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Chemistry

Pretargeted Radioimmuntherapie basierend auf die Inverse Elektron Nachfrage Diels-Alder-Reaktion

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Charakterisierung von einem Trans- Cyclooctene (TCO)-modifizierte Antikörper und einem 177-Lu-Label kurz (Tz) Radioligand für pretargeted Radioimmuntherapie (Gewinn). Darüber hinaus enthält sie die Verwendung von diesen beiden Konstrukte für in Vivo Bioverteilung und längs Therapiestudien in einem Mausmodell des kolorektalen Karzinoms.

Abstract

Während Radioimmuntherapie (RIT) einen vielversprechenden Ansatz für die Behandlung von Krebs ist, kann die lange pharmakokinetische Halbwertszeit von radioaktiven Antikörper hohe Strahlendosen auf gesundes Gewebe führen. Vielleicht haben es überrascht nicht, verschiedene Strategien entwickelt, um diese beunruhigende Einschränkung zu umgehen. Eines der vielversprechendsten Ansätze ist pretargeted Radioimmuntherapie (Gewinn). Gewinn gründet sich auf Entkopplung Radionuklids aus dem Immunglobulin, Injektion von ihnen getrennt und dann erlauben sie, in Vivo im Zielgewebe zu kombinieren. Dieser Ansatz nutzt die außergewöhnliche Tumor-targeting Eigenschaften der Antikörper während Sockelleiste ihre pharmakokinetischen Nachteile, dadurch Senkung der Strahlenbelastung für Nichtziel-Gewebe und erleichtert den Einsatz von Radionukliden mit Halbwertszeiten, die als zu kurz für Einsatz in traditionellen Radioimmunoconjugates. In den letzten fünf Jahren haben unser Labor und andere ein Ansatz zur in-Vivo pretargeting basierend auf die inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder (IEDDA) Reaktion zwischen Trans- Cyclooctene (TCO) und kurz (Tz) entwickelt. Diese Strategie erfolgreich angewendet wurde, pretargeted Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und Single Photon Emission Computertomographie (SPECT) Bildgebung mit einer Vielzahl von Antikörper-Antigen-Systemen. Wir haben in ein paar Neuerscheinungen die Wirksamkeit des IEDDA-basierte Gewinn in murinen Modellen Duktales Pankreaskarzinom und kolorektalen Karzinom gezeigt. Wir beschreiben in diesem Protokoll Protokolle für Gewinn mit einem 177-Lu-DOTA-Label kurz Radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz) und einer TCO-modifizierte Variante des colorectal Krebses Ausrichtung auf huA33 Antikörper (huA33-TCO). Genauer gesagt, beschreiben wir den Bau der huA33-TCO, Synthese und enzymatische [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz, und die Leistung der in Vivo Bioverteilung und längs Therapiestudien in murinen Modellen der kolorektalen Karzinom.

Introduction

Radioimmuntherapie (RIT) – die Verwendung von Antikörpern für die Lieferung von therapeutischen Radionuklide zu Tumoren – schon seit langem ein verlockender Ansatz zur Behandlung von Krebs1,2. In der Tat hat dieses Versprechen durch die United States Food and Drug Administration Zulassung von zwei Radioimmunoconjugates für die Behandlung von Non-Hodgkin Lymphom unterstrichen worden: 90Y-Ibritumomab Tiuxetan und 131-Tositumomab3 , 4. aber auch von ihren Anfängen, die klinische Perspektiven der RIT durch eine wichtige Komplikation behindert haben: hohe Strahlung Dosis Raten auf gesundes Gewebe5,6. Im allgemeinen Radioimmunoconjugates für RIT mit langlebiger Radionuklide gekennzeichnet sind (z. B. 131ich [t½ = 8,0 Tage] und 90Y [t½ = 2,7 Tage]) mit physischen Halbwertszeiten, die gut mit der lange pharmakokinetische Halbwertszeiten von Immunglobulinen. Dies ist wichtig, denn es gewährleistet, dass genügend Radioaktivität bleibt der Antikörper nach einigen Tagen nach der Übermittlung seiner optimalen Bioverteilung angekommen. Diese Kombination von langen Verweilzeiten im Blut und lange körperliche Halbwertszeiten führt jedoch unweigerlich in der Bestrahlung von gesundem Gewebe, wodurch therapeutische Verhältnisse und die Wirksamkeit der Therapie7zu begrenzen. Verschiedene Strategien zur Umgehung dieses Problems, einschließlich der Verwendung von abgeschnittenen Antikörperfragmente wie Fab, Fab erkundet worden ", F(ab')2, Minibodies und Nanobodies8,9,10. Eine der vielversprechendsten und faszinierend, aber unbestreitbar Komplex, alternative Ansätze ist in Vivo pretargeting11.

Pretargeting in Vivo ist ein Ansatz zur nuklearen Bildgebung und Therapie, die versucht, die exquisite Affinität und Selektivität von Antikörpern nutzbar zu machen, während ihre pharmakokinetischen Nachteile11,12,13Sockelleiste. Zu diesem Zweck ist der radioaktiven Antikörper verwendet im traditionellen Radioimmuntherapie in zwei Komponenten zerlegt: ein kleines Molekül Radioligand und eine Immunoconjugate, die sowohl ein Tumor Antigen und die oben genannten Radioligand binden können. Das Immunoconjugate ist zuerst injiziert und einen "Vorsprung", oft mehrere Tage, in denen es reichert sich in das Zielgewebe und löscht aus dem Blut. Anschließend das kleine Molekül Radioligand verabreicht und kombiniert mit der Immunoconjugate auf den Tumor oder löscht rasch aus dem Körper. Im wesentlichen stützt sich in Vivo pretargeting auf Radiochemie innerhalb des Körpers selbst durchführen. Durch die Reduzierung der Zirkulation der Radioaktivität, dieser Ansatz gleichzeitig reduziert Strahlenbelastung auf gesundes Gewebe und erleichtert den Einsatz von Radionukliden (z. B. 68Ga, t½ = 68 min.211; Als t½ = 7,2 h) mit Halbwertszeiten, die in der Regel mit Antikörper-basierten Vektoren unvereinbar angesehen werden.

Beginnend in den späten 1980er Jahren, eine Handvoll verschiedener Ansätze zur in-Vivo pretargeting entwickelt worden, einschließlich Strategien basierend auf Bispezifische Antikörper, die Interaktion zwischen Streptavidin und Biotin, und der Hybridisierung von ergänzenden Oligonukleotide14,15,16,17,18. Noch ist jeder zurück in unterschiedlichem Ausmaß von Komplikationen, am bekanntesten die potente Immunogenität von Streptavidin-modifizierte Antikörper19,20gehalten worden. In den letzten fünf Jahren haben unsere Gruppe und andere einen Ansatz zur in-Vivo pretargeting basierend auf der schnellen und Bioorthogonal inverse Elektron Nachfrage Diels-Alder Ligatur zwischen Trans- Cyclooctene (TCO) und kurz (Tz) entwickelt 21,22,23,24. Das erfolgreichste dieser Strategien haben ein TCO-modifizierte Antikörper und ein Tz-Lager Radioligand beschäftigt wie TCO in der Regel stabiler in Vivo als seine Tz Partner (Abbildung 1)25,26. In anderen pretargeting Methoden ist die mAb-TCO Immunoconjugate zuerst verabreicht und Zeit aus dem Verkehr gezogen und im Tumorgewebe anreichern. Anschließend wird das kleine Molekül Tz Radioligand injiziert, anschließend entweder mit der Immunoconjugate in das Zielgewebe klickt oder löscht rasch aus dem Körper. Dieses in Vivo pretargeting Strategie bewährt sehr effektiv für PET und SPECT imaging mit mehreren verschiedenen Antikörper/Antigen-Systemen, konsequent produziert Bilder mit hohem Kontrast und ermöglicht die Verwendung von kurzlebigen Radionukliden wie 18 F (t½ = 109 min) und 64Cu (t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Vor kurzem wurde die Wirksamkeit von Klick-basierte pretargeted Radioimmuntherapie (Gewinn) in murinen Modellen Duktales Pankreaskarzinom (PDAC) und kolorektalen Karzinom27,28nachgewiesen. Zu diesem Zweck die therapeutischen Radionuklids 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 Tage) wurde in Verbindung mit zwei verschiedenen Antikörpern eingesetzt: 5B1, die Kohlenhydrat-Antigen 19,9 (CA19.9) ubiquitär in PDAC ausgedrückt richtet sich an , und huA33, die A33 abzielt, einen transmembranen Glycoprotein ausgedrückt in > 95 % der kolorektale Karzinome. In beiden Fällen diesen Ansatz auf 177Lu-Gewinn ergab hohe Aktivitätskonzentrationen im Tumorgewebe, erstellt eine dosisabhängige therapeutische Wirkung und reduziert gleichzeitig Aktivitätskonzentrationen in gesundes Gewebe im Vergleich zu traditionellen direkt-mit der Bezeichnung Radioimmunoconjugates.

In diesem Artikel beschreiben wir Protokolle für Gewinn mit einem 177-Lu-DOTA-Label kurz Radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz) und einer TCO-modifizierte Variante der huA33 Antikörper (huA33-TCO). Genauer gesagt, beschreiben wir den Bau des huA33-TCO (Abbildung 2), der Synthese und enzymatische [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (Abbildung 3 und Abbildung 4) und die Leistung von in Vivo Bioverteilung und längs Therapiestudien in murinen Modellen des kolorektalen Karzinoms. Darüber hinaus in der repräsentative Ergebnisse und Diskussion, wir präsentieren ein Beispieldatensatz Adresse mögliche Strategien zur Optimierung dieses Ansatzes und betrachten diese Strategie in den größeren Zusammenhang der in Vivo pretargeting und Gewinn. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass während wir gewählt haben, konzentrieren sich auf pretargeting mit huA33-TCO und [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz in diesem Protokoll, diese Strategie hochmodular ist und kann eine Vielzahl von Antikörpern angepasst werden und Radionuklide.

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Protocol

Alle in Vivo Tierversuche in dieser Arbeit beschriebenen wurden nach genehmigten Protokolle durchgeführt und ausgeführt nach den ethischen Richtlinien der Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center und Hunter College Institutionelle Pflege der Tiere und Nutzung Ausschüsse (IACUC).

1. die Vorbereitung der huA33-TCO

Hinweis: Die Synthese von huA33-TCO wurde bereits berichtet29. Jedoch für den Leser zu erleichtern, ist es hier mit Anpassungen für optimale Bedingungen repliziert.

  1. In einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch, bereiten die 125 μL Lösung (E) - Cyclooct - 4-Enyl 2,5-Dioxo-1-Pyrrolidinyl Carbonat (TCO-NHS) im trockenen Dimethyl Formamid (DMF) in einer Konzentration von 40 mg/mL (0,15 M). Diese Lösung kann regelmÄÑig und gefrorenen bei-80 ° C für den Einsatz in weiteren Untersuchungen sein.
  2. Bereiten Sie in einem separaten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch die 5 mg/mL Lösung von huA33 in 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 2,7 mM Kaliumchlorid, 137 mM Natriumchlorid und 11,9 mM Kalium Phosphat, pH 7,4).
  3. Mit kleinen Aliquote (< 5 μL) von 0,1 M Na2CO3, stellen Sie den pH-Wert der Antikörper-Lösung von Schritt 1.2 auf 8,8-9,0. Verwenden Sie pH-Papier oder ein pH-Meter mit einer Mikroelektrode zur Überwachung des pH-Wertes und seien Sie vorsichtig, dass der pH-Wert 9.0 nicht überschreitet.
  4. Die beschriebene in Schritt 1.3 Antikörperlösung langsam Hinzufügen eines Datenträgers entspricht 40 molare Entsprechungen der TCO-NHS im Verhältnis zu der Menge des Antikörpers. Beispielsweise ist 5 mg (30 Nmol) huA33 in der Lösung fügen Sie 9.0 μL (1,20 μmol) 40 mg/mL (0,15 M) Lösung der TCO-NHS hinzu.
    Hinweis: TCO-NHS ist hydrophob. Wenn es um die Lösung des Antikörpers hinzufügen, fügen Sie es langsam und mit Agitation, Niederschlag zu verhindern. Nicht mehr als 10 % DMF nach Volumen in der endgültigen Reaktionslösung.
  5. Lassen Sie die Reaktion bei 25 ° C auf einem Thermomixer für 1 h mit milden Agitation (500 u/min) inkubieren.
  6. Reinigen Sie nach 1 h die huA33-TCO Immunoconjugate über eine vorverpackte Einweg Größe Ausgrenzung Entsalzung Spalte.
    1. Equilibrate der Ausgrenzung-Spalte "Größe", wie beschrieben durch den Lieferanten, von Konservierungsstoffen in der Spalte vorhanden während der Lagerung zu entfernen. Eine typische Vorgehensweise beinhaltet waschen die Spalte 5 X mit einem Volumen von PBS, die das Volumen der Spalte entspricht: 5 x 2,5 mL PBS.
    2. Spalte "Größe-Ausschluss" das Volumen des Reaktionsgemisches in Anbetracht fügen Sie die Reaktionsmischung hinzu.
    3. Nachdem das Reaktionsgemisch die Spalte eingegeben hat, fügen Sie einen angemessenen Betrag von PBS, das Gesamtvolumen der Lösung hinzugefügt, um die Spalte zu bringen bis zu 2,5 mL. Zum Beispiel, wenn die Konjugation Reaktion führte zu einem Gesamtvolumen von 1,3 mL, 1,2 mL zusätzliche PBS die Spalte hinzufügen.
    4. Das Produkt mit 2 mL PBS als das Laufmittel zu sammeln.
      Hinweis: Dieser Schritt wird die endgültige Konstrukt huA33-TCO in 2 mL PBS, pH 7.4 Ausbeute.
  7. Messen der Konzentration der huA33-TCO mit einem UV-Vis Spektralphotometer Überwachung der 280 nm Wellenlänge. Der molaren Aussterben Koeffizient für die meisten IgGs (ε280) ist 210.000 M-1cm-1.
  8. Wenn eine Lösung mit einer höheren Konzentration von Immunoconjugate gewünscht wird, konzentrieren sich die huA33-TCO-Lösung unter Verwendung einer zentrifugalen Filtereinheit mit einem 50.000 Molekulargewicht Cut-off nach Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Viele Antikörper haben dafür bekannt, zu aggregieren oder Niederschlag während der Konzentration. Wenn Sie dieses Verfahren mit einem neuen Antikörper versuchen, sollten Forscher der Literatur oder eigene Erfahrung im Umgang mit den fraglichen Antikörper aufschieben.
  9. Speichern Sie das ausgefüllte huA33-TCO Immunoconjugate bei 4 ° C im Dunkeln ggf. sofort. Wenn es mehr als 4 Tage in der Zukunft verwendet werden soll, speichern sie bei-80 ° C im Dunkeln.
    Hinweis: Dies ist eine akzeptable Haltepunkt in der Prozedur. Die abgeschlossenen huA33-TCO Immunoconjugate sollte für mindestens 6 Monate Lagerung bei-80 ° C im Dunkeln stabil sein.

(2) die Synthese von Tz-PEG-7- NHBoc

  1. Lösen Sie in einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch 5 mg kurz N- Hydroxysuccinimidyl Ester (Tz-NHS; 12,6 μmol) in 0,15 mL wasserfreiem Dimethyl Sulfoxid (DMSO).
  2. Lösen sich in einem separaten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch 8 mg des Boc-geschützten amino PEG Polymers, O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene Glykol (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) in 0,15 mL wasserfreiem DMSO.
  3. Zur Lösung der Tz-NHS 3 μL (21,3 μmol, 1,7 molare Äquivalente) von Triethylamin (Tee) und mischen Sie gründlich.
  4. Die NHBoc-PEG7-NH2 Lösung aus Schritt 2.2 rosa kurz-Lösung hinzu und inkubieren Sie das Reaktionsgemisch für 30 min bei Raumtemperatur (RT) mit milden Agitation.
  5. Nach 30 Minuten die Reaktion 1:1 in H2O verdünnen und reinigen die Reaktion unter Verwendung der umgekehrt Phase C18 Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) zu jeder nicht umgesetztes Tz-NHS trennen die Tz-PEG-7- NHBoc. Verwenden Sie Lösungsmittel ohne Säure die vorzeitige Entfernung des Boc Gruppe Schutz zu verhindern. Überwachen der beiden Tz-PEG-7- NHBoc und Tz-NHS bei einer Wellenlänge von 525 nm.
    Hinweis: Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC Ausstattung jedes Labor (Pumpen, Spalten, Schläuche, etc.) und entsprechende Kontrollen sollten vor der Reinigung ausgeführt werden. Jedoch, beispielsweise wenn ein Gefälle von 5:95 MeCN/H2O präsentieren (beide ohne irgendeinen Zusatz) zu 95:5 MeCN/H2O über 30 min eine Durchflussmenge von 1 mL/min und eine analytische 4,6 x 250 mm C18Spalte verwendet , die Retentionszeiten der Tz-NHS und Tz-PEG-7- NHBoc sind rund 16 min und 18 min bzw..
  6. Die gesammelten HPLC Eluent mit flüssigem Stickstoff eingefroren und das jetzt eingefroren Sammelröhrchen in Alufolie wickeln. Ort der gefrorenen Sammelröhrchen auf ein Gefriertrockner über Nacht in der mobilen Phase HPLC zu entfernen. Das Produkt wird eine charakteristische helle Rosa solide sein.
    Hinweis: Wenn flüssiger Stickstoff nicht verfügbar ist, frieren die gesammelten HPLC Elutionsmittels in Trockeneis oder über Nacht in einem-80 ° C Gefrierschrank.

(3) die Synthese von Tz-PEG7-NH2

  1. Das Produkt aus Schritt 2.6, Tz-PEG-7- NHBoc, 1,5 mL Dichlormethan (DCM) hinzufügen und diese Lösung auf einem kleinen Rundboden-Kolben übertragen.
  2. 0,25 mL Trifluoroacetic Säure (TFA) tropfenweise auf die rosa Lösung aus Schritt 3.1 hinzufügen.
  3. Lassen Sie die Reaktion für 30 min bei RT mit milden Agitation auszubrüten.
  4. Nach 30 min verdunsten der Lösungsmittel über rotary Verdunstung. Überschreiten Sie Bad Wassertemperatur von 37 ° c nicht
  5. Bereiten Sie das rosa viskose Produkt in 0,5 mL Wasser.
  6. Reinigen Sie das Produkt mit umgekehrt Phase C18 HPLC, um Tz-PEG7-NH2 von der Boc-geschützten Vorläufer zu trennen. Überwachen der beiden Tz-PEG-7- NHBoc und Tz-PEG7-NH2 bei einer Wellenlänge von 525 nm.
    Hinweis: Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC Ausstattung jedes Labor (Pumpen, Spalten, Schläuche, etc.) und entsprechende Kontrollen sollten vor der Reinigung ausgeführt werden. Jedoch, beispielsweise wenn ein Gefälle von 5:95 MeCN/H2O präsentieren (beide mit 0,1 % TFA), 95:5 MeCN/H2O über 30 min eine Durchflussmenge von 1 mL/min und eine analytische 4,6 x 250 mm C18Spalte verwendet , die Retentionszeiten der Tz-PEG-7- NHBoc und Tz-PEG7-NH2 sind ca. 18 min. 13 min. bzw..
  7. Die gesammelten HPLC Eluent mit flüssigem Stickstoff eingefroren und das jetzt eingefroren Sammelröhrchen in Alufolie wickeln. Ort der gefrorenen Sammelröhrchen auf ein Gefriertrockner über Nacht in der mobilen Phase HPLC zu entfernen. Das Produkt wird eine leuchtend rosa solide sein.
  8. Bereiten Sie das Produkt aus Schritt 3.7, Tz-PEG7-NH2, mit 150 μL DMSO und Transfer zu einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch.
  9. Messen Sie die Konzentration von Tz-PEG7-NH2 mit einem UV-Vis Spektralphotometer Überwachung der 525 nm Wellenlänge. Der molaren Aussterben Koeffizient für Tz-PEG7-NH2 (ε525) ist 535 M-1cm-1.

(4) die Synthese von Tz-PEG7- DOTA

  1. Lösen Sie Tz-PEG7-NH2 (4,5 mg, 6.9 μmol auf) in 0,15 mL DMSO (oder fahren Sie einfach mit der Lösung erstellt in Schritt 3,8).
  2. Die kurz-haltige Lösung 22 molare äquivalente Tee (21 μL, 0,15 Mmol) aus Schritt 4.1 hinzufügen.
  3. Fügen Sie 10 mg (14,2 μmol) von p- SCN-Bn-DOTA als solide und Wirbel die Lösung für ca. 2 min oder bis das Material vollständig aufgelöst ist.
  4. Lassen Sie die Reaktion für 30 min bei RT mit milden Agitation auszubrüten.
  5. Verdünnen Sie nach 30 min die Reaktion 1:1 in H2O und reinigen Sie das Produkt mit umgekehrt Phase C18 HPLC um nicht umgesetztes p- SCN-Bn-DOTA zu entfernen. Die p- SCN-Bn-DOTA überwacht werden kann, bei einer Wellenlänge von 254 nm, während die Tz-PEG-7- DOTA ist am besten kontrollieren bei einer Wellenlänge von 525 nm.
    Hinweis: Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC Ausstattung jedes Labor (Pumpen, Spalten, Schläuche, etc.) und entsprechende Kontrollen sollten vor der Reinigung ausgeführt werden. Jedoch, beispielsweise wenn ein Gefälle von 5:95 MeCN/H2O präsentieren (beide mit 0,1 % TFA), 95:5 MeCN/H2O über 30 min und einer analytischen 4,6 x 250 mm C18Spalte dienen, Tz-PEG-7- DOTA und p-SCN-Bn-DOTA haben Retentionszeiten der rund 15,6 min und 16,1 min. bzw..
  6. Die gesammelten HPLC Eluent mit flüssigem Stickstoff eingefroren und das jetzt eingefroren Sammelröhrchen in Alufolie wickeln. Ort der gefrorenen Sammelröhrchen auf ein Gefriertrockner über Nacht in der mobilen Phase HPLC zu entfernen. Das Produkt wird ein helles rosa Pulver sein.
  7. Rekonstruieren Sie das Produkt in 0,15 mL DMSO und Messen Sie die Konzentration mit einem UV-Vis Spektralphotometer Überwachung der 525 nm Wellenlänge. Die Molaren Aussterben Koeffizient für Tz-PEG-7- DOTA (ε525) ist 535 M-1cm-1.
  8. Analysieren Sie die letzte Verbindung durch Kernspinresonanz (NMR) und hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) zu überprüfen, diese Synthese war erfolgreich. Siehe Tabelle 1 für die experimentell ermittelten chemischen Verschiebungen und Molekulargewichte aller Verbindungen, die in dieser Arbeit diskutiert.
  9. Speichern Sie die gereinigte Tz-PEG7- DOTA Lösung im Dunkeln bei-80 ° C.
    Hinweis: Dies ist eine akzeptable Haltepunkt in der Prozedur. Der fertige Tz-PEG7- DOTA Vorläufer ist für mindestens 1 Jahr unter diesen Bedingungen stabil.

5. 177Lu enzymatische von Tz-PEG7- DOTA

Achtung: Dieser Schritt des Protokolls umfasst die Bearbeitung und Manipulation von Radioaktivität. Vor dem Ausführen dieser Schritte – oder jede andere Arbeitsleistung mit Radioaktivität – Forscher sollten wenden Sie sich an ihrer Heimathochschule Strahlenabteilung Sicherheit. Alle möglichen Schritte zur Minimierung der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung.

Hinweis: Beim Arbeiten mit kleinen Mengen von Radiometals wird empfohlen, dass alle Puffer frei von Spurenmetallen in Koordination Sitebindung Störungen.

  1. Fügen Sie in einem 1,7 mL Zentrifugenröhrchen 200 μL von 0,25 M Ammonium-Acetat-Puffer mit aliquoten von 1 M HCl auf pH 5,5 angepasst.
    Hinweis: Wenn Sie weniger als 370 MBq Tätigkeit für die Kennzeichnung verwenden, sollte das Volumen des Puffers zu 100 µL reduziert werden.
  2. Fügen Sie die gewünschte Menge an [177Lu] LuCl3 in der Pufferlösung. Der Betrag addiert werden abhängig von der Anzahl der Themen in das Experiment und die radioaktive Dosis verabreicht wird. Es wird empfohlen, dass 1-2 zusätzliche Dosen Wert von Radioaktivität als Vorsichtsmaßnahme, um den möglichen Verlust von Radioaktivität während Reinigungsschritte auszugleichen hinzugefügt werden.
  3. Fügen Sie Tz-PEG-7- DOTA in DMSO die radioaktive Mischung im Schritt 5.2. Die Höhe der Tz-PEG-7- DOTA ist hängt von der Anzahl der Probanden getestet. Weitere Einzelheiten zu diesem Thema finden Sie im Schritt 6.2.2.2.
  4. Lassen Sie die Lösung bei 37 ° C für 20 min inkubieren.
  5. Überprüfen Sie, ob die enzymatische abgeschlossen mit Radio instant Dünnschichtchromatographie (Radio-iTLC) mit 50 mM EDTA, pH 5,5 als mobile Phase ist. Die beschrifteten [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz bleibt an der Grundlinie — Rf = 0 — zwar frei [177Lu] Lu3 + wird von EDTA koordiniert und reist mit dem Lösungsmittel Front Rf = 1,0 (Abb. 3 b).
  6. Wenn quantitative Kennzeichnung nicht erreicht wird, fügen Sie zusätzliche Liganden der freien Radiometal zu koordinieren. Alternativ zu reinigen die beschrifteten [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz mit einem C-18 -Patrone. Anweisungen der Hersteller für den Einsatz. Nachstehend finden Sie eine Beispiel-Prozedur.
    1. Entlüften der Patrone durch langsam vorbei durch 5 mL Ethanol durch die Patrone mit einer großen Spritze. Anschließend durchlaufen Sie die 5 mL Acetonitril und dann 5 mL deionisiertes (DI) H2O.
    2. Ziehen Sie die Radioligand-Lösung von Schritt 5.3 in eine kleinere Spritze und injizieren sie langsam auf die C-18 -Patrone. Dann ungebunden waschen die Patrone mit 10 mL DI H2O, entfernen [177Lu] LuCl3.
    3. Eluieren Sie mit 500 µL Ethanol. Entfernen Sie alle Ethanol aus dem Endprodukt durch Überfahren des Schiffes mit einer low-Flow-Rate von trockenem Stickstoff oder Argon für 10-15 min. Anschließend erneut die Radioligand in Kochsalzlösung in einem Volumen im Schritt 6.2.2.2 bestimmt.

6. in-Vivo -Studien

Achtung: Wie in Abschnitt 5 beinhaltet dieser Schritt des Protokolls die Handhabung und Bearbeitung von Radioaktivität. Bevor Sie diese Schritte durchführen, sollten Forscher mit ihrer Heimathochschule Strahlung Sicherheit Abteilung konsultieren. Alle möglichen Schritte zur Minimierung der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung.

  1. Vorbereitung der Tiere
    1. Bei nackte weibliche Athymic Mäusen subkutan Implantat 5 x 106 SW1222 colorectal Krebszellen ausgesetzt in 150 μl einer 1:1 Mischung aus Zelle Medien und Matrix (zB., Matrigel) und diese in einen 100-150 mm3 Xenograft (14-18 Tage wachsen lassen nach der Inokulation).
    2. Sortierung der Tiere für ein Bioverteilung experiment
      1. Sobald die Tumoren von ausreichender Größe wie vom Bremssattel Messung festgelegt sind, sortieren Sie die Tiere um sicherzustellen, dass jeder Kohorte hat ungefähr die gleiche durchschnittliche Tumorvolumen. Die Tiere können in jedem Käfig durch Markierungen am Heck mit unauslöschbarer Tinte (ein Band, zwei Bands, etc.) unterschieden werden.
    3. Sortierung der Tiere für eine longitudinale Therapiestudie
      1. Sobald die Tumoren von ausreichender Größe wie vom Bremssattel Messung festgelegt sind, legen Sie Ohrmarken auf jedes der Tiere zur richtigen Tracking während des Experiments zu gewährleisten.
        Hinweis: Numerische Ohrmarken können im Laufe des Experiments abfallen. Infolgedessen, es empfiehlt sich, diese physischen Tags mit Ohr Einkerbungen in systematischer Weise zu begleiten (i.e., rechts, links, beidseitig, rechts 2, Links 2).
      2. Sortieren Sie die Tiere, so dass die durchschnittliche Tumorvolumen in jeder Kohorte ungefähr gleich ist. Die folgende Methode zum Sortieren von Tieren kann mit einem Tabellenkalkulations-Programm durchgeführt werden.
        1. Liste der tierischen Identifikationsnummern, Ohr Kerbe Muster und Tumorvolumen in drei separate Spalten.
        2. Sortieren Sie die Daten vom kleinsten zum größten Tumorvolumen.
        3. Weisen Sie in einer vierten Spalte jedes Tier eine Käfig-Nummer und die Käfige in einem verschlungenen Muster zu durchlaufen zu. Zum Beispiel gibt es 5 Käfige, diese Spalte wäre "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." gefüllt, bis alle Tiere in einem Käfig zugewiesen sind.
        4. Sobald die Käfige zugeordnet sind, sortieren Sie die Daten von Käfig-Reihe. Wenn Ohr Kerben verwendet werden, stellen Sie sicher, dass jedes Tier in einem bestimmten Käfig eine einzigartiges Ohr Kerbe Muster hat. Wenn in einem bestimmten Käfig gibt es Duplikate (zwei oder mehr der gleichen Muster), hat Swap eine Maus mit einem aus einem anderen Käfig mit dem fehlenden Muster bis jeder Käfig Tiere mit einzigartigen Ohr Kerbe Mustern.
  2. Formulierungen und Injektionen
    Hinweis: Die Reihenfolge der Einspritzung für Bioverteilung und Therapie-Studie geht wie folgt: huA33-TCO injiziert zuerst, gefolgt von [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz nach einem vorher festgelegten Intervall.
    1. Immunoconjugate
      1. Ein Aliquot der huA33-TCO-Lösung von 1,9 Schritt zu einer Konzentration von 0,8 mg/mL in sterilen Kochsalzlösung 0,9 % verdünnen.
      2. Zeichnen Sie Dosen von 150 µL (100 µg) huA33-TCO-Lösung in Spritzen in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) vorbehandelt und speichern Sie diese Spritzen auf Eis.
        Hinweis: BSA-Behandlung reduziert die unspezifische Bindung des Antikörpers an den Wänden der Spritze.
      3. Wärmen Sie die Tiere unter einer Wärmelampe für 3 Minuten, die Rute Vene zu dehnen.
      4. Die huA33-TCO-Lösung in die Vene der Schweif der Maus Xenograft-Lager zu injizieren. Die huA33-TCO akkumulieren in den Tumor der Maus ermöglichen Sie 24 h (oder ein anderes vorher festgelegten Zeitintervall).
    2. Radioligand
      1. Radiomarkierung Tz-PEG-7- DOTA wie in Abschnitt 5 beschrieben.
      2. Zeichnen Sie Dosen in 150 μL von 0,9 % sterile Kochsalzlösung enthält 1,1 molare Entsprechungen von Tz-PEG-7- DOTA im Verhältnis zu der Menge des huA33-TCO verabreicht. Beispielsweise werden wenn 100 μg (0,67 Nmol) huA33-TCO das Tier injiziert wurde und [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz Reaktionsmischung wurde mit einer spezifischen Aktivität von 12,4 GBq/μmol, dann Dosen gezeichnet mit 9,14 MBq Aktivität jedes. Dies entspricht 0,74 Nmol Tz (1.1 molare EQ relativ zur huA33-TCO).
      3. Wärmen Sie die Tiere unter einer Wärmelampe für 3 min, die Rute Vene zu dehnen.
      4. Die Dosis von Radioligand in die Rute Vene der Maus Xenograft-Lager zu injizieren. Die Höhe der Aktivität injiziert werden, richtet sich nach der Forscher. Veröffentlichte Daten haben dosisabhängig therapeutische Auswirkungen auf die Größe des Tumors innerhalb eines Bereichs von 7,4-55,5 MBq gezeigt.
  3. Bioverteilung
    1. Zum gewünschten Zeitpunkt nach der Verabreichung der Radioligand einschläfern jeder Kohorte von Mäusen mit einem 2 % O2 / 6 % CO2 gas-Gemisch.
      Hinweis: Führen Sie institutionellen Anforderungen an Methoden zur sekundären physischen Euthanasie (z. B. zervikale Dislokation).
    2. Für jedes Tier, entfernen alle Organe von Interesse, in einem Wasserbad entfernen überschüssiges Blut zu waschen und trocknen Sie sie auf einem Papiertuch unter freiem Himmel für 5 min. Beispielliste Orgel in der empfohlenen Reihenfolge: Blut, Tumor, Herz, Lunge, Leber, Milz, Magen, Dünndarm , Dickdarm, Nieren, Muskeln, Knochen, Haut, Schweif.
    3. Sobald ausreichend getrocknet ist, legen Sie die Organe in vorgewogene Einweg Kultur Röhren. Wiegen Sie die nun gefüllte Schläuche noch einmal auf die Masse des einzelnen Organ oder Gewebe zu erhalten.
    4. Messen Sie die Aktivität in jedes der Rohre mit einem Gamma-Zähler. Die gemessene Aktivität in den Gamma-Zähler an den Detektor zur Messung der gezeichneten Dosis zu kalibrieren. Radioaktiven Normen von 177Lu auf jedem Instrument zählen und bestimmen ein Kalibrierfaktor für Wechsel zwischen Aktivität und zählt pro Minute (cpm).
    5. Die Bioverteilung Daten als Balkendiagramm darstellen (siehe Abbildung 5) mit dem Mittelwert normalisiert Aufnahme für jedes Organ angezeigt zusammen mit eine Bar bezeichnet eine Standardabweichung. Statistische Unterschiede Beispielgruppen Aufnahme können von einem ungepaarten t-Test, Bedeutung erlangte bewertet werden wenn p < 0,05.
  4. Therapiemonitoring
    1. Messen Sie Bremssättel, die längste Seite des länglichen Tumors (Länge) sowie die Breite, die senkrecht auf die Länge. Volumen mit der Formel für das Volumen eines Ellipsoides berechnen: (4/3) πL· W· H, die zu ½L· vereinfacht W2, vorausgesetzt, dass die Höhe der Breite ungefähr gleich ist.
      Hinweis: Es ist auch möglich, einen Handheld-Tumor, Messgerät, wenn man zur Verfügung (siehe Tabelle der Materialien) zu verwenden.
    2. Wiegen Sie jede Maus auf einem Gleichgewicht, Gewichtszunahme oder Gewichtsverlust im Laufe der Zeit zu verfolgen.
    3. Überwachen Sie wichtig ist, jedes Tier physische Erscheinung auf Anzeichen von Not, wie z. B. zurück gebeugt oder geplatzten kutanen Blutgefäße (die Hämatoxizität angeben können).
      Hinweis: Tumor-Messungen sollten alle 1-2 Tage im Laufe des longitudinalen Therapiestudie erhoben werden.
    4. Plot-Daten von der longitudinalen Therapie als Durchschnittsvolumina Tumor im Laufe der Zeit zu studieren und normalisieren, Tumorvolumen ab, falls gewünscht. Statistische Unterschiede in der Aufnahme am selben Tag zwischen Beispielgruppen können von einem ungepaarten t-Test, Bedeutung erlangte bewertet wenn P < 0,05. Weitergehende statistische Analysen können und wie durch eine ausgebildete Biostatistiker empfohlen durchgeführt werden sollte.

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Representative Results

Die Konjugation des TCO, huA33 beruht auf der Kopplung zwischen den Amin-reaktive TCO-NHS und die Lysin-Rückstände auf der Oberfläche der Immunglobulin. Diese Methode ist sehr robust und reproduzierbare und zuverlässig liefert eine Grad-der-Kennzeichnung von 2-4 TCO/mAb. In diesem Fall wurde MALDI-ToF-Massenspektrometrie eingesetzt, um ein Maß für die Kennzeichnung von ca. 4,0 TCO/mAb zu bestätigen; ein ähnlicher Wert wurde mit einem Fluorophor-modifizierte kurz als ein Reporter24erhalten. Die Synthese des kurz-Liganden erfolgt in drei Schritten: (1) die Kopplung der Tz-NHS an ein Mono-Boc-geschützten PEG Linker (2) die Deprotection von diesem mittleren Ertrag Tz-PEG7-NH2und (3) die Bildung einer Thioharnstoff-Verbindung zwischen p- SCN-Bn-DOTA und Tz-PEG7-NH2. Dieses Verfahren ist relativ leicht und bietet Tz-PEG-7- DOTA in einem Gesamtertrag von ~ 75 %. Jeder der die Zwischenprodukte ist gekennzeichnet von HRMS und 1H-NMR; Diese Daten werden in Tabelle 1dargestellt.

Um die enzymatische, 177Lu3 + in der Regel von kommerziellen Anbietern ergibt sich da ein Chlorid Salz [177Lu] LuCl3 in 0,5 M HCl. Die enzymatische Tz-PEG-7- DOTA mit 177Lu Radioligand [177Lu] Lu-DOTA-PEG7Ausbeute - Tz ist sehr einfach: in nur 20 min, ist die Reaktion abgeschlossen, produzieren das gewünschte Produkt in > 99 % radiochemische Reinheit, wie von Radio-iTLC bestimmt. In der Regel ist keine weitere Reinigung vor der Formulierung erforderlich. Ein Überblick über die Literatur zu Tz/TCO-basierte pretargeting schlägt vor, dass ein Tz:mAb Molverhältnis von ~ 1:1 produziert die besten in Vivo Daten10. Infolgedessen ist es nicht wichtig, die Radioligand in die höchste mögliche molare Aktivität zu erhalten. Zum Beispiel Bioverteilung Experimente diskutiert hier beschäftigen [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz mit einer molaren Aktivität von ~ 12 GBq/µmol. Für längs-Therapiestudien, im Gegensatz dazu [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz mit höheren Molaren Aktivität wurde verwendet, um die Verwaltung von größeren Dosen von Radioaktivität zu erleichtern, ohne Veränderung der Anzahl der injizierten Mol kurz.

Wie behandelt wird weiter in der Diskussion Bioverteilung Experimente sind von größter Bedeutung für das Verständnis und jede Annäherung an Gewinn zu optimieren. In diesem Fall wurden Bioverteilung Experimente durchgeführt, um die optimale Intervallzeit zwischen der Verwaltung der Immunoconjugate und die Injektion von der Radioligand zu bestimmen. Zu diesem Zweck haben wir Athymic nackte Mäuse mit subkutanen A33 Antigen exprimierenden SW1222 Xenotransplantate auf ihrer rechten Schulter beschäftigt. Diese Tiere erhielten 100 µg (0,67 Nmol) huA33-TCO 24, 48, 72 oder 120 h vor der Injektion von [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz (9,14 MBq, 0,74 Nmol). Abbildung 5 zeigt, dass alle Injektion Intervalle hochaktiver Konzentrationen im Tumorgewebe sowie niedrige Aktivitätskonzentrationen in gesunde Organe produzieren. Das 24 h-Injektion-Intervall bietet die höchste Tumor Aufnahme auf 120 h nach der Injektion: 21,2 ± 2.9%ID/g. Jeder Satz von Bedingungen produziert auch beeindruckende Tumor-Organtätigkeit Konzentrationsverhältnis. Pretargeting mit einem 24-Stunden-Intervall, z. B. Tumor-zu-Blut, Tumor, Leber und Tumor-Muskel-Verhältnis von 20 ± 5, ergibt 37 ± 7 und 184 ± 30, bzw. 120 h nach Verabreichung der Radioligand. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, wurde eine 24 h-Intervall für die nachfolgenden längs Therapiestudie (siehe unten) gewählt.

Für die in Vivo längs Therapiestudie, Kohorten (n = 10) Athymic nackte Mäuse mit subkutanen SW1222 Xenotransplantate auf ihrer rechten Flanke waren verabreichten huA33-TCO (100 Ug, 0,67 Nmol) 24 Stunden vor der Injektion [177Lu] Lu-DOTA-PEG 7- Tz. Drei verschiedene experimentelle Kohorten waren beschäftigt, Empfang 18,7, 37 oder 55.5 MBq [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz (entsprechend molare Aktivitäten von 24, 45 und 70 GBq/µmol). Darüber hinaus zwei Kontrolle Kohorten erhielt eine Hälfte des Gewinn-Therapie: entweder huA33-TCO (100 Ug, 0,67 Nmol) ohne [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz oder [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (55,5 MBq, 0,74 Nmol) ohne huA33-TCO. Dies sind wesentliche Kontrollen sicherstellen, dass die therapeutische Reaktion durch die Immunoconjugate oder Radioligand allein nicht ausgelöst wird. Die Bände der Tumoren wurden alle 3 Tage für die ersten drei Wochen der Studie und danach einmal pro Woche bis zum Abschluss des Experiments (70 Tage, 10 Halbwertszeiten von 177Lu) gemessen. Wie in Abbildung 6zu sehen, gibt es ein krasser Unterschied in der Reaktion der experimentellen Kohorten im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Während die Tumoren in den Mäusen erhalten nur eine Komponente der Gewinn-Strategie unkontrolliert wachsen weiterhin, die Tumoren der Mäuse erhalten die volle Gewinn-Therapie aufhören zu wachsen und schließlich verkleinern auf Volumen deutlich unter denen zu Beginn der Studie gemessen. Wichtig ist, keine toxischen Nebenwirkungen wurden beobachtet, und alle Tiere gepflegt eine Gewicht innerhalb von 20 % ihrer ursprünglichen Masse (Abb. 7A). Ein Kaplan-Meier-Plot der Daten bietet eine noch markantere Visualisierung der Studie: während alle Mäuse in der Steuerelement-Kohorten innerhalb weniger Wochen eingeschläfert werden musste, hatten die Mäuse von den experimentellen Kohorten eine makellose Bilanz des Überlebens am Ende der Untersuchung ( Abbildung 7 b).

Figure 1
Abbildung 1: Cartoon schematische Darstellung der pretargeted Radioimmuntherapie basierend auf die inverse Elektron Nachfrage Diels-Alder Reaktion. Diese Zahl wurde von Referenz #28 geändert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Membreno, R., Koch, B. E., Fung, (angepasst) K., Lewis, J. S. u. Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmuntherapie des kolorektalen Karzinoms. Molekulare Pharmazie. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische des Baus des huA33-TCO. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische der Synthese von Tz-PEG-7- DOTA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: (A) schematische Darstellung der enzymatische [ 177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz; (B) repräsentativen Radio-iTLC Chromatogramm zeigt die > 98 % radiochemische Reinheit [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Bioverteilung in der pretargeting mit huA33-TCO und [177Lu] in Vivo - DOTA - PEG-7- Tz in den Athymic nackten Mäusen mit subkutanen SW1222 menschlichen colorectal Krebstumoren mit pretargeting Abständen von 24 (lila), 48 (grün) , (orange) 72 oder 120 Stunden (blau). Daten mit Standardfehler von Kohorten von n = 4; Statistische Auswertung erfolgte durch ein ungepaartes Student t-Test, **p < 0,01. Diese Zahl wurde von Referenz #28 geändert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Membreno, R., Koch, B. E., Fung, (angepasst) K., Lewis, J. S. u. Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmuntherapie des kolorektalen Karzinoms. Molekulare Pharmazie. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Longitudinal Therapiestudie von 5 Gruppen von Mäusen (n = 10 Stück) Lager subkutane SW1222 Tumoren in durchschnittliche Tumorvolumen dargestellt als Funktion der Zeit (A); und Tumorvolumen normiert auf Ausgangsmenge als Funktion der Zeit (B). Die Kontrollgruppen erhielten entweder das Immunoconjugate ohne die Radioligand (blau) oder der Radioligand ohne die Immunoconjugate (rot). Die drei Behandlung Gruppen erhalten huA33-TCO (100 µg, 0,6 Nmol) 24 h später gefolgt von 18,5 (grün), 37,0 (lila) oder 55.5 (orange) MBq (~0.8 Nmol jeweils) [177Lu] - DOTA - PEG-7- Tz. Testen von Log-Rank (Mantel-Cox), Überleben war signifikante (p < 0,0001) für alle Behandlungsgruppen. Diese Zahl wurde von Referenz #28 geändert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Membreno, R., Koch, B. E., Fung, (angepasst) K., Lewis, J. S. u. Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmuntherapie des kolorektalen Karzinoms. Molekulare Pharmazie. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Gewicht Kurven für Tiere während der longitudinalen Therapiestudie von 5 Gruppen von Mäusen (n = 10 Stück) mit subkutanen SW1222 Tumoren (A); das entsprechende Kaplan-Meier-überleben Kurve (B). Die Kontrollgruppen erhielten entweder das Immunoconjugate ohne die Radioligand (blau) oder der Radioligand ohne die Immunoconjugate (rot). Die drei Behandlung Gruppen erhalten huA33-TCO (100 µg, 0,6 Nmol) 24 h später gefolgt von 18,5 (grün), 37,0 (lila) oder 55.5 (orange) MBq (~0.8 Nmol jeweils) [177Lu] - DOTA - PEG-7- Tz. Diese Zahl wurde von Referenz #28 geändert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Membreno, R., Koch, B. E., Fung, (angepasst) K., Lewis, J. S. u. Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmuntherapie des kolorektalen Karzinoms. Molekulare Pharmazie. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Verbindung 1 H-NMR Verschiebungen HRMS (ESI)
500 MHz, DMSO
TZ-PEG-7- NHBoc 10,52 (s, 1H), 8,50 (m, 3H), 7,82 (t, 1H), 7,46 (d, 2H), 6,69 (t, 1H), 4.33 (d, 2H), 3,42 (m, 22H), 3,33 (t, 2H), 3.31 (t, 2H), 3.12 (Q, 2H), 2,99 (Q, 2H), 2.12 (t, 2H), 2.03 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,70 (Q, 2H), 1.29 (s 9 H) m/Z berech. für C35H57N7O11Na: 774.4005; gefunden: 774.4014.
TZ-PEG7-NH2 10.58 (s, 1H), 8,46 (m, 2H), 7.87 (t, 1H), 7,75 (d, 2H), 7,52 (d, 1H), 4.40 (d, 2H), 3,60-3,50 (m, 26H), 3,40 (t, 2H), 3,32 (bs, 2H), 3.20 (Q, 2H), 2,99 (bs, 2H), 2.19 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,79 (d, 2H). m/Z berech. für C30H50N7O9: 652.3670; gefunden: 652.3676.
TZ-PEG7- DOTA 10.57 (s, 1H), 9.63 (bs, 1H), 8.45 Uhr (m, 3H), 7,86 (m, 1H), 7,73 (bs, 1H), 7,54 (d, 2H), 7.41 (m, 2H), 7.19 (m, 2H), 6.54 (bs, 1H), 4.40 (d, 2H), 4,00-3.20 (m, 55H), 3.20 (Q, 4H), 1,76 (Q 2,54 (s, 1H), 2.18 (t, 3H), 2.10 (t, 3H) 2 H). m/Z berech. für C50H76N11O15S: 1202.56; gefunden: 1203.5741.

Tabelle 1. Charakterisierungsdaten für organischen Verbindungen, die in diesem Protokoll beschrieben.

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Discussion

Eine der Stärken dieses Ansatzes zu in Vivo pretargeting — vor allem in Bezug auf Strategien auf Bispezifische Antikörper ausgesagt und radioaktiv Haptens – ist seine Modularität: Trans- Cyclooctene Moieties können angehängt werden, um Antikörper und kurz Radioligands kann mit einer außergewöhnlichen Vielfalt von Radionukliden ohne Beeinträchtigung ihrer Reaktionsfähigkeit mit ihren Partnern klicken Sie radioaktiv sein. Die Anpassung dieses Konzepts auf andere Antikörper/Antigen-System ist noch nicht so einfach wie das Duplizieren von des hier beschriebenen Protokolls. Natürlich sollte jeder Versuch zum Erstellen einer neuen mAb-TCO Immunoconjugate oder eine neuartige kurz tragenden Radioligand durch geeignete chemische und biologische Charakterisierung Assays, einschließlich Tests für Stabilität und Reaktivität begleitet werden. Aber darüber hinaus gibt es zwei Variablen, die besonders wichtig zu erforschen und zu optimieren sind: (1) die Masse des mAb-TCO Immunoconjugate verabreicht und (2) die Intervallzeit zwischen der Injektion von mAb-TCO und der Verwaltung der Radioligand. Beide Faktoren können die in Vivo -Verhalten des pretargeting Systems drastisch beeinflussen. Beispielsweise kann die Verwendung von übermäßig hohen Dosen Immunoconjugate oder Intervall Perioden, die zu kurz sind unerwünscht hohe Aktivität-Konzentrationen im Blut durch Klick Reaktionen zwischen der Radioligand und Immunoconjugate im Umlauf bleiben führen. Umgekehrt kann mit Massen von Immunoconjugate, die zu niedrig sind oder übermäßig lange Intervall Zeiträume unnötig Aktivitätskonzentrationen im Tumor aufgrund eines Fehlers das Antigen oder die unerbittliche (wenn auch langsam) Isomerisierung der Trans zu sättigen reduzieren - Cyclooctene, inaktive Cis- Cyclooctene. In diesem Sinne kann die Durchführung Bioverteilung Experimente mit einer Reihe von Massen von Immunoconjugate und pretargeting Intervalle außerordentlich hilfreich sein. Natürlich ist es auch empfohlen, entsprechende Kontrollen im Tandem mit keine in-Vivo -Experimente ausgeführt werden. Dazu gehören – sind aber nicht beschränkt auf – Experimente mit Antigen-negativen Zelllinien, blockieren Kohorten, die einen großen Überschuss an unconjugated Antikörper, die Verwaltung der Radioligand allein, die Injektion von Radioligand, die nach einer TCO- erhalten fehlt Immunoconjugate, und in Vivo pretargeting mit einem unspezifischen, Isotype Kontrolle TCO-Lager Immunoconjugate.

Alternativ können bildgebende Experimenten zur Optimierung verwendet werden, wenn das therapeutische Radionuklid Positronen emittiert oder "bedruckbare" Photonen oder wenn ein "bedruckbare" Isotopologue des therapeutischen Radionuklids verfügbar. Letztlich sollten die Sätze von Variablen, die die beste Balance aus hoher Tumor Aktivitätskonzentrationen und hohe Tumor-Hintergrundaktivität Konzentrationsverhältnis bieten für nachfolgende längs Therapiestudien ausgewählt werden. Im hier vorgestellten Fall 100 µg huA33-TCO injiziert wurde, mit einem Intervall von 24 h. Dosimetrie Berechnungen – insbesondere jene, die für die Berechnung der Tumor Dosen und therapeutische Verhältnisse erlauben – kann auch hilfreich sein, während der Prozess der Optimierung.

Es ist wichtig zu beachten, dass auch das vielversprechende [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz/huA33-TCO System, das entwickelt wurde von weiteren Optimierung profitieren könnten. Ein Vergleich zwischen den Dosimetrie Daten aus diesem Ansatz für Gewinn und traditionellen RIT mit einer 177-Lu-Label-Variante des huA33 zeigt, dass die Tumor-Dosis von Gewinn unterhalb des traditionellen RIT. liegt Darüber hinaus ist die effektive Dosis des Gewinn-Systems (0.054 mSv/MBq) nur geringfügig niedriger als die der traditionellen RIT (0.068 mSv/MBq).

Zwei Mittel, um diese Themen werden derzeit geprüft. Zunächst wurde ein dendritischen Gerüst in der Lage, die Zahl der TCOs an jeder Antikörper30angehängt entwickelt. Im Rahmen der pretargeted PET-Bildgebung, dieser Ansatz drastisch steigert Tumor Aktivitätskonzentrationen und analog Experimente mit [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz sind im Gange. Zweitens kann die Verwendung von kurz-Lager Clearing Agenten im Rahmen der Gewinn nützlich. Die Verwaltung der clearing-Agenten vor der Injektion der Radioligand wurde ausgenutzt, in einer Vielzahl von pretargeting Methoden als ein Weg, um die Konzentration der verbleibenden Immunoconjugate im Blut zu verringern und reduzieren somit die Aktivitätskonzentrationen in gesunde Organe23,31. Die Verwendung von clearing Agenten ist nicht ohne seine Nachteile, aber; Das bemerkenswerteste davon steigt die Komplexität der eine bereits zugegeben komplizierten therapeutische Modalität. Dennoch, Forscher am Memorial Sloan Kettering Cancer Center kürzlich veröffentlichte einen überzeugenden Bericht über die Schaffung einer Tz-Label Dextran clearing Agent für pretargeted PET imaging und Daten über die Nutzung dieses Konstrukts in Verbindung mit [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz und huA33-TCO sind bevorstehenden32. Ein weiterer Ansatz zur Maximierung der dosimetrische Vorteile der Gewinn ist der Einsatz von Radionukliden mit kürzeren körperlichen Halbwertszeiten. Dies hat für die Bildgebung sehr bewährt; therapeutischen Radionuklide mit kurze physikalische Halbwertszeit sind jedoch rar gesät.

Schließlich wären wir nachlässig, wenn wir es versäumt, den systeminternen Einschränkungen von pretargeting basierend auf die inverse Elektron Nachfrage Diels-Alder-Reaktion angemessen zu reagieren. Die erste dieser Probleme ist, die alle Ansätze zur in-Vivo pretargeting: der Antikörper eingesetzt kann nicht bei der Bindung an das Zielgewebe verinnerlicht werden. Dies ist natürlich wichtig, wie die Antikörper für die Radioligand anstatt in einem intrazellulären Kompartiment abgesondert zugänglich bleiben muss. Diese Einschränkung ist zwar schwer zu umgehen ist, obwohl es vor kurzem gezeigt worden ist, dass Antikörper mit langsam bis mäßig verinnerlichen können für in Vivo pretargeting33,34verwendet werden. Zweitens die langsam in Vivo Isomerisierung von reaktiven Trans -Cyclooctene, inaktive Cis -Cyclooctene hat das Potenzial, die Länge des Intervalls zwischen der Verwaltung der TCO-Lager Immunoconjugate begrenzen und die Injektion von der Radioligand. Kritisch, lieferten Intervalle von bis zu 120 h noch hervorragende Ergebnisse im Rahmen der beiden pretargeted PET imaging und Gewinn. Jedoch ist die Verwendung von diesen längeren Intervallen fast immer von leichten Rückgang der Tumor Aktivitätskonzentrationen, ein Ergebnis begleitet, aus dieser Isomerisierung stammen kann. Um dieses Problem zu beheben, haben mehrere Labors versucht, Erstellen stabiler Trans- Cyclooctenes ohne Reaktivität, während andere versucht haben, entwickeln völlig neue Dienophiles reagieren mit kurz35 . In den kommenden Jahren ist es unsere Hoffnung, dass diese chemischen Entwicklungen für Gewinn genutzt werden werden.

Am Ende ist Gewinn anhand der inverse Elektron Nachfrage Diels-Alder-Ligatur unbestreitbar eine emergente und etwas unreif Technologie. Allerdings sind wir dennoch durch die präklinische Ergebnisse ermutigt, die haben wir gewonnen und begeistert für das klinische Versprechen dieser Strategie. Wir hoffen, dass dieses Protokoll andere ermutigt, erkunden und diesen Ansatz zu optimieren und somit Kraftstoff seine Reise aus dem Labor in die Klinik.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Jacob Houghton für hilfreiche Gespräche. Die Autoren auch möchte die NIH für ihre großzügige Finanzierung (R00CA178205 und U01CA221046).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Chemie Ausgabe 143 Radioimmuntherapie pretargeted Radioimmuntherapie pretargeting inverse Elektron Nachfrage Diels-Alder-Reaktion kurz Trans- Cyclooctene huA33 A33 Antigen Lutetium-177
Pretargeted Radioimmuntherapie basierend auf die Inverse Elektron Nachfrage Diels-Alder-Reaktion
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Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis, B. M. Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (143), e59041, doi:10.3791/59041 (2019).

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