Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Pretargeted Radioimmunotherapy baseret på Inverse elektron efterspørgsel Diels-elletræ reaktion

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

Denne protokol beskriver syntese og karakterisering af en trans- cyclooctene (TCO)-modificeret antistof og en 177Lu-mærket tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (ANNS). Derudover detaljer det brugen af disse to konstruktioner til i vivo biodistribution og langsgående terapi undersøgelser i en murine model af kolorektal cancer.

Abstract

Mens radioimmunotherapy (RIT) er en lovende metode til behandling af kræft, kan den lange farmakokinetiske half-life af radiolabeled antistoffer resultere i høje strålingsdoser til sundt væv. Måske ikke overraskende, er flere forskellige strategier blevet udviklet for at omgå denne bekymrende begrænsning. En af de mest lovende af disse tilgange er pretargeted radioimmunotherapy (ANNS). CONNIES er baseret på afkobling radionuklid fra immunoglobulin, indsprøjte dem separat, og derefter giver dem mulighed for at kombinere i vivo på målvæv. Denne tilgang udnytter de ekstraordinære tumor-targeting egenskaber af antistoffer mens fodpaneler deres farmakokinetiske ulemper, derved sænke stråledoser til ikke-målarter væv og lette anvendelsen af radionuklider med halveringstider, der er anses for kort til brug i traditionelle radioimmunoconjugates. I de sidste fem år, har vores laboratorium og andre udviklet en tilgang til i vivo pretargeting baseret på inverse elektron-demand Diels-elletræ (IEDDA) reaktion mellem trans- cyclooctene (TCO) og tetrazine (Tz). Denne strategi har været anvendt med succes til pretargeted positron emission tomografi (PET) og single photon emission computertomografi (SPECT), imaging med en række forskellige antigen-antistof systemer. I et par af de seneste publikationer, har vi vist effekten af IEDDA-baseret ANNS i murine modeller af pancreas duktalt adenokarcinom og colorectal karcinom. I denne protokol, vi beskriver protokoller for ANNS ved hjælp af en 177Lu-DOTA-mærket tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz) og en TCO-modificeret variant af kolorektal kræft målretning huA33 antistof (huA33-TCO). Mere specifikt vil vi beskrive opbygningen af huA33-TCO, syntese og radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz, og ydeevne i vivo biodistribution og langsgående terapi undersøgelser i murine modeller af Colorectal karcinom.

Introduction

Radioimmunotherapy (RIT) — anvendelse af antistoffer til levering af terapeutiske radionuklider til tumorer – har længe været en lokkende tilgang til behandling af kræft1,2. Ja, dette løfte er blevet understreget af USA 's Food and Drug Administration godkendelse af to radioimmunoconjugates til behandling af Non-Hodgkins lymfom: 90Y-ibritumomab tiuxetan og 131-tositumomab3 , 4. men selv fra sine tidligste dage, kliniske udsigterne til RIT har været hæmmet af en kritisk komplikation: høj stråling dosishastigheder til sundt væv5,6. Generelt er radioimmunoconjugates til RIT er mærket med langlivede radionuklider (f.eks. 131jeg [t½ = 8,0 dage] og 90Y [t½ = 2,7 dage]) med fysiske halveringstid, som harmonerer godt med den længe farmakokinetiske halveringstid af immunoglobuliner. Det er afgørende, da det sikrer, at tilstrækkelige radioaktivitet er stadig når antistoffet har nået sin optimale biodistribution efter flere dage af omsætning. Men denne kombination af lang opholdstid i blod og længe fysiske halveringstid uundgåeligt resultater i bestråling af sunde væv, dermed reducere terapeutiske nøgletal og begrænse effekten af terapi7. Flere strategier har været undersøgt for at omgå dette problem, herunder afkortede antistof fragmenter såsom Fab, Fab', F(ab')2, minibodies og nanobodies8,9,10. En af de mest lovende og fascinerende, men unægtelig komplekse, alternative tilgange er i vivo pretargeting11.

In vivo pretargeting er en tilgang til nukleare billeddannelse og terapi, der søger at udnytte den udsøgte affinitet og selektivitet af antistoffer mens fodpaneler deres farmakokinetiske ulemper11,12,13. Med henblik herpå, den radiolabeled antistof anvendes i traditionelle radioimmunotherapy er dekonstrueret i to komponenter: en lille molekyle radioligand og en immunoconjugate, der kan binde både en tumor antigen og de ovennævnte radioligand. Immunoconjugate er indsprøjtet først og givet en 'head start', ofte i flere dage, hvor det ophobes i målvæv og rydder fra blodet. Efterfølgende, den lille molekyle radioligand administreres og kombinerer med immunoconjugate på tumor eller hurtigt rydder fra kroppen. I det væsentlige, i vivo pretargeting er afhængig af udfører radiokemi inden kroppen selv. Ved at reducere udbredelsen af radioaktivitet, denne tilgang samtidig reducerer stråledoser til sunde væv og letter brugen af radionuklider (f.eks. 68Ga, t½ = 68 min.211; Som t½ = 7,2 h) med halveringstider der er typisk betragtes som uforenelig med antistof-baserede vektorer.

Starter i slutningen af 1980 ' erne, en håndfuld forskellige tilgange til i vivo pretargeting er blevet udviklet, herunder strategier baseret på bispecific antistoffer, samspillet mellem streptavidin og biotin, og hybridisering af supplerende oligonukleotider14,15,16,17,18. Endnu har hver været holdt tilbage til varierende grader af komplikationer, mest berømt den potente immunogenicitet af streptavidin-ændret antistoffer19,20. I de sidste fem år, har vores gruppe og andre udviklet en tilgang til i vivo pretargeting baseret på den hurtige og bioorthogonal inverse elektron efterspørgsel Diels-elletræ ligatur mellem trans- cyclooctene (TCO) og tetrazine (Tz) 21,22,23,24. Den mest succesfulde af disse strategier har ansat en TCO-modificerede antistof og et Tz-bærende radioligand, som samlede ejeromkostninger er typisk mere stabil i vivo end dens Tz partner (figur 1)25,26. Som i andre pretargeting metoder, er mAb-TCO immunoconjugate administreres først og have tid til at rydde ud af cirkulation og ophobes i tumor væv. Derefter sprøjtes lille molekyle Tz radioligand, hvorefter det enten klikker med immunoconjugate i målvæv eller rydder hurtigt fra kroppen. Denne i vivo pretargeting strategien har vist sig meget effektiv til PET og SPECT imaging med flere forskellige antistof/antigen systemer, konsekvent producerer billeder med høj kontrast og at brugen af kortvarig radionuklider som 18 F (t½ = 109 min) og 64Cu (t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Mere nylig, effekten af klik-baseret pretargeted radioimmunotherapy (ANNS) er blevet påvist i murine modeller af pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) og colorectal karcinom27,28. Til dette formål, terapeutiske radionuklid 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 dage) var ansat i forbindelse med to forskellige antistoffer: 5B1, som er rettet mod kulhydrater antigen 19,9 (CA19.9) allestedsnærværende udtrykt i PDAC , og huA33, som er rettet mod A33, en transmembrane glycoprotein udtrykt i > 95% af tyktarms-og endetarmskræft. I begge tilfælde, denne tilgang til 177Lu-ANNS givet høj aktivitetskoncentrationer i tumor væv, lavet en dosisafhængig terapeutisk virkning, og samtidig reduceret aktivitetskoncentrationer i sundt væv sammenlignet med traditionelle direkte-mærket radioimmunoconjugates.

I denne artikel vil vi beskrive protokoller for ANNS ved hjælp af en 177Lu-DOTA-mærket tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz) og en TCO-modificeret variant af huA33 antistof (huA33-TCO). Mere specifikt, vi beskrive opbygningen af huA33-TCO (figur 2), syntese og radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz (figur 3 og figur 4), og udførelsen af in vivo Biodistribution og langsgående terapi undersøgelser i murine modeller af colorectal karcinom. Endvidere i de repræsentative resultater og diskussion, vi præsentere en eksempeldatasæt, adresse mulige strategier for optimering af denne tilgang, og overveje denne strategi i en bredere kontekst i vivo pretargeting og CONNIES. Endelig er det vigtigt at bemærke, at mens vi har valgt at fokusere på pretargeting ved hjælp af huA33-TCO og [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz i denne protokol, denne strategi er yderst modulopbygget og kan tilpasses til en bred vifte af antistoffer og radionuklider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle i vivo dyreforsøg beskrevet i dette arbejde blev udført efter godkendte protokoller og henrettet under de etiske retningslinjer Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center og Hunter College Institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC).

1. forberedelse af huA33-TCO

Bemærk: Syntese af huA33-TCO har været tidligere rapporteret29. Men for at lette læseren, er den replikeret her med justeringer for optimale betingelser.

  1. I en 1,7 mL microcentrifuge tube, forberede en 125 μl opløsning af (E) - cyclooct - 4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl karbonat (TCO-NHS) i tørre dimethyl formamid (DMF) ved en koncentration på 40 mg/mL (0,15 M). Denne løsning kan være aliquoted og frosne ved-80 ° C til brug i fremtidige eksperimenter.
  2. I en separat 1,7 mL microcentrifuge tube, forberede en 5 mg/mL opløsning af huA33 i 1 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS; 2,7 mM kaliumchlorid, 137 mM natriumchlorid og 11,9 mM kalium fosfat, pH 7,4).
  3. Ved hjælp af små prøver (< 5 μl) 0,1 M Na2CO3, Juster pH-værdien af antistof løsningen fra trin 1.2 8,8-9.0. Brug enten pH papir eller et pH-meter med en mikroelektrode til at kontrollere pH og udvise omhu at pH-værdien ikke overstiger 9.0.
  4. Til antistof løsningen er beskrevet i trin 1.3, tilsættes langsomt et volumen svarende til 40 kindtand ækvivalenter af TCO-NHS i forhold til mængden af antistof. For eksempel, hvis 5 mg (30 nmol) af huA33 i opløsningen, tilføje 9.0 μL (1,20 μmol) 40 mg/mL (0,15 M)-opløsning af TCO-NHS.
    Bemærk: TCO-NHS er hydrofobe. Når du tilføjer det til løsningen af antistof, tilføje det langsomt og med agitation mod nedbør. Ikke overstiger 10% DMF volumen i den sidste reaktion løsning.
  5. Tillad reaktion på inkuberes ved 25 ° C på en thermomixer for 1 h med mild uro (500 rpm).
  6. Efter 1 time, rense huA33-TCO immunoconjugate ved hjælp af en færdigpakket engangs størrelse udstødelse udvanding kolonne.
    1. Blandingen henstår kolonnen størrelse udelukkelse, som beskrevet af leverandøren til at fjerne enhver konserveringsmidler findes i kolonnen under opbevaring. En typisk procedure indebærer vask kolonnen 5 x med et volumen på PBS, der svarer til mængden af kolonnen: 5 x 2,5 mL PBS.
    2. Tilføje reaktionsblandingen til kolonnen størrelse udstødelse noterer sig omfanget af reaktionsblandingen.
    3. Efter reaktionsblandingen er trådt kolonnen, tilføje en passende mængde af PBS til at bringe den samlede mængde af løsningen føjes til kolonnen op til 2,5 mL. Hvis konjugation reaktion resulterede i en samlet maengde paa 1,3 mL, skal du tilføje 1,2 mL yderligere PBS til kolonnen.
    4. Indsamle den fabrikat benytter 2 mL PBS, som af elueringsvæsken.
      Bemærk: Dette trin vil give den endelige konstruktion huA33-TCO i 2 mL PBS, pH 7,4.
  7. Mål koncentrationen af huA33-TCO ved hjælp af en UV-Vis Spektrofotometer overvågning 280 nm bølgelængde. Molær ekstinktion koefficienten for de fleste IgGs (ε280) er 210.000 M-1cm-1.
  8. Hvis en løsning med en højere koncentration af immunoconjugate ønskes, koncentrere huA33-TCO løsning ved hjælp af en centrifugal filterenhed med 50.000 molekylvægt afskæring efter producentens anvisninger.
    Bemærk: Mange antistoffer har været kendt for at sammenlægge eller bundfald under koncentration. Når du forsøger denne procedure med et nyt antistof, bør forskere udsætte til litteraturen eller deres egen erfaring med håndtering af det pågældende antistof.
  9. Gemme den færdige huA33-TCO immunoconjugate ved 4 ° C i mørke, hvis det er nødvendigt straks. Hvis det skal bruges mere end 4 dage i fremtiden, opbevares ved-80 ° C i mørke.
    Bemærk: Dette er en acceptabel standsested i proceduren. Den færdige huA33-TCO immunoconjugate bør være stabil i mindst 6 måneder opbevaring ved-80 ° C i mørke.

2. syntese af Tz-PIND7- NHBoc

  1. 5 mg af tetrazine N- hydroxysuccinimidyl ester (Tz-NHS; 12,6 μmol) i 0,15 mL af vandfri dimethylsulfoxid (DMSO) opløses i en 1,7 mL microcentrifuge tube.
  2. I en separat 1,7 mL microcentrifuge rør, 8 mg af den Boc-beskyttet amino PIND polymer, O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) i 0,15 mL af vandfri DMSO opløses.
  3. Til løsning af Tz-NHS, tilsættes 3 μL (21,3 μmol, 1,7 kindtand ækvivalenter) triethylamin (te) og blandes grundigt.
  4. Tilføje pink tetrazine løsning til NHBoc-PIND7-NH2 løsning fra trin 2.2 og inkuberes reaktionsblandingen i 30 min. ved stuetemperatur (RT) med mild agitation.
  5. Efter 30 minutter, fortyndes reaktion 1:1 i H2O og rense reaktion med omvendt fase C18 high-performance væskekromatografi (HPLC) til at adskille enhver ureageret Tz-NHS fra Tz-PIND7- NHBoc. Bruge opløsningsmidler uden syre til at forhindre for tidlig fjernelse af Boc beskytte gruppe. Overvåge både Tz-PIND7- NHBoc og Tz-NHS ved en bølgelængde på 525 nm.
    Bemærk: Retentionstiderne er naturligvis meget afhængige af HPLC-udstyr af hvert laboratorium (pumper, søjler, rør, osv.), og passende kontrol bør køres før rensning. Men at præsentere et eksempel, hvis et forløb af 5:95 MeCN/H2O (begge uden nogen tilsætningsstof) til 95:5 MeCN/H2O over 30 min, en gennemstrømningshastighed på 1 mL/min og en analytisk 4,6 mm x 250 mm C18kolonne bruges , retentionstider af Tz-NHS og Tz-PIND7- NHBoc er omkring 16 min. og 18 min, henholdsvis.
  6. Fryse de indsamlede HPLC elueringsvæsken ved hjælp af flydende nitrogen og wrap nu-frosne collection tube i aluminiumsfolie. Sted den frosne collection tube på en lyophilizer natten til at fjerne HPLC Mobil fase. Produktet vil være en karakteristisk lyse pink solid.
    Bemærk: Hvis flydende nitrogen ikke er tilgængelig, fryse de indsamlede HPLC elueringsvæsken i tøris eller natten over i en-80 ° C fryser.

3. syntesen af Tz-PIND7-NH2

  1. Produkt fra trin 2.6, Tz-PIND7- NHBoc, der tilsættes 1,5 mL dichlormethan (DCM) og denne opløsning overføres til en lille runde-bunden kolbe.
  2. Tilføje 0,25 mL trifluoreddikesyre (TFA) dråbevis til opløsningen pink fra trin 3.1.
  3. Tillad reaktion på Inkubér i 30 min. ved RT med mild agitation.
  4. Efter 30 min, fordampe opløsningsmidler via roterende fordampning. Overskrid ikke et vand bad temperatur på 37 ° C.
  5. Rekonstruere den lyserøde tyktflydende produkt i 0,5 mL vand.
  6. Rense produktet Adskil Tz-PIND7-NH2 fra Boc-beskyttet forløber med omvendt fase C18 HPLC. Overvåge både Tz-PIND7- NHBoc og Tz-PIND7-NH2 ved en bølgelængde på 525 nm.
    Bemærk: Retentionstiderne er naturligvis meget afhængige af HPLC-udstyr af hvert laboratorium (pumper, søjler, rør, osv.), og passende kontrol bør køres før rensning. Men at præsentere et eksempel, hvis et forløb af 5:95 MeCN/H2O (begge med 0,1% TFA) til 95:5 MeCN/H2O over 30 min, en gennemstrømningshastighed på 1 mL/min og en analytisk 4,6 mm x 250 mm C18kolonne bruges , retentionstiderne Tz-PIND7- NHBoc og Tz-PIND7-NH2 er ca 18 min og 13 min, henholdsvis.
  7. Fryse de indsamlede HPLC elueringsvæsken ved hjælp af flydende nitrogen og wrap nu-frosne collection tube i aluminiumsfolie. Sted den frosne collection tube på en lyophilizer natten til at fjerne HPLC Mobil fase. Produktet vil være en lyse pink solid.
  8. Rekonstruere produkt fra trin 3.7, Tz-PIND7-NH2, med 150 μl DMSO og overførsel til en 1,7 mL microcentrifuge tube.
  9. Mål koncentrationen af Tz-PIND7-NH2 ved hjælp af en UV-Vis Spektrofotometer overvågning 525 nm bølgelængde. Molær ekstinktion koefficient for Tz-PIND7-NH2 (ε525) er 535 M-1cm-1.

4. syntese af Tz-PIND7- DOTA

  1. Opløse Tz-PIND7-NH2 (4,5 mg, 6,9 μmol) i 0,15 mL af DMSO (eller bare fortsætte med den løsning, der er oprettet i trin 3.8).
  2. Tilføje 22 kindtand ækvivalenter te (21 μL, 0,15 mmol) til den tetrazine-holdige løsning fra trin 4.1.
  3. Tilføje 10 mg (14.2 μmol) af p- SCN-Bn-DOTA som en solid og vortex løsning for ca 2 min, eller indtil materialet er helt opløst.
  4. Tillad reaktion på Inkubér i 30 min. ved RT med mild agitation.
  5. Efter 30 min, fortyndes reaktion 1:1 i H2O og rense den fabrikat benytter omvendt fase C18 HPLC fjerne ureageret p- SCN-Bn-DOTA. P- SCN-Bn-DOTA kan overvåges ved en bølgelængde på 254 nm, mens Tz-PIND7- DOTA overvåges bedst ved en bølgelængde på 525 nm.
    Bemærk: Retentionstiderne er naturligvis meget afhængige af HPLC-udstyr af hvert laboratorium (pumper, søjler, rør, osv.), og passende kontrol bør køres før rensning. Men at præsentere et eksempel, hvis et forløb af 5:95 MeCN/H2O (begge med 0,1% TFA) til 95:5 MeCN/H2O over 30 min og en analytisk 4.6 x 250 mm C18kolonne bruges, Tz-PIND7- DOTA og p-SCN-Bn-DOTA har retentionstider af omkring 15,6 min og 16,1 min, henholdsvis.
  6. Fryse de indsamlede HPLC elueringsvæsken ved hjælp af flydende nitrogen og wrap nu-frosne collection tube i aluminiumsfolie. Sted den frosne collection tube på en lyophilizer natten til at fjerne HPLC Mobil fase. Produktet vil være en lyse pink pulver.
  7. Rekonstruere produkt i 0,15 mL af DMSO og måle koncentrationen ved hjælp af en UV-Vis Spektrofotometer overvågning 525 nm bølgelængde. Molær ekstinktion koefficient for Tz-PIND7- DOTA (ε525) er 535 M-1cm-1.
  8. Analysere den endelige sammensatte ved Kernemagnetisk resonans (NMR) og høj opløsning massespektrometri (HRMS) at kontrollere, at syntesen var vellykket. Se tabel 1 for eksperimentelt bestemte kemiske Skift og Molekylær vægt af alle de forbindelser, der er drøftet i dette arbejde.
  9. Gemme den rensede Tz-PIND7- DOTA løsning i mørke ved-80 ° C.
    Bemærk: Dette er en acceptabel standsested i proceduren. Den udfyldte Tz-PIND7- DOTA forløber er stabil i mindst 1 år på disse betingelser.

5. 177Lu Radiolabeling af Tz-PIND7- DOTA

Forsigtig: Dette trin i protokollen indebærer håndtering og manipulation af radioaktivitet. Før du udfører disse trin — eller udføre andet arbejde med radioaktivitet — forskere bør rådføre sig med deres hjem-institution stråling sikkerhed afdeling. Tage alle mulige skridt til at minimere eksponering for ioniserende stråling.

Bemærk: Når du arbejder med små mængder af radiometals anbefales det, at alle buffere være fri for spor metaller til at forhindre indblanding i koordinering site bindende.

  1. I et 1,7 mL centrifugeglas, tilføje 200 μl af 0,25 M ammonium acetat buffer justeret med delprøver af 1 M HCl pH 5,5.
    Bemærk: Hvis du bruger mindre end 370 MBq af aktivitet for mærkning, mængden af buffer, der bruges bør reduceres til 100 µL.
  2. Tilføj den ønskede mængde af [177Lu] LuCl3 til stødpudeopløsning. Den tilsatte mængde vil være afhængig af antallet af emner i eksperimentet og de radioaktive doser. Det anbefales, at 1-2 ekstra doser værd af radioaktivitet tilføjes som en forholdsregel at kompensere for det potentielle tab af radioaktivitet under rensning trin.
  3. Tilføje Tz-PIND7- DOTA i DMSO til radioaktivt blandingen i trin 5.2. Mængden af Tz-PIND7- DOTA er afhængig af antallet af emner, der bliver testet. Flere detaljer om dette emne kan findes i trin 6.2.2.2.
  4. Tillade løsning til inkuberes ved 37 ° C i 20 min.
  5. Kontroller, at radiolabeling er fuldført, ved hjælp af radio instant tyndtlagskromatografi (radio-iTLC) med 50 mM EDTA, pH 5,5 som den mobile fase. Den hedder [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz forbliver på oprindeligt — Rf = 0 — mens gratis [177Lu] Lu3 + vil blive koordineret af EDTA og vil rejse med væskefronten, Rasmussenf = 1,0 (figur 3B).
  6. Hvis kvantitative mærkning ikke er opnået, tilføje yderligere ligand for at koordinere den frie radiometal. Alternativt, rense den mærket [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz ved hjælp af en C18 patron. Følg producentens anvisninger for brugen. Et eksempel på en procedure er nedenfor.
    1. Prime patronen af langsomt passerer gennem 5 mL ethanol gennem patronen med en stor sprøjte. Derefter passere gennem 5 mL acetonitril og derefter 5 mL deioniseret vand (DI) H2O.
    2. Udarbejde radioligand løsning fra trin 5.3 i en mindre sprøjte og injicere det langsomt ind på C18 patron. Derefter ubundet vask patron med 10 mL af DI H2O fjerne et [177Lu] LuCl3.
    3. Elueres med 500 µL af ethanol. Fjern eventuelle ethanol fra det endelige produkt af passerer over fartøj med en lav gennemstrømningshastighed på tør nitrogen eller argon for 10-15 min. Efterfølgende resuspend radioligand i saltvand i et volumen bestemmes i trin 6.2.2.2.

6. in vivo undersøgelser

Forsigtig: Som i sektion 5, i dette trin i protokollen indebærer håndtering og manipulation af radioaktivitet. Før du udfører disse trin, bør forskere konsultere med deres hjem-institution stråling sikkerhed afdeling. Tage alle mulige skridt til at minimere eksponering for ioniserende stråling.

  1. Forberedelse af dyr
    1. I kvindelige athymiske nøgen mus, subkutant implantat 5 x 106 SW1222 kolorektal cancerceller suspenderet i 150 μl af en 1:1 blanding af celle medier og matrix (fx., Matrigel) og tillade disse at vokse ind i en 100-150 mm3 xenograft (14-18 dage efter podning).
    2. Sortering af dyr til en biodistribution eksperiment
      1. Når tumorer er af tilstrækkelig størrelse som fastsat af caliper måling, sortere dyr for at sikre, at hver studerende har cirka den samme gennemsnitlige tumor volumen. Dyrene kan skelnes i hvert bur på markeringer på halen med uudsletteligt blæk (et band, to bands, osv.).
    3. Sortering af dyr til en langsgående terapi undersøgelse
      1. Når tumorer er af tilstrækkelig størrelse som fastsat af caliper måling, lægger øremærker til hver af dyr til at sikre korrekt sporing under hele forsøget.
        Bemærk: Numeriske øremærker kan falde under hele forsøget. Som et resultat, anbefales det at ledsage disse fysiske tags med øre hak systematisk (dvs., højre, venstre, bilaterale, højre x 2, venstre x 2).
      2. Sortere dyrene, så den gennemsnitlige tumor volumen i hver kohorte er nogenlunde lige. Følgende metode til sortering af dyr kan udføres ved hjælp af et regnearksprogram.
        1. Liste over dyrenes identifikationsnumre, øre notch mønster og tumor volumen i tre separate kolonner.
        2. Sortere data fra mindste til største tumor volumen.
        3. I en fjerde kolonne, tildele hvert dyr en bur antallet og cycle gennem bure i en slangelignende mønster. For eksempel, hvis der er 5 bure, denne kolonne ville være fyldt "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." indtil alle dyr er tildelt et bur.
        4. Når burene er tildelt, sortere data efter bur antallet. Hvis øre hak bruges, sikre, at hvert dyr i en given bur har en unik øre notch mønster. Hvis der er dubletter (to eller flere af de samme mønster) i en given bur, har swap en mus med en fra en anden bur med den manglende mønster indtil hvert bur dyr med unikke øre notch mønstre.
  2. Formuleringer og injektioner
    Bemærk: Rækkefølgen af injektion for både biodistribution og terapi undersøgelse fortsætter som følger: huA33-TCO sprøjtes først, efterfulgt af [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz efter et forudbestemt interval.
    1. Immunoconjugate
      1. Fortynde en alikvot del af huA33-TCO-løsning fra trin 1,9 til en koncentration på 0,8 mg/mL i 0,9% sterilt saltvand.
      2. Tegne doser af 150 µL (100 µg) af huA33-TCO løsning i sprøjter forbehandlet med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS og gemme disse sprøjter på is.
        Bemærk: BSA behandling reducerer ikke-specifik binding af antistof mod væggene i sprøjten.
      3. Varm dyr under en varmelampe i 3 minutter til at spile hale vene.
      4. Tilføre den hale vene xenograft-bærende mus huA33-TCO-løsning. Tillad 24 h (eller en anden forudbestemte gang interval) for huA33-TCO ophobes i tumor af musen.
    2. Radioligand
      1. Radiolabel Tz-PIND7- DOTA som beskrevet i afsnit 5.
      2. Tegne doser i 150 μl af 0,9% sterilt saltvand, der indeholder 1.1 kindtand ækvivalenter af Tz-PIND7- DOTA i forhold til mængden af huA33-TCO administreres. Som et eksempel, hvis 100 μg (0,67 nmol) af huA33-TCO blev sprøjtet ind i dyret og [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz reaktionsblandingen foregik med en specifik aktivitet på 12,4 GBq/μmol, trækkes derefter doser der indeholder 9.14 MBq af aktivitet hver. Dette svarer til 0,74 nmol af Tz (1,1 kindtand eq. slægtning til huA33-TCO).
      3. Varm dyr under en varmelampe i 3 min. til at spile hale vene.
      4. Tilføre den hale vene xenograft-bærende mus dosis af radioligand. Mængden af aktivitet skal injiceres bestemmes af forskeren. Offentliggjorte data har vist dosisafhængig terapeutiske virkninger på tumorstørrelse inden for en række 7,4-55,5 MBq.
  3. Biodistribution
    1. For den ønskede tidspunkt efter indgift af radioligand, aflive hver kohorte af mus ved hjælp af en 2% O2 / 6% CO2 gas blandingen.
      Bemærk: Følg nogen institutionelle krav vedrørende metoder til sekundære fysiske eutanasi (fx, cervikal dislokation).
    2. For hvert dyr, fjerne alle organer af interesse, vask dem i et vandbad til at fjerne eventuelle overskydende blod og tør dem på et stykke køkkenrulle i åben luft i 5 min. prøve orgel liste i foreslåede rækkefølge: blod, tumor, hjerte, lunger, lever, milt, mave, tyndtarmen , tyktarmen, nyrerne, muskler, knogler, hud, hale.
    3. Når tilstrækkeligt tørret, placere organer i pre vejes engangs kultur rør. Veje nu-fyldt rør igen for at få massen af hvert organ eller væv.
    4. Måle aktivitet i hvert af rørene ved hjælp en gamma-counter. Kalibrere den målte aktivitet i tælleren gamma til detektoren bruges til at måle den udtrukne dosis. Tælle radioaktive standarder 177Lu på hvert instrument og bestemme en kalibreringsfaktor for energifremtid mellem aktivitet og tæller pr. minut (cpm).
    5. Plot biodistribution data som et søjlediagram (Se figur 5) med middelværdi normaliseres optagelsen for hver orgel vises sammen med en bar betegner én standardafvigelse. Statistiske forskelle i optagelsen mellem prøve grupper kan blive vurderet af en uparret t-test, hvori betydningen opnås når p < 0,05.
  4. Terapi overvågning
    1. Bruger calipre, mål den længste side af de aflange tumor (længde) samt den bredde, der er vinkelret i forhold til længden. Beregning af volumen ved hjælp af formlen for omfanget af en ellipseformet: (4/3) πL· W· H, hvilket forenkler til ½L· W2, forudsat at højden er ca svarende til bredden.
      Bemærk: Det er også muligt at bruge en håndholdt tumor måleapparat, hvis man er tilgængelige (Se Tabel af materialer).
    2. Veje hver mus på en balance til at spore vægtøgning eller vægttab over tid.
    3. Vigtigere, overvåge hvert enkelt dyr fysiske udseende for tegn på angst, såsom krum tilbage eller bristet kutane blodkar (som kan indikere haematotoxicity).
      Bemærk: Tumor målinger bør indsamles hver 1-2 dage i løbet af den langsgående terapi undersøgelse.
    4. Plot data fra den langsgående terapi studere som gennemsnitlige tumor mængder over tid og normalisere at starte tumor volumen, hvis det ønskes. Statistiske forskelle i optagelse på samme dag mellem prøve grupper kan blive vurderet af en uparret t-test, hvori betydningen opnås når P < 0,05. Mere omfattende statistiske analyser kan og bør udføres som anbefalet af en uddannet biostatistician.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Konjugation af TCO til huA33 er baseret på kobling mellem Amin-reaktiv TCO-NHS og lysin rester på overfladen af immunglobulin. Denne metode er meget robust og reproducerbare og giver pålideligt en grad af-mærkning af 2-4 TCO/mAb. I dette tilfælde var MALDI-ToF-massespektrometri ansat til at bekræfte en grad af mærkning af ca 4.0 TCO/mAb; en lignende værdi er opnået ved hjælp af en fluorophore-modificerede tetrazine som en reporter24. Syntesen af tetrazine liganden udføres i tre trin: (1) koblingen af Tz-NHS til en mono-Boc-beskyttet PEG linker, (2) deprotection af dette mellemliggende til udbytte Tz-PIND7-NH2og (3) dannelsen af en thiourinstof kobling mellem p- SCN-Bn-DOTA og Tz-PIND7-NH2. Denne procedure er relativt letkøbt og Tz-PIND7- DOTA i et samlet udbytte på ~ 75%. Hver af mellemprodukter har været præget af HRMS og 1H-NMR; disse data er præsenteret i tabel 1.

Går videre til den radiolabeling, er 177Lu3 + typisk fremstillet af kommercielle leverandører som en chlorid salt [177Lu] LuCl3 i 0,5 M HCl. Radiolabeling Tz-PIND7- DOTA med 177Lu at give radioligand [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz er meget ligetil: i bare 20 min, reaktionen er færdig, producerer den ønskede vare i > 99% radiokemiske renhed som fastsat af radio-iTLC. Typisk er ingen yderligere rensning nødvendig, inden formulering. En undersøgelse af litteraturen om Tz/TCO-baseret pretargeting tyder på, at Tz:mAb kindtand forholdet ~ 1:1 producerer den bedste in vivo data10. Som et resultat, er det ikke nødvendigt at opnå radioligand i den højeste mulige molar aktivitet. For eksempel, biodistribution eksperimenter drøftet her ansætte [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz med en molar aktivitet på ~ 12 GBq/µmol. For langsgående terapi undersøgelser, derimod [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz med højere molar aktivitet blev brugt for at lette administrationen af større doser af radioaktivitet uden at ændre antallet af injicerede modermærker af tetrazine.

Som vil blive behandlet yderligere i diskussionen, biodistribution eksperimenter er af afgørende betydning at forstå og optimere enhver tilgang til ANNS. I dette tilfælde blev biodistribution eksperimenter udført for at bestemme den optimale tidsinterval mellem forvaltningen af immunoconjugate og tilførsel af radioligand. Til dette formål ansat vi athymiske nøgen mus forsynet med subkutan A33 antigen-udtrykker SW1222 xenografts på deres højre skulder. Disse dyr har modtaget 100 µg (0,67 nmol) af huA33-TCO 24, 48, 72 eller 120 h før injektion af [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz (9.14 MBq, 0,74 nmol). Figur 5 viser, at alle injektion intervaller producere høj aktivitetskoncentrationer i tumor væv samt lav aktivitetskoncentrationer i raske organer. 24 h injektion interval giver den højeste tumorsygdomme optagelse på 120 h efter injektion: 21,2 ± 2.9%ID/g. Hvert sæt af betingelser producerer også imponerende tumor til orgel aktivitet koncentration nøgletal. Pretargeting med en 24-timers interval, eksempelvis udbytter tumor-til-blod, svulsten til leveren og tumor til muskel nøgletal på 20 ± 5, 37 ± 7 og 184 ± 30, henholdsvis, 120 h efter indgift af radioligand. Baseret på disse resultater, blev en 24-timers interval valgt for den efterfølgende langsgående terapi undersøgelse (se nedenfor).

For i vivo langsgående terapi studiet, kohorter (n = 10) af athymiske nøgen mus forsynet med subkutane SW1222 xenografts på deres højre flanke blev administreret huA33-TCO (100 mg, 0,67 nmol) 24 timer før injektion af [177Lu] Lu-DOTA-PEG 7- Tz. Tre forskellige eksperimentelle kohorter var beskæftiget, modtager 18,7, 37 eller 55.5 MBq af [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz (svarende til 24, 45 og 70 GBq/µmol kindtand aktiviteter). Desuden to kontrol kohorter modtaget en halvdel af CONNIES regime: enten huA33-TCO (100 mg, 0,67 nmol) uden [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz eller [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz (55.5 MBq, 0,74 nmol) uden huA33-TCO. Disse er væsentlige kontrol for at sikre, at den terapeutiske reaktion ikke fremkaldes ved enten immunoconjugate eller radioligand alene. Mængder af tumorer blev målt hver 3 dage for de første tre uger af undersøgelse og derefter en gang om ugen indtil afslutningen af eksperiment (70 dage, 10 halveringstider 177Lu). Som det ses i figur 6, er der en grel forskel i svar af de eksperimentelle kohorter i forhold til kontrolgruppen. Tumorer i mus modtager kun én komponent af CONNIES strategi fortsat at vokse ukontrolleret, tumorer i mus modtage den fulde ANNS regime stoppe voksende og i sidste ende skrumpe til mængder godt under dem målt i begyndelsen af undersøgelsen. Vigtigere, ingen giftige bivirkninger blev observeret, og alle dyr opretholdes en vægt inden for 20% af deres oprindelige masse (figur 7A). Kaplan-Meier plot af dataene, der giver en endnu mere slående visualisering af undersøgelsen: mens alle mus i kontrol kohorter måtte aflives inden for et par uger, mus af de eksperimentelle kohorter havde en perfekt rekord for overlevelse i slutningen af undersøgelsen ( Figur 7B).

Figure 1
Figur 1: tegneserie skematisk af pretargeted radioimmunotherapy baseret på inverse elektron efterspørgsel Diels-elletræ reaktion. Dette tal er blevet ændret fra reference #28. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy af Colorectal karcinom. Molekylær farmaci. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skematisk af opførelsen af huA33-TCO. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skematisk af syntesen af Tz-PIND7- DOTA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: (en) skematisk af radiolabeling [ 177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz; (B) repræsentative radio-iTLC kromatogrammet demonstrerer den > 98% radiokemiske renhed af [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Biodistribution i af i vivo pretargeting med huA33-TCO og [177Lu] - DOTA - PIND7- Tz i athymiske nøgen mus forsynet med subkutane SW1222 menneskelige kolorektal kræft tumorer ved hjælp af pretargeting intervaller på 24 (lilla), 48 (grøn) , 72 (orange) eller 120 (blå) timer. Data med standard fejl fra kohorter af n = 4; Statistisk analyse blev udført af en uparret Student's t-test, **p < 0,01. Dette tal er blevet ændret fra reference #28. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy af Colorectal karcinom. Molekylær farmaci. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: langsgående terapi undersøgelse af 5 grupper af mus (n = 10) forsynet med subkutane SW1222 tumorer afbildet i gennemsnitlige tumor volumen som funktion af tiden a; og tumor volumen normaliseret til oprindelige volumen som funktion af tid (B). Kontrolgruppen modtog enten immunoconjugate uden radioligand (blå) eller radioligand uden immunoconjugate (rød). De tre behandling grupper modtog huA33-TCO (100 µg, 0,6 nmol) efterfulgt af enten 18,5 (grøn), 37.0 (lilla) eller 55.5 (orange) MBq (~0.8 nmol i hvert enkelt tilfælde) [177Lu] 24 timer senere - DOTA - PIND7- Tz. Af log-rank (Mantel-Cox) test, overlevelse var signifikant (p < 0,0001) for alle behandlingsgrupper. Dette tal er blevet ændret fra reference #28. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy af Colorectal karcinom. Molekylær farmaci. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Vægtkurve for dyr under den langsgående terapi undersøgelse af 5 grupper af mus (n = 10) forsynet med subkutane SW1222 tumorer (A); den tilsvarende Kaplan-Meier overlevelse kurven (B). Kontrolgruppen modtog enten immunoconjugate uden radioligand (blå) eller radioligand uden immunoconjugate (rød). De tre behandling grupper modtog huA33-TCO (100 µg, 0,6 nmol) efterfulgt af enten 18,5 (grøn), 37.0 (lilla) eller 55.5 (orange) MBq (~0.8 nmol i hvert enkelt tilfælde) [177Lu] 24 timer senere - DOTA - PIND7- Tz. Dette tal er blevet ændret fra reference #28. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy af Colorectal karcinom. Molekylær farmaci. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Sammensatte 1 H-NMR Skiftehold HRMS (ESI)
500 MHz, DMSO
TZ-PIND7- NHBoc 10.52 (s, 1H), 8,50 (m, 3H), 7.82 (t, 1H), 7,46 (d, 2H), 6.69 (t, 1H), 4.33 (d, 2H), 3.42 (m, 22H), 3.33 (t, 2H), 3,31 (t, 2H), 3.12 (q, 2H), 2,99 (q, 2H), 2.12 (t, 2H), 2,03 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,70 (q, 2H), 1.29 (s 9 H) m/z beregnet årligt beløb. for C35H57N7O11Na: 774.4005; fundet: 774.4014.
TZ-PIND7-NH2 10.58 (s, 1H), 8.46 (m, 2H), 7.87 (t, 1H), 7,75 (d, 2H), 7,52 (d, 1H), 4.40 (d, 2H), 3.60-3,50 (m, 26H), 3,40 (t, 2H), 3,32 (bs, 2H), 3.20 (q, 2H), 2,99 (bs, 2H), 2.19 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,79 (q, 2H). m/z beregnet årligt beløb. C30H50N7O9: 652.3670; fundet: 652.3676.
TZ-PIND7- DOTA 10.57 (s, 1H), 9,63 (bs, 1H), 8.45 (m, 3H), 7.86 (m, 1H), 7,73 (bs, 1H), 7,54 (d, 2H), 7,41 (m, 2H), 7.19 (m, 2H), 6,54 (bs, 1H), 4.40 (d, 2H), 4,00-3,20 (m, 55H), 3.20 (q, 4H), 2,54 (s, 1H), 2.18 (t, 3H), 2.10 (t, 3H), 1,76 (q 2 H). m/z beregnet årligt beløb. C50H76N11O15S: 1202.56; fundet: 1203.5741.

Bord 1. Karakterisering data for de organiske forbindelser, der er beskrevet i denne protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En af styrkerne ved denne tilgang til i vivo pretargeting — især i forhold til strategier baseret på bispecific antistoffer og radiolabeled habtener — er dens modularitet: trans- cyclooctene fraspaltning kan blive tilføjet til enhver antistof, og tetrazine radioligands kan være radiolabeled med en ekstraordinær bred vifte af radionuklider uden at forringe deres evne til at reagere med deres Klik partnere. Endnu er en tilpasning af denne tilgang til andre antistof/antigen system ikke så simpelt som at dublere protokollen beskrevet her. Naturligvis bør ethvert forsøg på at oprette en ny mAb-TCO immunoconjugate eller en roman tetrazine-bærende radioligand ledsages af passende kemiske og biologiske karakterisering assays, herunder test for stabilitet og reaktivitet. Men ud over dette, er der to variabler, der er særligt vigtigt at udforske og optimere: (1) masse mAb-TCO immunoconjugate administreres og (2) interval tid mellem injektion af mAb-TCO og administrationen af radioligand. Begge faktorer kan drastisk påvirke funktionen i vivo af pretargeting systemet. For eksempel, kan brug af alt for høje doser af immunoconjugate eller interval perioder, der er for kort resultere i uønskede høj aktivitetskoncentrationer i blodet på grund af klik reaktioner mellem radioligand og immunoconjugate tilbage i omløb. Omvendt kan beskæftiger masser af immunoconjugate, der er for lavt eller overdrevent lange interval perioder unødigt reducere aktivitetskoncentrationer i tumor på grund af en fejl at mætte antigenet eller den ubønhørlige (selvom langsom) isomeriseringen af trans - cyclooctene til inaktive cis- cyclooctene. Langs disse linjer, kan udfører biodistribution eksperimenter ved hjælp af en vifte af masser af immunoconjugate og pretargeting intervaller være overordentligt nyttigt. Det anbefales naturligvis også, at passende kontrol køres parallelt med enhver i vivo eksperimenter. Disse omfatter — men er ikke begrænset til — forsøg med antigen-negative cellelinjer, blokerer kohorter, der modtager et stort overskud af ukonjugeret antistof, administration af radioligand alene, injektion af radioligand efter en TCO- mangler immunoconjugate, og i vivo pretargeting ved hjælp af en ikke-specifik, isotype kontrol TCO-bærende immunoconjugate.

Alternativt, imaging eksperimenter kan bruges til optimering, hvis de terapeutiske radionuklid udsender rumtid eller 'billedområde' fotoner, eller hvis en 'billedområde' isotopologue af den terapeutiske radionuklid er tilgængelige. I sidste ende, sæt af variabler, der giver den bedste balance af høj tumorsygdomme aktivitetskoncentrationer og høj tumor til baggrund aktivitet koncentration nøgletal skal vælges for efterfølgende langsgående terapi undersøgelser. I sagen forelagt her, 100 µg for huA33-TCO blev sprøjtet med et interval på 24 h. dosimetri beregninger — især dem, der giver mulighed for beregning af tumor doser og terapeutiske nøgletal – kan også være nyttigt under processen med optimering.

Det er vigtigt at bemærke, at selv den lovende [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz/huA33-TCO system, der er blevet udviklet kunne drage fordel af yderligere optimering. En sammenligning mellem dosimetri data fra denne tilgang til ANNS og traditionelle RIT med en 177Lu-mærket variant af huA33 afslører, at tumor dosis af CONNIES ligger under de traditionelle RIT. Desuden, den effektive dosis af CONNIES system (0,054 mSv/MBq) er kun lidt lavere end for traditionelle RIT (0.068 mSv/MBq).

To retsmidler til disse spørgsmål er i øjeblikket ved at blive undersøgt. For det første er en dendritiske stillads udviklet i stand til at øge antallet af TCOs er føjet til hver antistof30. I forbindelse med pretargeted PET imaging, denne tilgang dramatisk øger tumorsygdomme aktivitetskoncentrationer, og tilsvarende eksperimenter med [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz er undervejs. Andet kan brugen af tetrazine-bærende clearing agenter være nyttige i forbindelse med ANNS. Administration af clearing agenter inden injektion af radioligand er blevet udnyttet i en række forskellige pretargeting metoder som en måde at mindske koncentrationen af resterende immunoconjugate i blodet og dermed reducere aktivitetskoncentrationer i raske organer23,31. Brugen af clearing agenter er ikke uden ulemper, selv; den mest bemærkelsesværdige af dem er stigende kompleksitet af en allerede ganske kompliceret terapeutisk modalitet. Ikke desto mindre, forskere ved Memorial Sloan Kettering Cancer Center for nylig offentliggjort en overbevisende betænkning om oprettelsen en Tz-mærket dextran clearing agent for pretargeted PET imaging og data om anvendelsen af denne konstruktion i forbindelse med [177Lu] Lu-DOTA-PIND7- Tz og huA33-TCO er kommende32. En anden tilgang til at maksimere dosimetriske fordelene ved ANNS er brugen af radionuklider med kortere fysiske halveringstid. Dette har vist sig særdeles effektiv for billeddannelse; men terapeutiske radionuklider med korte fysiske halveringstid er få og langt imellem.

Endelig ville vi være forsømmelige, hvis vi ikke har korrekt adresse nogle af de iboende begrænsninger af pretargeting baseret på inverse elektron efterspørgsel Diels-elletræ reaktion. Først af disse problemer er iboende alle tilgange til i vivo pretargeting: antistof ansat kan blive internaliseret ved binding til målvæv. Dette, er naturligvis afgørende, som antistoffet skal forblive tilgængelig for radioligand snarere end afsondret i en intracellulær rum. Denne begrænsning er ganske vist svært at omgå, selvom det har været vist for nylig at antistoffer med langsom til moderat satser af internalisere kan bruges til i vivo pretargeting33,34. Andet, langsom i vivo isomeriseringen af reaktive trans -cyclooctene til inaktive cis -cyclooctene har potentiale til at begrænse længden af intervallet mellem administrationen af TCO-bærende immunoconjugate og den injektion af radioligand. Kritisk, har intervaller på op til 120 h stadig givet glimrende resultater inden for rammerne af begge pretargeted PET imaging og CONNIES. Brugen af disse længere intervaller er dog næsten altid ledsaget af lille reduktioner i tumorsygdomme aktivitetskoncentrationer, et resultat, der kan stamme fra denne isomerisation. For at løse dette problem, har flere laboratorier forsøgt at skabe mere stabile trans- cyclooctenes uden at kompromittere reaktivitet, mens andre har forsøgt at udvikle helt nye dienophiles i stand til at reagere med tetrazine35 . I de kommende år er det vores håb, at disse kemiske udvikling vil være gearede til ANNS.

I sidste ende er ANNS baseret på inverse elektron efterspørgsel Diels-elletræ ligatur unægtelig en emergent og lidt umodne teknologi. Vi opfordres dog alligevel af de prækliniske resultater vi har opnået og begejstrede for det kliniske løfte af denne strategi. Vi håber inderligt, at denne protokol opfordrer andre til at udforske og optimere denne tilgang og dermed brændstof sin rejse fra laboratoriet til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Dr. Jacob Houghton for nyttige samtaler. Forfatterne vil også gerne takke NIH for deres generøse støtte (R00CA178205 og U01CA221046).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
  2. Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
  3. Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
  4. Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
  5. Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin's Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
  6. Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
  7. Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
  8. Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
  9. Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
  10. van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
  11. Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
  12. Goldenberg, D. M., Chatal, J. -F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
  13. Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
  14. Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
  15. Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Cancer Research. 76 (22), 6669 (2016).
  16. Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
  17. Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
  18. Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
  19. Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
  20. Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
  21. Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
  22. Meyer, J. -P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
  23. Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
  24. Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  26. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
  27. Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
  28. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
  29. Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
  30. Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
  31. Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
  32. Meyer, J. -P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
  33. Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
  34. Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
  35. Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).

Tags

Kemi spørgsmålet 143 radioimmunotherapy pretargeted radioimmunotherapy pretargeting inverse elektron efterspørgsel Diels-elletræ reaktion tetrazine trans- cyclooctene huA33 A33 antigen lutetium 177
Pretargeted Radioimmunotherapy baseret på Inverse elektron efterspørgsel Diels-elletræ reaktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis,… More

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis, B. M. Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (143), e59041, doi:10.3791/59041 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter