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Chemistry

Radioinmunoterapia pretargeted basada en la reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

Este protocolo describe la síntesis y caracterización de un transporte- cyclooctene (TCO)-modifica un radioligando de Lu-labeled tetrazina (Tz) 177para radioinmunoterapia pretargeted (PRIT) y el anticuerpo. Además, detalla el uso de estas dos construcciones en vivo biodistribución y estudios longitudinales de la terapia en un modelo murino de cáncer colorrectal.

Abstract

La radioinmunoterapia (RIT) es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer, la vida media larga farmacocinética de anticuerpos radiactivos puede resultar en altas dosis de radiación a los tejidos sanos. Tal vez no es de extrañar varias estrategias diferentes se han desarrollado para eludir esta limitación preocupante. Uno de los más prometedores de estos enfoques es pretargeted radioinmunoterapia (PRIT). PRIT se basa en disociar el radionúclido de la inmunoglobulina, inyectarlas por separado y luego lo que les permite combinar en vivo en el tejido diana. Este enfoque aprovecha las propiedades excepcionales de tumor targeting de anticuerpos mientras que bordea sus inconvenientes farmacocinéticos, bajar las dosis de radiación a los tejidos no Diana y facilitar el uso de radionúclidos con vidas medias que son considerado demasiado corto para uso en radioimmunoconjugates tradicional. En los últimos cinco años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado un enfoque en vivo pretargeting basa en la reacción de Diels-Alder (IEDDA) de demanda electrónica inversa entre transporte- cyclooctene (TCO) y tetrazina (Tz). Esta estrategia se ha aplicado con éxito a pretargeted tomografía por emisión de positrones (PET) y computarizada por emisión de fotón único tomografía (SPECT) proyección de imagen con una variedad de sistemas antígeno-anticuerpo. En un par de publicaciones recientes, hemos demostrado la eficacia de PRIT IEDDA basado en modelos murinos de adenocarcinoma ductal de páncreas y carcinoma colorrectal. En este protocolo, describimos protocolos por PRIT usando un radioligando de 177Lu-DOTA-labeled tetrazina (Lu-DOTA-PEG [177Lu]7- Tz) y una variante modificada de TCO del cáncer colorrectal a anticuerpo huA33 (huA33-TCO). Más concretamente, vamos a describir la construcción de huA33-TCO, la síntesis y de Lu-DOTA-PEG radiolabeling de [177Lu]7- Tz y el rendimiento de biodistribución en vivo y estudios longitudinales terapia en modelos murinos de carcinoma colorrectal.

Introduction

La radioinmunoterapia (RIT), el uso de anticuerpos para la entrega de los radionucleidos terapéuticos para tumores — ha sido un enfoque atractivo para el tratamiento de cáncer1,2. De hecho, esta promesa ha sido puesto de relieve por la aprobación de los Estados Unidos administración de alimentos y drogas de dos radioimmunoconjugates para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin: 90Y-ibritumomab tiuxetan y 131-tositumomab3 , 4. sin embargo, incluso desde sus primeros días, las perspectivas clínicas de RIT han visto obstaculizadas por una complicación crítica: las tasas de dosis alta de radiación a tejidos sanos5,6. En general, radioimmunoconjugates de RIT están marcados con radionucleidos de larga vida (p. ej., 131I [t½ = 8,0 días] y 90Y [t½ = 2,7 días]) con vida media física que encajar bien con la largo farmacocinética vida media de las inmunoglobulinas. Esto es esencial, como asegura que eso suficiente radiactividad sigue siendo una vez que el anticuerpo ha alcanzado su biodistribución óptimos después de varios días de circulación. Sin embargo, esta combinación de tiempos de residencia largos en la sangre y vida media larga física resulta inevitablemente en la irradiación de los tejidos sanos, lo que reducir la relación terapéutica y limitar la eficacia de la terapia7. Se han explorado diversas estrategias para evitar este problema, incluyendo el uso de fragmentos de anticuerpos truncado como Fab, Fab', F(ab')2, minibodies y nanobodies8,9,10. Una de las más prometedoras y fascinante, pero indudablemente complejos enfoques alternativos es en vivo pretargeting11.

En vivo pretargeting es una aproximación a la proyección de imagen nuclear y la terapia que busca aprovechar la exquisita afinidad y selectividad de anticuerpos mientras bordeando sus inconvenientes farmacocinéticos11,12,13. Para ello, los anticuerpos radiactivos utilizados en la radioinmunoterapia tradicional es deconstruido en dos componentes: un radioligando de molécula pequeña y un immunoconjugate que puede enlazar tanto un antígeno de tumor y el ya mencionado así. El immunoconjugate se inyecta primero y da una ventaja, a menudo varios días, durante el cual se acumula en el tejido diana y elimina de la sangre. Posteriormente, se administra el radioligando de molécula pequeña y combina con el immunoconjugate en el tumor o elimina rápidamente del cuerpo. En esencia, en vivo pretargeting se basa en realizar radiochemistry dentro del propio cuerpo. Al reducir la circulación de la radiactividad, este enfoque reduce la dosis de radiación a los tejidos sanos y simultáneamente facilita el uso de radionucleidos (p. ej., 68Ga, t½ = min 68211; Como t½ = 7,2 h) con vida media que normalmente se considera incompatible con vectores basados en anticuerpos.

A partir de la década de 1980, un puñado de diferentes enfoques en vivo pretargeting han sido desarrollados, incluyendo estrategias basadas en la interacción estreptavidina-biotina, tienen anticuerpos y la hibridación de complementarios oligonucleótidos14,15,16,17,18. Pero cada uno se ha celebrado nuevamente en diversos grados por complicaciones, más famosa la inmunogenicidad potente de anticuerpos modificados de estreptavidina19,20. En los últimos cinco años, nuestro grupo y otros han desarrollado un enfoque en vivo pretargeting basa en la ligadura rápido y bioorthogonal inversa electrónica demanda Diels-Alder entre transporte- cyclooctene (TCO) y tetrazina (Tz) 2122,de,23,24. La más exitosa de estas estrategias ha utilizado un anticuerpo modificado de TCO y un radioligando Tz-cojinete, como TCO es normalmente más estable en vivo que su Tz socio (figura 1)25,26. Como en otras metodologías pretargeting, el immunoconjugate mAb-TCO es administrado en primer lugar y dado el tiempo para borrar de la circulación y se acumulan en el tejido del tumor. Posteriormente, se inyecta el radioligando Tz de molécula pequeña, después de lo cual hace clic con el immunoconjugate dentro del tejido de destino o elimina rápidamente del cuerpo. Esta en vivo pretargeting estrategia ha demostrado ser altamente eficaz para PET y SPECT proyección de imagen con varios sistemas diferentes anticuerpos/antígeno, constantemente produciendo imágenes con alto contraste y que permite el uso de radionuclides de breve duración tales como 18 F (t½ = 109 min) y 64(t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Más recientemente, la eficacia de la base haga clic en la radioinmunoterapia pretargeted (PRIT) ha demostrado en modelos murinos de la adenocarcinoma ductal pancreática (PDAC) y carcinoma colorrectal27,28. Para ello, la terapéutica con radionúclidos 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 días) fue empleado junto con dos anticuerpos diferentes: 5B1, que apunta a antígeno carbohidrato 19.9 (CA19.9) ubicuo expresado en PDAC , y huA33, que dirige el A33, una glicoproteína transmembrana expresa en > 95% de los cánceres colorrectales. En ambos casos, este enfoque 177Lu-PRIT produjo concentraciones de alta actividad en tejido tumoral creó un efecto terapéutico dependiente de la dosis y al mismo tiempo reduce las concentraciones de actividad en los tejidos sanos en comparación con el tradicional directamente-con la etiqueta radioimmunoconjugates.

En este artículo, describimos protocolos por PRIT usando un radioligando de 177Lu-DOTA-labeled tetrazina (Lu-DOTA-PEG [177Lu]7- Tz) y una variante modificada de TCO del anticuerpo huA33 (huA33-TCO). Más específicamente, se describe la construcción de huA33-TCO (figura 2), la síntesis y de Lu-DOTA-PEG radiolabeling de [177Lu]7- Tz (figura 3 y figura 4) y el rendimiento de en vivo biodistribución y estudios longitudinales terapia en modelos murinos de carcinoma colorrectal. Además, en los resultados representativos y discusión, presentamos un conjunto de datos de muestra, posibles estrategias de dirección para la optimización de este enfoque y considerar esta estrategia en el contexto más amplio de en vivo pretargeting y PRIT. Por último, es importante tener en cuenta que si bien hemos optado por centrarse en pretargeting con huA33-TCO y [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz en este protocolo, esta estrategia es altamente modular y se puede adaptar a una amplia gama de anticuerpos y radionúclidos.

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Protocol

Todos en vivo animal los experimentos descritos en este trabajo fueron realizados según protocolos aprobados y ejecutados bajo los lineamientos éticos del Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center y Hunter College Cuidado institucional de los animales y los comités de uso (IACUC).

1. la preparación de huA33-TCO

Nota: La síntesis de huA33-TCO ha sido previamente reportado29. Sin embargo, para facilidad del lector, que es replicado aquí con ajustes para las condiciones óptimas.

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, prepare una solución de 125 μL de (E) - cyclooct - 4-propenil 2, 5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonato (TCO-NHS) en seco dimetil formamida (DMF) en una concentración de 40 mg/mL (0,15 M). Esta solución puede alícuotas congeladas a-80 ° C para su uso en futuros experimentos.
  2. En un tubo de microcentrífuga separada 1,7 mL, prepare una solución de 5 mg/mL de huA33 en 1 mL de tampón fosfato salino (PBS; 2,7 mM cloruro de potasio, cloruro de sodio de 137 mM y 11,9 mM fosfato potasio, fosfato, pH 7,4).
  3. Utilizando pequeñas alícuotas (< 5 μL) de 0,1 M Na2CO3, ajustar el pH de la solución de anticuerpo de paso 1.2 8.8-9.0. Utilizar papel pH o un medidor de pH con un microelectrodo para vigilar el pH y tenga cuidado que el pH no sea mayor a 9.0.
  4. A la solución de anticuerpo descrita en el paso 1.3, agregue lentamente un volumen correspondiente a 40 molares equivalentes de TCO-NHS en relación con la cantidad de anticuerpos. Por ejemplo, si 5 mg (30 nmol) de huA33 está en la solución, añadir 9,0 μL (1,20 μmol) de la solución de 40 mg/mL (0,15 M) de TCO-NHS.
    Nota: TCO-NHS es hidrofóbico. Cuando se agrega a la solución de anticuerpo, agregar lentamente y con agitación para evitar la precipitación. No exceda 10% DMF en volumen de la solución de reacción final.
  5. Permite la reacción a incubar a 25 ° C en un Termomezcladores de 1 h con suave agitación (500 rpm).
  6. Después de 1 h, purificar el immunoconjugate huA33-TCO usando una columna de desalación de exclusión de tamaño desechable empacadas.
    1. Equilibrar la columna de exclusión de tamaño como se describe por el proveedor para eliminar conservantes presentes en la columna durante el almacenamiento. Un procedimiento típico consiste en lavar la columna 5 x con un volumen de PBS que corresponde al volumen de la columna: 5 x 2, 5 mL de PBS.
    2. Añadir la mezcla de reacción a la columna de exclusión de tamaño teniendo en cuenta el volumen de la mezcla de reacción.
    3. Después de la mezcla de reacción ha entrado en la columna, agregar una cantidad apropiada de PBS para llevar el volumen total de solución añadida a la columna a 2,5 mL. Por ejemplo, si la reacción verbal dio lugar a un volumen total de 1,3 mL, agregar 1,2 mL de PBS adicional a la columna.
    4. Recoger el producto con 2 mL de PBS como eluyente.
      Nota: Este paso dará el final de la construcción huA33-TCO en 2 mL de PBS, pH 7,4.
  7. Medir la concentración de la TCO de huA33 usando un espectrofotómetro UV-Vis, control de la longitud de onda de 280 nm. El coeficiente de extinción molar para IgGs la mayoría (ε280) es de 210.000 M-1cm-1.
  8. Si se desea una solución con una concentración más alta de immunoconjugate, concentrar la solución de huA33-TCO con una unidad de filtro centrífugo de un corte de peso molecular 50.000 siguiendo las instrucciones del fabricante.
    Nota: Muchos anticuerpos se han sabido para agregado o precipitar durante la concentración. Al intentar este procedimiento con un nuevo anticuerpo, los investigadores deben aplazar hasta la literatura o su propia experiencia el anticuerpo en cuestión.
  9. Almacenar el immunoconjugate terminado huA33-TCO a 4 ° C en la oscuridad, si es necesario inmediatamente. Si se va a utilizar más de 4 días en el futuro, almacenar a-80 ° C en la oscuridad.
    Nota: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El immunoconjugate terminado huA33-TCO debe ser estable para el almacenamiento de al menos 6 meses a-80 ° C en la oscuridad.

2. la síntesis de Tz-PEG7- NHBoc

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, disolver 5 mg de tetrazina N- hydroxysuccinimidyl ester (Tz-NHS; 12,6 μmol) de 0.15 mL de anhidro dimetil sulfóxido (DMSO).
  2. En un tubo de microcentrífuga separada 1,7 mL, disolver 8 mg de Boc-protegido amino PEG polímero, glicol O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene (NHBoc-PEG7-NH2; 17.1 μmol) de 0.15 mL de DMSO anhidro.
  3. A la solución de Tz-NHS, agregar 3 μL (21,3 μmol, 1,7 equivalentes molares) de trietilamina (TEA) y mezclar bien.
  4. Añadir la solución rosa tetrazina para la solución de PEG NHBoc7-NH2 del paso 2.2 e incubar la mezcla de reacción durante 30 min a temperatura ambiente (RT) con agitación suave.
  5. Después de 30 minutos, diluir la reacción 1:1 en H2O y purificar la reacción utilizando cromatografía líquida del alto rendimiento de la18 C fase inversa (CLAR) para separar cualquier Tz-NHS no reaccionado de la Tz-PEG7- NHBoc. Utilice disolventes sin ácido para evitar la eliminación prematura de la Boc protección de grupo. Monitorear ambos Tz-PEG7- NHBoc y Tz-NHS en una longitud de onda de 525 nm.
    Nota: Tiempos de retención son obviamente muy dependientes de los equipos de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubería, etcetera), y los controles adecuados se deben ejecutar antes de la purificación. Sin embargo, presentar un ejemplo, si un gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos sin ningún aditivo) a 95: 5 MeCN/H2O más de 30 min, se utilizan un caudal de 1 mL/min y una columna de18analítica 4,6 x 250 mm C , los tiempos de retención de NHS Tz y Tz-PEG7- NHBoc son alrededor de 16 minutos y 18 minutos, respectivamente.
  6. Congelar el eluyente recogido de HPLC utilizando nitrógeno líquido y envuelva el tubo de la colección congelado ahora en papel de aluminio. Lugar el tubo de la colección congelado en un liofilizador durante la noche para eliminar la fase móvil de HPLC. El producto será un sólido de color rosa brillante característico.
    Nota: Si no hay nitrógeno líquido congelar el eluyente HPLC recogido en hielo seco o durante la noche en un congelador de-80 ° C.

3. la síntesis de Tz-PEG7-NH2

  1. Al producto del paso 2.6, Tz-PEG7- NHBoc, añadir 1,5 mL de diclorometano (DCM) y transferir esta solución a un matraz de fondo redondo pequeño.
  2. Añadir 0,25 mL de ácido trifluoroacético (TFA) gota a gota a la solución de rosa de paso 3.1.
  3. Permite la reacción a incubar por 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.
  4. Después de 30 min, evaporar el solvente a través de evaporación rotatoria. No exceda una temperatura de baño de agua de 37 ° C.
  5. Reconstituir el producto viscoso rosado en 0,5 mL de agua.
  6. Purificar el producto usando fase inversa C18 HPLC para separar Tz-PEG7-NH2 del precursor Boc-protegido. Monitorear ambos Tz-PEG7- NHBoc y Tz-PEG7NH -2 en una longitud de onda de 525 nm.
    Nota: Tiempos de retención son obviamente muy dependientes de los equipos de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubería, etcetera), y los controles adecuados se deben ejecutar antes de la purificación. Sin embargo, presentar un ejemplo, si un gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos con 0.1% TFA) a 95: 5 MeCN/H2O más de 30 min, se utilizan un caudal de 1 mL/min y una columna de18analítica 4,6 x 250 mm C , los tiempos de retención de Tz-PEG7- NHBoc y Tz-PEG7-NH2 son alrededor de 18 minutos y 13 minutos, respectivamente.
  7. Congelar el eluyente recogido de HPLC utilizando nitrógeno líquido y envuelva el tubo de la colección congelado ahora en papel de aluminio. Lugar el tubo de la colección congelado en un liofilizador durante la noche para eliminar la fase móvil de HPLC. El producto será un sólido de color rosa brillante.
  8. Reconstituir el producto de paso 3.7, Tz-PEG7-NH2, con 150 μL de DMSO y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
  9. Medir la concentración de PEG de Tz7-NH2 usando un espectrofotómetro UV-Vis, control de la longitud de onda de 525 nm. El coeficiente de extinción molar para Tz-PEG7-NH2 (ε525) es 535 M-1cm-1.

4. la síntesis de Tz-PEG7- DOTA

  1. Disolver Tz-PEG7-NH2 (4.5 mg, 6,9 μmol) de 0.15 mL de DMSO (o simplemente proceder con la solución creada en paso 3.8).
  2. Añadir 22 equivalentes molares de té (μL 21, 0,15 mmol) a la solución que contiene la tetrazina del paso 4.1.
  3. Añadir 10 mg (14.2 μmol) de p- SCN-Bn-DOTA como un sólido y agitar la solución durante unos 2 minutos o hasta que se haya disuelto completamente el material.
  4. Permite la reacción a incubar por 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.
  5. Después de 30 min, diluir la reacción 1:1 en H2O y purificar el producto usando fase inversa C18 HPLC para quitar p- SCN-Bn-DOTA. El p- SCN-Bn-DOTA puede ser monitoreado en una longitud de onda de 254 nm, mientras que la Tz-PEG7- DOTA se controla mejor a una longitud de onda de 525 nm.
    Nota: Tiempos de retención son obviamente muy dependientes de los equipos de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubería, etcetera), y los controles adecuados se deben ejecutar antes de la purificación. Sin embargo, presentar un ejemplo, si un gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos con 0.1% TFA) a 95: 5 MeCN/H se utilizan2O más de 30 min y una columna de18analítica 4.6 x 250 mm C, Tz-PEG7- DOTA y p-SCN-Bn-DOTA tienen tiempos de retención de alrededor de 15,6 min y min 16,1, respectivamente.
  6. Congelar el eluyente recogido de HPLC utilizando nitrógeno líquido y envuelva el tubo de la colección congelado ahora en papel de aluminio. Lugar el tubo de la colección congelado en un liofilizador durante la noche para eliminar la fase móvil de HPLC. El producto será un polvo de color rosa brillante.
  7. Reconstituir el producto en 0,15 mL de DMSO y medir la concentración usando un espectrofotómetro UV-Vis, control de la longitud de onda de 525 nm. El coeficiente de extinción molar para Tz-PEG7- DOTA (ε525) es 535 M-1cm-1.
  8. Analizar el compuesto final por resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) para verificar esa síntesis era acertado. Vea la tabla 1 para el determinado experimentalmente cambios químicas y pesos moleculares de todos los compuestos que se discuten en este trabajo.
  9. Tienda la solución purificada de - DOTA de7Tz-PEG en la oscuridad a-80 ° C.
    Nota: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El precursor de - DOTA completo de Tz-PEG7es estable durante al menos 1 año en estas condiciones.

5. 177Lu Radiolabeling de Tz-PEG7- DOTA

Atención: Este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos, o realizar cualquier otro trabajo con la radiactividad, los investigadores deben consultar con el Departamento de seguridad de radiación de su institución de origen. Tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante.

Nota: Cuando se trabaja con pequeñas cantidades de radiometals se recomienda que todos los búferes está libre de metales traza para evitar interferencia en el enlace de la página de coordinación.

  1. En un tubo de centrífuga de 1,7 mL, añadir 200 μL de tampón de acetato de amonio de 0,25 M ajustado con alícuotas de 1 M de HCl a pH 5.5.
    Nota: Si utiliza menos de 370 MBq de actividad para el etiquetado, debe reducirse el volumen de tampón usado a 100 μl.
  2. Añadir la cantidad deseada de [177Lu] LuCl3 a la solución tampón. La cantidad añadida será dependiente en el número de sujetos en el experimento y la dosis radiactiva se administra. Se recomienda agregar 1-2 dosis adicionales vale la pena de la radiactividad como medida de precaución para compensar la posible pérdida de radiactividad durante los pasos de purificación.
  3. Añadir Tz-PEG7- DOTA en DMSO a la mezcla radiactiva paso 5.2. La cantidad de Tz-PEG7- DOTA es dependiente en el número de sujetos de prueba. Más detalles sobre este tema pueden encontrarse en el paso 6.2.2.2.
  4. Deje que la solución de incubar a 37 ° C durante 20 minutos.
  5. Verificar que el radiolabeling es completa con cromatografía de capa fina instantánea de radio (radio-objetivo) de 50 mM EDTA, pH 5.5 como fase móvil. La etiqueta [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz se mantendrá en la línea de base: Rf = 0, mientras gratis [177Lu] Lu3 + será coordinada por el EDTA y viajará con el frente del disolvente, Rf = 1.0 (figura 3B).
  6. Si no se logra el etiquetado cuantitativo, agregar adicional ligando para coordinar el radiometal gratis. Alternativamente, purificar la etiqueta [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz con un cartucho de18 C. Siga las instrucciones del fabricante para su uso. Un procedimiento de la muestra se expone a continuación.
    1. Cebe el cartucho lentamente pasando por 5 mL de etanol a través del cartucho con una jeringa grande. Luego, pasar 5 mL de acetonitrilo y 5 mL de desionizada (DI) H2O.
    2. Elaborar la solución así de paso 5.3 en una jeringa más pequeña e inyectar lentamente en el cartucho de18 C. Luego, lavar el cartucho con 10 mL de DI H2O para quitar cualquier desatado [177Lu] LuCl3.
    3. Eluir con 500 μl de etanol. Quite cualquier etanol del producto final pasando por encima el vaso con un bajo caudal de nitrógeno seco o argón de 10-15 minutos. Posteriormente, Resuspender el radioligando en solución salina en un volumen determinado en el paso 6.2.2.2.

6. estudios in vivo

PRECAUCIÓN: Al igual que en la sección 5, este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos, los investigadores deben consultar con el Departamento de seguridad de radiación de su institución de origen. Tomar todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante.

  1. Preparación de animales
    1. En ratones desnudos athymic femeninos, implante subcutáneo 5 x 106 SW1222 células de cáncer colorrectal en 150 μL de una mezcla 1:1 de los medios de comunicación de la célula y la matriz (e.g., Matrigel) y permiten crecer en un xenoinjerto de3 100-150 m m (14-18 días después de la inoculación).
    2. Clasificación de los animales para un experimento de biodistribución
      1. Una vez que los tumores son de tamaño suficiente según lo determinado por la medición del calibre, ordenar los animales para cada cohorte tiene aproximadamente el mismo volumen de tumor promedio. Los animales pueden ser distinguidos en cada jaula por las marcas en la cola con tinta indeleble (dos bandas, una banda, etc.).
    3. Clasificación de los animales para un estudio longitudinal de la terapia
      1. Una vez que los tumores son de tamaño suficiente según lo determinado por la medición del calibre, adjuntar etiquetas de oreja a cada uno de los animales para asegurar el correcto seguimiento durante todo el experimento.
        Nota: Marcas auriculares numéricos pueden caerse en el transcurso del experimento. Como resultado, se recomienda para acompañar estas etiquetas físicas con las muescas de la oreja de manera sistemática (es decir., derecha, izquierda, bilateral, derecho x 2, x 2 de la izquierda).
      2. Clasificar los animales por lo que el volumen promedio del tumor en cada cohorte es aproximadamente igual. El siguiente método para la clasificación de animales puede realizarse con un programa de hoja de cálculo.
        1. Lista de los números de identificación de animales, diseño de ranuras de oído y volumen del tumor en tres columnas separadas.
        2. Ordenar los datos de menor a mayor volumen de tumor.
        3. En la cuarta, asignar cada animal un número de jaula y ciclo a través de las jaulas en forma de serpiente. Por ejemplo, si hay 5 jaulas, esta columna sería lleno "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." hasta que todos los animales se les asigna una jaula.
        4. Una vez que se asignan las jaulas, ordenar los datos por número de jaula. Si se utilizan muescas de oreja, asegúrese de que cada animal en una jaula dada tiene un patrón de ranura única oreja. Si hay duplicados (dos o más del mismo patrón) en una determinada jaula, intercambio un ratón con una de la otra jaula con el patrón que falta hasta cada jaula tiene animales con patrones de muesca único oído.
  2. Formulaciones y las inyecciones
    Nota: La secuencia de inyección para el estudio de biodistribución y terapia procede como sigue: huA33-TCO se inyecta en primer lugar, seguido por [177Lu] Lu-DOTA-PEG7Tz - después de un intervalo determinado.
    1. Immunoconjugate
      1. Diluir una alícuota de la solución de huA33-TCO de 1,9 de paso a una concentración de 0,8 mg/mL en solución salina estéril 0,9%.
      2. Extraer la dosis de 150 μL (100 μg) de solución de huA33-TCO en jeringuillas pretratadas con 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS y almacenar las jeringas en el hielo.
        Nota: BSA el tratamiento reduce el atascamiento no específico de los anticuerpos a las paredes de la jeringa.
      3. Caliente los animales bajo una lámpara de calor durante 3 minutos dilatar la vena de la cola.
      4. Inyectar la solución de huA33-TCO en la vena de la cola del ratón xenoinjerto-cojinete. Permitir 24 h (o un intervalo de tiempo determinado diferentes) para que el huA33-TCO se acumule en el tumor del ratón.
    2. Así
      1. Radiolabel Tz-PEG7- DOTA como se indica en la sección 5.
      2. Llamar la dosis en 150 μL de 0.9% estéril salina que contiene 1,1 equivalentes molares de Tz-PEG7administrado - DOTA en relación con la cantidad de huA33-TCO. Por ejemplo, si 100 μg (0.67 nmol) de huA33-TCO fue inyectada en el animal y la mezcla de reacción [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz fue hecha con una actividad específica de 12,4 GBq/μmol, luego dosis se dibujarán con 9.14 MBq de actividad cada. Esto corresponde a 0,74 nmol de Tz (1.1 ecuación molar relativa a huA33-TCO).
      3. Caliente los animales bajo una lámpara de calor de 3 min dilatar la vena de la cola.
      4. Inyectar la dosis de radioligando en la vena de la cola del ratón xenoinjerto-cojinete. La cantidad de actividad a inyectar es determinada por el investigador. Datos publicados han demostrado efectos terapéuticos dosis dependiente en el tamaño del tumor dentro de un rango de 7.4-55.5 MBq.
  3. Biodistribución
    1. En el momento deseado después de la administración de la así, eutanasia cada cohorte de ratones utilizando un 2% O2 / 6% CO2 gas mezcla.
      Nota: Siga los requisitos institucionales sobre métodos de eutanasia física secundaria (por ejemplo, la dislocación cervical).
    2. Para cada animal, quiten todos los órganos de interés, en un baño de agua para quitar cualquier exceso de sangre y secarlos en una toalla de papel al aire libre por 5 minutos muestra órgano lista sugerida orden: sangre, tumor, corazón, pulmones, hígado, bazo, estómago, intestino delgado , intestino, riñones, músculo, hueso, piel, cola.
    3. Una vez suficientemente seco, colocar los órganos en tubos de cultivo desechables previamente pesado. Pesar los tubos llenos de ahora una vez más para obtener la masa de cada órgano o tejido.
    4. Medir la actividad en cada uno de los tubos mediante un contador gamma. Calibrar la actividad medida en el contador gamma para el detector utilizado para medir la dosis dibujada. Cuenta estándares radioactivos de 177Lu en cada instrumento y determinar un factor de calibración para la interconversión entre la actividad y las cuentas por minuto (cpm).
    5. Parcela los datos de biodistribución como un gráfico de barras (ver figura 5) con la media normalizada captación de cada órgano junto con un bar que denotan una desviación estándar. Diferencias estadísticas en la absorción entre los grupos de la muestra pueden evaluarse por una prueba de t no pareada, en la que se obtiene significación cuando p < 0.05.
  4. Seguimiento farmacoterapéutico
    1. Utilizando pinzas, medir el lado más largo del tumor oblongo (longitud) así como la anchura, que es perpendicular a la longitud. Calcular volumen utilizando la fórmula para el volumen de un elipsoide: πL· (4/3) W· H, lo que simplifica a ½L· W2, suponiendo que la altura es aproximadamente igual a la anchura.
      Nota: También es posible utilizar un tumor mano medidor si uno está disponible (véase Tabla de materiales).
    2. Pesar cada ratón en un equilibrio para seguir el aumento de peso o pérdida de peso con el tiempo.
    3. Lo importante es controlar el aspecto físico de cada animal para detectar signos de peligro, tales como encorvada hacia atrás o rotos vasos sanguíneos cutáneos (que puede indicar hematotoxicidad).
      Nota: Las medidas del Tumor deben ser recogidas cada 1-2 días durante el curso del estudio longitudinal de la terapia.
    4. Datos de la terapia longitudinal estudian volúmenes tumorales como promedio en el tiempo y normalizan a partir de volumen del tumor si se desea. Diferencias estadísticas en la absorción en el mismo día entre los grupos de la muestra pueden evaluarse por una prueba de t no pareada, en la que se obtiene significación cuando P < 0.05. Análisis estadísticos más extensos pueden y deben llevarse a cabo según las recomendaciones de un bioestadístico entrenado.

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Representative Results

La conjugación de TCO a huA33 se basa en el acoplamiento entre el amina reactiva TCO-NHS y los residuos de lisina en la superficie de la inmunoglobulina. Este método es altamente robusta y reproducible y fiable produce un grado de-etiquetas de 2-4 TCO/mAb. En este caso, espectrometría de masas MALDI-ToF se empleó para confirmar un grado de etiquetado de aproximadamente 4.0 TCO/mAb; se obtuvo un valor similar utilizando un tetrazina fluoróforo modificado como un reportero24. La síntesis del ligando tetrazina se realiza en tres pasos: (1) el acoplamiento de Tz-NHS a un vinculador de clavija mono-Boc-protegido (2) la desprotección de este intermedio a producción Tz-PEG7-NH2y (3) la formación de una vinculación de tiourea p- SCN-Bn-DOTA y Tz-PEG7-NH2. Este procedimiento es relativamente fácil y brinda Tz-PEG7- DOTA en un rendimiento total de ~ 75%. Cada uno de los intermedios se ha caracterizado por HRMS y 1H-NMR; Esta información se presenta en la tabla 1.

Pasando al radiolabeling, 177Lu3 + por lo general se obtiene de proveedores comerciales como un cloruro de sal [177Lu] LuCl3 de 0,5 M de HCl. El radiolabeling de Tz-PEG7- DOTA con 177Lu ceder el radioligando [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz es muy sencillo: en sólo 20 minutos, la reacción es completa, produciendo el producto deseado en > 99% radioquímico pureza por radio-objetivo. Por lo general, no es necesario antes de la formulación purificación adicional. Una encuesta de la literatura en Tz/TCO-based pretargeting sugiere que un cociente molar de Tz:mAb de ~ 1:1 produce mejor en vivo datos10. Como resultado, no es esencial para obtener el radioligando en el más alto posible actividad molar. Por ejemplo, experimentos de biodistribución discutieron aquí emplean [177Lu] Lu-DOTA-PEG7Tz - con una actividad molar de ~ 12 GBq/μmol. Estudios longitudinales de la terapia, en cambio, [177Lu] Lu-DOTA-PEG7Tz - con mayor actividad molar fue utilizado para facilitar la administración de grandes dosis de radiactividad sin cambiar el número de moles inyectados de tetrazina.

Como se abordará más en la discusión, experimentos de biodistribución son de primordial importancia para comprender y optimizar cualquier acercamiento a PRIT. En este caso, se realizaron experimentos de biodistribución para determinar el intervalo óptimo entre la administración de la immunoconjugate y la inyección del radioligando. Para ello, empleamos ratones desnudos athymic con xenoinjertos de SW1222 expresando antígeno A33 subcutáneos en su hombro derecho. Estos animales recibieron 100 μg (0.67 nmol) de 24, 48, 72 o 120 h antes de la inyección de [177Lu] Lu-DOTA-PEG7de huA33-TCO - Tz (9.14 MBq, 0,74 nmol). La figura 5 muestra que los intervalos de inyección producen concentraciones de alta actividad en el tejido del tumor, así como concentraciones de actividad baja en órganos sanos. El intervalo de inyección 24 h ofrece la más alta captación tumoral en después de la inyección 120 h: 21.2 ± 2.9%ID/g. Cada conjunto de condiciones también produce relaciones de concentración impresionante de tumor a órganos de actividad. Pretargeting con un intervalo de 24 h, por ejemplo, rendimientos de tumor a la sangre, tumor de hígado y tumor del músculo ratios de 20 ± 5, 37 ± 7 y 184 ± 30, respectivamente, 120 h después de la administración del radioligando. Basado en estos resultados, un intervalo de 24 h fue elegido para el estudio longitudinal posterior de la terapia (véase abajo).

Para el en vivo estudio longitudinal terapia, cohortes (n = 10) de ratones desnudos athymic SW1222 subcutáneo xenoinjertos en su flanco derecho fueron administrado huA33-TCO (100 ug, 0.67 nmol) 24 horas antes de la inyección de [177Lu] Lu-DOTA-PEG 7- Tz. Se utilizaron tres diferentes cohortes experimentales, recibiendo 18.7, 37 o 55.5 MBq [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (correspondiente a actividades molares de 24, 45 y 70 GBq/μmol). Además, dos cohortes de control recibieron una mitad del régimen PRIT: ya sea huA33-TCO (100 ug, 0.67 nmol) sin [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz o [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (55.5 MBq, 0,74 nmol) sin huA33-TCO. Estos son los controles esenciales para asegurar que la respuesta terapéutica no se produce por el immunoconjugate o así sola. Los volúmenes de los tumores fueron medidos cada 3 días durante las primeras tres semanas del estudio y luego una vez por semana hasta la conclusión del experimento (70 días, vida media 10 de 177Lu). Como se ve en la figura 6, hay una fuerte diferencia en la respuesta de las cohortes experimentales en comparación con los grupos de control. Mientras que los tumores en los ratones recibiendo sólo un componente de la estrategia PRIT siguen creciendo sin control, los tumores de los ratones que recibieron el régimen completo de PRIT dejen de crecer y en última instancia, reducirse a volúmenes muy inferiores a los medidos en el inicio del estudio. Importante, se observó ningunos efectos secundarios tóxicos, y todos los animales mantienen un peso dentro del 20% de su masa inicial (Figura 7A). Una parcela de Kaplan-Meier de los datos proporciona una visualización aún más llamativa del estudio: mientras que todos los ratones en las cohortes de control tuvieron que ser sacrificados en unas semanas, los ratones de las cohortes experimentales tenían un récord perfecto de supervivencia al final de la investigación ( Figura 7B).

Figure 1
Figura 1: esquema de dibujos animados de radioinmunoterapia pretargeted basado en la reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa. Esta figura ha sido modificada de referencia #28. Reimpreso (adaptado) con permiso de Membreño, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S. & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted radioinmunoterapia de un Carcinoma colorrectal. Farmacia molecular. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: esquema de la construcción de huA33-TCO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: esquema de la síntesis de Tz-PEG7- DOTA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: (A) esquema de radiolabeling de Lu-DOTA-PEG [ 177Lu]7- Tz; (B) representante radio-objetivo cromatograma demostrando el > 98% de pureza radioquímica de la [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Biodistribución en de en vivo pretargeting con huA33-TCO y [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz en ratones desnudos athymic subcutáneos tumores de cáncer colorrectal humano SW1222 con intervalos de pretargeting de 24 (violeta), 48 (verde) , 72 (naranja), o 120 horas (azul). Datos con errores de estándar de cohortes n = 4; Análisis estadístico se realizó por la prueba t de estudiante impar, **p < 0.01. Esta figura ha sido modificada de referencia #28. Reimpreso (adaptado) con permiso de Membreño, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S. & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted radioinmunoterapia de un Carcinoma colorrectal. Farmacia molecular. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Estudio Longitudinal de la terapia de 5 grupos de ratones (n = 10) cojinete tumores subcutáneos de SW1222 representados en volumen promedio del tumor en función del tiempo (A); y el volumen de tumor normalizado al volumen inicial como una función de tiempo (B). Los grupos control recibieron el immunoconjugate sin el radioligando (azul) o así sin el immunoconjugate (rojo). El tres tratamiento grupos recibidos huA33-TCO (100 μg, 0.6 nmol) seguida de 24 h más tarde 18.5 (verde), 37.0 (púrpura) o 55.5 MBq (naranja) (~0.8 nmol en cada caso) [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz. Prueba de log-rank (Mantel-Cox), la supervivencia fue significativa (p < 0.0001) para todos los grupos de tratamiento. Esta figura ha sido modificada de referencia #28. Reimpreso (adaptado) con permiso de Membreño, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S. & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted radioinmunoterapia de un Carcinoma colorrectal. Farmacia molecular. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: curvas para animales de peso durante el estudio longitudinal de la terapia de 5 grupos de ratones (n = 10) la supervivencia de Kaplan-Meier correspondiente curva de rodamiento subcutáneo SW1222 tumores (A); (B). Los grupos control recibieron el immunoconjugate sin el radioligando (azul) o así sin el immunoconjugate (rojo). El tres tratamiento grupos recibidos huA33-TCO (100 μg, 0.6 nmol) seguida de 24 h más tarde 18.5 (verde), 37.0 (púrpura) o 55.5 MBq (naranja) (~0.8 nmol en cada caso) [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz. Esta figura ha sido modificada de referencia #28. Reimpreso (adaptado) con permiso de Membreño, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S. & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted radioinmunoterapia de un Carcinoma colorrectal. Farmacia molecular. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Compuesto 1 Cambios de H-NMR HRMS (ESI)
500 MHz, DMSO
7- NHBoc TZ-PEG 10.52 (s, 1H) 8.50 (m, 3H), 7.82 (t, 1H), 7,46 (d, 2H), 6.69 (t, 1H), 4.33 (d, 2H), 3.42 (m, 22H), 3.33 (t, 2H), 3.31 (t, 2H), 3.12 (q, 2H), 2.99 (q, 2H), 2.12 (t, 2H), 2.03 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,70 (q, 2H), 1.29 (s 9 H) m/z importe anual calculado. C35H57N7O11na: 774.4005; encontrado: 774.4014.
TZ-PEG7-NH2 10.58 (s, 1H) 8.46 (m, 2H), 7.87 (t, 1H), 7.75 (d, 2H), 7.52 (d, 1H), 4.40 (d, 2H), 3,60 3,50 (m, H 26), 3,40 (t, 2H), 3.32 (bs, 2H), 3,20 (q, 2H), 2.99 (bs, 2H), 2.19 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1.79 (q, 2H). m/z importe anual calculado. para C30H50N7O9: 652.3670; encontrado: 652.3676.
TZ-PEG7- DOTA 10.57 (s, 1H), 9.63 (bs, 1H), 8.45 (m, 3H), 7.86 (m, 1H), 7,73 (bs, 1H), 7.54 (d, 2H), 7.41 (m, 2H), 7.19 (m, 2H), 6.54 (bs, 1H), 4.40 (d, 2H), 4.00 3.20 (m, H 55), 3,20 (q, 4H) 2.54 (s, 1H), 2.18 (t, 3H), 2.10 (t, 3H), 1.76 (q 2 H). m/z importe anual calculado. para el C50H76N11O15S: 1202.56; encontrado: 1203.5741.

Tabla 1. Datos de caracterización de los compuestos orgánicos que se describe en este protocolo.

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Discussion

Uno de los puntos fuertes de este enfoque en vivo pretargeting — especialmente en lo referente a estrategias basadas en anticuerpos tienen y radiactiva haptenos, es su modularidad: transporte- cyclooctene fracciones pueden ser añadidos a cualquier anticuerpo, y tetrazina radioligands puede ser radiactiva con una extraordinaria variedad de radionucleidos sin deteriorar su capacidad de reaccionar con sus socios de clic. Sin embargo la adaptación de este enfoque a otros sistema de antígeno anticuerpo no es tan simple como duplicar el protocolo descrito aquí. Por supuesto, cualquier intento de crear un nuevo immunoconjugate mAb-TCO o un novela así tetrazina-cojinete debe acompañarse de los ensayos de caracterización química y biológica apropiada, incluyendo pruebas de estabilidad y reactividad. Pero más allá de esto, hay dos variables que son particularmente importantes para explorar y optimizar: (1) la masa de mAb-TCO immunoconjugate administrado y (2) el intervalo entre la inyección de la mAb-TCO y la administración del radioligando. Ambos factores pueden influir drásticamente el comportamiento en vivo del sistema pretargeting. Por ejemplo, el uso de dosis excesivamente altas de immunoconjugate o intervalo de períodos que son demasiado cortos puede resultar en concentraciones indeseable de alta actividad en la sangre debido a las reacciones de click entre el radioligando y immunoconjugate restante en la circulación. Por el contrario, empleando masas de immunoconjugate que son demasiado bajos o excesivamente largo intervalo de tiempo periodos innecesariamente puede reducir las concentraciones de actividad en el tumor debido a una falla para saturar el antígeno o el inexorable (aunque lento) isomerización de la trans - cyclooctene a inactivo cis- cyclooctene. A lo largo de estas líneas, puede ser extraordinariamente útil realizar biodistribución experimentos utilizando una variedad de masas de immunoconjugate e intervalos de pretargeting. Por supuesto, también se recomienda ejecutar los controles adecuados en conjunto con cualquier experimentos en vivo . Estos incluyen, pero no se limitan a: experimentos con líneas de células de antígeno-negativo, bloqueo de cohortes que reciben un gran exceso de anticuerpos sin conjugar, la administración del solo así, la inyección de radioligando siguiendo un TCO- falta immunoconjugate y en vivo pretargeting con un no específico, isotipo control TCO-cojinete immunoconjugate.

Alternativamente, experimentos de proyección de imagen pueden utilizarse para optimización si el radionuclide terapéutico emite positrones o fotones 'imagen' o una 'exposición' isotopologue del radionúclido terapéutico está disponible. En última instancia, los conjuntos de variables que proporcionan el mejor equilibrio de las concentraciones de alta actividad tumoral y ratios de concentración de alta actividad de tumor a fondo se deben seleccionar para estudios de terapia longitudinal posterior. En el caso presentado aquí, 100 μg de huA33-TCO fue inyectado con un intervalo de cálculos de dosimetría de 24 horas — especialmente aquellos que permiten el cálculo de dosis tumor y relaciones terapéuticas: también puede ser útil durante el proceso de optimización.

Es importante tener en cuenta que incluso el prometedor [177Lu] Lu-DOTA-PEG - Tz/huA33-TCO sistema7que ha sido desarrollado podría beneficiarse de optimización adicional. Una comparación entre los datos de la dosimetría de este enfoque a PRIT y RIT tradicional con una variante de etiquetado Lu 177de huA33 revela que la dosis tumor de PRIT se encuentra por debajo del tradicional RIT. Además, la dosis efectiva del sistema PRIT (0.054 mSv/MBq) es sólo ligeramente inferior a la del tradicional RIT (0.068 mSv/MBq).

Actualmente se están estudiando dos Remedios a estos problemas. En primer lugar, se ha desarrollado un andamio dendrítico capaces de aumentar el número de TCOs anexada a cada anticuerpo30. En el contexto de las imágenes de PET pretargeted, este enfoque dramáticamente aumenta las concentraciones de actividad tumoral, y experimentos análogos con Lu-DOTA-PEG [177Lu]7- Tz están en marcha. En segundo lugar, el uso de agentes tetrazina-teniendo claro puede ser útil en el contexto de PRIT. La administración de agentes antes de la inyección del así de claro se ha explotado en una variedad de metodologías de pretargeting como una manera de disminuir la concentración de immunoconjugate residual en la sangre y así reducir las concentraciones de actividad en órganos sanos23,31. El uso de agentes de limpieza es no sin inconvenientes, sin embargo; el más notable de que está aumentando la complejidad de una modalidad terapéutica ya ciertamente complicada. Sin embargo, los investigadores del Memorial Sloan Kettering Cancer Center ha publicado recientemente un informe convincente sobre la creación un dextrano marcado con Tz claro a agente de pretargeted del animal doméstico proyección de imagen y datos sobre el uso de esta construcción en conjunto con [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz y huA33-TCO son próximas32. Otro enfoque para maximizar los beneficios dosimétricos de PRIT es el uso de radionucleidos con menor vida media física. Esto ha demostrado ser altamente eficaz para la proyección de imagen; sin embargo, radionúclidos terapéuticos con corta vida media física son pocos y lejos entre.

Por último, nos sería remiso si no tratar correctamente algunas de las limitaciones intrínsecas de pretargeting basado en la reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa. El primero de estos problemas es inherente a todos los enfoques que en vivo pretargeting: el anticuerpo empleado no puede internalizarse en Unión a los tejidos de destino. Esto, por supuesto, es esencial, como el anticuerpo debe permanecer accesible a la así en lugar de secuestrado en un compartimiento intracelular. Esta limitación es ciertamente difícil de eludir, aunque se ha demostrado recientemente los anticuerpos con lenta a moderada tasa de internalización puede ser utilizado para en vivo pretargeting33,34. En segundo lugar, la isomerización lento en vivo de reactiva transporte -cyclooctene a inactivo cis -cyclooctene tiene el potencial para limitar la longitud del intervalo entre la administración de la immunoconjugate rodamiento de TCO y la inyección del radioligando. Críticamente, intervalos de hasta 120 h todavía proporcionaron excelentes resultados en el contexto de ambos pretargeted del animal doméstico proyección de imagen y PRIT. Sin embargo, el uso de estos intervalos más largos es acompañado casi siempre de leve reducción en las concentraciones de actividad tumoral, un resultado que puede deberse a esta isomerización. Para resolver este problema, varios laboratorios han intentado crear trans- cyclooctenes más estable sin comprometer la reactividad, mientras que otros han intentado desarrollar dienophiles completamente nuevo capaz de reaccionar con tetrazina35 . En los próximos años, es nuestra esperanza que estos desarrollos químicos va ser aprovechados por PRIT.

Al final, PRIT basado en la ligadura de Diels-Alder de demanda electrónica inversa sin lugar a dudas es una tecnología emergente y algo inmadura. Sin embargo, nos anima, sin embargo, los resultados preclínicos, hemos obtenido y excitado por la promesa clínica de esta estrategia. Esperamos sinceramente que este protocolo alienta a otros para explorar y optimizar este enfoque y así alimentar su recorrido desde el laboratorio a la clínica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Dr. Jacob Houghton para conversaciones útiles. Los autores quisieran agradecer a los NIH para su financiación generosa (R00CA178205 y U01CA221046).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

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Química número 143 radioinmunoterapia radioinmunoterapia pretargeted pretargeting reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa tetrazina transporte- cyclooctene huA33 antígeno A33 Lutecio-177
Radioinmunoterapia pretargeted basada en la reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa
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Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis, B. M. Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (143), e59041, doi:10.3791/59041 (2019).

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