boa prática para registrar o tempo de morte como a última vez que uma célula pode ser identificada com confiança como vivo (censura à esquerda).
Análise de riscos proporcionais de Cox realizando e visualização de resultados: O acompanhamento Survival.R script permite a comparação do risco de morte entre as populações e sua significância estatística usando riscos proporcionais de Cox análise (Figura 4A) e também resultados de enredo como uma curva de Kaplan-Meier (Figura 4B) ou um risco cumulativo do enredo de morte (Figura 4). Análise de sobrevivência, análise de riscos proporcionais de Cox e o pacote de "sobrevivência" em R são descritos mais detalhadamente por Christensen12 e no https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
Adaptando-se os procedimentos descritos aqui, uma variedade de características neuronais pode estar relacionada à sobrevivência. Geração de um ROI em torno do corpo celular e/ou núcleo permite ao usuário monitorar longitudinalmente célula tamanho e morfologia, nível de expressão de proteínas e localização ou a formação de estruturas subcelulares como partitura ou proteína agrega13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. importante, porque cada um desses fatores é observado em relação a morte celular, é possível determinar quantitativamente bem como factores individuais preveem celular sobrevivência ou morte durante o período de tempo determinado. Caminhos de celular e metabolismo de proteínas também podem ser analisados por expressar os repórteres fluorescentes que fornecem medições em tempo real de fisiologia celular subjacente (por exemplo., gCaMP6f a ensaiar a atividade). Empregando esta abordagem poderosa, fatores que impulsionam a manutenção celular, função e disfunção podem ser descoberto e estudado em detalhe, inspirando, assim, novas vias de investigação.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Steve Finkbeiner e membros do laboratório Finkbeiner pelo pioneirismo microscopia robótica. Agradecemos também o Dan Peisach para a construção inicial do software necessário para o processamento de imagem e sobrevivência análise automatizada. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e Stroke (NINDS) R01-NS097542, Universidade de Michigan dobradura de proteína doença iniciativa e Ann Arbor ativo contra ALS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
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