Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att övervaka överlevnad på basis av encelliga och identifiera variabler som betydligt förutsäga celldöd.
Abstract
Standard cytotoxicitet analyser, som kräver insamling av lysates eller fasta celler vid flera tidpunkter, har begränsad känslighet och förmåga att bedöma faktorer som påverkar neuronala öde. Dessa analyser kräver observation av åtskilda populationer av celler vid diskret tidpunkter. Som ett resultat, kan inte enskilda celler följas prospektivt över tiden, starkt begränsa möjligheten att diskriminera huruvida subcellulär händelser, såsom puncta bildandet eller protein mislocalization, är patogena förare av sjukdom, homeostatiska svar, eller bara tillfällighet fenomen. Encelliga längsgående mikroskopi övervinner dessa begränsningar, så att forskaren att avgöra skillnader i överlevnad mellan populationer och dra kausala relationer med ökad känslighet. Denna video guide kommer att beskriva ett representativt arbetsflöde för experiment mäta encelliga överlevnad av råtta primära kortikala nervceller att uttrycka en fluorescerande protein markör. Betraktaren kommer att lära dig att uppnå hög verkningsgrad transfections, samla in och bearbeta bilder som gör det möjligt för blivande spårning av enskilda celler och jämför relativa överlevnaden av neuronala populationer med hjälp av Cox proportionella riskmodell analys.
Introduction
Onormal celldöd är en drivande faktor i många sjukdomar, inklusive cancer, neurodegeneration och stroke1. Robust och känsliga analyser för celldöd är avgörande för karakterisering av dessa sjukdomar, liksom utvecklingen av terapeutiska strategier för att utöka eller minska cellulära överlevnad. Närvarande finns det massor av tekniker för att mäta celldöd, antingen direkt eller via surrogat markörer2. Till exempel kan celldöd bedömas visuellt med hjälp av vitala färgämnen som selektivt färgar döda eller levande celler3, eller genom att övervaka uppkomsten av specifika fosfolipider på plasmamembranet4,5,6 . Mätningar av intracellulära komponenter eller cellulära metaboliter släpps ut i media på cellulära upplösning kan också användas som proxyservrar för cell död7,8. Alternativt, cellulära livskraft kan approximeras genom att bedöma metabolisk aktivitet9,10. Även om dessa metoder ger snabba sätt att bedöma cellöverlevnad, är de inte utan förbehåll. Varje teknik har påpekat kulturen som en enda population, vilket gör det omöjligt att skilja mellan enskilda celler och deras unika priser för överlevnad. Dessutom kan sådana populationsbaserade analyser inte mäta faktorer som kan vara viktiga för celldöd, inklusive cellulära morfologi, proteinuttryck eller lokalisering. I många fall, dessa analyser är begränsade till diskreta tidpunkter, och tillåter inte för kontinuerlig observation av celler med tiden.
Däremot är längsgående fluorescensmikroskopi en mycket flexibel metod som direkt och kontinuerligt övervakar risken för död på en enskild cell grund11. I korthet, gör längsgående fluorescensmikroskopi tusentals enskilda celler spåras regelbundet för längre perioder, vilket gör att exakta bestämningar av celldöd och de faktorer som förbättrar eller undertrycka celldöd. På dess bas innebär metoden den övergående transfection eller transduktion celler med vektorer kodning fluorescerande proteiner. En unik Mï upprättas sedan och varje transfekterade cellen i förhållande till detta landmärke tillåter användaren att bilden och spåra enskilda celler under loppet av timmar, dagar eller veckor. När dessa bilder visas sekventiellt, markeras celldöd av karakteristiska förändringar i fluorescens, morfologi och fragmentering av cell kroppen, möjliggör tilldelning av en tid av döden för varje cell. Det beräknade priset av död, bestäms av funktionen fara, kan sedan kvantitativt jämfört mellan villkor eller relaterade till Välj cellulära egenskaper med univariat eller multivariat Cox proportionella riskmodell analys12. Tillsammans, aktivera dessa synsätt den korrekta och objektiv diskrimineringen av celldöd bland cellulära populationer och identifiering av variabler som betydligt förutsäger celldöd och/eller överlevnad (figur 1).
Även om denna metod kan användas för att övervaka överlevnad i någon post mitotiska celltyp i en mängd olika plätering format, kommer detta protokoll beskriva villkoren för transfecting och imaging råtta kortikala nervceller odlade i en plattan med 96 brunnar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla vertebrate djur arbete godkände utskottet för användning och skötsel av djur vid University of Michigan (protokoll nr PRO00007096). Experiment är noggrant planerad för att minimera antalet djur som offras. Gravid kvinna vildtyp (WT), icke-transgena lång Evans råttor (Rattus norvegicus) ligger ensamma i kamrarna utrustad med miljömässiga anrikning och vårdas av enheten för laboratorium djur medicin (ULAM) vid University of Michigan, i enlighet med guiden NIH-stöd för skötsel och användning av försöksdjur. Alla råttor hölls i rutin bostäder för så lite tid som möjligt innan eutanasi, konsekvent med rekommendationerna i riktlinjerna för avlivning av den American Veterinary Medical Association och University of Michigan metoder för avlivning av Arter riktlinjer.
1. materiella beredning
- Dissekera kortikala nervceller från embryonala dag 19 – 20 råttungar och kultur råtta kortikala nervceller på 0,5 x 106 celler per milliliter på poly-D-lysin belagda plåtar för 4 dagar i vitro, som tidigare beskrivits13,14, 15,16,17,18,19.
- Förbereda plasmiden DNA av intresse följa stegen av en endotoxinfria plasmid DNA isolering kit (se Tabell för material). Kvantifiera den resulterande DNA med en spektrofotometer.
- In vitro-dag 4 (DIV4), alikvotens, filtrera sterilisera och inkubera vid 37 ° C: 6 mL följande medier minskade serum media (RSM; e.g., OptiMEM), 25 mL neuronala basala media (NBM), 40 mL NBKY (NBM + 1 mM kynurensyra + 10 mM MgCl2, justerat till pH-värdet 7. 4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronala cell kultur tillägg + 1 x L-glutamin tillägg + 1 x penna Strep).
Obs: Volymer som visas är tillräckliga för transfecting en plattan med 96 brunnar. Se Tabell för material för specifika reagens.
2. transfection råtta kortikala nervceller
- Ändra angivna exempel transfection blad (se kompletterande fil 1) genom att justera plattan typ, plattan karta, antal DNAs, DNA-koncentration och antal brunnar (gröna rutor).
Obs: Den totala DNA summerar 0.2 µg per brunn, oberoende av huruvida en (t.ex.., DNA A) eller flera (t.ex. DNA B och C) DNA konstruktioner läggs till varje brunn. - Arbeta från kalkylbladet, kombinera lämplig mängd RSM och DNA i en tub. Kombinera lämplig mängd RSM och transfection reagens (t.ex. Lipofectamine) i ett separat rör.
- Odla i rumstemperatur (RT) för 5 min.
- Kombinera DNA och transfection reagens RSM blandningar och inkubera vid RT i 20 min.
- Under denna inkubation steg, använda en flerkanalspipett och sterila plast tråg att tvätta celler 2 x med 100 µL per brunn av NBM. Reservera det luftkonditionerade mediet (CM) och lagra vid 37 ° C. För detta och följande steg, var noga med för att minimera mängden tid nervceller utsätts för luft.
- Ta bort NBM materialet och ersätta med 100 µL per brunn av NBKY.
- Efter 20 min, tillsätt 50 µL av transfection reagens/DNA blandningen droppvis till varje brunn.
- Inkubera cellerna med transfection reagens/DNA komplexen i 20 min vid 37 ° C.
- Skölj 2 x med NBKY och ersätta med 100 µL av CM och NBC 100 µL per brunn.
- Framgångsrikt transfekterade celler ska synas genom fluorescensmikroskopi inom 16 – 24 h av transfection. För att mäta effektivitet, använda fluorescerande Mikroskop för att kontrollera transfection efter natten inkubation vid 37 ° C.
Obs: Denna teknik resulterar i en total transfection effektivitet på 5 till 10%.
3. imaging
- Placera plattan på ett fluorescerande Mikroskop med en motoriserad scen, och upprätta en förvaltare (t.ex. ett märke på undersidan av plattan) som tillåter användaren att justera plattan varje gång det är avbildade. Spara en bild av denna lojalitetsplikt för referens.
- Navigera till ett intresseområde och notera de x-y-koordinaterna i förhållande till förvaltare.
- Fokusera på transfekterade celler som uttrycker en fluorescerande etikett.
- Ta fluorescerande bilder i rätt kanal eller kanaler (t.ex. röd fluorescerande protein [RFP], grönt fluorescerande protein [GFP], 4, 6-diamidin-2-fenylindol [DAPI]), manuellt eller i ett automatiserat sätt. Genom att ta flera bilder med regelbundet fördelade intervall, ett montage av brunnen kan monteras under bildbehandling (se steg 4).
Obs: Avståndet beror på flera faktorer, inklusive förstoring, optiken i mikroskopet och detektor storlek. I allmänhet blir optiska avståndet mellan intilliggande bilder mellan 90 – 95% av storleken på varje enskild bild, att möjliggöra en liten grad av bild överlappning och har justering. - Upprepa denna process så ofta som krävs, anpassning till den ursprungliga Mï varje gång. För överlevnadsanalys rum imaging äger varje 6 – 24 h, beroende på cell och syftet med experimentet.
4. bildbehandling
Obs: Efter bild förvärvandet krävs en rad bearbetningssteg före bildanalys. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, sy, stapling och bakgrunden subtraktion (figur 1). Målet med dessa steg är att producera en bildstapel eller tidsserier, där cellerna är tydligt urskiljbar från deras bakgrund och lätt att följa över flera tidpunkter. En dedikerad FIJI makro (Image_Processing.ijm, se kompletterande fil 2), utför grundläggande sömmar, stapling, och bakgrund subtraktion. En förklaring av varje steg och parametrar för att överväga när du utför bildbehandling finns i diskussionsavsnittet.
- Justera rådata eller input directory att samma formatering ska visas i figur 2.
- Om tidpunkter inte är sammanhängande (dvs, T1, T2, T3), byta namn på mapparna så att de är. Detta steg är avgörande för att säkerställa att makrot Image_Processing inte krascha under stapling.
- Dubbelklicka på ikonen Fiji att öppna programmet, klicka och dra makrot Image_Processing till Fiji baren. Detta kommer att öppna makrot i Fiji.
- Justera rader 2-7 med makrot Image_Processing att ange indata katalogen som innehåller bilder, önskad utdatakatalogen för sydda och staplade bilder, antal imaging tidpunkter, antal fluorescerande kanaler och platta format.
- Bestämma den ordning som bilderna förvärvades. För att testa detta manuellt sy ett montage av bilder i FIJI genom att manövrera till Plugins rullgardinsmenyn | Sömmar | Grid/samling sömmar. Justera inställningarna i listmenyerna typ och ordning tills en korrekt sydd bild produceras.
- Justera variablerna GRID_TYPE och STITCH_ORDER på raderna 8 och 9 i makrot Image_Processing att matcha dessa val.
- Ange antalet bilder per brunn genom att justera linje 10 i makrot Image_Processing .
Obs: För en 2 x 2 montage av bilder, denna linje skulle läsa DIM = 2. - Om bakgrunden subtraktion krävs, justera linje 14 i makrot Image_Processing till BGSUB = true.
- Ställa in den rullande boll radien genom att justera linje 15 i makrot Image_Processing .
Obs: För optimalt resultat, ange radien som åtminstone diametern på det största förgrundsobjektet i bilden. - Klicka på Kör för att starta makrot Image_Processing . En gång började, kommer Image_Processing automatiskt att avancera genom sömnad, stapling och bakgrunden subtraktion.
5. scoring celldöd
Obs: Se avsnittet diskussion för mer information på scoring celldöd och censurerande data.
- Leta upp de bildstaplar som produceras av skriptet Image_Processing . Öppna dessa i FIJI.
- Använd den peka verktyg inom FIJI att individuellt märka varje cell med ett nummer. Tryck på t efter varje punkt kommer att lägga cell identifierare till chefen ROI (region-of-interest).
Obs: Identifierarna kan visualiseras genom att klicka på Etiketter och Visa alla kryssrutorna i ROI Manager. -
Framsteg genom tidpunkter i varje bildstapel och post tidpunkt när varje cell antingen dör eller behöver censureras i filen Survival_spreadsheet.csv (se kompletterande fil 3).
- Varje cell upptar en rad i kalkylbladet, där en unik identifierare (ID) för varje cell består av dess motsvarande väl och ROI nummer inom det brunnen. tp_death är den senaste tidpunkten som en cell observeras för att vara levande, medan time_death representerar den faktiska tiden för döden i timmar. För varje cell, dessa indata. Det är viktigt att upprätthålla denna struktur för efterföljande analys med hjälp av överlevnad. R (se kompletterande fil 4).
Obs: Kriterierna för att bestämma celldöd är avgörande och kan variera beroende på celltyp. Tre huvudkriterier används i identifiering av döda nervceller11,20 (figur 3): förlust av fluorescensintensiteten (t.ex. Neuron 1 på 69 h), avrundning av cell kroppen (t.ex. Neuron 2 188 h), och förlust av neurite integritet eller blebbing (t.ex. Neuron 2 188 h).
- Varje cell upptar en rad i kalkylbladet, där en unik identifierare (ID) för varje cell består av dess motsvarande väl och ROI nummer inom det brunnen. tp_death är den senaste tidpunkten som en cell observeras för att vara levande, medan time_death representerar den faktiska tiden för döden i timmar. För varje cell, dessa indata. Det är viktigt att upprätthålla denna struktur för efterföljande analys med hjälp av överlevnad. R (se kompletterande fil 4).
- Registrera censor status av cellen i den sista kolumnen.
Obs: Här, på grund av det säregna sättet censurera hanteras av R, censurerade celler markeras med 0, medan ocensurerade celler markeras med 1. Observera att alla celler som lever till sista tidpunkt är censurerade och därför märkta som 0.
6. utföra Cox proportionella faror analys och visualisera resultat
- Vid behov, Hämta R studio på https://cran.r-project.org/mirrors.html.
- R-studio och dubbelklicka på ikonen för överlevnad. R skript.
- Placera markören på rad 2 för överlevnad. R och klicka på knappen Kör i huvudfönstret i R studio för att läsa in överlevnad.
- Ändra raden 5 av överlevnad. R skript för att matcha platsen för filen Survival_spreadsheet.csv. Klicka på Kör att läsa in överlevnadsdata som en dataframe.
- Markera raderna 8 och 9 och klickar på Kör i fönstret R studio-konsolen för att utföra analys Cox proportionella hazardmodell. Resultat och produktionen statistik visas i konsolfönstret av R studio.
- Markera raderna 12-16 i överlevnad. R och tryck på knappen Kör för att producera en kumulativ risk för död tomten, som visas i fliken tomter i R studio. Denna fil kan sparas genom att klicka på knappen Exportera ovanför tomten.
- Om det är önskvärt att rita överlevnadsdata som en Kaplan-Meier-kurva, markera rader 19-24 med överlevnad. R och tryck på knappen Kör .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DIV4 råtta kortikala nervceller använder transfection proceduren som beskrivs här, och var transfekterade med en plasmid kodning den fluorescerande protein mApple. Med början 24 h efter transfection, var celler fotograferad av fluorescensmikroskopi varje 24 h för 10 dagar. De resulterande bilderna var organiserade som anges i figur 2, och sedan sydda, staplade och gjorde för celldöd (figur 1). Figur 3 visar en dags kurs för 3 representativa nervceller, två av som dör under försöket (nervceller 1 och 2) medan tredje överlever (Neuron 3).
Överlevnadsdata analyserades med hjälp av skriptet R som tillhandahålls (överlevnad. R), och resultaten sammanfattas i figur 4. Tabellen som genereras vid kör linje 7 och 8 i överlevnad. R kod innehåller en sammanfattning av Cox proportionella riskmodell analys. Fyra särskilt viktig statistik i tabellen markeras i figur 4A. Siffran i ruta 1 representerar riskkvoten för gruppen ”muterat” i förhållande till ”WT”. Märke att gruppen ”WT” inte anges. Detta beror på att gruppen ”WT” fungerar som referenspopulationen - risken för dödsfall observerats i alla andra grupper jämförs med det av referenspopulationen att beräkna hazard ratio. Riskkvoten större än 1 anger snabbare död jämfört med referenspopulationen, och värden mindre än 1 representerar därför en nedsättning av döden. I exemplet, visar muterade celler en riskkvot på 2,2, vilket innebär att de dog 2.2 x snabbare än WT celler. Som standard kommer R ordna grupperna i alfanumerisk ordning, med den bästa gruppen som tjänstgör som referenspopulationen. Placering nummer framför gruppnamn är ett enkelt sätt att fastställa den ordning i vilken de utvärderas. Värdena i fälten 2 och 3 representerar p-värden och 95% konfidensintervall för riskkvoten, respektive beräknas genom analys Cox proportionella hazardmodell. I ruta 4redovisas resultaten av det log-rank-testet. Detta test utvärderar om det finns en statistiskt signifikant skillnad i överlevnad bland populationer som testas, men beskriver inte vilka grupper skiljer sig från de andra och beräknar inte en magnitud för observerade skillnaden.
Kaplan-Meier-kurvor (figur 4B) används ofta i kliniska studier för att utvärdera effekterna av ett ingripande på patientens överlevnad. Därför känner många forskare tolkar överlevnadsdata visualiseras detta sätt. I samband med encelliga överlevnad skildra dessa tomter fraktionen av celler vid liv över tid i varje grupp. Snarare än plotting cellöverlevnad är en alternativ metod att skildra graden av celldöd i varje grupp via en kumulativ risk för död tomt (figur 4 c). I de flesta överlevnad studier följer antalet händelser inte en linjär progression; i stället för en given hastighet av döden observeras ett större antal händelser vid tidigare tillfällen. Till exempel i en population av 100 celler, kommer att om 20% av celler dör mellan intervall, sedan 20 celler dö inom det första intervallet, 16 i andra pausen, 13 under tredje intervallet, och så vidare. Denna logaritmisk trend är konceptuellt lättare att visualisera med kumulativ risk för död tomter, eftersom y-axeln representerar negativa log transformeringen av cellulära överlevnad. Y-axeln av den kumulativa risken för död tomt kan alternativt också presenteras som % celldöd, beräknat som 1-1/ekumulativ risk för död. Dessa tomter också aktivera enkla jämförelser av risken för död mellan populationer. Omfattningen av hazard ratio återspeglar slutta av den kumulativa risken för död tomt för varje befolkning, i förhållande till referensgruppen.
Figur 1: Schema för en typisk överlevnad experiment. Rat kortikala nervceller är transfekterade på DIV4 med hjälp av proceduren som beskrivs i denna artikel. Med början 24 h efter transfection, är celler avbildade på regelbundet med jämna mellanrum i enlighet med de särskilda kraven i experimentet. Bilderna är sydd och staplade innan celldöd poängsätts och Cox proportionella faroanalys används för att jämföra risken för död mellan populationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: krävs filstruktur. Medföljande FIJI makrot kräver att raw-data är formaterade på ett särskilt sätt. För att utnyttja organisera Image_Processing, raw-data som visas till vänster. Ett exempel experiment och åtföljande filstruktur visas till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Scoring celldöd i transfekterade råtta kortikala nervceller. Med de metoder som beskrivs i denna artikel, var råtta kortikala nervceller transfekterade med en plasmid kodning den fluorescerande protein mApple. Cellerna var sedan avbildas ungefär varje 24 h, bilderna var sydd och staplade och celldöd gjorde med hjälp av kriterierna. Celldöd är indicerat för Neuron 1 på 69 h, vilket framgår av förlust av fluorescens. Neuron 2 dör på 188 h, som indikeras av fragmentering av processer och avrundning av cellkroppen. Neuron 3 överlever under experimentet. Observera att vissa celler blir synlig endast sent i experimentet, vilket framgår av uppkomsten av en ny cell på 235 h. Endast celler som är synliga på den ursprungliga tidpunkten för bildframställning ingår i efterföljande analyser. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: tolkning av Cox proportionella faroanalys. (A) utgång sammanfattningen innehåller fyra viktig statistik som är markerade i denna figur. Box 1 innehåller riskkvoten av den experimentella gruppen jämfört med kontrollgruppen, medan ruta 2 och Box 3 visar den p-värden och 95% konfidensintervall för varje riskkvot, respektive. Ruta 4 belyser resultaten av det log-rank-testet. Dessa uppgifter finns också avbildade via en Kaplan-Meier kurva (B) och kumulativ risk för död tomt (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenteras metod att direkt övervaka neuronal överlevnad på basis av encelliga. I motsats till traditionella analyser för celldöd som är begränsade till diskreta tidpunkter och hela populationer av celler, denna metod möjliggör kontinuerlig bedömning av en mängd faktorer såsom cellulär morfologi, proteinuttryck eller lokalisering, och kan avgöra hur varje faktor påverkar cellulära överlevnad i ett blivande sätt.
Denna metod kan ändras för att passa en rad olika experimentella behov. Frekvens och varaktighet av imaging kan enkelt justeras, och något protein av intresse kan vara co transfekterade med fluorescerande markör till modell sjukdomstillstånd eller undersöka protein funktion13,14,15, 16,17,18,19. Även om denna artikel beskriver hur optimal transfecting råtta kortikala nervceller, kan experimentella schemat tillämpas på någon efter mitotiska celltyp. Dock de optimala transfection villkor kan behöva optimeras på basis per-cell linje och substrat kan behöva justeras för att förhindra celler från klumpar eller flytta för mycket tillförlitligt spåra.
Bild bearbetning och analys kraven varierar beroende på de specifika parametrarna för varje längsgående mikroskopi experiment. En kort förklaring av varje kritiskt steg ingår nedan för att anpassa protokollet till bättre matchning experiment's krav.
Sy: om ett montage av bilder tas, sömmar kan utföras för att skapa en enda, större bild för varje synfält. För de flesta applikationer är det att föredra att utföra sömnad innan stapling. Om bara en bild tas per brunn, finns det inget behov av att utföra det här steget.
Stapling: Snarare än att spåra celler över tiden på separata bildfiler, kan stapling utföras för att anpassa på varandra följande bilder i en enda tidsserier, analogt med en stop bildruteanimering. Framgångsrika förvaltare anpassningen justeras de enskilda bildrutor bestående av staplade bilden noggrant. Om det finns märkbara förskjutningar eller rotationer mellan ramar, behövs dock bildregistrering. Makrot Image_Processing utför automatiskt registrering med hjälp av FIJI plugin ”MultiStackReg”. Denna plugin hjälper till att minska små avvikelser mellan imaging körningar. Dock med betydande förskjutningar, manuellt beskära och omgruppera bilder kan krävas.
Bakgrunden subtraktion (tillval): en potentiella problem som kan uppstå under bild förvärv är ojämn belysning. Detta kommer att leda till variationer i signalintensitet över en bild som kan förvirra uppskattningar av fluorescensintensiteten. I dessa fall kan intensitet variationer elimineras genom bakgrunden subtraktion tekniker. Detta är särskilt relevant med låg signal till brus nyckeltal, där intensitet skift på grund av ojämn belysning kan vara jämförbara i storlek med signalera av fluorophore själv. I området i närheten finns det många bakgrund subtraktion algoritmer, varav flera har associerat FIJI plugins. Valet av vilken algoritm att använda beror på egenskaper hos bilden själv och signal som mäts. Inom FIJI makrot Image_Processing, användaren ges möjlighet att utföra ”rullande boll” bakgrund subtraktion på en staplad uppsättning bilder (linje 14). I denna metod bestäms en lokal bakgrund för varje pixel baserat på genomsnittliga intensiteten i en cirkel som omger den pixeln. Detta värde ska sedan subtraheras från pixelns initialvärde. Det optimala värdet för radien av den cirkel som används för lokala bakgrund uppskattningar varierar utifrån diametern på det största förgrundsobjektet i bilden.
Scoring celldöd: För korrekta jämförelser mellan populationer är det viktigt att de kriterier som beskrivs ovan för att identifiera döda nervceller tillämpas konsekvent inom hela datamängden. Dessutom eliminerar bländande individerna scoring celldöd till experimentella grupper under utredning potentiella källor av partiskhet. Beroende på de särskilda kriterierna och deras generaliserbarhet, kan de ingå i automatiserad algoritmer för opartisk bedömning av cellulära överlevnad15,16,17,18, 19.
I samband med överlevnadsanalys och andra tid-till-händelse-analyser finns det tre möjliga utfall. Det första evenemanget (celldöd) har inträffat, och den tid som händelsen inträffade registreras. Det andra uteblev evenemanget under tidsramen för observation. Dessa observationer är censurerade vid slutförandet av experimentet. Det tredje kunde händelsen inte vara poängsätts eftersom cellen flyttat ut ur synfältet eller var skyms av närliggande celler. I det här fallet censureras cellen när det inte längre kan följas noggrant. För det första resultatet, kan den exakta tidpunkten för celldöd vara svårt att avgöra utifrån avbildning intervallet. Exempelvis kan en cell som inledningsvis är levande men märkt som död 24 h senare ha dött när som helst inom denna 24 h period. För att vara konservativ, är det god praxis att registrera tid av död som förra gången en cell tryggt kan identifieras som levande (vänster censurering).
Analys utför Cox proportionella hazardmodell och visualisera resultat: medföljande Survival.R skriptet gör jämförelsen av risken för död bland befolkningar och deras statistisk signifikans med hjälp av Cox proportionella riskmodell med analys (figur 4A), och också tomt resultat som antingen en Kaplan-Meier-kurva (figur 4B) eller en kumulativ risk för död tomt (figur 4 c). Överlevnadsanalys, Cox proportionella riskmodell analys och ”överlevnad” paketet i R beskrivs mer i detalj av Christensen12 och på https://cran.r-project.org/web/packages/survival/survival.pdf.
Genom att anpassa de förfaranden som beskrivs här, kan en mängd neuronala funktioner relateras till överlevnad. Generation av en ROI runt på cellkroppen och/eller nucleus möjliggör för användaren att longitudinellt övervaka Cellstorlek och morfologi, protein uttryck nivå och lokalisering eller bildandet av subcellulära strukturer såsom puncta eller protein aggregat13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. ännu viktigare, eftersom alla dessa faktorer observeras i förhållande till celldöd, är det möjligt att kvantitativt bestämma hur väl enskilda faktorer förutsäga cellulära överlevnad eller dödsfall under viss tid ramen. Protein metabolism och cellular vägar kan också analyseras genom att uttrycka fluorescerande reportrar som ger realtid mätningar av underliggande cellulär fysiologi (e.g., gCaMP6f till assay aktivitet). Genom att använda denna kraftfulla metod, kan faktorer som drive cellulära underhåll, funktion och dysfunktion vara avslöjade och studerade i detalj, därmed inspirerande nya vägar för förfrågan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Steve Finkbeiner och medlemmar av Finkbeiner labbet för banbrytande robotic mikroskopi. Vi tackar också Dan Peisach för byggnadens ursprungliga programvaran krävs för bildbehandling och automatiserad överlevnadsanalys. Detta arbete finansierades av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke (NINDS) R01-NS097542, University of Michigan Protein Folding Disease Initiative och Ann Arbor aktiva mot ALS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
