Summary
Здесь мы представляем протокол для отслеживания выживания на основе одной ячейки и определения переменных, которые значительно предсказать смерть клетки.
Abstract
Стандартные цитотоксичность анализов, которые требуют сбора лизатов или фиксированные ячейки в нескольких точках времени, имеют ограниченный чувствительность и способность оценить факторы, которые влияют нейрональных судьбы. Эти анализы требуют наблюдения за отдельные популяции клеток в точках дискретного времени. В результате отдельные клетки не могут следовать проспективно со временем, серьезно ограничивая способность различать ли субцеллюлярные события, такие как формирование puncta или белка mislocalization, патогенных драйвера болезни, гомеостатических реакций, или просто случайными явлениями. Одноклеточных продольной микроскопии преодолевает эти ограничения, позволяя исследователя определить различия в выживаемости между населением и привлечь причинно-следственной связи с повышенной чувствительностью. Это видео руководство будет изложить представитель рабочего процесса для экспериментов, измерения одноклеточных выживания крыса первичной корковых нейронов, выражая флуоресцентного белка маркера. Зритель будет узнать, как добиться высокой эффективности transfections, собирать и обрабатывать изображения, включение перспективных отслеживания отдельных ячеек и сравнить относительную выживания нейрональных популяций, с помощью анализа пропорционально опасности Кокс.
Introduction
Клеточная атипия смерть является движущим фактором во многих заболеваний, включая рак, нейродегенеративные и ход1. Надежные и чувствительные анализы для смерти клетки важны для характеристики этих расстройств, а также разработки терапевтических стратегий для расширения или сокращения сотовой выживания. В настоящее время есть множество методов для измерения смерти клетки, либо непосредственно, либо через суррогатные маркеры2. Например смерть клетки можно оценить визуально с помощью жизненно красителей, которые выборочно пятно3живых или мертвых клеток, или путем наблюдения за внешний вид конкретных фосфолипидов на плазматической мембраны4,5,6 . Измерения внутриклеточных компонентов или сотовых метаболитов, выпущенный в СМИ после клеточного распада также может использоваться как прокси для клеток смерть7,8. В качестве альтернативы клеточной жизнеспособности могут быть аппроксимированы оценки метаболической активности9,10. Хотя эти методы обеспечивают быстрое средства оценки выживаемость клеток, они не являются без оговорок. Каждый метод отмечает культуры как одной популяции, делает невозможным провести различие между отдельными клетками и их уникальные показатели выживания. Кроме того такие анализы на основе населения не в состоянии оценить факторы, которые могут быть важными для смерти клетки, в том числе клеточной морфологии, выражение протеина или локализации. Во многих случаях эти анализы ограничены точек дискретного времени и не позволяют для непрерывного наблюдения клеток с течением времени.
В отличие от продольных флуоресцентной микроскопии является весьма гибкой методологии, которая непосредственно и постоянно следит за риск смерти на основе одной ячейки11. Короче говоря продольные флуоресцентной микроскопии позволяет тысячи отдельных ячеек, чтобы быть отслежены на регулярной основе для длительных периодов времени, позволяя точные определения гибель клеток и факторов, которые расширения или подавить смерти клетки. На его базе метод предполагает переходных трансфекции или трансдукции клеток с векторами, кодирование флуоресцентных белков. Затем устанавливается уникальный доверенным лицом, и положение каждой transfected клеток по отношению к этот ориентир позволяет пользователю изображения и отслеживать отдельные ячейки в течение часов, дней или недель. Когда эти изображения просматриваются последовательно, гибель клеток характеризуется характерные изменения флюоресценции, морфология и фрагментации клетки тела, позволяя назначение времени смерти для каждой ячейки. Расчетный уровень смертности, определяется функцией опасности, можно затем количественном сравнении между условиями, или связанных с выбора сотовой характеристик с помощью одномерных или многовариантный Кокс пропорционально опасности анализ12. Вместе эти подходы позволяют точной и объективной дискриминации ставок клеточной смерти среди клеточных популяций, и определения переменных, которые значительно предсказать смерть клетки или выживания (рис. 1).
Хотя этот метод может использоваться для наблюдения за выживание в любой тип клеток после митотическая в различных покрытий форматов, этот протокол будет описывать условия для transfecting и визуализации крыса корковых нейронов, культивируемых в 96-луночных пластине.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все позвоночных животных работы был одобрен Комитетом по использованию и уходу за животных в университете штата Мичиган (протокол # PRO00007096). Эксперименты, тщательно планируется свести к минимуму количество животных в жертву. Беременных женщин одичал тип (WT), не трансгенных крыс длинные Эванс (Rattus Омар) поодиночке размещаются в камерах с экологическими обогащения и позабочено для группой для лабораторных животных медицины (УЛАМ) в университете штата Мичиган, в в соответствии с руководством NIH-поддерживается для ухода и использования лабораторных животных. Все крысы хранились в рутину, жилье для мало времени, как возможно до эвтаназии, в соответствии с рекомендациями руководящих принципов по эвтаназии американской ветеринарной медицинской ассоциации и Мичиганский университет методов эвтаназии Виды руководящих принципов.
1. Подготовка
- Вскрыть корковых нейронов из эмбриональных день 19 – 20 детенышей крыса и культуры крыса корковых нейронов в 0,5 х 106 клеток на миллилитр на поли D-лизин пластины с покрытием для 4 дней в пробирке, как описано ранее13,14, 15,16,,1718,19.
- Подготовьте плазмидной ДНК интерес после описанные бесплатно эндотоксина плазмида ДНК изоляции комплект (см. Таблицу материалы). Количественно результирующая ДНК, используя спектрофотометр.
- В пробирке день аликвота, фильтр 4 (DIV4), стерилизации, и инкубировать следующие средства массовой информации на 37 ° C: 6 мл и сокращение сыворотке СМИ (RSM, например., OptiMEM), 25 мл нейронов базальной СМИ (НБМ), 40 мл NBKY (НБМ + 1 мм Кинуреновая кислота + 10 мм MgCl2, скорректирована с рН 7. 4), 10 мл NBC (НБМ + 1 x нейрональные клетки культуры дополнение + 1 x L-глютамин добавки + 1 х перо Strep).
Примечание: Тома в списке достаточно для transfecting одну плиту 96-луночных. Обратитесь к Таблице материалы для определенных реагентов.
2. transfection корковых нейронов крысы
- Изменить предоставленный Пример трансфекции листа (см. дополнительный файл 1), регулируя тип пластины, пластины карта, количество ДНК, концентрации ДНК и количество скважин (зеленые квадратики).
Примечание: Общая ДНК суммы до 0,2 мкг на хорошо, независимо от ли один (например,., А ДНК) или несколько (например, ДНК B и C) ДНК конструкции добавляются к каждой скважины. - Рабочие из электронной таблицы, сочетают в себе соответствующее количество RSM и ДНК в одной из труб. Объединить соответствующее количество RSM и трансфекции реагент (например, Lipofectamine) в отдельном трубку.
- Инкубации при комнатной температуре (RT) за 5 мин.
- Объединить ДНК и трансфекции RSM смеси реагентов и Инкубируйте на RT на 20 мин.
- На этом этапе инкубации, использовать многоканальные пипетки и стерильных пластиковых желоба для мытья клетки 2 x с 100 мкл на хорошо НБМ. Зарезервировать кондиционером СМИ (CM) и хранить при температуре 37 ° C. Для этого и следующие шаги Позаботьтесь, чтобы свести к минимуму количество времени, которое нейронов подвергаются воздействию воздуха.
- Извлеките носитель НБМ и заменить 100 мкл на хорошо NBKY.
- После 20 минут прошло, добавьте 50 мкл Реагента/ДНК смесь transfection каплям каждой скважины.
- Инкубировать клетки с трансфекции реагент/ДНК комплексы для 20 минут при 37 ° C.
- Промыть 2 x с NBKY и замените µL 100 см и 100 мкл NBC в колодец.
- Успешно transfected клеток должен быть виден при микроскопии флуоресцирования в течение 16-24 ч transfection. Чтобы оценить эффективность, используйте флуоресцентный микроскоп для проверки трансфекции после ночи инкубации при температуре 37 ° C.
Примечание: Этот метод приводит общую эффективность трансфекции от 5 до 10%.
3. томография
- Установите пластину на флуоресцентный микроскоп с моторизованного столика и установления доверительного (например, знак на нижней плиты), которая позволит пользователю для выравнивания пластины каждый раз, когда его образ. Сохраните изображение этой фидуциарных для справки.
- Перейдите к полю интерес и внимание координаты x-y относительно доверительного.
- Сосредоточиться на transfected клеток, выражая флуоресцентные метки.
- Принять флуоресцентного изображения в соответствующий канал или каналы (например, красный флуоресцирующий белок [запрос], Зеленый флуоресцирующий белок [GFP], 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), либо вручную, либо в автоматическом режиме. Взяв несколько изображений регулярно-на расстоянии промежутки, монтаж скважины может быть смонтирован во время обработки изображений (см. шаг 4).
Примечание: Расстояние зависит от нескольких факторов, включая увеличение, оптики микроскопа и детектор размер. В общем оптических расстояние между соседними изображения будет между 90 – 95% от размера каждого индивидуального изображения, чтобы разрешить для небольшой степени совпадения изображения и есть выравнивание. - Повторите этот процесс так часто, как требуется, приведение к оригинальной доверительного каждый раз. Для выживания анализа изображений занимает место каждые 6 – 24 ч, в зависимости от типа клеток и Цель эксперимента.
4. обработка изображений
Примечание: После захвата изображений ряд шагов обработки требуются до анализа изображений. Они включают, но не ограничиваясь, брошюровка, укладки и вычитание фона (рис. 1). Цель этих шагов-производить стек изображений, или временных рядов, в которых клетки четко различимы от их происхождения и легко следить за несколькими моментами времени. Специальный макрос Фиджи (Image_Processing.ijm, см. Дополнительные 2 файла), выполняет основные швы, укладки и вычитание фона. Каждый шаг и параметры, которые необходимо учитывать при выполнении обработки изображений, разъясняются в разделе обсуждения.
- Настройка исходных данных или ввода каталог для соответствия параметрам форматирования, показано на рисунке 2.
- Если время очки не являются смежными (то есть, T1, T2, T3), переименовать эти папки так, что они являются. Этот шаг очень важен для обеспечения что Image_Processing макрос не врезаться во время укладки.
- Дважды щелкните на значке Фиджи открыть программу, а затем нажмите и перетащите макрос Image_Processing на Фиджи бар. Это позволит открыть макрос в Фиджи.
- Настройка линии 2-7 Image_Processing макрос для указания входных каталог, содержащий изображения, желаемый выходной каталог для изображения сшитые и накоплением, количество изображений timepoints, количество флуоресцентные каналов и формат пластины.
- Определите порядок, в котором были приобретены изображения. Чтобы проверить это, вручную стежка монтаж изображений в Фиджи, маневрируя плагины меню падения вниз | Брошюровка | Коллекцию сетки строчки. Настройте параметры в раскрывающемся меню тип и порядок пока не точно нашит изображения производится.
- Настройте переменные GRID_TYPE и STITCH_ORDER в линии 8 и 9 макрос Image_Processing , чтобы соответствовать этим критериям.
- Укажите количество изображений в колодец, регулируя линии 10 в макросе Image_Processing .
Примечание: Для 2 x 2 Монтаж изображений, эта линия будет читать DIM = 2. - Если требуется вычитание фона, отрегулируйте линия 14 в макросе Image_Processing BGSUB = true.
- Установите радиусу качения шарика, регулируя линия 15 в макросе Image_Processing .
Примечание: Для получения оптимальных результатов, установить радиус до по крайней мере диаметр крупнейших переднего плана объекта на изображении. - Нажмите запустить для запуска макроса Image_Processing . После запуска, Image_Processing автоматически будет заранее через швы, укладки и вычитание фона.
5. Озвучивание смерть клетки
Примечание: В разделе обсуждения для получения дополнительной информации о скоринга гибель клеток и цензуры данных.
- Найдите стеки изображений, производимые Image_Processing сценарий. Откройте их в Фиджи.
- Используйте точку инструментом в Фиджи для индивидуально этикетке каждой ячейки с числом. Нажать t , после каждой точки будет добавить идентификатор клетки к диспетчеру ROI (регион интереса).
Примечание: Идентификаторы могут быть визуализированы, нажав этикетки и Показать все флажки в менеджере ROI. -
Прогресс через timepoints в каждом стека изображений и записи timepoint при каждой ячейки, либо умирает, или нужно быть цензуре в файле Survival_spreadsheet.csv (см. дополнительный файл 3).
- Каждая ячейка занимает одну строку в таблице, где уникальный идентификатор (ID) для каждой ячейки состоит из его соответствующих хорошо и РУА число в пределах что хорошо. tp_death это последний момент времени, клетки наблюдается быть живым, в то время как time_death представляет фактическое время смерти в часах. Для каждой ячейки ввод этих данных. Крайне важно сохранить эту структуру для последующего анализа с использованием выживания. R (см. дополнительные 4 файла).
Примечание: Критерии для определения смерти клетки имеют решающее значение и может варьироваться в зависимости от типа ячейки. Три основные критерии используются в идентификации мертвых нейронов11,20 (рис. 3): потеря интенсивности флуоресценции (например, нейрон 1 69 ч), округление клеток тела (например, нейрон 2 188 ч) и потери neurite целостности или блеббинг (например, нейрон 2 188 ч).
- Каждая ячейка занимает одну строку в таблице, где уникальный идентификатор (ID) для каждой ячейки состоит из его соответствующих хорошо и РУА число в пределах что хорошо. tp_death это последний момент времени, клетки наблюдается быть живым, в то время как time_death представляет фактическое время смерти в часах. Для каждой ячейки ввод этих данных. Крайне важно сохранить эту структуру для последующего анализа с использованием выживания. R (см. дополнительные 4 файла).
- Запишите цензор состояние ячейки в последней колонке.
Примечание: Здесь, благодаря своеобразно цензуры обрабатываются по R, цензуре клетки обозначены 0, в то время как без цензуры клетки характеризуются 1. Обратите внимание, что все ячейки, которые живут на последний момент цензуре и поэтому помечен как 0.
6. выполнение Кокс пропорционально опасности для анализа и визуализации результатов
- При необходимости загрузить утилиту R-studio в https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- Откройте R-studio и дважды щелкните значок для выживания . R сценарий.
- Поместите курсор на строке 2 выживания. R и нажмите кнопку выполнить в главном окне студии R для того чтобы загрузить библиотеку выживания.
- Измените линия 5 выживания. R сценарий для соответствия расположения файла Survival_spreadsheet.csv. Нажмите запустить для загрузки данных выживания как датафрэйма.
- Выделить линии 8 и 9 и нажмите кнопку запустить в окне консоли studio R для того чтобы выполнить анализ пропорциональной опасности Кокс. Результаты и Статистика выходных данных отображаются в окне консоли R студии.
- Выделите линии 12-16 выживания. R и нажмите кнопку запустить чтобы производят совокупного риска смерти участок, который будет отображаться на вкладке участки в R-studio. Этот файл можно сохранить, нажав на кнопку Экспорт выше сюжет.
- Если желательно данные выживания, как кривая Каплана-Мейера, выделите линии 19-24 выживания. R и нажмите кнопку выполнить .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью трансфекции процедуру, описанную здесь, DIV4 крыса корковых нейронов были transfected с плазмида кодирования mApple флуоресцентный белок. Начиная с 24 ч после трансфекции, клетки были образы микроскопии флуоресцирования каждые 24 ч для 10 дней подряд. Результирующего изображения были организованы как указано на рисунке 2, а затем сшитые, штабелироваться и забил за гибель клеток (рис. 1). Рисунок 3 показывает время курс для 3 представителя нейронов, два из которых умирают в ходе эксперимента (нейроны 1 и 2) во время третьего выживает (нейрон 3).
Выживание данные были проанализированы с помощью R сценарий, предоставленный (выживания. R) и результаты обобщены на рисунке 4. Таблицы, созданные после запуска линии 7 и 8 выживания. R код содержится резюме Кокс пропорционально опасности анализ. В рисунке 4Aвыделяются четыре особо важных статистических данных в таблице. Число в графе 1 представляет соотношение риска для группы «Мутант» относительно «Вт». Обратите внимание, что группа «Вт» не указан. Это потому, что группа «Вт» служит ссылка населения - риск смерти, наблюдается во всех группах по сравнению с населения в ссылку для вычисления коэффициента опасности. Таким образом коэффициенты риска более чем 1 указывают быстрее смерти по сравнению с населением ссылку и значения меньше 1 представляют сниженная смерти. В примере мутантные клетки отображают отношение опасности 2.2, означает, что они умерли 2.2 x быстрее, чем WT клетки. По умолчанию R будет организовать группы в алфавитном порядке, с верхней группе, выступающей в качестве базисной совокупности. Размещение номеров перед имена групп является простой способ установить порядок, в котором они оцениваются. Значения в полях 2 и 3 представляют p ценности и 95% доверительные интервалы для коэффициенты риска, соответственно, рассчитывается путем анализа пропорционально опасности Кокс. В графе 4сообщили результаты теста журнала ранг. Этот тест определяет, является ли статистически значимого различия в выживаемости среди населения проходит проверку, но не описывают, какие группы отличаются от других и не рассчитать величины наблюдаемых различий.
Каплана-Мейера кривых (рис. 4B) широко используются в клинических испытаниях для оценки последствий вмешательства на выживаемость пациентов. По этой причине многие исследователи знакомы с интерпретации данных выживания визуализирована таким образом. В контексте одной ячейки выживания эти участки изображают часть живых клеток со временем в каждой группе. Вместо печати выживание клетки альтернативный подход заключается в изображают уровень гибели клеток в каждой группе через совокупный риск смерти участок (рис. 4 c). В большинстве исследований выживания количество событий не следовать линейной прогрессии; скорее для данного тарифа смерти большее количество событий наблюдается в прежние времена. Например в популяции 100 клеток, если 20% клеток умирает между интервалами, затем 20 клетки будут умирают в течение первого интервала, 16 во время второго интервала, 13 во время третьего интервала и так далее. Концептуально это логарифмический тренд легче визуализировать с помощью совокупного риска смерти участков, так как ось y представляет отрицательный журнала преобразования клеточных выживания. Кроме того ось y совокупный риск смерти участок также могут быть представлены как % гибели клеток, рассчитывается как 1-1/eсовокупный риск смерти. Эти участки также позволяют простым сравнения риска смерти между населением. Величина коэффициента опасности отражает наклон совокупный риск смерти участок для каждой популяции, по отношению к справочной группы.
Рисунок 1: схема для эксперимента типичными выживания. Корковых нейронов крысы transfected в DIV4 с помощью процедуры, описанной в этой статье. Начиная с 24 ч после трансфекции, клетки отражаются интервалы через равные интервалы в соответствии с требованиями конкретного эксперимента. Изображения сшитые и укладываются до смерти клетки забил, и анализ пропорциональной опасности Кокс используется для сравнения риска смерти между населением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: требуется структура файла. Указанный макрос Фиджи требует, что необработанные данные отформатированы особым образом. Использовать Image_Processing, организовать необработанные данные, как показано на левой стороне. Пример эксперимента и сопровождающих структура файла показано справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: озвучивание гибели клеток в transfected крыса корковых нейронов. Используя методы, описанные в этой статье, корковых нейронов крысы были transfected с плазмида кодирования mApple флуоресцентный белок. Клетки были затем образ приблизительно каждые 24 ч, изображения были сшиты и уложены, и смерть клетки забил с использованием критериев, предусмотренных. Смерть клетки указана нейрон 1 ч 69, что подтверждается потери флуоресценции. Нейрон 2 умирает в 188 ч, как указано на фрагментацию процессов и округление клеток тела. Нейрон 3 выживает в течение всего эксперимента. Обратите внимание, что некоторые клетки становятся видимыми только поздно в эксперименте, о чем свидетельствует появление новых клеток в 235 h. Только ячейки, которые видны в начальный момент изображений включены в последующие анализы. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: интерпретация анализа пропорционально опасности Кокс. (A) вывода резюме включает четыре важные статистические данные, которые будут выделены на этом рисунке. Вставка 1 включает в себя соотношение риска экспериментальной группы по отношению к группе управления, в то время как 2 поле и поле 3 Показать p ценности и 95% доверительный интервал для каждого соотношение риска, соответственно. Вставка 4 освещаются результаты теста журнала ранг. Эти данные являются также изображается через Каплана-Мейера кривой (B) и совокупный риск смерти участок (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлены методологии непосредственно следить за выживаемость нейронов на основе одной ячейки. В отличие от традиционных анализов для смерти клетки, которые ограничены для дискретного времени точек и всей популяции клеток, этот метод позволяет для непрерывной оценки различных факторов, таких как клеточной морфологии, выражение протеина или локализации, и можно определить, как каждый фактор влияет сотовой выживания на основе перспективных.
Эта методология может быть изменено соответствует широкий спектр экспериментальной потребностей. Частота и продолжительность обработки изображений можно легко отрегулировать, и любой протеин интереса может быть совместно transfected маркером флуоресцентные модели болезни государства или расследовать белков функции13,14,15, 16,,1718,19. Хотя эта статья описывает оптимальные процедуры для transfecting крыса корковых нейронов, экспериментальная схема может применяться к любому типу пост митотическая ячейки. Однако в условиях оптимальной transfection может потребоваться быть оптимизированы на основе в клеточной линии, и субстратов, возможно, потребуется быть скорректированы для предотвращения клетки от слипания или слишком много движущихся надежно отслеживать.
Требования обработки и анализа изображений будет варьироваться в зависимости от конкретных параметров каждого эксперимента продольной микроскопии. Ниже приводится краткое объяснение каждого критического шага чтобы помочь настроить протокол, чтобы лучше соответствовать требованиям эксперимент.
Колющие: Если монтаж изображений, швы могут быть выполнены для создания единого, более крупные изображения для каждого поля зрения. Для большинства приложений является предпочтительным для выполнения строчки до укладки. Если только одно изображение берется за хорошо, нет необходимости выполнять этот шаг.
Укладка: Вместо того, чтобы отслеживание клетки со временем отдельных файлов изображений, укладки может выполняться для выравнивания последовательных изображений в один временных рядов, аналог стоп кадр анимации. С успешным фидуциарных выравнивание отдельные кадры, включающий сложены изображения будет тесно. Однако если есть заметные сдвиги или ротации между кадрами, изображения регистрация требуется. Image_Processing макрос автоматически выполняет регистрацию с помощью Фиджи плагин «MultiStackReg.» Этот плагин помогает уменьшить малых перекосы между запусками изображений. Однако с значительные сдвиги, вручную обрезка и перепрофилировании изображения может потребоваться.
Вычитание фона (необязательно): одна потенциальная проблема, которая может возникнуть во время захвата изображений является неравномерное освещение. Это приведет к различия в интенсивности сигнала через образ, который можно смешивать оценки интенсивности флуоресценции. В этих случаях вариации интенсивности могут быть устранены путем методов вычитание фона. Эти особенно актуальны с сигнал низкого шума коэффициенты, где интенсивность изменения вследствие неравномерного освещения могут быть сопоставимы по своим масштабам сигнал Флюорофор, самой. Существует множество алгоритмов вычитание фона, некоторые из которых имеют связанные Фиджи плагины. Выбор, какой алгоритм использовать зависит от свойств изображения себя и измеряемого сигнала. В Фиджи макрос Image_Processing, пользователю предоставляется возможность выполнить «шар преткновения» фон вычитания на сложены набор изображений (линия 14). В этом методе местные фона определяется для каждого пикселя на основе средней интенсивности круг вокруг этого пикселя. Это значение затем вычитается из начального значения пиксела. Оптимальное значение для радиус окружности, используется для местных фона, что оценки будут отличаться основаны на диаметр крупнейших переднего плана объекта на изображении.
Забил клеточной смерти: Для точных сопоставлений между населением важно, что последовательно применять критерии, изложенные выше, для выявления мертвых нейронов через весь набор данных. Кроме того ослепляя лица скоринга смерть клетки в экспериментальной группы под следствием устраняет потенциальные источники предвзятости. В зависимости от конкретных критериев и их обобщения они могут быть включены в автоматизированный алгоритмы для объективной оценки сотовой выживания15,16,,1718, 19.
В контексте анализа выживания и другие события времени анализа существует три возможных исходов. Во-первых произошло событие (гибель клеток), и время, в котором произошло событие регистрируется. Во-вторых это событие не происходит в течение периода наблюдения. Эти замечания являются цензуре на завершение эксперимента. В-третьих событие мог забить не потому, что клетки переехал из поля зрения, или была заслонена близлежащих клеток. В этом случае ячейки цензуре, когда он больше не могут быть отслежены точно. Для первого результата точное время смерти клетки может быть сложно определить на основе интервала обработки изображений. Например ячейки, которая первоначально жив, но помечен как мертвые 24 h позже возможно, умер в любой момент в течение этого периода 24 h. Чтобы быть консервативным, это хорошая практика, чтобы записывать время смерти, как в последний раз клетки могут быть уверенно определены как жив (левый цензуры).
Выполнение Кокс пропорционально опасности анализа и визуализации результатов: сопровождающие Survival.R сценарий включает сравнение риска смерти среди населения и их статистической значимости, с использованием пропорционально опасности Кокс анализ (рис. 4A), а также результаты участок кривой Каплана-Мейера (рис. 4B) или совокупный риск смерти участок (рис. 4 c). Анализ выживаемости, Кокс пропорционально опасности анализ и пакет «выживания» в R описаны более подробно Кристенсен12 и в https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
Путем адаптации процедур, изложенных здесь, разнообразные нейронные функции могут быть связаны с выживания. Поколение ROI вокруг тела клетки и/или ядро позволяет пользователю продольно контролировать размер ячейки и морфологии, уровень выражения протеина и локализации или формирования внутриклеточных структур, таких как puncta или белка объединяет13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. важно, потому что каждый из этих факторов наблюдается по отношению к смерти клетки, можно количественно определить, насколько хорошо индивидуальных факторов предсказать сотовой выживания или смерти в течение отведенного времени. Пути метаболизма и клеточного белка может также быть assayed выразить флуоресцентные репортеров, которые обеспечивают в реальном времени измерения базового клеточной физиологии (например., gCaMP6f для анализа активности). Используя этот мощный подход, факторы, способствующие сотовой обслуживания, функции и дисфункции могут быть обнаружены и изучены в деталях, тем самым вдохновляющим новых направлений расследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Стива Finkbeiner и члены Finkbeiner лаборатории для новаторских роботизированных микроскопии. Мы также благодарим Dan Пейсах за строительство первоначального программного обеспечения для обработки изображений и автоматизированный анализ выживаемости. Эта работа финансировалась Национальный институт неврологических расстройств и инсульта (NINDS) R01-NS097542, Мичиганского университета протеин складные болезни инициативы, и Энн Арбор активных против ALS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
