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Chemistry

Pretargeted radio-immunothérapie basée sur la réaction de Diels-Alder demande Inverse d’électrons

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

Ce protocole décrit la synthèse et la caractérisation d’un trans- cyclooctène (TCO)-modification des anticorps et un radioligand de Lu marqué tetrazine (Tz) 177pour pretargeted radio-immunothérapie (Amel). En outre, il décrit en détail l’utilisation de ces deux concepts pour in vivo de biodistribution et études de thérapie longitudinale dans un modèle murin de cancer colorectal.

Abstract

Alors que radio-immunothérapie (RIT) est une approche prometteuse pour le traitement du cancer, la demi-vie longue pharmacocinétique des anticorps radiomarqués peut entraîner des doses élevées de rayonnement aux tissus sains. Peut-être sans surprise, plusieurs stratégies différentes ont été développés pour contourner cette limitation troublante. L’un des plus prometteurs de ces approches est pretargeted radio-immunothérapie (Amel). TRIOUX repose sur découplage le radionucléide de l’immunoglobuline, y injecter séparément et ensuite leur permettant de combiner in vivo dans le tissu cible. Cette approche exploite les propriétés exceptionnelles de ciblage tumoral des anticorps tout en longeant leurs inconvénients pharmacocinétiques, ainsi réduisant les doses de rayonnement aux tissus non ciblés et facilitant l’utilisation des radionucléides ayant une demi-vie qui sont considéré comme trop court pour utilisation en radioimmunoconjugates traditionnel. Au cours des cinq dernières années, notre laboratoire et autres ont mis au point une approche en vivo pretargeting basée sur la réaction de Diels-Alder (DADEI) inverse la demande électronique entre trans- cyclooctène (TCO) et tetrazine (Tz). Cette stratégie a été appliquée avec succès à pretargeted par émission de positrons (TEP) et d’émission monophotonique une tomodensitométrie (SPECT) d’imagerie avec une variété de systèmes d’anticorps-antigène. Dans une paire de publications récentes, nous avons démontré l’efficacité de base DADEI PRIT dans des modèles murins d’adénocarcinome ductal pancréatique et carcinome colorectal. Dans ce protocole, nous décrivons des protocoles pour TRIOUX utilisant un radioligand de Lu-DOTA-étiqueté tetrazine 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) et une variante modifiée de TCO du cancer colorectal ciblant les anticorps huA33 (huA33-TCO). Plus précisément, nous allons décrire la construction de huA33-TCO, la synthèse radiolabeling de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz et la performance in vivo la biodistribution des études longitudinales de la thérapie dans des modèles murins de carcinome colorectal.

Introduction

Radio-immunothérapie (RIT) — l’utilisation d’anticorps pour la prestation de radionucléides thérapeutiques aux tumeurs — est depuis longtemps une approche alléchante au traitement du cancer1,2. En effet, cette promesse a été soulignée par l’United States Food and Drug Administration approbation de deux radioimmunoconjugates pour le traitement du lymphome Non hodgkinien : 90Y-ibritumomab tiuxétan et 131tositumomab-j’ai3 , 4. pourtant, dès ses débuts, les perspectives cliniques de RIT ont été entravés par une complication critique : débits de dose de rayonnement élevée aux tissus sains5,6. En général, radioimmunoconjugates de RIT sont étiquetés avec des radionucléides à vie longue (p. ex., 131j’ai [t½ = 8,0 jours] et 90Y [t½ = 2,7 jours]) ayant une demi-vie physique qui conjugue bien avec les demi-vie longue pharmacocinétiques des immunoglobulines. C’est essentiel, car il garantit que la radioactivité suffisante reste une fois que l’anticorps a atteint sa biodistribution optimale après plusieurs jours de circulation. Toutefois, cette combinaison des temps de séjour prolongé dans le sang et la demi-vie longue physique entraîne inévitablement l’irradiation des tissus sains, ce qui réduit les rapports thérapeutiques et limitant l’efficacité de la thérapie7. Plusieurs stratégies ont été explorées pour contourner ce problème, y compris l’utilisation de fragments d’anticorps tronqué comme Fab, Fab', f2, minibodies et nanocorps8,9,10. Un des plus prometteurs et fascinant, mais indéniablement complexe des approches alternatives est en vivo pretargeting11.

In vivo pretargeting est une approche d’imagerie nucléaire et thérapie qui cherche à exploiter l’affinité exquise et la sélectivité des anticorps en longeant leurs inconvénients pharmacocinétiques11,12,13. À cette fin, l’anticorps radiomarqués utilisé en radio-immunothérapie traditionnel est déconstruit en deux composantes : une petite molécule radioligands et un immunoconjugué pouvant lier aussi bien un antigène tumoral et au radioligand susmentionné. L’immunoconjugué est injecté tout d’abord et donné une « longueur d’avance », souvent de plusieurs jours, au cours de laquelle il s’accumule dans le tissu cible et efface dans le sang. Par la suite, la petite molécule radioligand est administré et combine avec l’immunoconjugué à la tumeur ou efface rapidement de l’organisme. En substance, en vivo pretargeting invoque effectuant la radiochimie dans le corps lui-même. En réduisant la circulation de la radioactivité, cette approche a simultanément réduit les doses de rayonnement aux tissus sains et facilite l’utilisation des radionucléides (p. ex., 68Ga, t½ = 68 min211; Comme, t½ = 7,2 h) ayant une demi-vie qui est généralement considérées comme incompatible avec les vecteurs de base d’anticorps.

À partir de la fin des années 1980, une poignée de différentes approches in vivo pretargeting ont été développées, y compris des stratégies fondées sur des anticorps bispécifiques, l’interaction streptavidine / biotine et l’hybridation des complémentaires oligonucléotides14,15,16,17,18. Encore chacun a été freiné à des degrés divers par des complications, le plus célèbre est l’immunogénicité puissante des anticorps streptavidine-modified19,20. Au cours des cinq dernières années, notre groupe et autres ont développé une approche en vivo pretargeting basé sur le rapide et bioorthogonal électron inversée demande Diels-Alder ligature entre trans- cyclooctène (TCO) et tetrazine (Tz) 2122,de,23,24. Les plus réussis de ces stratégies ont employé un anticorps modifiés TCO et un radioligand Tz-roulement, comme le TCO est généralement plus stable en vivo que ses Tz partenaire (Figure 1)25,26. Comme dans d’autres méthodologies pretargeting, l’immunoconjugué mAb-TCO est administré d’abord et le temps pour effacer de la circulation et s’accumuler dans les tissus tumoraux. Par la suite, la petite molécule Tz radioligand est injecté, après quoi il clique avec l’immunoconjugué dans le tissu cible ou efface rapidement de l’organisme. Cette in vivo pretargeting stratégie a prouvé très efficace pour PET et SPECT imaging avec plusieurs systèmes différents anticorps/antigène, constamment produisant des images avec un contraste élevé et permettant l’utilisation de courte durées radionucléides tels que 18 F (t½ = 109 min) et 64Cu (t1/2 = h 12,7)21,22,24. Plus récemment, l’efficacité de click-basé pretargeted radio-immunothérapie (Amel) a été démontrée dans des modèles murins d’adénocarcinome ductal pancréatique (ACPE) et carcinome colorectal27,28. À cette fin, le radionucléide thérapeutique 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 jours) a été employé en conjonction avec deux types d’anticorps : 5 b 1, qui cible l’antigène glucidique 19,9 (CA19.9) ubiquitaire exprimée en ACPE , et huA33, qui s’adresse l’A33, une glycoprotéine transmembranaire exprimée en > 95 % des cancers colorectaux. Dans les deux cas, cette approche à 177Lu-Justine ont donné des concentrations d’activité élevé dans le tissu tumoral, créé un effet thérapeutique de la dose-dépendante et réduit simultanément les concentrations d’activité dans les tissus sains par rapport aux traditionnels directement marqués radioimmunoconjugates.

Dans cet article, nous décrivons les protocoles pour TRIOUX utilisant un radioligand de Lu-DOTA-étiqueté tetrazine 177([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) et une variante modifiée de TCO de l’anticorps huA33 (huA33-TCO). Plus précisément, les auteurs décrivent la construction de huA33-TCO (Figure 2), la synthèse radiolabeling de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (Figure 3 et Figure 4) et la performance de in vivo la biodistribution et études longitudinales de la thérapie dans des modèles murins du cancer colorectal. En outre, dans les résultats représentatifs et de la discussion, nous présentons un ensemble de données d’échantillons, stratégies possibles d’adresse pour l’optimisation de cette approche et considérer cette stratégie dans le contexte plus large d’en vivo pretargeting et PRIT. Enfin, il est important de noter que tandis que nous avons choisi de mettre l’accent sur pretargeting en utilisant huA33-TCO et [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz dans le présent protocole, cette stratégie est très modulaire et peut être adapté pour répondre à un large éventail d’anticorps et radionucléides.

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Protocol

Tous in vivo des expérimentations animales décrites dans cet ouvrage ont été réalisées selon les protocoles approuvés et exécutées sous les directives éthiques du Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center et Hunter College Soins institutionnels des animaux et utilisation des comités (IACUC).

1. la préparation du huA33-TCO

NOTE : La synthèse du huA33-TCO a été précédemment rapporté29. Toutefois, pour la facilité du lecteur, il est reproduit ici avec les ajustements pour des conditions optimales.

  1. Dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL, préparer une solution de 125 μL de (E) - cyclooct - 4-ényle 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) à sec de diméthylformamide (DMF) à une concentration de 40 mg/mL (0,15 M). Cette solution peut être aliquoté et congelé à-80 ° C pour une utilisation dans des expériences futures.
  2. Dans un tube de microcentrifuge distinct 1,7 mL, préparer une solution de 5 mg/mL d’huA33 dans 1 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 2,7 mM chlorure de potassium, chlorure de sodium de 137 mM et phosphate de potassium 11,9 mM, pH 7,4).
  3. À l’aide de petites parties aliquotes (< 5 μL) de 0,1 M Na2CO3, ajuster le pH de la solution d’anticorps de 1,2 Step à 8,8-9.0. Utilisez papier pH ou un pH-mètre avec une microélectrode à surveiller le pH et la diligence que le pH ne dépasse pas 9.0.
  4. À la solution d’anticorps décrite au point 1.3 de l’étape, ajouter lentement un volume correspondant à 40 équivalents molaires de TCO-NHS par rapport à la quantité d’anticorps. Par exemple, si 5 mg (30 nmol) de huA33 est la solution, ajouter 9,0 μL (1,20 μmol) de la solution de 40 mg/mL (0,15 M) du TCO-NHS.
    NOTE : TCO-NHS est hydrophobe. Lorsque vous l’ajoutez à la solution d’anticorps, ajouter lentement et en agitant le mélange pour éviter la précipitation. Ne pas dépasser 10 % DMF en volume de la solution finale de réaction.
  5. Permettre la réaction d’incubation à 25 ° C sur un thermomixer pendant 1 h avec agitation légère (500 tr/min).
  6. Après 1 h, purifier l’immunoconjugué huA33-TCO en utilisant une colonne de dessalement exclusion préemballages jetables taille.
    1. Equilibrer la colonne d’exclusion de taille tel que décrit par le fournisseur à supprimer tous les préservatifs présents dans la colonne pendant le stockage. Une procédure typique consiste à laver la colonne 5 x avec un volume de PBS qui correspond au volume de la colonne : 5 x 2,5 mL de PBS.
    2. Ajouter le mélange réactionnel à la colonne d’exclusion de taille notant le volume du mélange réactionnel.
    3. Une fois le mélange réactionnel est entré dans la colonne, ajouter une quantité appropriée de PBS pour porter le volume total de solution ajoutée à la colonne à 2,5 mL. Par exemple, si la réaction de conjugaison conduit à un volume total de 1,3 mL, ajouter 1,2 mL de PBS supplémentaires à la colonne.
    4. Recueillir le produit à l’aide de 2 mL de PBS comme l’éluant.
      Remarque : Cette étape permet d’obtenir la construction finale huA33-TCO dans 2 mL de PBS, pH 7,4.
  7. Mesurer la concentration de l’huA33-TCO à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis, suivi de la longueur d’onde nm 280. Le coefficient d’extinction molaire pour la plupart IgG (ε280) est de 210 000 M-1cm-1.
  8. Si vous souhaitez une solution avec une concentration plus élevée d’immunoconjugué, concentrer la solution huA33-TCO en utilisant une unité de filtration centrifuge avec un seuil de 50 000 poids moléculaire suivant instructions du fabricant.
    Remarque : De nombreux anticorps ont été connus pour agréger ou précipiter lors de la concentration. Lorsque vous essayez cette procédure avec un nouvel anticorps, les chercheurs devraient s’en remettre à la littérature ou de leur propre expérience manutention l’anticorps en question.
  9. Stocker l’immunoconjugué huA33-TCO terminé à 4 ° C dans l’obscurité s’il est nécessaire immédiatement. Si elle doit être utilisée plus de 4 jours dans le futur, stockez-le à-80 ° C dans l’obscurité.
    NOTE : Ceci est un point d’arrêt acceptable dans la procédure. L’immunoconjugué huA33-TCO dûment rempli doit être stable pour le stockage d’au moins 6 mois à-80 ° C dans l’obscurité.

2. la synthèse de Tz-PEG7- NHBoc

  1. Dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL, dissoudre 5 mg de tetrazine N- hydroxysuccinimidyl ester (Tz-NHS ; 12,6 μmol) à 0,15 mL d’anhydre diméthyl sulfoxyde (DMSO).
  2. Dans un tube de microcentrifuge distinct 1,7 mL, dissoudre 8 mg de Boc protégé amino PEG polymère, glycol de O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) à 0,15 mL de DMSO anhydre.
  3. À la solution de Tz-NHS, ajouter 3 μL (21,3 μmol, 1,7 équivalents molaires) de triéthylamine (TEA) et bien mélanger.
  4. Ajoutez la solution de tetrazine rose à la solution NHBoc-PEG7-NH2 du point 2.2 et incuber le mélange réactionnel pendant 30 min à température ambiante (RT) avec agitation douce.
  5. Après 30 minutes, diluer la réaction 1:1 H2O et purifier la réaction en phase inverse C18 haute performance par chromatographie liquide (HPLC) à séparer tout Tz-NHS n’a pas réagi de la Tz-PEG7- NHBoc. Utiliser des solvants sans acide pour empêcher la suppression prématurée de la Boc groupe protecteur. Surveiller les deux Tz-PEG7- NHBoc et Tz-NHS à une longueur d’onde de 525 nm.
    NOTE : Temps de rétention sont évidemment fortement tributaires de l’équipement CLHP chaque laboratoire (pompes, colonnes, tuyaux, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Toutefois, pour présenter un exemple, si une pente de 5 : 95 MeCN/H2O (les deux sans aucun additif) 95 : 5 MeCN/H2O pendant 30 min, un débit de 1 mL/min et une colonne de18analytique 4,6 mm x 250 mm C sont utilisées , les temps de rétention de Tz-NHS et Tz-PEG7- NHBoc sont autour de 16 min à 18 min, respectivement.
  6. Geler l’éluant HPLC recueillie à l’aide d’azote liquide et enroulez le tube de prélèvement gelé en papier d’aluminium. Place le tube de prélèvement congelé sur un lyophilisateur durant la nuit pour enlever la phase mobile CLHP. Le produit sera un solide rose brillant caractéristique.
    Remarque : Si l’azote liquide n’est pas disponible, geler l’éluant HPLC recueillie dans la glace sèche ou pendant la nuit dans un congélateur à-80 ° C.

3. la synthèse de Tz-PEG7-NH2

  1. Le produit de l’étape 2.6, Tz-PEG7- NHBoc, ajouter 1,5 mL de dichlorométhane (DCM) et transférer cette solution dans un petit ballon à fond rond.
  2. Ajouter 0,25 mL d’acide trifluoroacétique (TFA) goutte à goutte la solution rose d’étape 3.1.
  3. Permettre la réaction à incuber 30 min à ta par une légère agitation.
  4. Après 30 min, faire évaporer le solvant par évaporateur rotatif. Ne pas dépasser une température de bain de l’eau 37 ° c.
  5. Reconstituer le produit visqueux rose dans 0,5 mL d’eau.
  6. Purifier le produit à l’aide de phase inverse C18 HPLC séparer Tz-PEG7-NH2 le précurseur Boc-protégé. Surveiller les deux Tz-PEG7- NHBoc et Tz-PEG7-NH2 à une longueur d’onde de 525 nm.
    NOTE : Temps de rétention sont évidemment fortement tributaires de l’équipement CLHP chaque laboratoire (pompes, colonnes, tuyaux, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Toutefois, pour présenter un exemple, si une pente de 5 : 95 MeCN/H2O (tous deux avec 0,1 % TFA) 95 : 5 MeCN/H2O pendant 30 min, un débit de 1 mL/min et une colonne de18analytique 4,6 mm x 250 mm C sont utilisées , les temps de rétention de Tz-PEG7- NHBoc et Tz-PEG7-NH2 sont environ 18 min et 13 min, respectivement.
  7. Geler l’éluant HPLC recueillie à l’aide d’azote liquide et enroulez le tube de prélèvement gelé en papier d’aluminium. Place le tube de prélèvement congelé sur un lyophilisateur durant la nuit pour enlever la phase mobile CLHP. Le produit sera un solide rose vif.
  8. Reconstituer le produit de l’étape 3.7, Tz-PEG7-NH2, avec 150 μl de DMSO et transférez dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL.
  9. Mesurer la concentration de Tz-PEG7-NH2 à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis, suivi de la longueur d’onde nm 525. Le coefficient d’extinction molaire pour Tz-PEG7-NH2 (ε525) est de 535 M-1cm-1.

4. la synthèse de Tz-PEG7- DOTA

  1. Dissoudre le Tz-PEG7-NH2 (4,5 mg, 6,9 μmol) à 0,15 mL de DMSO (ou simplement aller de l’avant avec la solution créée dans étape 3,8).
  2. Ajouter 22 équivalents molaires de thé (21 μL, 0,15 mmol) de la solution contenant tetrazine d’étape 4.1.
  3. Ajouter 10 mg (14,2 μmol) de p- SCN-Bn-DOTA comme un solide et un vortex la solution pendant environ 2 minutes ou jusqu'à ce que le matériel est entièrement dissous.
  4. Permettre la réaction à incuber 30 min à ta par une légère agitation.
  5. Après 30 min, diluer la réaction 1:1 H2O et purifier le produit à l’aide de phase inverse C18 HPLC pour supprimer n’ayant pas réagi p- SCN-Bn-DOTA. Le p- SCN-Bn-DOTA peut être surveillé à une longueur d’onde de 254 nm, tandis que le Tz-PEG7- DOTA est mieux surveillée à une longueur d’onde de 525 nm.
    NOTE : Temps de rétention sont évidemment fortement tributaires de l’équipement CLHP chaque laboratoire (pompes, colonnes, tuyaux, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Toutefois, pour présenter un exemple, si une pente de 5 : 95 MeCN/H2O (tous deux avec 0,1 % TFA) 95 : 5 MeCN/H2O pendant 30 min et une colonne de18analytique 4,6 x 250 mm C sont utilisées, Tz-PEG7- DOTA et p-SCN-Bn-DOTA ont des temps de rétention des autour de 15,6 min et 16,1 min, respectivement.
  6. Geler l’éluant HPLC recueillie à l’aide d’azote liquide et enroulez le tube de prélèvement gelé en papier d’aluminium. Place le tube de prélèvement congelé sur un lyophilisateur durant la nuit pour enlever la phase mobile CLHP. Le produit sera une poudre rose vif.
  7. Reconstituer le produit à 0,15 mL de DMSO et mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis, suivi de la longueur d’onde nm 525. Le coefficient d’extinction molaire pour Tz-PEG7- DOTA (ε525) est de 535 M-1cm-1.
  8. Analyser le composé final par résonance magnétique nucléaire (RMN) et la spectrométrie de masse à haute résolution (SGRH) pour vérifier que la synthèse a été un succès. Voir le tableau 1 pour les déplacements chimiques déterminées expérimentalement et poids moléculaires de tous les composés mentionnés dans cet ouvrage.
  9. Stocker la solution DOTA - Tz-PEG7purifiée dans l’obscurité à-80 ° C.
    NOTE : Ceci est un point d’arrêt acceptable dans la procédure. Le rempli7Tz-PEG - DOTA précurseur est stable pendant au moins 1 an dans ces conditions.

5. 177Lu radiomarquage de Tz-PEG7- DOTA

Attention : Cette étape du protocole implique la manipulation et la manipulation de la radioactivité. Avant d’effectuer ces étapes — ou d’effectuer toute autre tâche à la radioactivité, les chercheurs devraient consulter Radiation Safety Department de leur établissement d’origine. Prendre toutes les mesures possibles pour minimiser l’exposition aux rayonnements ionisants.

Remarque : Lorsque vous travaillez avec de petites quantités de radiometals, il est recommandé que tous les tampons sont exempts de métaux-traces pour éviter toute interférence dans la liaison de site de coordination.

  1. Dans un tube à centrifuger 1,7 mL, ajouter 200 μl de tampon d’acétate d’ammonium 0,25 M ajusté avec parties aliquotes de 1 M HCl, Ph 5,5.
    Remarque : Si vous utilisez moins de 370 MBq d’activité pour l’étiquetage, le volume de mémoire tampon utilisée devrait être réduit à 100 µL.
  2. Ajoutez la quantité désirée de [177Lu] LuCl3 à la solution tampon. Le montant ajouté sera fonction du nombre de sujets dans l’expérience et les doses radioactives administrés. Il est recommandé d’ajouter 1 à 2 doses supplémentaires d’une valeur de la radioactivité par mesure de précaution pour compenser la perte potentielle de radioactivité pendant les étapes de purification.
  3. Ajouter Tz-PEG7- DOTA dans le DMSO au mélange radioactif au point 5.2. Le montant de Tz-PEG7- DOTA est fonction du nombre de sujets mis à l’essai. Plus de détails sur ce sujet se trouvent à l’étape 6.2.2.2.
  4. Laisser la solution d’incubation à 37 ° C pendant 20 min.
  5. Vérifiez que le radiomarquage est complet à l’aide de chromatographie en phase instantanée fine couche de radio (radio-technologique) avec 50 mM EDTA, pH 5,5 comme phase mobile. L’étiquette [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz restera à la ligne de base — Rf = 0 — bien que libre [177Lu] Lu3 + sera coordonné par l’EDTA et voyagera avec le front de solvant, Rf = 1,0 (Figure 3 b).
  6. Si l’étiquetage quantitatif n’est pas atteint, ajouter ligand supplémentaire afin de coordonner la radiometal libre. Vous pouvez également purifier l’étiquette [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz en utilisant une cartouche de18 C. Suivez les instructions du fabricant pour l’utilisation. Un exemple de procédure est donné ci-dessous.
    1. Amorcer la cartouche en passant lentement par 5 mL d’éthanol à travers la cartouche avec une grande seringue. Ensuite, passer par 5 mL d’acétonitrile, puis 5 mL de désionisée (DI) H2O.
    2. Rédiger la solution radioligands de 5,3 étape dans une petite seringue et injecter lentement sur la cartouche de18 C. Ensuite, laver la cartouche avec 10 mL de DI H2O pour supprimer les éléments non consolidé [177Lu] LuCl3.
    3. Éluer avec 500 µL d’éthanol. Retirer tout l’éthanol du produit final en passant sur le navire avec un faible débit d’azote sec ou de l’argon pendant 10-15 min. Par la suite, remettre en suspension le radioligand dans une solution saline dans un volume déterminé à l’étape 6.2.2.2.

6. études in vivo

Attention : Comme dans l’article 5, cette étape du protocole implique la manipulation et la manipulation de la radioactivité. Avant d’effectuer ces étapes, les chercheurs devraient consulter Radiation Safety Department de leur établissement d’origine. Prendre toutes les mesures possibles pour minimiser l’exposition aux rayonnements ionisants.

  1. Préparation des animaux
    1. Chez la souris nude athymique femelle, par voie sous-cutanée de l’implant suspendues à 150 μL d’un mélange de 1:1 de médias de la cellule et la matrice de cellules du cancer colorectal de6 SW1222 5 x 10 (e.g., Matrigel) et permettre à ceux-ci d’évoluer vers une xénogreffe de3 100 à 150 mm (14-18 jours après l’inoculation).
    2. Tri des animaux pour une expérience de biodistribution
      1. Une fois que les tumeurs sont de taille suffisante, telle que déterminée par la mesure de calibre, trier les animaux pour s’assurer que chaque cohorte a environ le même volume de tumeur moyenne. Les animaux peuvent être distinguées dans chaque cage par des marques sur la queue à l’encre indélébile (une seule bande, deux bandes, etc.).
    3. Tri des animaux pour une étude longitudinale de la thérapie
      1. Une fois que les tumeurs sont de taille suffisante, telle que déterminée par la mesure de calibre, fixer des marques auriculaires pour chacun des animaux afin d’assurer un suivi correct tout au long de l’expérience.
        NOTE : Les marques auriculaires numérique peuvent tomber tout au long de l’expérience. En conséquence, il est recommandé d’accompagner ces balises physiques avec les encoches de l’oreille de manière systématique (i.e., droite, gauche, bilatéraux, droit x 2, gauche x 2).
      2. Trier les animaux afin que le volume tumoral moyen dans chaque cohorte est à peu près égal. La méthode suivante pour le tri des animaux peut être effectuée à l’aide d’un tableur.
        1. Liste des numéros d’identification des animaux, modèle encoche oreille et volume de la tumeur en trois colonnes distinctes.
        2. Trier les données du plus petit au plus grand volume de la tumeur.
        3. Dans une quatrième colonne, affectez chaque animal un cycle dans les cages en forme de polochon et le nombre de cage. Par exemple, si il y a 5 cages, cette colonne est remplie « 5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5... » jusqu'à ce que tous les animaux sont assignés à une cage.
        4. Une fois que les cages sont assignés, trier les données par numéro de cage. Si les encoches de l’oreille sont utilisés, veiller à ce que chaque animal dans une cage donnée a un modèle d’encoche oreille unique. Si des doublons (deux ou plus du même modèle) dans une cage donnée, un souris swap avec celle d’une autre cage avec le modèle manquant jusqu'à ce que chaque cage a animaux présentant des motifs encoche oreille unique.
  2. Formulations et Injections
    Remarque : La séquence d’injection pour l’étude de biodistribution et la thérapie se déroule comme suit : huA33-TCO est injecté en premier lieu, suivi par [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz après un intervalle prédéterminé.
    1. Immunoconjugué
      1. Diluer une aliquote de la solution huA33-TCO de 1,9 étape à une concentration de 0,8 mg/mL dans une solution saline stérile de 0,9 %.
      2. Dessiner des doses de 150 µL (100 µg) de solution huA33-TCO en seringues prétraités avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS et stocker ces seringues sur la glace.
        Remarque : Le traitement de la BSA réduit la liaison non spécifique de l’anticorps aux parois de la seringue.
      3. Réchauffer les animaux sous une lampe de chaleur pendant 3 minutes afin de dilater la veine caudale.
      4. Injecter la solution huA33-TCO dans la veine caudale de la souris portant des xénogreffes. 24h (ou un intervalle de temps prédéterminé différentes) permettant le huA33-TCO à s’accumuler dans la tumeur de la souris.
    2. Radioligands
      1. Radiolabel Tz-PEG7- DOTA tel qu’indiqué dans la Section 5.
      2. Dessiner des doses dans 150 μl de 0,9 % stérile saline contenant 1,1 équivalents molaires de Tz-PEG7- DOTA par rapport à la quantité de huA33-TCO administré. Par exemple, si 100 μg (0,67 nmol) de huA33-TCO a été injecté dans l’animal et le mélange de réaction [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz a été effectué avec une activité spécifique de 12,4 GBq/μmol, puis doses seront dessinés contenant 9,14 MBq d’activité chaque. Cela correspond à 0,74 nmol de Tz (1,1 EQ molaire par rapport au huA33-TCO).
      3. Réchauffer les animaux sous une lampe de chaleur pendant 3 min à se dilater la veine caudale.
      4. Injecter la dose du radioligand dans la veine de la queue de la souris portant des xénogreffes. Le montant de l’activité à doser est déterminé par le chercheur. Données publiées ont montré des effets thérapeutiques dose-dépendante sur la taille de la tumeur dans une fourchette de 7,4-55,5 MBq.
  3. Biodistribution
    1. Au point d’heure après l’administration du radioligand, euthanasier chaque cohorte de souris en utilisant un 2 % O2 / mélange de gaz de 6 % de CO2 .
      Remarque : Suivez les exigences institutionnelles concernant les méthodes d’euthanasie physique secondaire (p. ex., la dislocation cervicale).
    2. Pour chaque animal, retirer tous les organes d’intérêt, les laver dans un bain d’eau pour enlever tout excès sanguin et les faire sécher sur une serviette en papier en plein air pour orgue voir échantillon 5 min. dans l’ordre suggéré : sang, tumeur, coeur, poumons, foie, rate, estomac, intestin grêle , gros intestin, reins, muscles, OS, peau, queue.
    3. Une fois suffisamment sec, placez les organes dans des tubes à culture jetables pré-pesés. Peser les tubes remplis maintenant une fois de plus pour obtenir la masse de chaque organe ou tissu.
    4. Mesurer l’activité dans chacun des tubes à l’aide d’un compteur gamma. Calibrer l’activité mesurée dans le compteur gamma au détecteur utilisé pour mesurer la dose dessinée. Compter les normes radioactives de 177Lu sur chaque instrument et déterminer un facteur d’étalonnage pour l’interconversion entre l’activité et les chefs d’accusation par minute (cpm).
    5. Tracer les données de biodistribution comme un graphique à barres (voir Figure 5) avec la moyenne normalisée de capture pour chaque organe affichée avec une barre qui dénote un écart. Des différences significatives dans l’absorption entre groupes d’échantillons peuvent être évaluées par un test t non apparié, dans lequel la signification est atteint lorsque p < 0,05.
  4. Surveillance de la thérapie
    1. À l’aide d’étriers, mesurer le côté le plus long de la tumeur oblongue (longueur) ainsi que la largeur, qui est perpendiculaire à la longueur. Calculer le volume à l’aide de la formule pour le volume d’un ellipsoïde : πL· (4/3) W· H, ce qui se simplifie en ½L· W2, en supposant que la hauteur est égale à la largeur.
      Remarque : Il est également possible d’utiliser une ordinateur de poche tumeur appareil de mesure si l'on est disponible (voir Table des matières).
    2. Peser chaque souris sur une balance pour effectuer le suivi de poids ou perte de poids au fil du temps.
    3. Ce qui est important, surveiller l’apparence physique de chaque animal pour des signes de détresse, comme penché en arrière ou de la rupture des vaisseaux sanguins cutanés (ce qui peut indiquer une hématotoxicité).
      NOTE : Les mesures tumorales doivent être recueillis tous les jours 1-2 au cours de l’étude longitudinale de la thérapie.
    4. Tracer les données longitudinales traitement à l’étudient comme moyenne des volumes des tumeurs au fil du temps et normaliser à partir du volume de la tumeur si vous le souhaitez. Des différences statistiques capture le jour même entre groupes d’échantillons peuvent être évaluées par un test t non apparié, dans lequel la signification est atteint lorsque P < 0,05. Analyses statistiques plus poussées peuvent et devraient être effectuées tel que recommandé par un biostatisticien formé.

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Representative Results

La conjugaison du TCO à huA33 repose sur le couplage entre le TCO-NHS amine-réactive et les résidus de lysine sur la surface de l’immunoglobuline. Cette méthode est très fiable et reproductible et fiable donne un degré de-marquage de 2-4 TCO/mAb. Dans ce cas, la spectrométrie de masse MALDI-ToF a été utilisée pour confirmer un degré d’étiquetage d’environ 4,0 TCO/mAb ; une valeur similaire a été obtenue en utilisant un fluorophore modifiés tetrazine comme un journaliste24. La synthèse du ligand tetrazine s’effectue en trois étapes : (1) le couplage du Tz-NHS avec un linker de PEG mono-Boc-protégé (2) la déprotection de cet intermédiaire à rendement Tz-PEG7-NH2et (3) la formation d’un lien de la thiourée entre p- SCN-Bn-DOTA et Tz-PEG7-NH2. Cette procédure est relativement facile et Tz-PEG7- DOTA avec un rendement global de ~ 75 %. Chacun des intermédiaires a été caractérisé par le SGRH et 1H-RMN ; ces données sont présentées dans le tableau 1.

Passer à la radiolabeling, 177Lu3 + provient généralement des fournisseurs commerciaux comme un chlorure de sel [177Lu] LuCl3 à 0,5 M HCl. Le radiomarquage de Tz-PEG7- DOTA avec 177Lu céder le radioligand [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz est très simple : en seulement 20 min, la réaction est terminée, la production du produit désiré dans > 99 % radiochimique pureté, tel que déterminé par radio-technologique. En règle générale, aucune purification plus poussée n’est nécessaire avant la formulation. Une recension des écrits sur la base de Tz/TCO pretargeting suggère qu’un rapport molaire de Tz:mAb de ~ 1:1 produit le meilleur en vivo de données10. En conséquence, il n’est pas indispensable d’obtenir au radioligand dans la plus grande possible activité molaire. Par exemple, des expériences de biodistribution discuté ici employer [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz avec une activité molaire de ~ 12 GBq/µmol. Pour les études longitudinales de la thérapie, en revanche, [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz avec activité molaire supérieure était utilisé afin de faciliter l’administration de doses plus élevées de radioactivité sans modifier le nombre de moles injectés de tetrazine.

Que sera abordée plus loin dans la discussion, expériences de biodistribution sont d’une importance à appréhender et optimiser toute approche PRIT. Dans ce cas, la biodistribution des expériences ont été menées pour déterminer l’intervalle optimal entre l’administration de l’immunoconjugué et l’injection du radioligand. À cette fin, nous avons utilisé des souris nude athymique portant sous-cutanée A33 exprimant l’antigène SW1222 xénogreffes sur leur épaule droite. Ces animaux ont reçu 100 µg (0,67 nmol) de huA33-TCO 24, 48, 72 ou 120 h avant l’injection de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (9,14 MBq, 0,74 nmol). La figure 5 montre que tous les intervalles d’injection produisent des concentrations d’activité élevé dans le tissu de la tumeur, ainsi que les concentrations de faible activité dans les organes sains. L’intervalle d’injection 24h donne le taux de participation tumorale après l’injection 120 h : 21,2 ± 2.9%ID/g. Chaque ensemble de conditions produit également des rapports de concentration impressionnante activité de tumeur à grand-orgue. Pretargeting avec un intervalle de 24 heures, par exemple, les rendements des rapports tumeur à sang, tumeur-de-foie et tumeur-à-musculaire de 20 ± 5, ± 37 7 et 184 ± 30, respectivement, 120 h après l’administration du radioligand. Basé sur ces résultats, un intervalle de 24 heures a été choisi pour l’étude de thérapie longitudinales ultérieures (voir ci-dessous).

Pour l’étude de thérapie longitudinale en vivo , cohortes (n = 10) des souris nude athymique portant SW1222 sous-cutanée xénogreffes sur leur flanc droit ont été administrée huA33-TCO (100 ug, 0,67 nmol) 24 heures avant l’injection de [177Lu] Lu-DOTA-PEG 7- Tz. Trois différentes cohortes expérimentaux ont été employés, recevoir 18,7, 37 ou 55,5 MBq de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (correspondant à une activité molaire de 24, 45 et 70 GBq/µmol). En outre, deux cohortes de contrôle a reçu une moitié du schéma TRIOUX : soit huA33-TCO (100 ug, 0,67 nmol) sans [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz ou [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (55,5 MBq, 0,74 nmol) sans huA33-TCO. Voici les contrôles essentiels pour s’assurer que la réponse thérapeutique n’est pas provoquée par l’immunoconjugué ou radioligands seul. Les volumes des tumeurs ont été mesurées tous les 3 jours pour les trois premières semaines de l’étude et puis une fois par semaine jusqu'à la conclusion de l’expérience (70 jours, 10 demi-vies de 177Lu). Comme on le voit à la Figure 6, il y a une différence marquée dans la réponse de cohortes expérimentales comparée aux groupes témoins. Les tumeurs chez les souris ayant ne reçu qu’une seule composante de la stratégie de TRIOUX continuent à augmenter non contrôlé, les tumeurs des souris recevant le PRIT plein cesse de croître et se rétrécissement en fin de compte aux volumes bien inférieurs à ceux mesurés au début de l’étude. Ce qui est important, pas d’effets secondaires toxiques ont été observés, et tous les animaux ont maintenu un poids dans 20 % de leur masse initiale (Figure 7 a). Une parcelle de Kaplan-Meier des données fournit une visualisation encore plus frappante de l’étude : alors que toutes les souris dans les cohortes de contrôle ont dû être euthanasiés en quelques semaines, les souris des cohortes expérimentales avaient une fiche parfaite de survie à la fin de l’enquête ( Figure 7 b).

Figure 1
Figure 1 : schéma de la bande dessinée de pretargeted radio-immunothérapie basée sur la réaction de Diels-Alder la demande inverse d’électrons. Ce chiffre a été modifié par référence #28. Réimprimé (adapté) avec la permission de Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, b. M. Click-Mediated Pretargeted radio-immunothérapie du carcinome Colorectal. Pharmacie moléculaire. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : schéma de la construction du huA33-TCO. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : schéma de la synthèse de Tz-PEG7- DOTA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : (A) représentation schématique du radiomarquage de [ 177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz ; (B) représentant radio-technologique chromatogramme montrant la > 98 % de pureté radiochimique de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Biodistribution dans d’en vivo pretargeting avec huA33-TCO et [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz chez la souris nude athymique porteurs de tumeurs de cancer colorectal humain SW1222 sous-cutanée à l’aide de pretargeting intervalles de 48 (violet), 24 (vert) , 72 (orange), soit 120 heures (bleus). Données avec une erreur standard de cohortes de n = 4 ; L’analyse statistique a été réalisée par t-test d’un étudiant non apparié, **p < 0,01. Ce chiffre a été modifié par référence #28. Réimprimé (adapté) avec la permission de Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, b. M. Click-Mediated Pretargeted radio-immunothérapie du carcinome Colorectal. Pharmacie moléculaire. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : étude longitudinale de la thérapie de 5 groupes de souris (n = 10) roulement sous-cutanée SW1222 tumeurs représentées dans le volume tumoral moyen en fonction du temps (A) ; et volume tumoral normalisé au volume initial en fonction du temps (B). Les groupes témoins ont reçu l’immunoconjugué sans radioligand (bleu) ou au radioligand sans l’immunoconjugué (rouge). Le trois traitement groupes a reçu huA33-TCO (100 µg, 0,6 nmol) suivies 24 h plus tard soit 18,5 (vert), 37,0 (violet), soit 55,5 MBq (orange) (nmol ~0.8 dans chaque cas) de [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz. Test de Mantel-Haenzel (Mantel-Cox), la survie était significative (p < 0,0001) pour tous les groupes de traitement. Ce chiffre a été modifié par référence #28. Réimprimé (adapté) avec la permission de Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, b. M. Click-Mediated Pretargeted radio-immunothérapie du carcinome Colorectal. Pharmacie moléculaire. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : pour les animaux, les courbes de poids au cours de l’étude longitudinale de la thérapie de 5 groupes de souris (n = 10 chaque) la survie de Kaplan-Meier correspondante portant sous-cutanée SW1222 tumeurs (A) ; courbe b. Les groupes témoins ont reçu l’immunoconjugué sans radioligand (bleu) ou au radioligand sans l’immunoconjugué (rouge). Le trois traitement groupes a reçu huA33-TCO (100 µg, 0,6 nmol) suivies 24 h plus tard soit 18,5 (vert), 37,0 (violet), soit 55,5 MBq (orange) (nmol ~0.8 dans chaque cas) de [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz. Ce chiffre a été modifié par référence #28. Réimprimé (adapté) avec la permission de Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, b. M. Click-Mediated Pretargeted radio-immunothérapie du carcinome Colorectal. Pharmacie moléculaire. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Composé 1 Déplacements en H-RMN SGRH (ESI)
500 MHz, DMSO
TZ-PEG7- NHBoc 10.52 (s, 1H), 8,50 (m, 3H), 7.82 (t, 1H), 7,46 (d, 2H), 6.69 (t, 1H), 4.33 (d, 2H), 3.42 (m, 22H), 3,33 (t, 2H), 3.31 (t, 2H), 3.12 (q, 2H), 2,99 (q, 2H), 2.12 (t, 2H), 2.03 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,70 (q, 2H), 1,29 (s 9 H) m/z calculé. pour C35H57N7O11Na : 774.4005 ; trouvé : 774.4014.
TZ-PEG7-NH2 10.58 (s, 1H), 8,46 (m, 2H), 7,87 (t, 1H), 7,75 (d, 2H), 7.52 (d, 1H), 4,40 (d, 2H), 3,60-3.50 (m, 26H), 3,40 (t, 2H), 3.32 (bs, 2H), 3.20 (q, 2H), 2,99 (bs, 2H), 2.19 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,79 (q, 2H). m/z calculé. pour C30H50N7O9: 652.3670 ; trouvé : 652.3676.
TZ-PEG7- DOTA 10.57 (s, 1H), 9.63 (bs, 1H), 8,45 (m, 3H), 7,86 (m, 1H), 7,73 (bs, 1H), 7,54 (d, 2H), 7,41 (m, 2H), 7.19 (m, 2H), 6,54 (bs, 1H), 4,40 (d, 2H), 4.00-3.20 m (55H) 1,76 (q, 2.18 (t, H 3), 3,20 (q, 4H), 2.10 (t, H 3), 2.54 (s, 1H) 2 H). m/z calculé. pour C50H76N11O15s : 1202.56 ; trouvé : 1203.5741.

Table 1. Données de caractérisation pour les composés organiques décrits dans le présent protocole.

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Discussion

L’un des points forts de cette approche en vivo pretargeting — en particulier en ce qui concerne les stratégies fondées sur des anticorps bispécifiques et radiomarqué haptènes — est sa modularité : trans- cyclooctène fractions peuvent être ajoutées à n’importe quel anticorps, et tetrazine radioligands peut être radioactif avec une extraordinaire variété de radionucléides sans nuire à leur capacité à réagir avec leurs partenaires de clic. Pourtant, l’adaptation de cette approche à d’autre système d’anticorps/antigène n’est pas aussi simple que de dupliquer le protocole décrit ici. Bien sûr, toute tentative de créer une nouvelle immunoconjugué mAb-TCO ou un roman radioligand tetrazine-roulement devrait s’accompagner par les dosages appropriés caractérisation chimique et biologique, y compris les essais de stabilité et de réactivité. Mais au-delà de cela, il y a deux variables qui sont particulièrement importantes à explorer et à optimiser : (1) la masse de mAb-TCO immunoconjugué administré et (2) l’intervalle de temps entre l’injection de la mAb-TCO et l’administration du radioligand. Ces deux facteurs peuvent influencer considérablement le comportement in vivo du système pretargeting. Par exemple, l’utilisation de trop fortes doses immunoconjugué ou intervalle des périodes qui sont trop court peut entraîner des concentrations d’activité indésirable élevé dans le sang due à des réactions de clic entre les radioligands et immunoconjugué restant en circulation. À l’inverse, employant des masses des immunoconjugué qui sont trop faibles ou trop long intervalle peut réduire inutilement des concentrations d’activité dans la tumeur dû à une panne pour saturer l’antigène ou l’isomérisation inexorable (quoique lente) de la trans - cyclooctène à inactif cis- cyclooctène. Dans ce sens, réaliser des expériences de biodistribution en utilisant une gamme de masses d’immunoconjugué et pretargeting intervalles peut être extraordinairement utile. Bien sûr, il est également recommandé que des contrôles appropriés soient effectués en tandem avec les expériences in vivo . Ceux-ci incluent, mais ne se limitent pas à — expériences mettant en vedette des lignées cellulaires de négatifs, bloquant les cohortes qui reçoivent un vaste excédent des anticorps non conjuguée, l’administration du radioligand seul, l’injection du radioligand suite à un coût total de possession- manque immunoconjugué et in vivo pretargeting en utilisant un non spécifique, l’isotype contrôle TCO-roulement immunoconjugué.

Alternativement, des expériences d’imagerie peuvent être utilisés pour l’optimisation si la thérapeutique radionucléide émet positrons ou photons « imageables » ou si une isotopologue « imageables » du radionucléide thérapeutique est disponible. En fin de compte, les ensembles de variables qui offrent le meilleur équilibre des concentrations de forte activité tumorale et des ratios de concentration haute activité de tumeur-à-fond doivent être choisies pour études de thérapie longitudinales ultérieures. Dans le cas présenté ici, 100 µg de huA33-TCO a été injecté avec un intervalle de calculs de dosimétrie de 24 h. — notamment ceux qui permettent le calcul des doses de la tumeur et des rapports thérapeutiques — peuvent aussi être utiles pendant le processus d’optimisation.

Il est important de noter que même le prometteur [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz/huA33-TCO système qui a été mis au point pourrait bénéficier d’une optimisation supplémentaire. Une comparaison entre les données de dosimétrie de cette approche de Justine et RIT traditionnel avec une variante de Lu marqué 177de huA33 montre que la dose de tumeur de Justine est en deçà de celle du rit traditionnel. En outre, la dose efficace du système TRIOUX (0,054 mSv/MBq) est seulement légèrement inférieure à celle de RIT traditionnel (0,068 mSv/MBq).

Deux remèdes à ces questions sont actuellement à l’étude. Tout d’abord, un échafaudage dendritique développé capable d’augmenter le nombre de TCOs annexée à chaque anticorps30. Dans le contexte de l’imagerie PET pretargeted, cette approche considérablement augmente la concentration de l’activité tumorale, et des expériences analogues avec [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz sont en cours. Deuxièmement, l’utilisation d’agents de compensation tetrazine-roulement peut être utile dans le contexte de PRIT. L’administration d’agents avant l’injection du radioligand de compensation a été exploitée dans une variété de pretargeting méthodologies comme un moyen de diminuer la concentration de résidus immunoconjugué dans le sang et ainsi réduire les concentrations d’activité dans organes sains23,31. L’utilisation des agents de la société n’est pas sans ses inconvénients, cependant ; le plus notable qui augmente la complexité d’une modalité thérapeutique déjà certes compliquée. Néanmoins, les chercheurs au Memorial Sloan Kettering Cancer Center a récemment publié un intéressant reportage sur la création un dextran Tz-étiqueté agent de compensation des pretargeted PET d’imagerie et des données sur l’utilisation de cette construction en collaboration avec [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz et huA33-TCO sont prochain32. Une autre approche pour maximiser les avantages dosimétriques des TRIOUX est l’utilisation de radionucléides à courte demi-vie physique. Cela s’est avéré très efficace pour l’imagerie ; Cependant, les thérapeutiques radionucléides à courte demi-vie physique sont peu nombreuses et espacées.

Enfin, nous manquerais si nous n’avons pas à répondre de manière appropriée les limitations intrinsèques de pretargeting basée sur la réaction de Diels-Alder la demande inverse d’électrons. Le premier de ces problèmes est inhérent à toutes les approches in vivo pretargeting : l’anticorps utilisé ne peut pas être intériorisées lors de la liaison pour le tissu cible. Ceci, bien sûr, est essentiel, car l’anticorps doit rester accessible au radioligand plutôt que séquestré dans un compartiment intracellulaire. Cette limitation est certes difficile à contourner, bien qu’il a été démontré récemment que les anticorps avec lente à modérée des taux d’internalisation peut être utilisé pour in vivo pretargeting33,34. Deuxièmement, l’isomérisation lente in vivo du réactif trans -cyclooctène à inactif cis -cyclooctène a le potentiel pour limiter la longueur de l’intervalle entre l’administration de l’immunoconjugué TCO-roulement et la injection du radioligand. Critique, intervalles jusqu'à 120 h ont toujours fourni excellents résultats dans le contexte de ces deux pretargeted PET imaging et PRIT. Toutefois, l’utilisation de ces intervalles plus longs est presque toujours accompagnée de légères réductions des concentrations d’activité tumorale, un résultat qui peut découler de cette isomérisation. Afin de répondre à cette question, plusieurs laboratoires ont tenté de créer des trans- cyclooctènes plus stable sans compromettre la réactivité, tandis que d’autres ont essayé de développer des diénophiles entièrement nouveau capables de réagir avec tetrazine35 . Dans les années à venir, c’est notre espoir que cette évolution chimique va être mise à profit pour Justine.

En fin de compte, TRIOUX basé sur la ligature de Diels-Alder la demande inverse d’électrons est indéniablement une technologie émergente et quelque peu immature. Cependant, nous sommes néanmoins encouragés par les résultats précliniques, nous avons obtenu et exhalté la promesse clinique de cette stratégie. Nous espérons sincèrement que ce protocole encourage les autres à explorer et optimiser cette approche et alimenter ainsi son voyage du laboratoire à la clinique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Dr Jacob Houghton pour les conversations utiles. Les auteurs tiens également à remercier le NIH pour leur généreuse contribution (R00CA178205 et U01CA221046).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

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Chimie numéro 143 immunothérapie pretargeted radio-immunothérapie pretargeting réaction de Diels-Alder la demande inverse d’électrons tetrazine trans- cyclooctène huA33 antigène A33 lutécium-177
Pretargeted radio-immunothérapie basée sur la réaction de Diels-Alder demande Inverse d’électrons
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Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis, B. M. Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (143), e59041, doi:10.3791/59041 (2019).

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