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Chemistry

基于逆电子需求函数-alder 反应的隐形放射免疫治疗

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

该协议描述了反式环磷 (tco) 修饰抗体和177个lu-tazine (tz) 辐射寡核苷酸的合成和表征, 用于预定目标放射治疗 (prit)。此外, 它还详细介绍了这两种结构在结直肠癌小鼠模型中的应用, 用于体内生物分布和纵向治疗研究。

Abstract

虽然放射免疫治疗 (rit) 是治疗癌症的一种有前途的方法, 但放射性标记抗体的长的药代动力学半衰期可能导致对健康组织的高辐射剂量。也许并不奇怪, 已经制定了几种不同的策略来规避这一令人不安的限制。其中最有希望的方法之一是预定目标放射免疫治疗 (prit)。prit 的前提是将放射性核素与免疫球蛋白脱钩, 分别注射, 然后允许它们在目标组织的体内结合。这种方法利用抗体的特殊肿瘤靶向特性, 同时规避其药代动力学缺陷, 从而降低对非目标组织的辐射剂量, 并促进使用半衰期为被认为太短, 可用于传统的辐射免疫共轭物。在过去的五年里, 我们的实验室和其他实验室开发了一种基于反式环环素 (tco) 和四氮素 (tz) 之间的逆随需电-diels-alder (iedda) 反应的体内预瞄准方法。该策略已成功地应用于具有多种抗体抗原系统的预定目标正电子发射断层扫描 (pet) 和单光子发射计算机断层扫描 (spect) 成像。在最近的两篇文章中, 我们已经证明了基于 iedda 的 prit 在胰腺导管腺癌和结直肠癌的小鼠模型中的有效性。在本协议中, 我们描述了使用 177lu-dota 标记的四氨酸半径和 ([177路] ludat-peg 7-tz) 和针对 hua33 抗体 (hua-tco) 的结直肠癌 tco 修饰变种的 prit 协议.更具体地说, 我们将描述 hua33-tco 的结构, [177lu] lu-dota-pg7-z 的合成和放射状标记, 以及在小鼠模型中的体内生物分布和纵向治疗研究的性能。肠癌。

Introduction

放射免疫治疗 (rit)--使用抗体将治疗性放射性核素输送到肿瘤--长期以来一直是治疗癌症1,2的一种诱人方法。事实上, 美国食品药品监督管理局批准了治疗非霍奇金淋巴瘤的两种放射免疫共轭物: 90Y-ibritumomab tiuxetan 和131i-to质他莫单 3.,4. 然而, 即使从一开始, rit 的临床前景也受到一个严重并发症的阻碍: 对健康组织的高辐射剂量率5、6.一般来说, rit 的放射免疫共轭标记为长寿命放射性核素 (例如, 131i [t半= 8.0] 和90y [t-学期 = 2.7天]), 物理半衰期与免疫球蛋白的半衰期长。这一点至关重要, 因为它确保一旦抗体在循环几天后达到最佳生物分布, 就会保持足够的放射性。然而, 这种在血液中停留时间长和物理半衰期长的组合不可避免地导致健康组织的照射, 从而降低治疗率,限制治疗7的疗效。已经探索了几种策略来规避这个问题, 包括使用截断的抗体片段, 如 fab、fab '、f (ab')2、微型体和纳米棒8, 9,10。最有希望的、最引人入胜的、但不可否认的复杂的替代方法之一是在体内预先针对11。

在体内预定位是一种方法, 核成像和治疗, 寻求利用微妙的亲和力和选择性的抗体, 同时绕过其药代动力学的缺点 11,12,13。为此, 传统放射免疫治疗中使用的放射性标记抗体被解构为两个组成部分: 一个是小分子的放射性寡核苷酸, 另一个是免疫结合, 既能结合肿瘤抗原, 又能结合上述放射性寡聚 and。免疫共轭首先注射, 并给予 "头部启动", 通常几天, 在此期间, 它积累在目标组织中, 并清除血液。随后, 小分子的放射寡核苷酸给药, 或者与肿瘤的免疫共轭结合, 或者迅速清除身体。从本质上讲,在体内, 预瞄准依赖于在体内进行放射性化学。通过减少放射性循环, 这种方法同时减少了对健康组织的辐射剂量, 并促进了放射性核素的使用 (例如, 68ga, t半= 68min211;由于半衰期通常被认为与基于抗体的向量不兼容, 因为 t 半 = 7.2 h)。

从20世纪80年代末开始, 开发了几种不同的体内预定位方法, 包括基于双特异性抗体的策略、链霉素与生物素的相互作用以及互补的杂交寡核苷酸14,15,16,17,18。然而, 每一种都被并发症不同程度地牵制住了, 最著名的是链霉素修饰抗体的强效免疫原性 19,20。在过去的五年里, 我们的团队和其他人已经开发出一种基于快速和生物正交逆电子需求 diels-alder 结扎的体内预定位方法。21,22,23,24。这些策略中最成功的是使用了 tco 修饰抗体和含 z 半径, 因为总体拥有成本通常比 tz 伙伴 (图 1)25、26更稳定. 与其他预靶向方法一样, mAb-TCO 免疫共轭首先被给予, 并给予时间从循环中清除并积累在肿瘤组织中。随后, 小分子 tz 半径低聚糖被注射, 之后它点击与免疫共轭在目标组织内或迅速地从身体清除。这种体内预瞄准策略已被证明是非常有效的 pet 和 spect 成像与几种不同的抗体抗原系统, 不断产生高对比度的图像, 并能够使用短命放射性核素, 如18f (t半= 109分钟) 和64铜 (t半= 12.7 小时)21,22,24。最近, 点击靶向放射免疫治疗 (prit) 的有效性已在胰导管腺癌 (pdac) 和结直肠癌 27,28的小鼠模型中得到了证明。为此, 结合两种不同的抗体使用了治疗性放射性核素177lu (β最大值 = 498 kev, t 半 = 6.7天): 5b1, 针对碳水化合物抗原 19.9 (c.9) 在 pdac 中普遍表示 和 hua33, 它的目标是 a33, 一种跨膜糖蛋白, 表达于 & gt;95 的结直肠癌。在这两种情况下, 这种方法对177luprit 在肿瘤组织中产生了较高的活性浓度, 产生了剂量依赖性的治疗效果, 与传统相比, 健康组织中的活性浓度降低。直接标记的辐射免疫共轭。

在本文中, 我们描述了使用177lu-dota 标记的四氨酸半径和 ([177 路] ludat-peg 7-tz) 和 hua33抗体 (hua33-tco) 的 tco 修饰变种的 prit 协议。更具体地说, 我们描述了 hua33-tco 的构造 (图 2)、[177lu] ludat-peg 7-tz 的合成和径向标记 (图 3和图 4), 以及在体内的性能。大肠癌小鼠模型的生物分布和纵向治疗研究。此外, 在具有代表性的结果和讨论中, 我们提出了一个样本数据集, 讨论了优化这种方法的可能策略, 并在体内预定位和 prit 的更广泛背景下考虑了这一策略。最后, 需要注意的是, 虽然我们选择在本协议中专注于使用 hua33-tco 和 [177lu] ludat-peg 7-tz进行预瞄准, 但这一策略是高度模块化的, 可以适应广泛的抗体和放射性 核素。

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Protocol

本研究中描述的所有体内动物实验都是根据批准的协议进行的, 并根据纪念斯隆·凯特林癌症中心、威尔·康奈尔大学医疗中心和亨特学院的道德准则进行机构动物护理和使用委员会 (iacuc)。

1. hua33-tco 的制备

注: hua33-tco 的合成以前曾报告过 29。但是, 为了便于读取器, 它在这里复制, 并进行调整以获得最佳条件。

  1. 在 1.7 ml 微离心管中, 在浓度为 40 mg/ml (dm15 m) 的干二甲酰氨基甲酸酯 (tco-nhs) 中制备125μl 溶液, 即 (e)-环己酸-4-烯基, 5-二氧-1-吡咯烷基碳酸酯 (tco-nhs)。该溶液可在-80°c 下进行冷冻, 以便在今后的实验中使用。
  2. 在单独的 1.7 ml 微离心管中, 在1毫升磷酸盐缓冲盐水中制备 5mg/wl hua33 溶液 (pbs; 2.7 mm 氯化钾、137 mm 氯化钠和 11.9 mm m 磷酸钾, ph 7.4)。
  3. 使用 0.1 m na2co 3 的小等价物 (& lt;5 μl),将抗体溶液的 ph 值从步骤1.2 调整到8.8-9.0。使用 ph 纸或带有微电极的 ph 计来监测 ph 值, 并注意 ph 值不超过9.0。
  4. 在步骤1.3 中描述的抗体溶液中, 慢慢添加一个与 tco-nhs 的抗体量相对于40摩尔当量的体积。例如, 如果 wa33 的含量为5毫克 (30 nmol), 则在 tco-nhs 的 40 mg/ml (0.15 m) 溶液中加入 9.0μl (1.20μmol)。
    注: tco-nhs 是疏水的。在抗体溶液中加入时, 慢慢搅拌, 防止沉淀。在最终反应溶液中, 按体积计算, 不要超过10% 的 dmf。
  5. 允许反应在25°c 时在热敏克比器上孵育 1小时, 并有轻度搅拌 (500 转/分)。
  6. 1小时后, 使用预包装的一次性尺寸排除脱盐柱纯化 hua33-tco 免疫共轭。
    1. 平衡供应商所描述的尺寸排除柱, 以去除存储过程中列中存在的任何防腐剂。一个典型的过程是用与柱体积相对应的 pbs 体积清洗列 5x: 5 x 2.5 ml 的 pbs。
    2. 将反应混合物加入到尺寸排除柱中, 注意反应混合物的体积。
    3. 反应混合物进入柱后, 加入适量的 pbs, 使添加到柱中的溶液总量达到 2.5 ml。例如, 如果共轭反应导致总体积为 1.3 ml, 则在列中添加 1.2 ml 的额外 pbs。
    4. 以 pbs 2 毫升为洗脱剂收集产品。
      注: 此步骤将产生最终构造 hua33-tco 在2毫升的 pbs, ph 7.4。
  7. 使用 uv-vis 分光光度计测量 hua33-tco 的浓度, 以监测280纳米波长。大多数 igg (280) 的摩尔消光系数为 210, 000 m-1 厘米-1.
  8. 如果需要免疫共轭浓度较高的溶液, 请按照制造商的指示, 使用离心过滤装置浓缩 hua33-tco 溶液, 并在制造商的指示下进行 50, 000 分子量的截止。
    注: 许多抗体已被称为聚集或沉淀在浓度过程中。在尝试使用新抗体的这一程序时, 研究人员应该服从文献或自己处理有关抗体的经验。
  9. 如果立即需要, 请将已完成的 hua33-tco 免疫共轭物存放在4°c 的黑暗中。如果将来要使用超过 4天, 请将其存放在-80°c 的黑暗中。
    注: 这是过程中可接受的停止点。完成的 hua33-tco 免疫共轭在-80°c 的黑暗条件下, 应稳定地储存至少6个月。

2. tz-peg 7-nhboc 的合成

  1. 在 1.7 ml 微离心管中, 将5毫克的四氮素 n-羟基琥珀酰亚胺酯 (tz-nhs; 12.6μmol) 溶解在 0.15 ml 无水二甲基亚硫醚 (dmso) 中。
  2. 在一个单独的1.7 毫升微离心管中溶出8毫克的 boc-koce peg 聚合物, o-(2-氨基乙基)-o '-[2-(boc-amico) 乙基] 己基乙二醇 (nhbco-peg7-nh2; 17.1 微米) 在0.15 毫升无水 dmso 中。
  3. 在 tz-nhs 的溶液中, 加入 3μl (21.3 微米, 1.7 摩尔当量), 彻底混合。
  4. 将粉红色的四嗪溶液加入步骤2.2 中的 nhboc-peg 7-nh2溶液中, 在室温下 (rt) 用温和的搅拌孵育反应混合物 30分钟.
  5. 30分钟后, 稀释反应 1:1 in h2o,并使用反相 c18高效液相色谱 (hplc) 纯化反应, 将任何未反应的 tz-nhs 与 Tz-NHS 7-nhboc 分离.使用不含酸的溶剂, 以防止过早去除博克保护基团。以525纳米的波长监测 tz-peg 7-nhboc 和 Tz-PEG。
    注: 保留时间显然在很大程度上取决于每个实验室的 hplc 设备 (泵、柱、油管等), 在纯化之前应进行适当的控制。然而, 举一个例子, 如果梯度 5:95 mecn/2 2o (均无任何添加剂) 到 5 mecn/h 2o 超过 30分钟,流量为 1 ml/2 min, 和分析4.6 毫米 x250毫米 c18 列, tz-nhs 和 Tz-NHS 7-nhboc的保留时间分别为16分钟和18分钟左右。
  6. 用液氮冷冻采集的高效液相色谱洗脱液, 并将现冻收集管包裹在铝箔中。将冷冻收集管放置在冻干机上过夜, 以去除高效液相色谱流动相。该产品将是一个典型的明亮的粉红色固体。
    注: 如果没有液氮, 请将收集到的 hplc 洗脱液冷冻在干冰中, 或在-80°c 的冰柜中过夜。

3. tz-peg7-nh2的合成

  1. 在步骤 2.6, tz-peg 7-nhboc的产品中, 加入1.5 毫升的二氯甲烷 (dcm), 并将该溶液转移到一个小的圆底烧瓶中。
  2. 从步骤3.1 滴入0.25 毫升的三氟乙酸 (tfa)。
  3. 允许反应在 rt 孵育 30分钟, 并进行轻度搅拌。
  4. 30分钟后,通过旋转蒸发蒸发溶剂。不要超过37°c 的水浴温度。
  5. 在0.5 毫升的水中重新加工粉红色粘性产品。
  6. 使用反相 c18 高效液相色谱法纯化产品, 将 tz-peg7-nh2与bocc 保护前体分离。以525纳米的波长监测 tz-peg 7-nhboc 和 Tz-PEG7-nh 2 .
    注: 保留时间显然在很大程度上取决于每个实验室的 hplc 设备 (泵、柱、油管等), 在纯化之前应进行适当的控制。但是, 举一个例子, 如果使用 5:95 mecn/2 o (均为 0.1% tfa) 到 95:5 mecn/2 o 超过30分钟、流量为 1 mL/min 和分析 4.6 mm x 250 mm c 18 列的梯度, tz-peg 7-nhboc和 tz-peg 7-nh2 的保留时间分别为18分钟和13分钟左右.
  7. 用液氮冷冻采集的高效液相色谱洗脱液, 并将现冻收集管包裹在铝箔中。将冷冻收集管放置在冻干机上过夜, 以去除高效液相色谱流动相。该产品将是一个明亮的粉红色固体。
  8. 重新制造步骤3.7、tz-peg 7-nh2 的产品, 使用150μl 的 dmso, 并转移到 1.7 ml 的微离心管中.
  9. 使用 uv-vis分光光度计测量 tz-peg 7-nh2 的浓度, 以监测 525 nm 波长。tz-peg 7-nh2的摩尔消光系数为 525 m-1厘米-1.

4. tz-peg 7-dota的合成

  1. 将 tz-peg 7-nh2 (4.5 毫克, 6.9μmol) 溶解在0.15 毫升的 dmso 中 (或简单地继续执行步骤3.8 中创建的解决方案).
  2. 在步骤4.1 中含有四嗪的溶液中加入22摩尔当量的 tea (21μl, 0.15 mmol)。
  3. 加入10毫克 (14.2μmol) 的pcnn-dota 作为固体, 并将溶液旋涡约2分钟或直到材料完全溶解。
  4. 允许反应在 rt 孵育 30分钟, 并进行轻度搅拌。
  5. 30分钟后, 稀释反应 1:1 in h2o,用反相 c18 高效液相色谱法纯化产品, 去除未反应的 p-scn-bn-dota.可以以254纳米的波长对 p-cn-bn-dota 进行监测, 而 Tz-PEG 7-dota的监测波长最好为 525 nm。
    注: 保留时间显然在很大程度上取决于每个实验室的 hplc 设备 (泵、柱、油管等), 在纯化之前应进行适当的控制。然而, 举一个例子, 如果梯度 5:95 mecn/2 2 o (均为 0.1% tfa) 到 95:5 mecn/2 o 超过 30分钟,并使用 4.6 x 250 mm c 18 列, tz-peg 7-dota 和 p-snn-bna保留时间为约15.6 分和16.1 分。
  6. 用液氮冷冻采集的高效液相色谱洗脱液, 并将现冻收集管包裹在铝箔中。将冷冻收集管放置在冻干机上过夜, 以去除高效液相色谱流动相。该产品将是一个明亮的粉红色粉末。
  7. 将产品重新构建为 dmso 0.15 ml, 并使用 uv-vis 分光光度计测量浓度, 以监测525纳米波长。tz-peg 7-dota的磨牙消光系数为 525 m-1厘米-1.
  8. 用核磁共振 (nmr) 和高分辨率质谱 (hrms) 对最终化合物进行分析, 验证合成是否成功。有关本研究中讨论的所有化合物的实验确定的化学转移和分子量, 请参见表 1 。
  9. 将纯化后的 tz-peg7-dota 溶液存放在-80°c 的黑暗中。
    注: 这是过程中可接受的停止点。在这些条件下, 已完成的 tz-peg 7-dota前体至少稳定1年。

5. 177tz-peg7-dota 的lu 无线电标记

注意: 该协议的这一步骤涉及放射性的处理和操作。在执行这些步骤之前--或执行任何其他具有放射性的工作--研究人员应咨询其所在机构的辐射安全部。采取一切可能的步骤, 尽量减少电离辐射的照射。

注: 在处理少量的径向时, 建议所有缓冲器不含微量金属, 以防止协调站点绑定中的干扰。

  1. 在 1.7 ml 离心管中, 将 0.25 m 醋酸铵缓冲液的200μl 加入 ph 值 5.5, 并调整为 1m hcl 的原料。
    注: 如果使用少于 370 mbq 的活性进行标记, 则所使用的缓冲量应减少到100μl。
  2. 将所需的 [177lu] lucl3添加到缓冲区解决方案中。添加的数量将取决于实验中的受试者数量和所使用的放射性剂量。建议增加1-2 剂额外的放射性, 作为预防措施, 以补偿在净化步骤中放射性的潜在损失。
  3. 在步骤5.2 中的放射性混合物中加入 dmso中的 tz-peg 7-dota。tz-peg 7-dota的数量取决于被测试对象的数量。有关此主题的更多详细信息, 请参阅步骤6.2.2.2。
  4. 允许溶液在37°c 孵育20分钟。
  5. 验证无线电标记是否完整, 使用无线电即时薄层色谱 (raado-itlc) 与 50 mm edta, ph 5.5 作为流动相。标记为 [177路] ludat-pg7-z将保持在基线-rf = 0-而免费 [177路] lu 3+将由 edta 协调, 并将与溶剂前部, rf = 1.0 (图 3 b)。
  6. 如果未实现定量标记, 请添加额外的配体来协调自由的辐射。或者, 使用c18墨盒净化标记为 [177路] ludat-pg 7-tz.请按照制造商的说明进行操作。下面给出了一个示例过程。
    1. 用一个大的注射器慢慢地通过5毫升的乙醇来提供墨盒。然后, 通过5毫升的乙腈, 然后5毫升的去电离 (di) h2o.
    2. 将步骤5.3 中的辐射和溶液放入较小的注射器中, 然后将其缓慢地注射到c18墨盒上。然后, 用 dh 2o的10 毫升清洗墨盒, 取出任何未绑定的 [177路] lucl3。
    3. 用500μl 的乙醇使其具有弹性。通过低流量的干氮或氩, 从最终产品中取出任何乙醇, 时间为10-15。随后, 在步骤6.2.2.2 中确定的体积中重新悬浮盐水中的放射性。

6.体内研究

注意: 与第5节一样, 协议的这一步骤涉及放射性的处理和操作。在执行这些步骤之前, 研究人员应咨询其所在机构的辐射安全部。采取一切可能的步骤, 尽量减少电离辐射的照射。

  1. 动物的准备
    1. 在雌性耳膜裸鼠中, 皮下植入 5 x10 6 sw1222 结直肠癌癌细胞悬浮在1:1 混合细胞介质和基质 (如matrigel) 的150μl 中, 并使其生长成10-150 毫米3异种移植 (14-18天)接种后)。
    2. 生物分布实验中的动物分类
      1. 一旦肿瘤的大小是足够的大小, 由卡尺测量确定, 排序的动物, 以确保每个队列有大约相同的平均肿瘤体积。在每个笼子里, 动物可以用不可磨灭的墨水 (一个波段, 两个波段等) 在尾巴上做标记来区分动物。
    3. 对动物进行纵向治疗研究的分类
      1. 一旦肿瘤的大小足够大, 由卡尺测量确定, 在每个动物上贴上耳垢, 以确保在整个实验过程中正确跟踪。
        注: 在整个实验过程中, 数字耳标可能会脱落。因此, 建议以系统的方式 (即右、左、双边、右 x 2、左 x 2) 以系统的方式伴随这些带有耳槽的物理标签。
      2. 对动物进行分类, 使每个队列中的平均肿瘤体积大致相等。下面的动物排序方法可以使用电子表格程序执行。
        1. 列出三个单独的色谱柱中的动物识别号码、耳槽图案和肿瘤体积。
        2. 对数据进行分类, 从最小到最大的肿瘤体积。
        3. 在第四列中, 给每只动物一个笼子号码, 并以蛇形的模式在笼子中循环。例如, 如果有5个保持架, 此列将填充 "5、4、3、2、1、1、2、3、4、5......", 直到为所有动物分配一个笼子。
        4. 分配保持架后, 按保持架编号对数据进行排序。如果正在使用耳槽, 请确保给定笼子中的每只动物都有独特的耳槽图案。如果给定的保持架中存在重复项 (两个或多个相同模式的), 请将一个鼠标与另一个保持架中的一个鼠标替换为缺少的模式, 直到每个保持架上都有具有独特耳槽图案的动物。
  2. 配方和注射
    注: 生物分布和治疗研究的注射顺序如下: hua33-tco 先注射, 然后是 [177lu] ludat-peg 7-tz, 经过预先确定的间隔。
    1. 免疫共轭
      1. 将 hua33-tco 溶液的一个脂肪从步骤1.9 稀释到0.9% 无菌盐水中的 0.8 mg/ml 浓度。
      2. 在 pbs 中使用1% 的牛血清白蛋白 (bsa) 预处理的注射器中提取 150μl (100μg) 的 hua33-tco 溶液剂量, 并将这些注射器储存在冰上。
        注: bsa 处理可减少抗体与注射器壁的非特异性结合。
      3. 在热灯下加热动物 3分钟, 以扩张尾巴静脉。
      4. 将 hua33-tco 溶液注入携带异种移植小鼠的尾静脉。让 hua33-tco 在小鼠肿瘤中积累 24小时 (或不同的预先确定的时间间隔)。
    2. 辐射寡糖
      1. 如第5节所述, Radiolabel tz-peg 7-dota.
      2. 得出 15μl 0.9% 无菌盐水的剂量, 含有1.1mols 的 tz-peg 7-dota 相对于给予的 hua33-tco量。例如, 如果将 hua33-tco 的100微克 (0.67 nmol) 注入动物体内, 并以 12.4 gbq/μmol 的特定活性制备 [177lu] ludat-peg 7-tz 反应混合物, 则会提取剂量, 每个活性为 9.14 mbq。这对应于 tz 的 0.74 nmol (相对于 hua33-tco 的 1.1molar eq)。
      3. 将动物加热 3分钟, 使动物扩张尾静脉。
      4. 将辐射寡核苷酸的剂量注入携带异种移植小鼠的尾静脉。注射的活动量由研究人员确定。已公布的数据表明, 剂量依赖性治疗对肿瘤大小的影响范围为 7.4-55.5 mbq。
  3. 生物分布
    1. 在给药辐射寡氨药后的理想时间点, 使用 2% o2/6% co2 气体混合物对每一组小鼠进行安乐死.
      注: 遵循有关二次物理安乐死方法 (如宫颈脱位) 的任何制度要求。
    2. 对于每一种动物, 取出所有感兴趣的器官, 在水浴中清洗, 去除多余的血液, 并在露天用纸巾擦干 5分钟. 样本器官清单按建议顺序: 血液、肿瘤、心脏、肺、肝脏、脾脏、胃、小肠大肠, 肾脏, 肌肉, 骨头, 皮肤, 尾巴。
    3. 一旦充分干燥, 将器官放入预称的一次性培养管中。再次称量现在充满的管子, 以获得每个器官或组织的质量。
    4. 使用伽玛计数器测量每个管道中的活动。将伽玛计数器中的测量活动与用于测量所绘制剂量的检测器校准。在每个仪器上计算 177lu 的放射性标准, 并确定活动与每分钟点数之间的校准系数 (cpm)。
    5. 将生物分布数据绘制为条形图 (见图 5), 显示每个器官的均归一化吸收以及表示一个标准偏差的条形图。样本组之间吸收的统计差异可以通过未配对的 t 检验进行评估, 在 t 测试中, 当p < 0.05 时, 就会达到显著性。
  4. 治疗监测
    1. 使用卡钳, 测量长圆形肿瘤 (长度) 的最长的一面以及宽度, 这是垂直于长度。计算体积使用公式为一个椭球体的容量: (4/3) l·w·h, 简化到半 l ·w2, 假设高度大致等于宽度。
      注: 也可以使用手持肿瘤测量装置 (见材料表)。
    2. 在天平上称重每只老鼠, 以跟踪随着时间的推移体重增加或体重减轻的情况。
    3. 重要的是, 监测每个动物的身体外观的痛苦迹象, 如驼背或皮肤血管破裂 (这可能表明血液毒性)。
      注: 在纵向治疗研究过程中, 应每1-2天收集一次肿瘤测量结果。
    4. 剧情数据从纵向疗法研究作为平均肿瘤容量随着时间的推移和正常化到开始肿瘤容量, 如果需要。样本组在同一天的统计差异可以通过未配对的 t 检验进行评估, 在测试中, p < 0.05 时达到了显著性。可以而且应该按照训练有素的生物统计学家的建议进行更广泛的统计分析。

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Representative Results

tco 与 hua33 的结合是基于氨基反应 tco-nhs 与免疫球蛋白表面赖氨酸残基之间的耦合。该方法具有很强的鲁棒性和可重复性, 并能可靠地产生 2-4 tco/mab 的标签。在这种情况下, 使用了 aldi-tof 质谱法, 以确认约 4.0 tco/mab 的标记程度;以氟改性四嗪为记者24, 得到了类似的值。四氮合配体的合成分三个步骤进行: (1) tz-nhs 与单博保护的 peg 链接器的耦合 (2) 这种中间体的保护, 产生 Tz-NHS 7-nh2;(3) 形成硫脲之间的联系p-scn-bn-dota 和 tz-peg7-nh2。该方法相对简便, 总收率约为 75%.每一种中间体都有 hrms 和1h-nmr 的特征;此数据见表 1。

在无线电标记上, 177lu3 +通常是从商业供应商那里获得的氯化物盐 [177路] lucl 3 在 0.5 m hcl.Tz-PEG 7-dota与 177lu 的无线电标记产生的辐射和 [177lu] ludat-pg 7-tz 是非常简单的: 在短短20分钟内, 反应完成, 产生所需的产品 & 和 gt;99% 的放射性化学纯度, 由无线电-itlc 测定。通常情况下, 在配方之前不需要进一步纯化。对基于 tz/tco 的预瞄准文献的调查表明, tz:mab 摩尔比 ~ 1:1 产生的体内数据最好10. 因此, 它不是必要的获得的辐射和在尽可能高的摩尔活性。例如, 本文讨论的生物分布实验采用了 [177路] ludat-peg 7-tz, 其摩尔活性约为 12 gbqμmol.相反, 在纵向治疗研究中, [177lu] ludota-peg 7-tz具有较高的摩尔活性, 以便利在不改变注射摩尔数的情况下给药更大剂量的放射性。四氮烷素。

正如将在讨论中进一步讨论的那样, 生物分布实验对于理解和优化任何 prit 方法至关重要。在这种情况下, 进行了生物分布实验, 以确定从免疫共轭的给药到注射放射线之间的最佳间隔时间。为此, 我们在右肩使用了带有皮下 a33 抗原表达 sw1222 异种的裸鼠。这些动物在注射 [177 lu] ludat-peg 7-tz (9.14mbq, 0.67 nmol) 之前, 接受了100微克 (0.67 nmol) 的 hua33-tco 24、48、72或 120小时.图 5显示, 所有注射间隔在肿瘤组织中产生较高的活性浓度, 以及在健康器官中产生低活性浓度。24小时注射间隔提供了最高的肿瘤摄取量在120小时注射后: 21.2±2.9 克德。每套条件也产生令人印象深刻的肿瘤对器官活动浓度比率。例如, 用24小时间隔的时间进行前定位, 在给药辐射寡糖后, 产生的肿瘤与血液、肿瘤对肝脏以及肿瘤与肌肉的比率分别为20±5、37±7和184±30。基于这些发现, 选择了24小时间隔的纵向治疗研究 (见下文)。

在体内纵向治疗研究中, 在注射[177lu] ludat-pg 之前24小时对右侧翼进行皮下 sw1222 异种移植的胸腺裸鼠进行了 hua33-tco (100 微克, 0.67 nmol)7-tz。采用了三个不同的实验队列, 其 [177 lu] ludat-pg7-z 的 ra.7mbq (对应于24、45和 70 gbq/μmol 的摩尔活性)。此外, 两个对照组接受了 prit 方案的一半: 没有 [177 路] ludat-peg 7-tg 或 [177 lu] ludat-peg 7-tz( 55.5mbq, 0.67 nmol),则没有 hua33-tco.这些都是必要的控制, 以确保治疗反应不会引起免疫共轭或放射和单独。在研究的前三周, 每3天测量一次肿瘤体积, 然后每周测量一次, 直到实验结束 (70天, 177个路的10个半衰期)。如图 6所示, 与对照组相比, 实验组的反应存在明显差异。虽然只接受 prit 策略的一个组成部分的小鼠体内的肿瘤继续不受控制地生长, 但接受完整 prit 方案的小鼠的肿瘤停止生长, 最终缩小到远远低于研究开始时测量到的体积。重要的是, 没有观察到有毒的副作用, 所有动物的重量保持在其初始质量的20% 以内 (图 7a)。卡普兰-梅耶尔的数据图提供了更引人注目的可视化的研究: 虽然所有的小鼠在几个星期内被安乐死, 实验队列中的老鼠有一个完美的生存记录, 在调查结束时 (图 7b)。

Figure 1
图 1: 基于反向电子需求的预定目标放射免疫治疗的卡通原理图.这一数字已从参考 #28 进行了修改。经 Membreno, r., cook, b. e., fung., k., lewis, j. s., & zeglis, b. m. 点击式放射治疗的结肠直肠癌。分子药物.15 (4)、1729-1734 (2018)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: hua33-tco 的构造示意图.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: tz-peg 7-dota合成原理图.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: (a) [ 177路] ludat-pg7-z 的无线电标记示意图;(b) 代表无线电-三氯联 (tlc) 色谱图, 表明 [177 lu] ludat-pg 7-z 的放射性化学纯度 gt;98.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 以 hua33-tco 和 [177lu]-dota-peg 7-tz 为靶向性裸鼠的体内生物分布,在具有皮下 sw1222 人结直肠癌的裸鼠中, 使用的预靶向间隔为 24 (紫色), 48 (绿色)、72 (橙色) 或 120 (蓝色) 小时.n = 4 队列中的标准错误的数据;统计分析是由一个未配对的学生的 t 测试, * *p < 0.01。这一数字已从参考 #28 进行了修改。经 Membreno, r., cook, b. e., fung., k., lewis, j. s., & zeglis, b. m. 点击式放射治疗的结肠直肠癌。分子药物.15 (4)、1729-1734 (2018)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 对5组小鼠 (n = 每组 10) 进行纵向治疗研究, 这些小鼠的皮下 sw1222 肿瘤平均肿瘤体积以平均肿瘤体积为时间函数 (a); 肿瘤体积归一化为初始体积 (b).对照组接受免疫共轭, 没有放射线 (蓝色) 或放射线, 没有免疫共轭 (红色)。三个治疗组接受 hua33-tco (100μg, 0.6 nmol) 后 24小时, 分别是 18.5 (绿色)、37.0 (紫色) 或 55.5 (橙色) mbq (每个病例 ~ 0.8 nmol) [177lu]-dota-pg 7-tz.通过对数排名 (mantel-cox) 测试, 所有治疗组的存活率都很高 (p < 0.0001)。这一数字已从参考 #28 进行了修改。经 Membreno, r., cook, b. e., fung., k., lewis, j. s., & zeglis, b. m. 点击式放射治疗的结肠直肠癌。分子药物。15 (4)、1729-1734 (2018)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 5 组小鼠 (n = 10) 的纵向治疗研究中动物体重曲线, 其皮下注射 sw1222 肿瘤 (a); 相应的卡普兰-梅耶尔存活曲线 (b).对照组接受免疫共轭, 没有放射线 (蓝色) 或放射线, 没有免疫共轭 (红色)。三个治疗组接受 hua33-tco (100μg, 0.6 nmol) 后 24小时, 分别是 18.5 (绿色)、37.0 (紫色) 或 55.5 (橙色) mbq (每个病例 ~ 0.8 nmol) [177lu]-dota-pg 7-tz.这一数字已从参考 #28 进行了修改。经 Membreno, r., cook, b. e., fung., k., lewis, j. s., & zeglis, b. m. 点击式放射治疗的结肠直肠癌。分子药物.15 (4)、1729-1734 (2018)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.

复合 1h-nmr 移位 人力资源管理系统 (ESI)
500 mhz, dmso
tz-peg 7-nhboc 10.52 (s, 1h)、8.50 (m, 3h)、7.82 (t, 1h)、7.82 (d, 2h)、6.69 (t, 1h)、4.33 (d, 2h)、3.42 (m, 22h), 3.42 (t, 2h)、3.42 (t, 2h)、3.42 (q, 2h)、2.99 (q, 2h)、2.99 (t, 2h)、2.99 (t, 2h)、2.99 (t, 2h)、1.70 (s), 9h) 莫兹卡尔德。适用于 c35h57n7o11n:774.4005;发现: 74.4 4014。
tz-peg7-nh2 10.58 (s, 1h)、8.46 (m, 2h)、7.87 (t, 1h)、7.87 (d, 2h)、7.87 (d, 1h)、4.40 (d, 2h)、3.60-3.50 (米, 26h)、3.60 (t, 2h)、3.60 (bs, 2h)、3.60 (q, 2h)、2.99 (bs, 2h)、2.99 (t, 2h)、2.99 (t, 2h)、1.79 (q, 2h)。 莫兹卡尔德。适用于 c30h50 n7o9:652.3670;发现: 662.3676。
tz-peg 7-dota 10.57 (s, 1h)、9.63 (bs, 1h)、8.45 (m, 3h)、7.86 (m, 1h)、7.86 (bs, 1h)、7.86 (d, 2h)、7.86 (m, 2h)、7.86 (m、2h)、6.54 (bs, 1h)、4.40 (d, 2h)、4.00-3.20 (m, 55h)、3.20 (q, 4h)、2.54 (s, 1h)、2.54 (t, 3h)、2.10 (t, 3h)、1.76 (q), 2h)。 莫兹卡尔德。适用于c50h76n11 o15s:1202.56;发现: 1203.5741。

表 1.本协议中描述的有机化合物的表征数据。

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Discussion

这种方法在体内预瞄准的优点之一--特别是在基于双特异性抗体和放射性标记的浸渍的策略方面--是它的模块化:反周期细胞分子可以附加到任何抗体上,四氮体辐射寡核苷酸可以用非常多的放射性核素进行放射性标记, 而不会损害它们与点击伙伴发生反应的能力。然而, 这种方法对其他抗体抗原系统的适应并不像复制这里描述的协议那么简单。当然, 任何试图创建一个新的 mAb-TCO 免疫共轭或一个新的四氨酸携带辐射寡核苷酸, 并应伴随着适当的化学和生物表征检测, 包括稳定性和反应性的测试。但除此之外, 还有两个变量是特别重要的探索和优化: (1) mab-tco 免疫共轭的质量给药和 (2) 从注射 ab-tco 到给药的辐射寡聚糖之间的间隔时间。这两个因素都会极大地影响预瞄准系统的体内行为。例如, 使用过高剂量的免疫共轭或间隔时间太短, 可能会导致血液中不希望高的活性浓度, 因为在辐射寡脑和免疫共轭之间的点击反应仍然循环。相反, 由于抗原饱和或反式的不可阻挡 (尽管缓慢) 异构, 使用过多的免疫共轭或过长的间隔时间可能会不必要地降低肿瘤的活性浓度.-环囊对不活跃的顺式环囊。按照这些思路, 使用一系列免疫共轭和预瞄准间隔进行生物分布实验是非常有帮助的。当然, 也建议在进行任何体内实验的同时进行适当的控制。其中包括--但不限于--具有抗原阴性细胞系的实验, 阻断接受大量非共轭抗体的队列, 放射寡核苷酸和单独抗体的管理, 辐射寡核苷酸的注射, 以及 tco -缺乏免疫共轭,并在体内预靶向使用非特异性, 同型对照 tco 轴承免疫共轭。

或者, 如果治疗性放射性核素发射正电子或 "可成像" 光子,或者如果有治疗性放射性核素的 "可成像" 同位素, 则可使用成像实验进行优化。最终, 应选择能够最好地平衡高肿瘤活性浓度和高肿瘤与背景活动浓度比率的变量集, 用于随后的纵向治疗研究。在这里介绍的情况下, 100 微克的 hua33-tco 被注射了24小时的间隔. 剂量测定的计算--特别是那些允许计算肿瘤剂量和治疗比率的计算--在优化过程中也会有帮助。

需要注意的是, 即使是有希望的 [177路] ludat-peg 7-tzhua3-toco 系统, 也可以从额外的优化中受益.将这种方法中的剂量学数据与传统 rit 的传统 rit 数据与177个Lu-labeled 的 hua33 变种进行比较后发现, prit 的肿瘤剂量低于传统 rit。此外, prit 系统的有效剂量 (0.054 mvmw) 仅比传统 rit 系统 (0.06 msv/mbq) 略低。

目前正在探讨解决这些问题的两种补救办法。首先, 开发了一种树突状支架, 能够增加每个抗体30的 tco 数量。在预定目标 pet 成像的背景下, 这种方法极大地提高了肿瘤的活性浓度, 类似的实验 [177lu] ludota-peg7-z 正在进行中。其次, 使用四氨酸轴承清除剂可能是有用的 prit 的上下文。在注射辐射剂之前给药, 已被用于各种预瞄准方法, 以减少血液中残留免疫共轭的浓度, 从而降低健康器官23,31。结算代理的使用并非没有缺点, 虽然;其中最值得注意的是增加了一个已经公认的复杂治疗方式的复杂性。尽管如此, 纪念斯隆凯特林癌症中心的研究人员最近发表了一份引人注目的报告, 介绍了一种带有 tz 标签的糊精清除剂, 用于预定目标 pet 成像, 以及与 [177lu] 一起使用这种结构的数据。ludota-peg 7-z和 hua33-tco 即将推出 32.另一种最大限度地发挥 prit 剂量学效益的方法是使用物理半衰期较短的放射性核素。这已被证明是非常有效的成像;然而, 物理半衰期较短的治疗性放射性核素却很少。

最后, 如果我们不能正确地解决基于逆电子需求 diels-alder 反应的预瞄准的一些内在局限性, 那将是我们的失职。其中第一个问题是所有体内预定位方法所固有的: 所使用的抗体在与目标组织结合时不能内化。当然, 这是必不可少的, 因为抗体必须保持可接触到的辐射寡核苷酸, 而不是隔离在细胞内的隔间。诚然, 这一限制很难规避, 尽管最近已经表明, 内化速度缓慢至中等的抗体可以在体内用于针对33、34 的预瞄准。其次, 反应性跨环素对非活性顺环化的体内缓慢异构有可能限制 tco 携带免疫共轭物的给药与非活性环孢菌素之间的间隔长度。注射的辐射寡核苷酸。关键的是, 高达120小时的间隔仍然在预定目标 pet 成像和prit 方面提供了出色的结果。然而, 使用这些较长的间隔几乎总是伴随着肿瘤活动浓度的轻微降低, 这可能是由于这种异构。为了解决这一问题, 一些实验室试图在不损害反应性的情况下制造更稳定的反式环囊, 而另一些实验室则试图开发出能够与四氨嗪35反应的全新的双核生物.我们希望在未来数年, 这些化学发展能用于 prit。

最后, 基于逆电子需求的 prit 无疑是一种新兴的、有些不成熟的技术。然而, 我们对我们已经获得的临床前结果感到鼓舞, 并对这一战略的临床承诺感到兴奋。我们真诚希望该协议鼓励其他人探索和优化这种方法, 从而为其从实验室到诊所的旅程提供燃料。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢雅各布·霍顿博士的有益对话。作者还要感谢国家卫生研究院的慷慨资助 (r00ca178205 和 U01CA221046)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

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基于逆电子需求函数-alder 反应的隐形放射免疫治疗
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