Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Pretargeted Radioimmunotherapy basert på Inverse Electron etterspørsel Diels-Alderreaksjonen

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

Denne protokollen beskriver syntese og karakterisering av en trans- cyclooctene (TCO)-endret antistoff og en 177Lu-merket tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). I tillegg detaljer det bruken av disse to konstruerer for i vivo biodistribution og langsgående terapi studier i en murine modell av tykktarmskreft.

Abstract

Mens radioimmunotherapy (RIT) er en lovende metode for behandling av kreft, kan lenge farmakokinetiske halveringstiden av radiolabeled antistoffer resultere i høye Stråledoser sunt vev. Kanskje ikke overraskende, er flere forskjellige strategier utviklet for å omgå denne problematisk begrensningen. En av de mest lovende disse tilnærmingene er pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT forutsetter at dekopling radionuklidenes fra immunglobulin injisere dem separat og deretter la dem å kombinere i vivo på vevet. Denne tilnærmingen seletøy eksepsjonell svulst målretting egenskapene av antistoffer mens lister sine farmakokinetiske ulemper, og dermed redusere Stråledoser ikke mål vev og tilrettelegger for bruk av Radionuklider med halv-liv som er vurdert for kort for bruk i tradisjonelle radioimmunoconjugates. De siste fem årene, har vårt laboratorium og andre utviklet en tilnærming til i vivo pretargeting basert på inverse elektron-demand Diels-Alder (IEDDA) reaksjonen trans- cyclooctene (TCO) og tetrazine (Tz). Denne strategien har vært anvendt på pretargeted fantes et positron utslipp tomografi (PET) og enkelt-fotonet utslipp tomografi (SPECT) tenkelig med en rekke antistoff-antigen systemer. I et par nye publikasjoner, har vi vist virkningen av IEDDA-baserte PRIT i murine modeller av bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma og colorectal carcinoma. I denne protokollen, beskriver vi protokoller for PRIT bruker en 177Lu-DOTA-merket tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz) og en TCO-modifisert variant av tykktarmskreft målretting huA33 antistoff (huA33-TCO). Mer spesifikt, vil vi beskrive byggingen av huA33-TCO, syntese og radiolabeling av [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz, og ytelse i vivo biodistribution og langsgående terapi studier i murine modeller av colorectal carcinoma.

Introduction

Radioimmunotherapy (RIT)-bruk av antistoffer for levering av terapeutiske Radionuklider til svulster, har lenge vært en fristende tilnærming til behandling av kreft1,2. Faktisk dette løftet har blitt understreket av USA Food and Drug Administration godkjennelse av to radioimmunoconjugates for behandling av Non-Hodgkins lymfom: 90Y-ibritumomab tiuxetan og 131-tositumomab3 , 4. men selv fra de tidligste dagene, klinisk utsiktene til RIT blitt hemmet av en kritisk komplikasjon: høy stråling dose priser til sunt vev5,6. Generelt radioimmunoconjugates for RIT er merket med lang levetid Radionuklider (f.eks 131jeg [t½ = 8,0 dager] og 90Y [t½ = 2,7 dager]) med fysiske halv-liv som dovetail med den lenge farmakokinetiske halv-livene til immunglobuliner. Dette er viktig, som sikrer at tilstrekkelig radioaktivitet forblir når antistoffer har nådd sin optimale biodistribution etter flere dager med sirkulasjon. Men fører denne kombinasjonen av lang botid ganger i blod og lenge fysiske halv-livet uunngåelig bestråling av sunt vev, og dermed redusere terapeutiske prosenter og begrense virkningen av terapi7. Flere strategier utforsket for å omgå dette problemet, inkludert bruk av avkortet antistoff fragmenter som Fab, Fab', F(ab')2, minibodies og nanobodies8,9,10. En av de mest lovende og fascinerende, men unektelig komplekse, alternative tilnærminger er i vivo pretargeting11.

I vivo pretargeting er en tilnærming til kjernefysiske bildebehandling og terapi som søker å utnytte utsøkte affinitet og selektivitet av antistoffer mens lister deres farmakokinetiske ulemper11,12,13. Dette radiolabeled antistoffer brukes i tradisjonelle radioimmunotherapy er dekonstruerte i to komponenter: en lite molekyl-radioligand og en immunoconjugate som kan binde både en svulst antigen og den nevnte radioligand. Immunoconjugate er injisert første og gitt et 'forsprang', ofte flere dager, der det akkumuleres i vevet og tømmer fra blodet. Deretter små molekyl-radioligand administreres og kombinerer med immunoconjugate på svulst eller raskt forsvinner fra kroppen. I hovedsak avhengig i vivo pretargeting utfører radiochemistry innenfor kroppen selv. Ved å redusere sirkulasjonen av radioaktiviteten, denne tilnærmingen samtidig reduserer Stråledoser sunt vev og forenkler bruken av Radionuklider (f.eks 68Ga, t½ = 68 min211; Som t½ = 7,2 h) med halv-liv som er vanligvis betraktet som uforenlig med antistoff-baserte vektorer.

Starter i slutten av 1980, en håndfull av ulike tilnærminger til i vivo pretargeting har blitt utviklet, inkludert strategier basert på bispecific antistoffer, samspillet mellom streptavidin og biotin, og hybridization av komplementære oligonucleotides14,15,16,17,18. Men har hver vært holdt tilbake i varierende grad av komplikasjoner, mest kjente den potente immunogenisitet streptavidin endret antistoffer19,20. De siste fem årene, har vår gruppe og andre utviklet en tilnærming til i vivo pretargeting basert på den rask og bioorthogonal omvendt elektron etterspørsel Diels-Alder ligation mellom trans- cyclooctene (TCO) og tetrazine (Tz) 21,22,23,24. De mest suksessrike av disse strategiene har ansatt et TCO-endret antistoff og en Tz-bærende radioligand, som TCO er vanligvis mer stabile i vivo sin Tz partner (figur 1)25,26. Som andre pretargeting metoder, mAb-TCO-immunoconjugate administreres først og tid å fjerne fra sirkulasjon og akkumuleres i tumor vev. Deretter injiseres små molekyl Tz radioligand, hvoretter den enten Klikk med immunoconjugate i vevet eller forsvinner raskt fra kroppen. Denne i vivo pretargeting strategi har vist seg svært effektive for PET og SPECT tenkelig med flere forskjellige antistoff/antigen systemer konsekvent produserer bilder med høy kontrast og muliggjør bruk av kortvarige Radionuklider som 18 F (t½ = 109 min) og 64Cu (t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Effekten av Klikk-baserte pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) har nylig vist i murine modeller av bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma (PDAC) og colorectal karsinom27,28. For dette formål, terapeutiske radionuklidenes 177Lu (βMaks = 498 keV, t1/2 = 6,7 dager) var ansatt sammen med to forskjellige antistoffer: 5B1, som mål karbohydrater antigen 19,9 (CA19.9) overalt uttrykt i PDAC , og huA33, som er målrettet mot A33, en transmembrane glykoprotein uttrykt i > 95% av kolorektal kreft. I begge tilfeller denne tilnærmingen til 177Lu-PRIT gitt høy aktivitet konsentrasjonene i tumor vev, opprettet en doseavhengig terapeutisk effekt, og samtidig redusert aktivitet konsentrasjonene i sunt vev sammenlignet med tradisjonelle direkte-merket radioimmunoconjugates.

I denne artikkelen beskriver vi protokoller for PRIT bruker en 177Lu-DOTA-merket tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz) og en TCO-modifisert variant av huA33 antistoffer (huA33-TCO). Mer spesifikt, beskriver vi byggingen av huA33-TCO (figur 2), syntese og radiolabeling av [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz (Figur 3 og Figur 4), og ytelse i vivo biodistribution og langsgående terapi studier i murine modeller av colorectal carcinoma. Videre i representant resultater og diskusjon, vi presentere data Prøvesett adressen mulig strategier for optimalisering av denne tilnærmingen, og vurdere denne strategien i den større sammenhengen i vivo pretargeting og PRIT. Endelig er det viktig å merke seg at mens vi har valgt å fokusere på pretargeting ved hjelp av huA33-TCO og [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz i denne protokollen, denne strategien er svært modulær og kan bli tilpasset et bredt spekter av antistoffer og Radionuklider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle i vivo dyreforsøk beskrevet i dette arbeidet ble utført i henhold til godkjente protokoller og utføres under etiske retningslinjer av Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center og Hunter College Institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteer (IACUC).

1. utarbeidelsen av huA33-TCO

Merk: Syntese av huA33-TCO har vært tidligere rapporterte29. Men for enkel leseren, blir den replisert her med justeringer for optimale forhold.

  1. I en 1,7 mL microcentrifuge tube, forbereder en 125 μL løsning av (E) - cyclooct - 4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl karbonat (TCO-NHS) i tørr dimethyl formamide (DMF) i en konsentrasjon av 40 mg/mL (0,15 M). Denne løsningen kan være aliquoted og frosne-80 ° c for bruk i senere eksperimenter.
  2. I en separat 1,7 mL microcentrifuge tube, Forbered en 5 mg/mL løsning av huA33 i 1 mL av fosfat bufret saltvann (PBS, 2.7 mM kalium klorid og 137 mM natriumklorid 11,9 mM kalium fosfat, pH 7.4).
  3. Bruke små dele (< 5 μL) 0.1 M Na2CO3, justere pH av antistoff løsningen fra trinn 1.2 8,8-9.0. Bruke pH papir eller en pH-meter med en microelectrode å overvåke pH og vær forsiktig at pH ikke overstiger 9.0.
  4. Antistoff løsningen beskrevet i trinn 1.3, sakte legger til et volum tilsvarer 40 molar ekvivalenter av TCO-NHS i forhold til mengden av antistoff. For eksempel hvis 5 mg (30 nmol) huA33 i løsningen, Legg 9.0 μL (1.20 μmol) 40 mg/mL (0,15 M) løsning av TCO-NHS.
    Merk: TCO-NHS er hydrofobe. Når du legger den løsningen antistoff, kan du legge den med en agitasjon å hindre nedbør. Ikke overstige 10% DMF av volumet i siste reaksjon løsningen.
  5. At reaksjonen å ruge ved 25 ° C på en thermomixer 1t med mild agitasjon (500 rpm).
  6. Etter 1 h, rense huA33-TCO-immunoconjugate bruker en pre-pakket disponibel størrelse utelukkelse avsalting kolonne.
    1. Equilibrate størrelse utelukkelse kolonnen som beskrevet av leverandøren fjerne konserveringsmidler i kolonnen under lagring. En typisk prosedyren innebærer vaske kolonnen 5 x med et volum på PBS som tilsvarer volumet av kolonnen: 5 x 2,5 mL PBS.
    2. Legge til reaksjonsblandingen størrelse utelukkelse kolonnen merke volumet reaksjonsblandingen.
    3. Når reaksjonsblandingen er inn kolonnen, legge til en passende mengde PBS å bringe det totale volumet av løsning lagt til kolonnen opptil 2,5 mL. For eksempel hvis Bøyning reaksjonen resulterte i et totalt volum på 1,3 mL, legge 1,2 mL ekstra PBS kolonnen.
    4. Samle produktet bruker 2 mL PBS som eluent.
      Merk: Dette trinnet vil gi endelige konstruere huA33-TCO i 2 mL PBS, pH 7.4.
  7. Måle konsentrasjonen av huA33-TCO bruker et UV-Vis spektrofotometer overvåking 280 nm bølgelengde. Molar utryddelse koeffisient for de fleste IgGs (ε280) er 210 000 M-1cm-1.
  8. Hvis en løsning med en høyere konsentrasjon av immunoconjugate, konsentrere huA33-TCO-løsningen bruker en sentrifugal filter enhet med et 50.000 molekylvekt cut-off følge instruksjonene fra produsenten.
    Merk: Mange antistoffer har vært kjent å samle eller bunnfall under konsentrasjon. Når du prøver denne prosedyren med en ny antistoff, bør forskere utsette litteratur eller sin egen erfaring håndtering antistoffer i spørsmålet.
  9. Lagre fullførte huA33-TCO-immunoconjugate på 4 ° C i mørket hvis det er nødvendig umiddelbart. Hvis det brukes mer enn 4 dager i fremtiden, kan du lagre det ved-80 ° C i mørket.
    Merk: Dette er en akseptabel sluttpunkt i prosedyren. Fullført huA33-TCO-immunoconjugate bør være stabile minst 6 måneder lagringsytelse ved-80 ° C i mørket.

2. syntese av Tz-pinne7- NHBoc

  1. I en 1,7 mL microcentrifuge tube, løses 5 mg tetrazine N- hydroxysuccinimidyl ester (Tz-NHS, 12.6 μmol) i 0,15 mL av vannfri dimethyl sulfoxide (DMSO).
  2. I en separat 1,7 mL microcentrifuge tube, løses 8 mg av Boc-beskyttet amino PEG polymer, O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol (NHBoc-PEG7-NH2, 17.1 μmol) i 0,15 mL av vannfri DMSO.
  3. Løsningen av Tz-NHS, tilsett 3 μL (21,3 μmol, 1,7 molar ekvivalenter) i triethylamine (te) og bland godt.
  4. Legge den rosa tetrazine løsningen til NHBoc-pinne7-NH2 løsningen fra trinn 2.2 og ruge reaksjonsblandingen i 30 min ved romtemperatur (RT) med mild agitasjon.
  5. Etter 30 minutter, fortynne reaksjonen 1:1 i H2O og rense reaksjonen bruker reverseres-fase C18 høyytelses flytende kromatografi (HPLC) til å skille en Ureagert Tz-NHS fra Tz-pinne7- NHBoc. Løsemidler uten syre for å forhindre tidlig fjerning av Boc beskytte gruppe. Overvåke både Tz-pinne7- NHBoc og Tz-NHS på en bølgelengde på 525 nm.
    Merk: Tid er åpenbart svært avhengig HPLC utstyret av hvert laboratorium (pumper, kolonner, rør, osv.), og aktuelle kontroller bør kjøres før rensing. Imidlertid å presentere et eksempel, hvis en stigning på 5:95 MeCN/T2O (begge uten tilsetning) til 95:5 MeCN/T2O over 30 min, en strømningshastighet på 1 mL/min og en analytisk 4.6 x 250 mm C18kolonne brukes , tid av Tz-NHS og Tz-pinne7- NHBoc er rundt 16 min og 18 min, henholdsvis.
  6. Fryse den innsamlede HPLC eluent med flytende nitrogen og Pakk den nå-frosne samling rør i aluminiumsfolie. Stedet den frosne samling rør på en lyophilizer over natten for å fjerne HPLC mobile fasen. Produktet vil være en karakteristisk lys rosa solid.
    Merk: Hvis flytende nitrogen ikke er tilgjengelig, fryse den innsamlede HPLC eluent i tørris eller overnatting i-80 ° C fryser.

3. syntese av Tz-pinne7-NH2

  1. Til produktet fra trinn 2.6, Tz-pinne7- NHBoc, legge til 1,5 mL diklormetan (DCM) og overføre denne løsningen til en liten runde bunn kolbe.
  2. Legge 0,25 mL av trifluoroacetic syre (TFA) dropwise til rosa løsningen fra trinn 3.1.
  3. At reaksjonen å ruge i 30 min på RT med mild agitasjon.
  4. Etter 30 min, fordampe løsemiddel via roterende fordampning. Ikke overskrid en bad temperaturen på 37 ° C.
  5. Rekonstituer rosa tyktflytende produktet i 0,5 mL vann.
  6. Rense produktet bruker reverseres-fase C18 HPLC skille Tz-pinne7-NH2 fra forløperen Boc-beskyttet. Overvåke både Tz-pinne7- NHBoc og Tz-pinne7-NH2 på en bølgelengde på 525 nm.
    Merk: Tid er åpenbart svært avhengig HPLC utstyret av hvert laboratorium (pumper, kolonner, rør, osv.), og aktuelle kontroller bør kjøres før rensing. Imidlertid å presentere et eksempel, hvis en stigning på 5:95 MeCN/T2O (begge med 0,1% TFA) til 95:5 MeCN/T2O over 30 min, en strømningshastighet på 1 mL/min og en analytisk 4.6 x 250 mm C18kolonne brukes , tid av Tz-pinne7- NHBoc og Tz-pinne7-NH2 er rundt 18 min og 13 min, henholdsvis.
  7. Fryse den innsamlede HPLC eluent med flytende nitrogen og Pakk den nå-frosne samling rør i aluminiumsfolie. Stedet den frosne samling rør på en lyophilizer over natten for å fjerne HPLC mobile fasen. Produktet vil være en lys rosa solid.
  8. Rekonstituer produktet fra trinn 3.7, Tz-pinne7-NH2, med 150 μL av DMSO og overføre til en 1,7 mL microcentrifuge tube.
  9. Måle konsentrasjonen av Tz-pinne7-NH2 bruke en UV-Vis spektrofotometer overvåking 525 nm bølgelengde. Molar utryddelse koeffisient Tz-pinne7-NH2 (ε525) er 535 M-1cm-1.

4. syntese av Tz-pinne7- DOTA

  1. Oppløse Tz-pinne7-NH2 (4,5 mg, 6,9 μmol) i 0,15 mL DMSO (eller bare fortsette med løsningen opprettet i trinn 3.8).
  2. Legge til 22 molar ekvivalenter te (21 μL, 0,15 mmol) til tetrazine som inneholder løsningen fra trinn 4.1.
  3. Legge 10 mg (14.2 μmol) p- SCN-Bn-DOTA som en solid og vortex løsningen i ca 2 minutter, eller til materialet er fullstendig oppløst.
  4. At reaksjonen å ruge i 30 min på RT med mild agitasjon.
  5. Etter 30 min, fortynne reaksjonen 1:1 i H2O og rense produktet bruker reverseres-fase C18 HPLC fjerne Ureagert p- SCN-Bn-DOTA. P- SCN-Bn-DOTA kan måles på en bølgelengde på 254 nm, mens Tz-pinne7- DOTA overvåkes best på en bølgelengde på 525 nm.
    Merk: Tid er åpenbart svært avhengig HPLC utstyret av hvert laboratorium (pumper, kolonner, rør, osv.), og aktuelle kontroller bør kjøres før rensing. Imidlertid å presentere et eksempel, hvis en stigning på 5:95 MeCN/T2O (begge med 0,1% TFA) til 95:5 MeCN/T2O over 30 min og en analytisk 4.6 x 250 mm C18kolonne brukes, Tz-pinne7- DOTA og p-SCN-Bn-DOTA har tid av rundt 15.6 min og 16,1 min, henholdsvis.
  6. Fryse den innsamlede HPLC eluent med flytende nitrogen og Pakk den nå-frosne samling rør i aluminiumsfolie. Stedet den frosne samling rør på en lyophilizer over natten for å fjerne HPLC mobile fasen. Produktet vil være et lys rosa pulver.
  7. Rekonstituer produktet i 0,15 mL DMSO og måle konsentrasjonen med en UV-Vis spektrofotometer overvåking 525 nm bølgelengde. Molar utryddelse koeffisient Tz-pinne7- DOTA (ε525) er 535 M-1cm-1.
  8. Analysere det endelige sammensatt av kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) og høy oppløsning massespektrometri (HRMS) for å bekrefte syntesen var vellykket. Se tabell 1 for eksperimentelt bestemt kjemiske Skift og molekylvekt av alle forbindelser i dette arbeidet.
  9. Lagre renset Tz-pinne7- DOTA løsningen i mørket på-80 ° C.
    Merk: Dette er en akseptabel sluttpunkt i prosedyren. Fullført Tz-pinne7- DOTA forløperen er stabil i minst 1 år under disse forholdene.

5. 177Lu Radiolabeling av Tz-pinne7- DOTA

Advarsel: Dette trinnet av protokollen innebærer håndtering og manipulering av radioaktivitet. Før du utfører disse trinnene, eller utføre andre arbeid med radioaktivitet-forskere bør konsultere med deres hjem institusjonens stråling sikkerhet avdelingen. Ta for å redusere eksponering for ioniserende stråling.

Merk: Når du arbeider med små mengder radiometals anbefales at alle buffere være uten spor metaller å hindre forstyrrelser i koordinering området binding.

  1. I en 1,7 mL sentrifuge tube, kan du legge til 200 μL 0,25 M ammonium acetate bufferen justert med dele 1 M HCl pH 5.5.
    Merk: Hvis bruker mindre enn 370 MBq aktivitet for merkingen, volumet av bufferen skal reduseres til 100 µL.
  2. Legge til ønsket antall [177Lu] LuCl3 buffer løsning. Hvor lagt vil være avhengig av antall emner i eksperimentet og radioaktivt doser som administreres. Det anbefales at 1-2 ekstra doser verdt av radioaktivitet legges til som en forholdsregel å kompensere for mulig tap av radioaktivitet i rensing trinnene.
  3. Legge til Tz-pinne7- DOTA i DMSO til radioaktiv blanding i trinn 5.2. Mengden Tz-pinne7- DOTA er avhengig av antall emner blir testet. Flere detaljer om dette emnet finner du i trinn 6.2.2.2.
  4. Tillate løsningen å ruge på 37 ° C for 20 min.
  5. Kontroller den radiolabeling er komplett med radio øyeblikkelig tynt lag kromatografi (radio-iTLC) med 50 mM EDTA, pH 5.5 som den mobile fasen. Det merket [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz vil forbli på opprinnelige-Rf = 0-mens gratis [177Lu] Lu3 + vil bli koordinert av EDTA og vil reise med løsemiddel foran Rf = 1.0 (figur 3B).
  6. Hvis kvantitative merking ikke er oppnådd, kan du legge til ekstra ligand koordinere den gratis radiometal. Alternativt, rense den merket [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz bruker C18 patron. Følg instruksjonene fra produsenten for bruk. Et eksempel på en prosedyre er angitt nedenfor.
    1. Prime kassetten av sakte passerer gjennom 5 mL av etanol gjennom kassetten med en stor sprøyte. Deretter passere 5 mL av acetonitrile og deretter 5 mL deionisert (DI) H2O.
    2. Utarbeide radioligand løsningen fra trinn 5.3 i en mindre sprøyten og injisere den sakte på C18 kassetten. Deretter ubundet vaske kassetten med 10 mL DI H2O å fjerne noen [177Lu] LuCl3.
    3. Elute med 500 µL av etanol. Fjern alle etanol fra det endelige produktet av passerer over skipet med en lav flow rate på tørr nitrogen eller argon i 10-15 min. Senere, resuspend radioligand i saltvann i et volum bestemmes i trinn 6.2.2.2.

6. i vivo studier

Advarsel: I seksjon 5, dette trinnet av protokollen innebærer håndtering og manipulering av radioaktivitet. Før du utfører disse trinnene, bør forskere konsultere med deres hjem institusjonens stråling sikkerhet avdelingen. Ta for å redusere eksponering for ioniserende stråling.

  1. Utarbeidelse av dyr
    1. I kvinnelige athymic naken mus, subcutaneously implantatet 5 x 106 SW1222 tykktarmskreft celler suspendert i 150 μL av en 1:1 blanding av cellen media og matrise (f.eks., Matrigel) og la disse til å vokse til en 100-150 mm3 xenograft (14-18 dager etter vaksinering).
    2. Sortering av dyr for en biodistribution eksperiment
      1. Når tumorer har tilstrekkelig størrelse som bestemmes av caliper måling, sortere dyrene for å sikre hver kohort har omtrent samme gjennomsnittlig svulst volum. Dyrene kan skilles i hver bur med tegninger på halen med uutslettelig blekk (ett band, to band, osv.).
    3. Sortering av dyr for en langsgående terapi studie
      1. Når tumorer er tilstrekkelig størrelse som bestemmes av caliper måling, knytte øret koder til hver av dyrene for å sikre riktig sporing gjennom hele eksperimentet.
        Merk: Numeriske øret tags faller av i løpet av eksperimentet. Derfor er det anbefalt å følge disse fysiske koder med øret hakkene på en systematisk måte (dvs., høyre, venstre, bilaterale, høyre x 2, venstre x 2).
      2. Sorter dyr slik at gjennomsnittlig svulst volumet i hver kohort er omtrent lik. Følgende metode for dyr sorteringen utføres med et regnearkprogram.
        1. Vis dyr identifikasjonsnumre, øret hakk mønster og svulst volum i tre separate kolonner.
        2. Sortere dataene fra minste til største svulst volumet.
        3. I en fjerde kolonne, tilordne hvert dyr bur tall og bla gjennom merdene i et snakelike mønster. For eksempel hvis det er 5 bur, denne kolonnen være fylt "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." til alle dyrene er tilordnet et bur.
        4. Når merdene er tilordnet, Sorter dataene etter buret. Hvis øret hakk brukes, kontrollerer du at hvert dyr i et gitt bur har en unik øret hakk mønster. Hvis det finnes duplikater (to eller flere av samme mønster) i en gitt bur, har bytte en mus med en fra en annen bur med manglende mønsteret til hver bur dyr med unike øret hakk mønstre.
  2. Formuleringer og injeksjoner
    Merk: Sekvensen av injeksjon for både biodistribution og terapi fortsetter som følger: huA33-TCO injiseres først, etterfulgt av [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz etter et bestemt intervall.
    1. Immunoconjugate
      1. Fortynne en aliquot av huA33-TCO løsningen fra trinn 1,9 en konsentrasjon av 0,8 mg/mL i 0,9% sterilt saltvann.
      2. Tegne doser av 150 µL (100 µg) av huA33-TCO-løsningen i sprøyter forbehandlet med 1% bovin serum albumin (BSA) i PBS og lagre disse sprøyter på isen.
        Merk: BSA behandling reduserer uspesifisert binding av antistoffer mot veggene i sprøyten.
      3. Varm dyr under en varmelampe i 3 minutter å dilate hale venen.
      4. Sette inn huA33-TCO-løsningen i halen venen xenograft-bærende museklikk. Tillat 24 h (eller en annen forhåndsbestemt tidsintervall) huA33-TCO vil akkumuleres i svulsten museklikk.
    2. Radioligand
      1. Radiolabel Tz-pinne7- DOTA som beskrevet i seksjon 5.
      2. Tegne doser på 150 μL av 0,9% sterilt saltvann inneholder 1.1 molar ekvivalenter av Tz-pinne7- DOTA i forhold til mengden av huA33-TCO administrert. Som et eksempel, hvis 100 μg (0.67 nmol) av huA33-TCO ble injisert i dyret og [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz reaksjonsblandingen ble gjort med en bestemt aktivitet av 12.4 GBq/μmol, vil deretter doser bli trukket som inneholder 9.14 MBq aktivitet hver. Dette tilsvarer 0.74 nmol av Tz (1.1 molar eq. i forhold til huA33-TCO).
      3. Varm dyr under en varmelampe i 3 minutter å dilate hale venen.
      4. Injisere dosen av radioligand i xenograft-bærende musen halen åre. Mengden aktivitet skal injiseres bestemmes av forskeren. Publiserte data har vist doseavhengig terapeutiske effekter med tumor størrelse i en rekke 7,4-55,5 MBq.
  3. Biodistribution
    1. Det ønsket tid punktet etter administrasjon av radioligand, euthanize hver kohort av mus med en 2% O2 / 6% CO2 gass blanding.
      Merk: Følg eventuelle institusjonelle krav om metoder for sekundær fysiske euthanasia (f.eks cervical forvridning).
    2. For hvert dyr, fjerne alle organer av interesse, vaske dem i et vannbad fjerne alle overflødig blod og tørk dem på et papirhåndkle i friluft for 5 min. eksempelliste foreslått for orgel: blod, svulst, hjerte, lunger, leveren, milt, mage, tynntarm , tykktarmen, nyrer, muskler, bein, hud, hale.
    3. Når tilstrekkelig tørket, plassere organer i pre vektet disponibel kultur rør. Veie nå fylt rør igjen for å få masse hvert organ eller vev.
    4. Måle aktiviteten i hver av rør med en gamma-teller. Kalibrere målt aktiviteten i gamma counter til detektoren brukes for å måle trukket dosen. Telle radioaktivt standarder for 177Lu på hvert instrument og finne en kalibreringsfaktoren for interconversion mellom aktivitet og teller per minutt (cpm).
    5. Plot biodistribution dataene som et stolpediagram (se figur 5) med gjennomsnitt normalisert opptak for hvert organ vises sammen med en linje viser ett standardavvik. Statistiske forskjellen i opptak eksempel grupper kan bli vurdert av en kort t-test, der betydning er oppnådd når p < 0,05.
  4. Terapi overvåking
    1. Bruker calipers, mål den lengste siden av avlang svulsten (lengde) samt bredden som er vinkelrett på lengden. Beregne volumet ved hjelp av formelen for volumet av en ellipsoid: (4/3) πL· W· H, som forenkler til ½L· W2, forutsatt at høyden er omtrent lik bredde.
      Merk: Det er også mulig å bruke en håndholdt svulst måleinstrument hvis en er tilgjengelig (se Tabell for materiale).
    2. Veie hver musen på en balanse spore vektøkning eller vekttap over tid.
    3. Viktigere, overvåke hvert dyr utseende for underskriver av smerte, som bøyd tilbake eller sprukket kutan blodkar (som kan indikere haematotoxicity).
      Merk: Svulst målinger skal samles hver 1-2 dager i løpet av langsgående terapi studien.
    4. Inntegnede data fra den langsgående terapien studier som gjennomsnittlig svulst volumer over tid og normalisere starter svulst volum hvis ønskelig. Statistisk forskjeller i opptaket på samme dag mellom eksempel grupper kan bli vurdert av en kort t-test, der betydning er oppnådd når P < 0,05. Mer omfattende statistiske analyser kan og bør utføres som anbefalt av en utdannet biostatistician.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bøyning av TCO til huA33 forutsetter at koblingen mellom Amin-reaktive TCO-NHS og lysin rester på overflaten av immunglobulin. Denne metoden er svært robust og reproduserbar og gir pålitelig en grad av-typen av 2-4 TCO/mAb. I dette tilfellet var MALDI-ToF massespektrometri ansatt å bekrefte en grad av merking av ca 4.0 TCO/mAb; en lignende verdi ble oppnådd med et fluorophore-modifisert tetrazine som en reporter24. Syntese av tetrazine ligand er utført i tre trinn: (1) kopling av Tz-NHS å en mono-Boc-beskyttet PEG koblingsfunksjonalitet (2) deprotection av dette mellomliggende avkastning Tz-pinne7-NH2, og (3) dannelsen av en thiourea sammenheng mellom p- SCN-Bn-DOTA og Tz-pinne7-NH2. Denne fremgangsmåten er relativt lettvinte og gir Tz-pinne7- DOTA i en samlet avkastning på ~ 75%. Hver av intermediates har vært preget av HRMS og 1H-NMR; disse dataene er presentert i tabell 1.

Flytte til den radiolabeling, hentes 177Lu3 + vanligvis fra kommersielle leverandører som en klorid salt [177Lu] LuCl3 i 0,5 M HCl. Radiolabeling Tz-pinne7- DOTA med 177Lu til radioligand [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz er veldig enkelt: bare 20 min, reaksjonen er fullført, produsere det ønskede produktet i > 99% radiochemical renhet som radio-iTLC. Ingen ytterligere rensing er vanligvis nødvendig før formulering. En undersøkelse av litteraturen om Tz/TCO-baserte pretargeting antyder at Tz:mAb molar forholdet ~ 1:1 gir det beste i vivo data10. Som et resultat, er det ikke nødvendig å få radioligand i høyest mulig molar aktiviteten. For eksempel biodistribution eksperimenter diskutert her ansette [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz med en molar aktivitet av ~ 12 GBq/µmol. For langsgående terapi studier, kontrast [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz med høyere molar aktivitet ble brukt for å lette administrasjonen av større doser av radioaktivitet uten å endre antall injisert mol av tetrazine.

Som sendes videre i diskusjonen, biodistribution eksperimenter er av avgjørende betydning å forstå og optimalisere noen tilnærming til PRIT. I dette tilfellet ble biodistribution eksperimenter gjennomført for å fastslå den optimale intervalltiden mellom administrasjonen av immunoconjugate og injeksjon av radioligand. Dette ansatt vi athymic naken mus bærer subkutan A33 antigen-uttrykke SW1222 xenografts sin høyre skulder. Disse dyrene fikk 100 µg (0.67 nmol) av huA33-TCO 24, 48, 72 eller 120 h før injeksjon av [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz (9.14 MBq, 0.74 nmol). Figur 5 viser at alle injeksjon intervaller produsere høy aktivitet konsentrasjoner i tumor vev og lav aktivitet konsentrasjoner i friske organer. 24 h injeksjon intervallet gir det høyeste tumoral opptaket på 120 timer etter injeksjon: 21.2 ± 2.9%ID/g. Hvert sett med betingelser produserer også imponerende svulst-til-orgel aktivitet konsentrasjon prosenter. Pretargeting med en 24-timers intervall, for eksempel gir svulst-til-blod og svulst til leveren svulst-til-muskel prosenter 20 + 5, 37 ± 7 og 184 ± 30, henholdsvis 120 timer etter administrasjon av radioligand. Basert på disse resultatene, ble en 24-timers intervall valgt for påfølgende langsgående terapi studier (se nedenfor).

For i vivo langsgående terapi studien, kohorter (n = 10) athymic naken mus bærer subkutan SW1222 xenografts på deres høyre flanke var administrert huA33-TCO (100 ug, 0.67 nmol) 24 timer før injeksjon av [177Lu] Lu-DOTA-pinne 7- Tz. Tre annerledes eksperimentell kohorter ble ansatt, mottar 18,7, 37 eller 55,5 MBq [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz (tilsvarende molar aktiviteter 24, 45 og 70 GBq/µmol). I tillegg to kontroll kohorter fikk en halvdel av den PRIT diett: enten huA33-TCO (100 ug, 0.67 nmol) uten [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz eller [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz (55,5 MBq, 0.74 nmol) uten huA33-TCO. Dette er viktig kontroller for å sikre at terapeutiske svaret ikke er skapte av immunoconjugate eller radioligand alene. Volum av tumorer ble målt hver 3 dager for de første tre ukene av studier og deretter en gang pr. uke av eksperimentet (70 dager, 10 halv-livene til 177Lu). Som vist i figur 6, er det en sterk forskjell i svaret av eksperimentelle kohortene sammenlignet kontroll grupper. Svulster i mus mottar bare én komponent av PRIT strategi fortsetter å vokse ukontrollert, svulster i mus motta den fulle PRIT diett slutte å vokse og til slutt krympe til volumer godt under de måles i begynnelsen av studien. Viktigere, ikke giftig bivirkninger ble observert, og alle dyr opprettholdt en vekt i 20% av sin opprinnelige masse (figur 7A). En Kaplan-Meier tomt dataene gir en enda mer slående visualisering av studien: mens alle mus i kontroll kohortene fikk å bli euthanized innen et par ukens, musene av eksperimentelle kohortene hadde en perfekt rekord på overlevelse på slutten av undersøkelsen ( Figur 7B).

Figure 1
Figur 1: tegneserie skjematisk av pretargeted radioimmunotherapy basert på inverse elektron etterspørsel Diels-Alder reaksjonen. Dette tallet er endret fra referanse #28. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., og Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy av Colorectal Carcinoma. Molekylær Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk av byggingen av huA33-TCO. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjematisk av syntesen av Tz-pinne7- DOTA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: (A) skjematisk av radiolabeling [ 177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz; (B) representant radio-iTLC chromatogram demonstrere den > 98% radiochemical renhet av [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Biodistribution i av i vivo pretargeting med huA33-TCO og [177Lu] - DOTA - pinne7- Tz i athymic naken mus bærer subkutan SW1222 menneskelige tykktarmskreft svulster med pretargeting intervaller på 24 (lilla), 48 (grønn) , 72 (oransje) eller 120 (blå) timer. Data med vanlige feilene fra kohorter n = 4; Statistisk analyse var utført av en kort Student t-test, **p < 0,01. Dette tallet er endret fra referanse #28. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., og Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy av Colorectal Carcinoma. Molekylær Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: langsgående terapi studie av 5 mus (n = 10 hver) peiling subkutan SW1222 svulster avbildet i gjennomsnittlig svulst volum som en funksjon av tid (A), og svulst volum normalisert til første volum som en funksjon av tid (B). Kontrollgruppe fikk enten immunoconjugate uten radioligand (blå) eller radioligand uten immunoconjugate (rød). Tre behandling grupper mottatt huA33-TCO (100 µg, 0,6 nmol) fulgte 24 timer senere av enten 18,5 (grønn), 37,0 (lilla) eller 55,5 (oransje) MBq (~0.8 nmol i hvert tilfelle) av [177Lu] - DOTA - pinne7- Tz. Av Logg-rank (Mantel-Cox) test, overlevelse var signifikant (p < 0,0001) for alle behandlingsgrupper. Dette tallet er endret fra referanse #28. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., og Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy av Colorectal Carcinoma. Molekylær Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: vekt kurver for dyrene i løpet av langsgående terapi studie av 5 mus (n = 10 hver) bærer subkutan SW1222 svulster (A), tilsvarende Kaplan-Meier overlevelse kurven (B). Kontrollgruppe fikk enten immunoconjugate uten radioligand (blå) eller radioligand uten immunoconjugate (rød). Tre behandling grupper mottatt huA33-TCO (100 µg, 0,6 nmol) fulgte 24 timer senere av enten 18,5 (grønn), 37,0 (lilla) eller 55,5 (oransje) MBq (~0.8 nmol i hvert tilfelle) av [177Lu] - DOTA - pinne7- Tz. Dette tallet er endret fra referanse #28. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., og Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy av Colorectal Carcinoma. Molekylær Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sammensatte 1 H-NMR Skift HRMS (ESI)
500 MHz, DMSO
Tz-pinne7- NHBoc 10.52 (s, 1H), 8,50 (m, 3H), 7.82 (t, 1H), 7.46 (d, 2H), 6.69 (t, 1H), 4.33 (d, 2H), 3.42 (m, 22H), 3.33 (t, 2H), 3.31 (t, 2H), 3.12 (q, 2H), 2,99 (q, 2H), 2.12 (t, 2H), 2.03 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,70 (q, 2H), 1,29 (s 9 H) m/z beregnet årlig beløp. for C35H57N7O11Na: 774.4005; funnet: 774.4014.
Tz-pinne7-NH2 10.58 (s, 1H), 8.46 (m, 2H), 7.87 (t, 1H), 7,75 (d, 2H), 7.52 (d, 1H), 4,40 (d, 2H), 3,60-3,50 (m, 26H), 3,40 (t, 2H), 3.32 (bs, 2H), 3,20 (q, 2H), 2,99 (bs, 2H), 2.19 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,79 (q, 2H). m/z beregnet årlig beløp. for C30H50N7O9: 652.3670; funnet: 652.3676.
Tz-pinne7- DOTA 10.57 (s, 1H), 9.63 (bs, 1H), 8.45 (m, 3H), 7.86 (m, 1H), 7.73 (bs, 1H), 7.54 (d, 2H), 7.41 (m, 2H), 7.19 (m, 2H), 6,54 (bs, 1H), 4,40 (d, 2H), 4.00-3,20 (m, 55H) 3,20 (q, 4H), 2,54 (s, 1H), 2,18 (t, 3H), 2.10 (t, 3H), 1.76 (q 2 H). m/z beregnet årlig beløp. C50H76N11O15S: 1202.56; funnet: 1203.5741.

Tabell 1. Karakterisering dataene for de organiske forbindelsene som beskrevet i denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En av styrkene til denne tilnærmingen til i vivo pretargeting, særlig når det gjelder strategier avhenger bispecific antistoffer og radiolabeled kan, er dens Modularitet: trans- cyclooctene moieties kan legges til noen antistoff, og tetrazine radioligands kan være radiolabeled med et ekstraordinært utvalg av Radionuklider uten å svekke deres evne til å reagere med Klikk partnerne. Likevel er tilpasningen av denne tilnærmingen til andre antistoff/antigen-systemet ikke så enkelt som å duplisere protokollen beskrevet her. Selvfølgelig, bør forsøk å opprette en ny mAb-TCO-immunoconjugate eller en roman tetrazine-bærende radioligand være ledsaget av passende kjemiske og biologiske karakterisering analyser, inkludert tester for stabilitet og reaktivitet. Men utover dette, finnes det to variabler som er spesielt viktig å utforske og optimalisere: (1) masse mAb-TCO immunoconjugate administreres og (2) intervalltiden mellom injeksjon av mAb-TCO og administrasjon av radioligand. Begge faktorer kan dramatisk påvirke atferden i vivo pretargeting systemet. Bruk av altfor høye doser av immunoconjugate eller intervall perioder som er for korte kan for eksempel føre til uønskede høy aktivitet konsentrasjoner i blodet på grunn av Klikk reaksjoner mellom radioligand og immunoconjugate i sirkulasjon. Omvendt, ansette masser av immunoconjugate som er for lav eller svært lange intervall perioder kan unødig redusere aktivitet konsentrasjonene i svulsten grunnet en feil å mette antigen eller den ubønnhørlige (men sakte) isomerization av trans - cyclooctene til inaktiv cis- cyclooctene. Langs disse linjene, kan utfører biodistribution eksperimenter ved hjelp av en rekke masser av immunoconjugate og pretargeting intervaller være svært nyttig. Selvfølgelig er det også anbefalt at egnede kontroller kjøres parallelt med eksperimenter i vivo . Disse inkluderer, men er ikke begrenset til-eksperimenter med antigen-negativ cellelinjer, blokkerer kohorter mottar et stort overskudd av unconjugated antistoff, administrasjon av radioligand alene, injeksjon av radioligand etter en TCO- mangler immunoconjugate, og i vivo pretargeting bruker en uspesifisert, isotype kontroll TCO-bærende immunoconjugate.

Tenkelig eksperimenter kan også brukes for optimalisering hvis den terapeutiske radionuklidenes avgir positrons eller 'bildeområdet defineres' fotoner eller hvis en 'bildeområdet defineres' isotopologue av den terapeutiske radionuklidenes er tilgjengelig. Til slutt skal sett med variabler som gir den beste balansen mellom høy tumoral aktivitet konsentrasjoner og høy svulst-til-bakgrunn aktivitet konsentrasjon forholdstall velges for påfølgende langsgående terapi studier. I tilfellet her, 100 µg av huA33-TCO ble injisert med et intervall på 24 h. Dosimetry beregninger-særlig de som lar for beregning av svulst doser og terapeutiske forhold-kan også være nyttig under prosessen med optimalisering.

Det er viktig å merke seg at selv lovende [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz/huA33-TCO-systemet som er utviklet kan ha nytte av ytterligere optimalisering. En sammenligning mellom dosimetry data fra denne tilnærmingen til PRIT og tradisjonelle RIT med en 177Lu-merket variant av huA33 avslører at svulsten dosen av PRIT ligger under det av tradisjonelle RIT. Videre den effektive dosen av PRIT (0.054 mSv/MBq) er bare litt lavere enn tradisjonelle RIT (fra 0.068 mSv/MBq).

To rettsmidler til disse spørsmålene undersøkt for tiden. Først har en dendrittiske stillaset blitt utviklet i stand til å øke antall TCOs lagt til hver antistoff30. I forbindelse med pretargeted PET bildebehandling, øker dette dramatisk tumoral aktivitet konsentrasjoner, og tilsvarende eksperimenter med [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz er underveis. Andre kan bruk av tetrazine-bærende clearing agenter være nyttig i forbindelse med PRIT. Administrasjon av clearing agenter før injeksjon av radioligand har blitt utnyttet i en rekke pretargeting metoder som en måte å redusere konsentrasjonen av gjenværende immunoconjugate i blodet og dermed redusere aktivitet konsentrasjonene i sunn organer23,31. Bruk av fjerne agenter er ikke uten sine ulemper, skjønt; den mest bemerkelsesverdige som øker kompleksiteten i en allerede riktignok komplisert terapeutisk modalitet. Likevel publisert forskere ved Memorial Sloan Kettering Cancer Center nylig en overbevisende rapport på etablering en Tz-merket dekstran fjerne agent for pretargeted PET imaging, og data om for denne konstruere sammen med [177Lu] Lu-DOTA-pinne7- Tz og huA33-TCO er kommende32. En annen tilnærming til å maksimere dosimetric fordelene ved PRIT er bruk av Radionuklider med kortere fysiske halv-liv. Dette har vist seg svært effektiv for bildebehandling; men er terapeutiske Radionuklider med korte fysiske halv-liv få og langt mellom.

Til slutt, vi ville være remiss hvis vi ikke riktig adresse noen av iboende begrensninger av pretargeting basert på inverse elektron etterspørsel Diels-Alder reaksjonen. Først av disse problemene er iboende til alle tilnærminger til i vivo pretargeting: antistoffer ansatt kan ikke være internalisert ved binding til vevet. Dette er selvfølgelig viktig, som antistoffer må være tilgjengelig for radioligand snarere enn sequestered i en intracellulær kupeen. Denne begrensningen er riktignok vanskelig å omgå, men det har vist nylig at antistoffer med treg til moderate priser introvert kan brukes i vivo pretargeting33,34. Andre treg i vivo -isomerization av reaktive trans -cyclooctene til inaktiv cis -cyclooctene har potensial til å begrense lengden på intervallet mellom administrasjonen av TCO-bærende immunoconjugate og injeksjon av radioligand. Kritisk, har intervaller på opptil 120 timer fortsatt gitt gode resultater i konteksten av begge pretargeted PET tenkelig og PRIT. Bruk av disse lengre intervaller er imidlertid nesten alltid ledsaget av liten reduksjon i tumoral aktivitet konsentrasjoner, et resultat som kan stamme fra denne isomerization. For å løse dette problemet, har flere laboratorier forsøkt å skape mer stabil trans- cyclooctenes uten at reaktivitet, mens andre har forsøkt å utvikle helt nye dienophiles kan reagere med tetrazine35 . I de kommende år er det vårt håp at disse kjemiske utviklingen vil utnyttes for PRIT.

Til slutt er PRIT basert på inverse elektron etterspørsel Diels-Alder hemorroider unektelig en emergent og litt umoden teknologi. Men er vi likevel oppmuntret av prekliniske resultatene vi har oppnådd og begeistret for klinisk løfte om denne strategien. Vi håper at denne protokollen oppfordrer andre til å utforske og optimalisere denne tilnærmingen og dermed drivstoff sin reise fra laboratoriet til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Jacob Houghton for nyttig samtaler. Forfatterne vil også gjerne takke NIH for deres generøse finansiering (R00CA178205 og U01CA221046).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
  2. Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
  3. Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
  4. Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
  5. Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin's Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
  6. Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
  7. Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
  8. Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
  9. Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
  10. van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
  11. Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
  12. Goldenberg, D. M., Chatal, J. -F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
  13. Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
  14. Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
  15. Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Cancer Research. 76 (22), 6669 (2016).
  16. Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
  17. Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
  18. Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
  19. Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
  20. Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
  21. Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
  22. Meyer, J. -P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
  23. Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
  24. Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  26. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
  27. Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
  28. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
  29. Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
  30. Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
  31. Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
  32. Meyer, J. -P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
  33. Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
  34. Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
  35. Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).

Tags

Kjemi problemet 143 radioimmunotherapy pretargeted radioimmunotherapy pretargeting omvendt elektron etterspørsel Diels-Alder reaksjon tetrazine trans- cyclooctene huA33 A33 antigen lutetium-177
Pretargeted Radioimmunotherapy basert på Inverse Electron etterspørsel Diels-Alderreaksjonen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis,… More

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis, B. M. Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (143), e59041, doi:10.3791/59041 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter