Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Pretargeted Radioimmunotherapy op basis van de Inverse Electron vraag Diels-Alder reactie

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

Dit protocol beschrijft de synthese en de karakterisering van een trans- Cycloocteen (TCO)-gemodificeerde antilichaam en een 177Lu-geëtiketteerden tetrazine (Tz) radioligand voor pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). Daarnaast geeft het het gebruik van deze twee constructies voor in vivo ook en longitudinale therapie studies in een lymfkliertest model van colorectal kanker.

Abstract

Terwijl radioimmunotherapy (RIT) een veelbelovende aanpak voor de behandeling van kanker is, de lange farmacokinetische halveringstijd van radiolabeled antilichamen kan leiden tot hoge stralingsdoses voor gezonde weefsels. Misschien niet verrassend, hebben diverse verschillende strategieën ontwikkeld om deze verontrustende beperking omzeilen. Een van de meest veelbelovende van deze benaderingen is pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT vloeit voort ontkoppeling van de radionuclide van de immunoglobuline, injecteren van hen afzonderlijk, en dan het toestaan van hen om te combineren in vivo op het doelweefsel is terechtgekomen. Deze aanpak maakt gebruik van de uitzonderlijke eigenschappen van de tumor-targeting van antilichamen terwijl plinten hun farmacokinetische nadelen, waardoor stralingsdoses aan doelsoort weefsels te verlagen en vergemakkelijken van het gebruik van radionucliden met half-leven die beschouwd als te kort is voor gebruik in traditionele radioimmunoconjugaten. Ons laboratorium en anderen hebben de afgelopen vijf jaar, een benadering van in vivo pretargeting op basis van de reactie van de Diels-Alder (IEDDA) inverse elektron-vraag tussen trans- Cycloocteen (TCO) en tetrazine (Tz) ontwikkeld. Deze strategie is met succes toegepast op pretargeted positron emissie tomografie (PET) en single-photon emission tomography (SPECT) met een verscheidenheid van antilichaam-antigeen systemen imaging berekend. In een paar van de recente publicaties, hebben wij de doeltreffendheid van de IEDDA gebaseerde PRIT in lymfkliertest modellen van de alvleesklier ductaal adenocarcinoom en colorectaal carcinoom aangetoond. In dit protocol, beschrijven we protocollen voor PRIT met behulp van een 177Lu-DOTA-geëtiketteerden tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) en een TCO gemodificeerde variant van het colorectaal carcinoom gericht op huA33 antilichaam (huA33-TCO). Meer in het bijzonder, beschrijven we de bouw van huA33-TCO, de synthese en de radiolabeling van [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz, en de prestaties van in vivo ook en longitudinale therapie studies in lymfkliertest modellen van colorectaal carcinoom.

Introduction

Radioimmunotherapy (RIT) — het gebruik van antilichamen voor de levering van therapeutische radionucliden aan tumoren — is al lang een verleidelijke benadering van de behandeling van kanker1,2. Inderdaad, deze belofte heeft al onderstreept door de Amerikaanse Food and Drug Administration de goedkeuring van twee radioimmunoconjugaten voor de behandeling van Non-Hodgkin lymfoom: 90Y-ibritumomab tiuxetan en 131-tositumomab3 , 4. maar zelfs vanaf zijn vroegste dagen, de klinische perspectieven op de RIT hebben belemmerd door een kritische complicatie: hoge straling dosistempo's naar gezonde weefsels5,6. Algemeen radioimmunoconjugaten voor RIT worden aangeduid met langlevende radionucliden (bijvoorbeeld 131ik [t½ = 8.0 dagen] en 90Y [t½ = 2,7 dagen]) met fysieke helft-leven die met aansluiten de lang farmacokinetische halfwaardetijd van immunoglobulinen. Dit is essentieel, aangezien het zorgt ervoor dat voldoende radioactiviteit blijft zodra het antilichaam haar optimale ook na enkele dagen van verkeer bereikt. Echter, deze combinatie van lange verblijf tijden in het bloed en lang fysieke halfwaardetijd leidt onvermijdelijk tot dedoorstraling van gezonde weefsels, waardoor vermindering van therapeutische ratio's en de beperking van de werkzaamheid van de therapie7. Verschillende strategieën werden onderzocht om te omzeilen van dit probleem, met inbegrip van het gebruik van afgekapte antilichaam fragmenten zoals Fab, Fab', F(ab')2, minibodies en nanobodies8,9,10. Een van de meest veelbelovende en fascinerend, maar onmiskenbaar complexe, alternatieve benaderingen is in vivo pretargeting11.

In vivo pretargeting is een benadering van nucleaire beeldvorming en therapie die tot doel heeft om uit te rusten van de exquise affiniteit en de selectiviteit van antilichamen terwijl hun farmacokinetische nadelen11,12,13plint. Te dien einde is het radiolabeled antilichaam gebruikt in traditionele radioimmunotherapy gedeconstrueerd in twee onderdelen: een klein molecuul radioligand en een immunoconjugate dat kan zowel een tumor-antigeen en de bovengenoemde radioligand binden. De immunoconjugate is eerste geïnjecteerd en gegeven een 'voorsprong', vaak enkele dagen, gedurende welke het hoopt zich op in het doelweefsel is terechtgekomen en wist uit het bloed. Daarna de klein molecuul radioligand wordt beheerd en combineert met de immunoconjugate op de tumor of snel wordt gewist uit het lichaam. Kortom, in vivo pretargeting is afhankelijk van het uitvoeren van radiochemie binnen het lichaam zelf. Door het verminderen van de verspreiding van de radioactiviteit, hierdoor tegelijkertijd beperkt stralingsdoses aan gezonde weefsels en vergemakkelijkt het gebruik van radionucliden (bijvoorbeeld 68Ga, t½ = 68 min211; Als t½ = 7.2 h) met half-levens die zijn doorgaans beschouwd als onverenigbaar met antilichaam gebaseerde vectoren.

Vanaf de late jaren 1980, een handvol van de verschillende benaderingen van in vivo pretargeting zijn ontwikkeld, met inbegrip van strategieën op basis van bispecifieke antilichamen, de interactie tussen streptavidine en biotine, en de kruising van complementaire oligonucleotides14,15,16,17,18. Nog is elk tegengehouden zijhetelkinverschillende mate door complicaties, meest beroemde de potente immunogeniciteit van daar gemodificeerde antilichamen19,20. De laatste vijf jaren heeft hebben onze fractie en anderen ontwikkeld een benadering van in vivo pretargeting op basis van de afbinding snelle en bioorthogonal inverse elektron vraag Diels-Alder tussen trans- Cycloocteen (TCO) en tetrazine (Tz) 21,22,23,24. De meest succesvolle van deze strategieën hebben ingezet een antilichaam TCO-bewerkt en een Tz-bevattende radioligand, zoals TCO meestal stabieler in vivo dan zijn Tz partner (Figuur 1)25,26 is. Net als in andere pretargeting methoden, is de mAb-TCO-immunoconjugate eerst beheerd en tijd krijgen om te wissen uit de roulatie en zich ophopen in de tumor weefsel. Daarna wordt de klein molecuul Tz radioligand geïnjecteerd, waarna het klikken met de immunoconjugate binnen het doelweefsel of wist snel uit het lichaam. Deze in vivo pretargeting strategie is zeer effectief gebleken voor PET en SPECT imaging met verschillende systemen van verschillende antilichaam/antigeen, consequent produceert beelden met een hoog contrast en waardoor het gebruik van korte duur radionucliden zoals 18 F (t½ = 109 min) en 64Cu (t-1/2 = 12,7 h)21,22,24. Meer recentelijk, de werkzaamheid van klik gebaseerde pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) is aangetoond in lymfkliertest modellen van de alvleesklier ductaal adenocarcinoom (PDAC) en colorectaal carcinoom27,28. Te dien einde, de therapeutische radionuclide 177Lu (βmax = 498 keV, t-1/2 = 6,7 dagen) was werkzaam in combinatie met twee verschillende antilichamen: 5B1, die gericht is op koolhydraten antigeen 19,9 (CA19.9) overal uitgedrukt in PDAC , en huA33, die gericht is op A33, een transmembraan glycoproteïne uitgedrukt in > 95% van colorectal kanker. In beide gevallen, deze benadering van 177Lu-PRIT leverde hoogactieve concentraties in tumor weefsel, gemaakt van een dosis-afhankelijke therapeutisch effect, en gelijktijdig verminderde activiteit concentraties in de gezonde weefsels in vergelijking met traditionele direct-label radioimmunoconjugaten.

In dit artikel beschrijven we protocollen voor PRIT met behulp van een 177Lu-DOTA-geëtiketteerden tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) en een TCO gemodificeerde variant van het antilichaam van de huA33 (huA33-TCO). Meer in het bijzonder, beschrijven we de bouw van huA33-TCO (Figuur 2), de synthese en de radiolabeling van [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (Figuur 3 en Figuur 4), en de prestaties van in vivo ook en longitudinale therapie studies in lymfkliertest modellen van colorectaal carcinoom. Bovendien, de representatieve resultaten en discussie, we presenteren een verzameling voorbeeldgegevens, adres mogelijke strategieën voor de optimalisatie van deze aanpak, en overwegen van deze strategie in de bredere context van in vivo pretargeting en PRIT. Tenslotte is het belangrijk op te merken dat terwijl we hebben gekozen zich te richten op het pretargeting met behulp van huA33-TCO en [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz in dit protocol, deze strategie is zeer modulair en kan aangepast worden aan een breed scala aan antilichamen en radionucliden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle in vivo dierproeven in dit werk beschreven werden uitgevoerd volgens goedgekeurde protocollen en geëxecuteerd onder de ethische richtlijnen van het Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center en Hunter College Verzorging van de dieren van de institutionele en gebruik commissies (IACUC).

1. de voorbereiding van de huA33-TCO

Opmerking: De synthese van huA33-TCO geweest eerder gemelde29. Echter, voor het gemak van de lezer, is deze gerepliceerd hier met aanpassingen voor optimale omstandigheden.

  1. Bereiden in een tube van 1,7 mL microcentrifuge, een oplossing van 125 μL van (E) - cyclooct - 4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl (TCO-NHS) carbonaat in droge dimethyl formamide (DMF) met een concentratie van 40 mg/mL (0,15 M). Deze oplossing kan worden aliquoted en bevroren bij-80 ° C voor gebruik in toekomstige experimenten.
  2. Bereid een 5 mg/mL oplossing van huA33 in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 2,7 mM kaliumchloride, 137 mM natriumchloride en 11.9 mM kalium fosfaat, pH 7.4) in een aparte 1,7 mL microcentrifuge buis.
  3. Met behulp van kleine porties (< 5 μl) van 0,1 M Na2CO3, breng de pH van de oplossing van het antilichaam van stap 1.2 tot 8,8-9.0. PH document of een pH-meter met een micro-elektrode gebruiken om te controleren de pH en zorg dat de pH niet 9.0 overschrijdt uitoefenen.
  4. Aan de antilichaam-oplossing beschreven in stap 1.3, Voeg langzaam een volume dat overeenkomt met 40 molaire equivalenten van TCO-NHS ten opzichte van de hoeveelheid antilichamen. Bijvoorbeeld, als 5 mg (30 nmol) van huA33 in de oplossing is, voeg 9.0 μL (1.20 μmol) van de 40 mg/mL (0,15 M) oplossing van TCO-NHS.
    Opmerking: TCO-NHS is hydrofoob. Wanneer u het toevoegt aan de oplossing van antilichaam, toevoegen het langzaam en met agitatie om te voorkomen dat neerslag. 10% niet overschrijden DMF volumepercentage in de uiteindelijke reactie-oplossing.
  5. Toestaan dat de reactie op Incubeer bij 25 ° C op een thermomixer voor 1 h met milde agitatie (500 rpm).
  6. Na 1 uur, de immunoconjugate van de huA33-TCO met behulp van een uitsluiting van de demineralisatie kolom van voorverpakte disposable grootte te zuiveren.
    1. De kolom grootte uitsluiting equilibreer zoals beschreven door de leverancier conserveringsmiddelen huidig in de kolom verwijderen tijdens de opslag. Een typische procedure hiervoor is het wassen van de kolom 5 x met een volume van PBS die overeenkomt met het volume van de kolom: 5 x 2.5 mL PBS.
    2. Het reactiemengsel toevoegen aan de uitsluiting kolom ' grootte ' vaststellend van het volume van het reactiemengsel.
    3. Nadat het reactiemengsel heeft de kolom ingevoerd, een passend bedrag van PBS toe zodat het totale volume van oplossing toegevoegd aan de kolom toevoegen tot 2,5 mL. Bijvoorbeeld, als de vervoeging reactie geleid tot een totaal volume van 1.3 mL, voeg 1.2 mL extra PBS aan de kolom.
    4. Het product met behulp van 2 mL PBS als het eluent verzamelen.
      Opmerking: Deze stap zal de uiteindelijke constructie huA33-TCO in 2 mL PBS, pH 7.4 opleveren.
  7. Het meten van de concentratie van de huA33-TCO met behulp van een UV-Vis spectrofotometer toezicht de 280 nm golflengte. De molaire extinctie-coëfficiënt voor de meeste IgGs (ε280) is 210.000 M-1cm-1.
  8. Als een oplossing met een hogere concentratie van immunoconjugate gewenst is, concentreren de oplossing van de huA33-TCO met behulp van een centrifugaal filter eenheid met een 50.000 molecuulgewicht cut-off instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Vele antistoffen zijn gekend om te aggregaat of precipiteren tijdens concentratie. Wanneer u probeert deze procedure met een nieuwe antilichaam, moeten onderzoekers uitstellen tot de literatuur en hun eigen ervaring hanteren het antilichaam in kwestie.
  9. Bewaar de ingevulde huA33-TCO-immunoconjugate bij 4 ° C in het donker als het nodig is direct. Als er meer dan 4 dagen in de toekomst worden gebruikt, het opslaan bij-80 ° C in het donker.
    Opmerking: Dit is een aanvaardbaar stopplaats in de procedure. De ingevulde huA33-TCO-immunoconjugate moet stabiel zijn voor ten minste 6 maanden opslag bij-80 ° C in het donker.

2. de synthese van Tz-PEG7- NHBoc

  1. Los in een tube van 1,7 mL microcentrifuge, 5 mg tetrazine N- hydroxysuccinimidyl ester (Tz-NHS; 12.6 μmol) in 0,15 mL watervrij dimethylsulfoxide (DMSO).
  2. Los in een aparte 1,7 mL microcentrifuge buis, 8 mg van de Boc-beschermd amino PEG polymeer, O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) in 0,15 mL watervrij DMSO.
  3. Aan de oplossing van Tz-NHS, voeg 3 l (21.3 μmol, 1.7 molaire equivalenten) triethylamine (thee) en meng.
  4. De roze tetrazine-oplossing toevoegen aan de NHBoc-PEG7-NH2 oplossing van stap 2.2 en Incubeer het reactiemengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) met milde agitatie.
  5. Na 30 minuten, Verdun de reactie 1:1 in H2O en zuiveren van de reactie omgekeerd-fase C18 krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) met elke spoorverontreiniging Tz-NHS scheiden van de Tz-PEG-7- NHBoc. Oplosmiddelen zonder zuur gebruiken om te voorkomen dat de vroegtijdige verwijdering van de Boc group te beschermen. Controleren van beide Tz-PEG-7- NHBoc en Tz-NHS bij een golflengte van 525 nm.
    Opmerking: Retentietijden zijn uiteraard sterk afhankelijk van de HPLC-apparatuur van elk laboratorium (pompen, kolommen, leidingen, enz.), en passende controles moeten worden uitgevoerd vóór de zuivering. Echter voor te leggen van een voorbeeld, als een gradiënt van 5:95 acetonitril/H2O (beide zonder alle additieven) aan 95:5 acetonitril/H2O meer dan 30 min, een debiet van 1 mL/min, en een analytische 4.6 x 250 mm C18kolom worden gebruikt , de retentietijden van Tz-NHS en Tz-PEG7- NHBoc zijn rond 16 min en 18 min, respectievelijk.
  6. Bevriezen van de verzamelde HPLC eluens met behulp van vloeibare stikstof en de nu-bevroren collectie buis wikkel in aluminiumfolie. Plaats de buis van de bevroren collectie op een lyophilizer's nachts te verwijderen van de HPLC mobiele fase. Het product zal worden een karakteristieke felle roze solid.
    Opmerking: Als vloeibare stikstof niet beschikbaar is, bevriezen de verzamelde HPLC eluens in droog ijs of overnachting in een vriezer-80 ° C.

3. de synthese van Tz-PEG7-NH2

  1. Aan het product van stap 2.6, Tz-PEG7- NHBoc, voeg 1,5 mL dichloormethaan (DCM) en breng deze oplossing over in een kleine rondbodemkolf.
  2. Voeg 0,25 mL trifluorazijnzuur (TFA) ontkleuring aan de roze oplossing van stap 3.1.
  3. Toestaan dat de reactie op Incubeer gedurende 30 min op RT met milde agitatie.
  4. Na 30 min, verdampen de oplosmiddelen via roterende verdamping. Niet meer dan een water bad temperatuur van 37 ° C.
  5. Reconstrueren het roze viskeuze product in 0,5 mL water.
  6. Het zuiveren van het product omgekeerd-fase C18 HPLC met Tz-PEG7-NH2 scheiden van de voorloper van de Boc-beschermd. Controleren van beide Tz-PEG-7- NHBoc en Tz-PEG7-NH2 bij een golflengte van 525 nm.
    Opmerking: Retentietijden zijn uiteraard sterk afhankelijk van de HPLC-apparatuur van elk laboratorium (pompen, kolommen, leidingen, enz.), en passende controles moeten worden uitgevoerd vóór de zuivering. Echter, voor te leggen van een voorbeeld, als een gradiënt van 5:95 acetonitril/H2O (beide met 0,1% TFA) aan 95:5 acetonitril/H2O meer dan 30 min, een debiet van 1 mL/min, en een analytische 4.6 x 250 mm C18kolom worden gebruikt , de retentietijden van Tz-PEG7- NHBoc en Tz-PEG7-NH2 zijn ongeveer 18 min en 13 min, respectievelijk.
  7. Bevriezen van de verzamelde HPLC eluens met behulp van vloeibare stikstof en de nu-bevroren collectie buis wikkel in aluminiumfolie. Plaats de buis van de bevroren collectie op een lyophilizer's nachts te verwijderen van de HPLC mobiele fase. Het product zal zijn een heldere roze solid.
  8. Het reconstrueren van het product uit stap 3.7, Tz-PEG7-NH2, met 150 μl van DMSO en overdracht aan een tube van 1,7 mL microcentrifuge.
  9. Het meten van de concentratie van Tz-PEG7-NH2 met behulp van een UV-Vis spectrofotometer bewaking van de 525 nm golflengte. De molaire extinctie-coëfficiënt voor Tz-PEG7-NH2 (ε525) is 535 M-1cm-1.

4. de synthese van Tz-PEG7- DOTA

  1. Tz-PEG7-NH2 (4.5 mg, 6.9 μmol) ontbinden in 0,15 mL DMSO (of gewoon gaan met de oplossing die is gemaakt in stap 3.8).
  2. 22 molaire equivalenten van thee (21 μL, 0,15 mmol) aan de tetrazine-bevattende oplossing uit stap 4.1 toevoegen.
  3. Voeg 10 mg (14.2 μmol) van p- SCN-Bn-DOTA als een solide en vortex de oplossing voor ongeveer 2 minuten, of totdat het materiaal is volledig opgelost.
  4. Toestaan dat de reactie op Incubeer gedurende 30 min op RT met milde agitatie.
  5. Na 30 min, Verdun de reactie 1:1 in H2O en het zuiveren van het product en omgekeerd-fase C18 HPLC spoorverontreiniging p- SCN-Bn-DOTA verwijderen. De p- SCN-Bn-DOTA kan worden gecontroleerd bij een golflengte van 254 nm, terwijl de Tz-PEG-7- DOTA is beste gecontroleerd bij een golflengte van 525 nm.
    Opmerking: Retentietijden zijn uiteraard sterk afhankelijk van de HPLC-apparatuur van elk laboratorium (pompen, kolommen, leidingen, enz.), en passende controles moeten worden uitgevoerd vóór de zuivering. Echter voor te leggen van een voorbeeld, als een gradiënt van 5:95 acetonitril/H2O (beide met 0,1% TFA) te 95:5 acetonitril/H2O meer dan 30 min en een analytische 4.6 x 250 mm C18kolom worden gebruikt, Tz-PEG7- DOTA en p-SCN-Bn-DOTA hebben retentietijden van ongeveer 15,6 min en 16.1 min, respectievelijk.
  6. Bevriezen van de verzamelde HPLC eluens met behulp van vloeibare stikstof en de nu-bevroren collectie buis wikkel in aluminiumfolie. Plaats de buis van de bevroren collectie op een lyophilizer's nachts te verwijderen van de HPLC mobiele fase. Het product zal zijn een heldere roze poeder.
  7. Reconstrueren van het product in 0,15 mL DMSO en meten van de concentratie met behulp van een UV-Vis spectrofotometer bewaking van de 525 nm golflengte. De molaire extinctie-coëfficiënt voor Tz-PEG7- DOTA (ε525) 535 M-1cm-1is.
  8. Analyseren van de definitieve verbinding door nucleaire magnetische resonantie (NMR) en hoge-resolutie massa spectrometrie (HRMS) om te controleren of die synthese was succesvol. Zie tabel 1 voor de experimenteel bepaalde chemische shifts en molecuulgewicht van alle de verbindingen besproken in dit werk.
  9. Winkel de gezuiverde Tz-PEG7- DOTA oplossing in het donker bij-80 ° C.
    Opmerking: Dit is een aanvaardbaar stopplaats in de procedure. De voltooide Tz-PEG7- DOTA voorloper is stabiel gedurende ten minste 1 jaar onder deze omstandigheden.

5. 177Lu Radiolabeling van Tz-PEG7- DOTA

Let op: Deze stap van het protocol omvat de behandeling en de manipulatie van radioactiviteit. Voordat u deze stappen uitvoert — of het uitvoeren van enig ander werk met radioactiviteit — onderzoekers moeten overleggen met hun eigen instelling straling veiligheidsdienst. Alle mogelijke stappen ondernemen om te minimaliseren van blootstelling aan ioniserende straling.

Opmerking: Bij het werken met kleine hoeveelheden van radiometals is het aanbevolen dat alle buffers vrij zijn van metaalsporen om storingen in coördinatie Sitebinding te voorkomen.

  1. In een centrifugebuis 1,7 mL toevoegen 200 μL van 0,25 M ammonium acetaat buffer aangepast met aliquots 1 M HCl pH 5.5.
    Opmerking: Als u minder dan 370 MBq van activiteit voor de labeling, de omvang van de buffer die wordt gebruikt moet worden teruggebracht tot 100 µL.
  2. Voeg de gewenste hoeveelheid [177Lu] LuCl3 aan de bufferoplossing. De toegevoegde hoeveelheid zullen afhankelijk van het aantal onderwerpen in het experiment en de radioactieve doses wordt beheerd. Het wordt aanbevolen dat 1-2 extra doses waard van radioactiviteit worden toegevoegd als een voorzorgsmaatregel om te compenseren voor het potentiële verlies van radioactiviteit tijdens zuivering stappen.
  3. Toevoegen van Tz-PEG7- DOTA in DMSO aan het radioactieve mengsel in stap 5.2. Het bedrag van de Tz-PEG7- DOTA is afhankelijk van het aantal onderwerpen wordt getest. Meer informatie over dit onderwerp kan worden gevonden in stap 6.2.2.2.
  4. Laat de oplossing voor Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
  5. Controleer of dat de radiolabeling is voltooid met behulp van radio instant Dunnelaagchromatografie (radio-iTLC) met 50 mM EDTA, pH 5.5 als de mobiele fase. De gelabelde [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz blijft op de basislijn — Rf = 0 — terwijl gratis [177Lu] Lu3 + zal worden gecoördineerd door de EDTA en reist met de oplosmiddelen voorkant, Rf = 1.0 (figuur 3B).
  6. Toevoegen extra ligand voor het coördineren van de vrije radiometal als kwantitatieve labeling, niet wordt bereikt. Als alternatief, zuiveren de gelabelde [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz met behulp van een patroon van de18 C. Volg de instructies van de fabrikant voor gebruik. Een voorbeeldprocedure wordt hieronder gegeven.
    1. De cartridge Prime door langzaam passeren 5 mL ethanol door de cartridge met een grote injectiespuit. Vervolgens passeren 5 mL acetonitril en vervolgens 5 mL gedeïoniseerd (DI) H2O.
    2. In een kleinere spuit de oplossing radioligand opstellen van stap 5.3 en Injecteer het langzaam naar de C18 cartridge. Vervolgens unbound wassen de cartridge met 10 mL DI H2O te verwijderen om het even welk [177Lu] LuCl3.
    3. Elueer met 500 µL van ethanol. Verwijder ethanol uit het eindproduct door te geven over het vaartuig met een lage stroomsnelheid van droge stikstof of argon voor 10-15 min. Vervolgens resuspendeer de radioligand in een zoutoplossing in een volume in stap 6.2.2.2 vastgesteld.

6. in vivo Studies

Let op: Zoals in paragraaf 5 houdt deze stap van het protocol de behandeling en de manipulatie van radioactiviteit. Voordat u deze stappen uitvoert, moeten onderzoekers overleggen met hun eigen instelling straling veiligheidsdienst. Alle mogelijke stappen ondernemen om te minimaliseren van blootstelling aan ioniserende straling.

  1. Voorbereiding van de dieren
    1. In vrouwelijke athymic naakt muizen, subcutaan implantaat 5 x 106 SW1222 colorectal kankercellen gesuspendeerd in 150 μl van een 1:1 mengsel van cel media en matrix (bv., Matrigel) en laat deze aan het uitgroeien tot een 100-150 mm3 xenograft (14-18 dagen na inoculatie).
    2. Sorteren van dieren ten behoeve van een experiment ook
      1. Zodra de tumoren van voldoende grootte zoals bepaald door meting van de remklauw zijn, sorteren de dieren om ervoor te zorgen dat elk cohort heeft ongeveer hetzelfde gemiddelde tumor volume. De dieren kunnen worden onderscheiden in iedere kooi door markeringen op de staart met onuitwisbare inkt (één band, twee bands, enz.).
    3. Sorteren van dieren ten behoeve van een longitudinale therapie-studie
      1. Zodra de tumoren van voldoende grootte zoals bepaald door meting van de remklauw zijn, oor tags toevoegen aan elk van de dieren te zorgen correct bijhouden gedurende het gehele experiment.
        Opmerking: Numerieke oormerken kunnen vallen in de loop van het experiment. Dientengevolge, wordt u geadviseerd te begeleiden van deze fysieke tags met oor inkepingen op een systematische wijze (dwz., rechts, links, bilaterale, recht x 2, links x 2).
      2. De dieren sorteren zodat het volume van de gemiddelde tumor in elk cohort ongeveer gelijk is. De volgende methode voor het sorteren van de dieren kan worden uitgevoerd met behulp van een spreadsheetprogramma.
        1. Lijst van de dier individuele identificatienummers, oor inkeping patroon, en het volume van de tumor in drie afzonderlijke kolommen.
        2. Sorteer de gegevens van kleinste naar grootste volume van de tumor.
        3. In een vierde kolom toewijzen u elk dier een kooi nummer en doorloopt de kooien in een snakelike patroon. Bijvoorbeeld, als er 5 kooien, deze kolom zou gevuld "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." totdat alle dieren een kooi zijn toegewezen.
        4. Zodra de kooien zijn toegewezen, worden de gegevens door kooi nummer sorteren. Als oor inkepingen worden gebruikt, zorgen ervoor dat elk dier in een bepaald kooi een unieke oor inkeping patroon heeft. Als er duplicaten (twee of meer van hetzelfde patroon) in een bepaalde kooi, heeft swap een muis met een uit een andere kooi met de ontbrekende patroon tot elke kooi dieren met unieke oor inkeping patronen.
  2. Formuleringen en injecties
    Opmerking: De volgorde van de injectie ook zowel therapie studie verloopt als volgt: huA33-TCO wordt geïnjecteerd eerst, gevolgd door [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz na een vooraf bepaalde interval.
    1. Immunoconjugate
      1. Verdun een aliquoot deel van de oplossing van de huA33-TCO van stap 1,9 tot een concentratie van 0,8 mg/mL in een steriele zoutoplossing 0,9%.
      2. Doses van 150 µL (100 µg) tekenen van huA33-TCO oplossing in spuiten voorbehandeld met 1% bovien serumalbumine (BSA) in PBS en sla deze spuiten op ijs.
        Opmerking: BSA behandeling vermindert de niet-specifieke binding van het antilichaam aan de muren van de spuit.
      3. Warm de dieren onder een warmte lamp gedurende 3 minuten de staart ader te verwijden.
      4. De oplossing van de huA33-TCO injecteren in de ader van de staart van de xenograft-bevattende muis. 24 h (of een andere vooraf bepaald tijdsinterval) voorzien in de huA33-TCO ophopen in de tumor van de muis.
    2. Radioligand
      1. Tz-PEG-7radiolabel - DOTA zoals uiteengezet in sectie 5.
      2. Tekenen doses 150 μl van 0,9 procent steriele zoutoplossing met 1.1 molaire equivalenten van Tz-PEG7- DOTA ten opzichte van de hoeveelheid huA33-TCO toegediend. Als voorbeeld, 100 μg (0,67 nmol) huA33-TCO werd geïnjecteerd in het dier als het reactiemengsel [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz is gemaakt met een specifieke activiteit van 12.4 GBq/μmol, worden vervolgens doses getrokken met 9.14 MBq van elke activiteit. Dit komt overeen met 0,74 nmol voor Tz (1.1 molaire eq. relatieve huA33-TCO).
      3. Warm de dieren onder een warmte lamp voor 3 min de staart ader te verwijden.
      4. De dosis van radioligand injecteren in de ader van de staart van de xenograft-bevattende muis. De hoeveelheid activiteit te worden geïnjecteerd wordt bepaald door de onderzoeker. Gepubliceerde gegevens gebleken dosisafhankelijk therapeutische effecten op het tumor grootte binnen een bereik van 7.4-55,5 MBq.
  3. Ook
    1. Op het gewenste tijdstip na de toediening van de radioligand, euthanaseren elk cohort van muizen met behulp van een 2% O2 / 6% CO2 gas mengsel.
      Opmerking: Voer institutionele eisen met betrekking tot methoden voor secundaire fysieke euthanasie (bijvoorbeeld cervicale dislocatie).
    2. Voor elk dier, verwijder alle organen van belang, was ze in een bad van water te verwijderen van de overtollige bloed en droog ze op een papieren handdoek in open lucht voor 5 min. monster orgel lijst in de voorgestelde order: bloed, tumor, hart, longen, lever, milt, maag, dunne darm , dikke darm, nieren, spieren, bot, huid, staart.
    3. Zodra voldoende gedroogd, plaats de organen in de vooraf gewogen wegwerp cultuur buizen. Weeg de nu gevulde buizen nogmaals met het oog op de massa van elk orgaan of weefsel.
    4. Het meten van de activiteit in elk van de buizen met een gamma-teller. Kalibreren van de gemeten activiteit in de gamma-teller naar de detector gebruikt voor het meten van de getekende dosis. Tellen van radioactieve normen van 177Lu op elk instrument en bepaal een kalibratiefactor voor interconversion tussen activiteit en graven-per-minuut (cpm).
    5. De gegevens ook als een staafdiagram uitzetten (Zie Figuur 5) met het gemiddelde genormaliseerde opname voor elk orgel weergegeven, samen met een balk ter aanduiding van één standaarddeviatie. Statistische verschillen in opname tussen monster groepen kunnen worden beoordeeld door een ongepaard t-test, waarin belang wordt bereikt wanneer p < 0.05.
  4. Toezicht op de therapie
    1. Met remklauwen, meten de langste zijde van de langwerpige tumor (lengte) en de breedte, dat loodrecht op de lengte is. Volume met behulp van de formule voor het volume van een ellipsoïde berekenen: πL· (4/3) W· H, waardoor eenvoudiger te ½L· W2, ervan uitgaande dat de hoogte is ongeveer gelijk aan de breedte.
      Opmerking: Het is ook mogelijk om te gebruiken van een handbediende tumor meettoestel als één beschikbaar is (Zie Tabel van materialen).
    2. Weeg elke muis op een evenwicht gewichtstoename of gewichtsverlies na verloop van tijd kan bijhouden.
    3. Nog belangrijker is, controleren de fysieke verschijning van elk dier op tekenen van nood, zoals gebogen terug of gescheurde cutane bloedvaten (die kunnen wijzen op haematotoxicity).
      Opmerking: Tumor metingen moeten worden verzameld elke 1-2 dagen in de loop van de therapie van de longitudinale studie.
    4. Plot gegevens uit de longitudinale therapie studeren als gemiddelde tumor volumes na verloop van tijd en normaliseren tumor volume beginnen indien gewenst. Statistische verschillen in opname op dezelfde dag tussen monster groepen kunnen worden beoordeeld door een ongepaard t-test, waarin belang wordt bereikt wanneer P < 0.05. Meer uitgebreide statistische analyses kunnen en moeten worden uitgevoerd zoals aanbevolen door een opgeleide biostatistician.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De vervoeging van TCO naar huA33 is gebaseerd op de koppeling tussen de amine-reactieve TCO-NHS en de lysine residuen op het oppervlak van de immunoglobuline. Deze methode is zeer robuust en reproduceerbare en betrouwbaar levert een graad-van-labeling van 2-4 TCO/mAb. In dit geval MALDI-ToF massa spectrometrie werkte te bevestigen van een zekere mate van etikettering van ongeveer 4,0 TCO/mAb; een soortgelijke waarde werd verkregen met behulp van een fluorophore gemodificeerde tetrazine als een verslaggever24. De synthese van de tetrazine-ligand wordt uitgevoerd in drie stappen: (1) de koppeling van Tz-NHS aan een mono-Boc-beschermd PEG linker (2) de deprotection van dit intermediair tot opbrengst Tz-PEG7-NH,2, en (3) de vorming van een thioureum koppeling tussen p- SCN-Bn-DOTA en Tz-PEG7-NH2. Deze procedure is relatief facile en biedt Tz-PEG7- DOTA in een totale oogst van ~ 75%. Elk van de tussenproducten wordt gekenmerkt door HRMS en 1H-NMR; deze gegevens worden weergegeven in tabel 1.

Verhuizen naar de radiolabeling, wordt 177Lu3 + meestal verkregen uit commerciële aanbieders zoals een chloride zout [177Lu] LuCl3 in 0.5 M HCl. De radiolabeling van Tz-PEG7- DOTA met 177Lu opleveren van de Lu-DOTA-PEG radioligand [177Lu]7- Tz is heel eenvoudig: in slechts 20 min, de reactie is voltooid, het gewenste product in productie > 99% radiochemische zuiverheid zoals bepaald door radio-iTLC. Geen verdere zuivering is meestal noodzakelijk vóór formulering. Een overzicht van de literatuur over Tz/TCO gebaseerde pretargeting suggereert dat een Tz:mAb molaire ratio van ~ 1:1 produceert de beste in vivo gegevens10. Dientengevolge, is het niet essentieel om te verkrijgen van de radioligand in de hoogste mogelijke molaire activiteit. Bijvoorbeeld ook experimenten hier besproken dienst [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz met een molaire activiteit van ~ 12 GBq/µmol. Voor therapie van de longitudinale studies, daarentegen [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz met hogere molaire activiteit werd gebruikt ter vergemakkelijking van het beheer van grote doses radioactiviteit zonder het wijzigen van het aantal ingespoten mol Tetrazine.

Zoals zal worden aangepakt verdere in de discussie, ook experimenten zijn van het grootste belang voor het begrijpen en optimaliseren van iedere aanpak PRIT. In dit geval werden ook experimenten uitgevoerd om te bepalen van de optimale intervaltijd tussen de administratie van de immunoconjugate en de injectie van de radioligand. Te dien einde dienst we athymic naakt muizen die onderhuids A33 antigeen-uiten SW1222 xenografts op hun rechterschouder. Deze dieren ontvangen 100 µg (0,67 nmol) huA33-TCO 24, 48, 72 of 120 h vóór de injectie van [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (9.14 MBq, 0,74 nmol). Figuur 5 toont dat alle injectie intervallen hoogactieve concentraties in het weefsel van de tumor en lage activiteit concentraties in gezonde organen produceren. De 24 h injectie interval biedt de hoogste tumoraal opname op 120 h na injectie: 21.2 ± 2.9%ID/g. Elke set voorwaarden produceert ook indrukwekkende tumor-naar-orgel activiteit concentratie ratio's. Pretargeting met een interval van 24 uur per dag, bijvoorbeeld, levert tumor-naar-bloed, tumor-naar-lever en tumor-aan-spier ratio's van 20 ± 5, 37 ± 7, en 184 ± 30, respectievelijk 120 h na de toediening van de radioligand. Op basis van deze bevindingen, werd een interval van 24 uur gekozen voor de daaropvolgende longitudinale therapie-studie (zie hieronder).

Voor de in vivo longitudinale therapie studie, cohorten (n = 10) van athymic naakt muizen die onderhuids SW1222 xenografts op hun rechter flank werden door de overheid gereguleerde huA33-TCO (100 mg, 0,67 nmol) 24 uur vóór het injecteren van [177Lu] Lu-DOTA-PEG 7- Tz. Drie verschillende experimentele cohorten werkten, ontvangst van 18,7, 37 of 55,5 MBq van [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (overeenkomend met molaire activiteiten van 24, 45 en 70 GBq/µmol). Verder twee controle cohorten ontvangen een helft van de PRIT regime: ofwel huA33-TCO (100 mg, 0,67 nmol) zonder [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz of [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (55.5 MBq, 0,74 nmol) zonder huA33-TCO. Dit zijn essentiële besturingselementen om ervoor te zorgen dat de therapeutische respons niet wordt opgewekt door de immunoconjugate of radioligand alleen. De volumes van de tumoren werden gemeten om de 3 dagen voor de eerste drie weken van de studie en vervolgens eenmaal per week tot de sluiting van het experiment (70 dagen, 10 half-leven van 177Lu). Zoals te zien in Figuur 6, is er een sterk verschil in de reactie van de experimentele cohorten vergeleken met de controlegroepen. Terwijl de tumoren in de muizen ontvangen slechts één onderdeel van de strategie van PRIT groeien ongecontroleerde blijven, de tumoren van de ontvangst van de volledige PRIT regime muizen stoppen met groeien en uiteindelijk verschrompelen volume ver onder die gemeten aan het begin van de studie. Nog belangrijker is, geen toxische bijwerkingen werden waargenomen, en alle dieren onderhouden een gewicht binnen 20% van hun aanvankelijke massa (figuur 7A). Een perceel Kaplan-Meier van de gegevens biedt een nog meer opvallende visualisatie van de studie: terwijl alle muizen in de cohorten controle worden euthanized binnen een paar weken moest, de muizen van de experimentele cohorten had een perfecte record van overleving aan het eind van het onderzoek () Figuur 7B).

Figure 1
Figuur 1: schema van de Cartoon van pretargeted radioimmunotherapy op basis van de inverse elektron vraag Diels-Alder reactie. Dit cijfer is gewijzigd van referentie #28. (Aangepast) overgenomen met toestemming van Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy van colorectaal carcinoom. Moleculaire farmacie. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: schematische van de bouw van huA33-TCO. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: schematische van de synthese van Tz-PEG7- DOTA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: (A) Schematische voorstelling van de radiolabeling van [ 177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz; (B) de vertegenwoordiger radio-iTLC chromatografische demonstreren de > 98% radiochemische zuiverheid van [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Ook in van in vivo pretargeting met huA33-TCO en [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz in athymic naakt muizen die onderhuids SW1222 menselijke colorectal kanker tumoren gebruik pretargeting intervallen van 24 (paars), 48 (groen) , 72 (oranje) of 120 (blauw) uren. Gegevens met standaardfouten van cohorten van n = 4; Statistische analyse werd uitgevoerd door een ongepaard Student t-test, **p < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van referentie #28. (Aangepast) overgenomen met toestemming van Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy van colorectaal carcinoom. Moleculaire farmacie. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: longitudinale therapie studie van 5 groepen van muizen (n = 10 per stuk) dragende onderhuids SW1222 tumoren afgebeeld in gemiddelde tumor volume als een functie van de tijd (A); en het volume van de tumor genormaliseerd naar oorspronkelijke volume als een functie van tijd (B). De controlegroepen ontving de immunoconjugate zonder de radioligand (blauw) of de radioligand zonder de immunoconjugate (rood). De behandeling van de drie groepen ontvangen huA33-TCO (100 µg, 0.6 nmol) 24 h later gevolgd door 18,5 (groen), 37,0 (paars) of 55,5 (oranje) MBq (~0.8 nmol in elk geval) van [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz. Door log-rank (Mantel-Cox) testen, overleven was significant (p < 0.0001) voor alle groepen van de behandeling. Dit cijfer is gewijzigd van referentie #28. (Aangepast) overgenomen met toestemming van Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy van colorectaal carcinoom. Moleculaire farmacie. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: gewicht van curven voor dieren tijdens de therapie van de longitudinale studie van 5 groepen van muizen (n = 10 per stuk) rekening houdend met onderhuidse SW1222 tumoren (A); het overeenkomstige Kaplan-Meier voortbestaan kromme (B). De controlegroepen ontving de immunoconjugate zonder de radioligand (blauw) of de radioligand zonder de immunoconjugate (rood). De behandeling van de drie groepen ontvangen huA33-TCO (100 µg, 0.6 nmol) 24 h later gevolgd door 18,5 (groen), 37,0 (paars) of 55,5 (oranje) MBq (~0.8 nmol in elk geval) van [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz. Dit cijfer is gewijzigd van referentie #28. (Aangepast) overgenomen met toestemming van Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy van colorectaal carcinoom. Moleculaire farmacie. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Samengestelde 1 H-NMR verschuivingen HRMS (ESI)
500 MHz, DMSO
TZ-PEG7- NHBoc 10,52 (s, 1H) 8,50 (m, 3H), 7.82 (t, 1H), 7,46 (d, 2H), 6.69 (t, 1H), 4.33 (d, 2H), 3.42 (m, 22H), 3,33 (t, 2H), 3.31 (t, 2H), 3.12 (q, 2H), 2.99 (q, 2H), 2.12 (t, 2H), 2.03 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1.70 (q, 2H), 1.29 (s 9U) m/z calcd. voor C35H57N7O11NB: 774.4005; gevonden: 774.4014.
TZ-PEG7-NH2 10.58 (s, 1H) 8.46 (m, 2H), 7,87 (t, 1H), 7.75 (d, 2H), 7,52 (d, 1H), 4.40 (d, 2H), 3,60-3,50 (m, 26H), 3,40 (t, 2H), 3.32 (bs, 2H), 3,20 (q, 2H), 2.99 (bs, 2H), 2.19 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1.79 (q, 2H). m/z calcd. voor C30H50N7O9: 652.3670; gevonden: 652.3676.
TZ-PEG7- DOTA 10.57 (s, 1H) 9,63 (bs, 1H), 8,45 (m, 3H), 7.86 (m, 1H), 7.73 (bs, 1H), 7.54 (d, 2H), 7.41 (m, 2H), 7.19 (m, 2H), 6,54 (bs, 1H), 4.40 d, 2H, 4,00-3,20 (m, 55H), 3,20 (q, 4H) met 2,54 (s, 1H), 2.18 (t, 3H), 2.10 (t, 3H), 1.76 (q 2U). m/z calcd. voor C50H76N11O15S: 1202.56; gevonden: 1203.5741.

Tabel 1. Karakterisering gegevens voor de organische stoffen die in dit protocol worden beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een van de sterke punten van deze benadering van in vivo pretargeting — met name met betrekking tot strategieën gebaseerd op bispecifieke antilichamen en radiolabeled haptens — is zijn modulariteit: trans- Cycloocteen wordt kunnen worden toegevoegd aan een antilichaam, en tetrazine radioligands kan met een buitengewone verscheidenheid van radionucliden worden radiolabeled zonder afbreuk te doen aan hun vermogen om te reageren met hun partners klik. De aanpassing van deze aanpak naar andere antilichaam/antigeen-systeem is nog niet zo eenvoudig als het dupliceren van het protocol beschreven hier. Natuurlijk, moet elke poging om een nieuwe mAb-TCO-immunoconjugate of een roman tetrazine-bevattende radioligand te maken vergezeld gaan van de juiste chemische en biologische karakterisering tests, met inbegrip van tests voor stabiliteit en reactiviteit. Maar daarnaast zijn er twee variabelen die bijzonder belangrijk zijn om te verkennen en te optimaliseren: (1) de massa van mAb-TCO immunoconjugate toegediend en (2) de intervaltijd tussen de injectie van de mAb-TCO en het beheer van de radioligand. Beide factoren kunnen drastisch beïnvloeden het gedrag in vivo van het pretargeting systeem. Bijvoorbeeld het gebruik van overdreven hoge doses van immunoconjugate of interval perioden die te kort zijn kan leiden tot ongewenst hoogactieve concentraties in het bloed als gevolg van klik reacties tussen de radioligand en immunoconjugate resterende in omloop. Omgekeerd, massa's van de immunoconjugate die te laag zijn of overmatig lange interval perioden in dienst kan onnodig verminderen activiteit concentraties in de tumor te wijten aan een niet verzadigen van het antigeen of de onverbiddelijke (hoewel langzaam) isomerisatie van de trans - Cycloocteen naar inactieve cis- Cycloocteen. Langs deze lijnen, kan uitvoeren ook experimenten met behulp van een scala van massa's van immunoconjugate en pretargeting intervallen buitengewoon nuttig zijn. Natuurlijk, is het ook aanbevolen dat passende controles in tandem met een in vivo experimenten worden uitgevoerd. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot — experimenten met antigeen-negatieve cellijnen, blokkeren van cohorten die ontvangt een grote overmaat van unconjugated antilichamen, de administratie van de radioligand alleen, de injectie van de radioligand na een TCO- gebrek aan immunoconjugate, en in vivo pretargeting met behulp van een niet-specifieke, isotype controle TCO-bevattende immunoconjugate.

Anderzijds kunnen de imaging experimenten voor optimalisatie worden gebruikt als de therapeutische radionuclide positronen stoot of 'afdrukbare' fotonen of als een 'afdrukbare' isotopologue van de therapeutische radionuclide beschikbaar. Uiteindelijk moeten de sets van variabelen die de beste balans tussen hoge tumoral activiteit concentraties en tumor-naar-achtergrond hoogactieve concentratie ratio's bieden voor latere longitudinale therapie studies worden geselecteerd. In het geval hier gepresenteerd, 100 µg huA33-TCO werd geïnjecteerd met een interval van 24 h. dosimetrie berekeningen — met name die waarmee voor de berekening van de tumor doses en therapeutische ratio's — ook nuttig kan zijn tijdens het proces van optimalisatie.

Het is belangrijk op te merken dat zelfs de veelbelovende [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz/huA33-TCO-systeem dat ontwikkeld is van aanvullende optimalisatie profiteren kan. Een vergelijking tussen de dosimetrie gegevens uit deze benadering PRIT en traditionele RIT met een 177Lu-geëtiketteerden variant van huA33 blijkt dat de tumor dosis PRIT onder dat van de traditionele rit ligt Bovendien, de effectieve dosis van het PRIT systeem (0.054 mSv/MBq) ligt iets lager dan dat van traditionele RIT (0.068 mSv/MBq).

Twee oplossingen voor deze problemen worden momenteel onderzocht. Ten eerste is een dendritische steiger kan verhoging van het aantal TCOs toegevoegd aan elke antilichaam30ontwikkeld. In het kader van pretargeted PET beeldvorming, deze aanpak drastisch verhoogt tumoral activiteit concentraties, en andere soortgelijke experimenten met [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz zijn aan de gang. Ten tweede, het gebruik van tetrazine-bevattende clearing agenten kan nuttig in de context van PRIT. De administratie van clearing agenten vóór de injectie van de radioligand is benut in een verscheidenheid van methoden als een manier om de concentratie van residuele immunoconjugate in het bloed verlagen en dus beperking van de concentraties van de activiteit in pretargeting gezonde organen23,31. Het gebruik van agenten clearing doet niet geen nadelen, al; de bekendste daarvan is de complexiteit van een reeds weliswaar ingewikkeld therapeutische modaliteit verhogen. Niettemin, onderzoekers van het Memorial Sloan-Kettering Cancer Center publiceerde onlangs een dwingende rapport over de eenmaking een Tz-geëtiketteerden dextran clearing agent voor pretargeted PET imaging, en gegevens over het gebruik van deze constructie in combinatie met [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz en huA33-TCO zijn komende32. Een andere benadering aan het maximaliseren van de dosimetrische voordelen van PRIT is het gebruik van radionucliden met fysieke kortere halfwaardetijd. Dit heeft bewezen zeer effectief voor imaging; echter, therapeutische radionucliden met korte fysieke helft-leven zijn weinigen en ver tussen.

Tot slot zouden wij remiss zijn als wij niet goed ingaan op enkele van de intrinsieke beperkingen van pretargeting gebaseerd op de omgekeerde elektron vraag Diels-Alder-reactie. De eerste van deze problemen is inherent aan alle benaderingen van in vivo pretargeting: het antilichaam werkzaam bij binding aan het doelweefsel kan niet worden geïnternaliseerd. Dit, natuurlijk, is essentieel, aangezien het antilichaam moet toegankelijk blijven voor de radioligand in plaats van afgezonderd in een intracellulair compartiment. Deze beperking is weliswaar moeilijk te omzeilen, hoewel is aangetoond onlangs dat antilichamen met langzame tot matige tarieven van internaliserende kan worden gebruikt voor in vivo pretargeting33,34. Ten tweede, de trage in vivo isomerisatie van reactieve trans -Cycloocteen naar inactieve cis -Cycloocteen heeft het potentieel om beperken de lengte van het interval tussen de administratie van de TCO-bevattende immunoconjugate en de injectie van de radioligand. Kritisch, intervallen van maximaal 120 h hebben nog steeds uitstekende resultaten opgeleverd in het kader van beide pretargeted huisdier imaging en PRIT. Echter gaat het gebruik van deze langere intervallen bijna altijd gepaard met lichte reducties in tumoral activiteit concentraties, een uitslag die uit deze isomerisatie voortvloeien kunnen. Om dit probleem te verhelpen, hebben verschillende laboratoria geprobeerd te maken meer stabiel trans- cyclooctenes zonder afbreuk te doen aan reactiviteit, terwijl anderen hebben geprobeerd te ontwikkelen volledig nieuwe dienophiles kunnen reageren met tetrazine35 . In de komende jaren is het onze hoop dat deze chemische ontwikkelingen zal worden benut voor PRIT.

Op het einde is PRIT op basis van de inverse elektron vraag Diels-Alder afbinding onmiskenbaar een opkomende en enigszins onvolwassen technologie. We zijn echter toch bemoedigd door de preklinische resultaten wij hebben verkregen en enthousiast voor de klinische belofte van deze strategie. Wij hopen van harte dat dit protocol anderen moedigt te verkennen en optimaliseren van deze aanpak en dus brandstof zijn reis van het laboratorium naar de kliniek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Dr. Jacob Houghton voor nuttig gesprekken. De auteurs ook bedank de NIH voor hun gulle financiering (R00CA178205 en U01CA221046).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
  2. Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
  3. Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
  4. Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
  5. Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin's Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
  6. Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
  7. Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
  8. Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
  9. Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
  10. van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
  11. Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
  12. Goldenberg, D. M., Chatal, J. -F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
  13. Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
  14. Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
  15. Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Cancer Research. 76 (22), 6669 (2016).
  16. Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
  17. Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
  18. Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
  19. Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
  20. Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
  21. Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
  22. Meyer, J. -P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
  23. Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
  24. Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  26. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
  27. Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
  28. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
  29. Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
  30. Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
  31. Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
  32. Meyer, J. -P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
  33. Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
  34. Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
  35. Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).

Tags

Chemie kwestie 143 radioimmunotherapy pretargeted radioimmunotherapy pretargeting inverse elektron vraag Diels-Alder reactie tetrazine trans- Cycloocteen huA33 A33 antigeen lutetium-177
Pretargeted Radioimmunotherapy op basis van de Inverse Electron vraag Diels-Alder reactie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis,… More

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis, B. M. Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (143), e59041, doi:10.3791/59041 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter