Summary
이 프로토콜 합성 및 트랜스-cyclooctene (TCO)의 특성에 설명 합니다-항 체와 177루 표시 tetrazine (Tz) radioligand pretargeted radioimmunotherapy (PRIT)에 대 한 수정. 또한, 그것은 자세히 biodistribution vivo에서 및 colorectal 암의 murine 모델에 경도 치료 연구에 대 한 이러한 두 가지 구조를 사용 하 여를 설명합니다.
Abstract
Radioimmunotherapy (RIT) 암 치료에 대 한 유망한 접근은, 건강 한 조직에 높은 방사선 복용량 방사선된 항 체의 긴 pharmacokinetic 반감기 발생할 수 있습니다. 아마 당연한 일로, 여러 가지 다른 전략이 문제가 제한 우회 개발 되었습니다. 이러한 접근의 가장 유망한 중 하나입니다 pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT는 비보에 대상 조직에 결합 하는 면역 글로불린에서 방사성 핵 종 분리, 별도로, 그들에 게 주입 하 고 다음 있도록에 입각 한입니다. 이 이렇게 pharmacokinetic 그들의 단점을 굽 도리 널, 그로 인하여 비 표적 조직에 방사선 복용량을 낮추는 고 반감기를 가진 방사성 핵의 사용을 촉진 하는 동안 항 체의 뛰어난 종양을 대상으로 속성을 보여준다 전통적인 radioimmunoconjugates에 대 한 너무 짧은 사용으로 간주 됩니다. 지난 5 년 동안 우리의 실험실과 다른 비보에 트랜스-cyclooctene (TCO) 및 tetrazine (Tz) 사이 역 전자-수요 Diels 오리 나무 (IEDDA) 반응에 따라 pretargeting에 대 한 접근을 개발 했습니다. 이 전략을 성공적으로 pretargeted 양전자 방출 단층 촬영 (PET)에 적용 된 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 항 체-항 원 시스템의 다양 한 이미징 및. 최근 간행물의 쌍, 우리 IEDDA 기반 PRIT 췌 장 ductal 선 암과 대 장 암 murine 모델에서의 효능을 증명 하고있다. 이 프로토콜에서 177루 DOTA 라는 tetrazine radioligand를 사용 하 여 PRIT에 대 한 프로토콜 설명 ([177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz)와 huA33 항 체 (huA33-TCO)을 대상으로 대 장 암의 TCO 수정 변종. 좀 더 구체적으로, 우리 huA33 TCO, 합성 [177루]의 radiolabeling 루-DOTA-말뚝7의 건설을 설명 합니다-Tz, vivo에서 biodistribution와 murine 모델에서 경도 치료 연구의 성과 대 장 암입니다.
Introduction
Radioimmunotherapy (RIT)-사용 항 체의 종양 치료 방사성의 배달에 대 한-긴 암1,2의 치료에 대 한 유혹 접근 되었습니다. 실제로,이 약속 했다 비-Hodgkin의 림프 종 치료에 대 한 두 개의 radioimmunoconjugates의 미국 식품 및 의약품 안전 청의 승인에 의해 강조 되었습니다: 90Y ibritumomab tiuxetan 및 131-tositumomab3 , 4. 초기 일에서 새끼의 임상 전망 중요 한 합병증에 의해 방해 되어 아직: 건강 한 조직이5,6높은 방사선 복용량 비율. 일반적으로 말하자면, 미 모에 대 한 radioimmunoconjugates 수명이 긴 방사성 표시 됩니다 (예: 131나 [t½ = 8.0 일] 90Y [t½ = 2.7 일]) 물리적 반감기와 잘 사 개 그와 면역 글로불린의 긴 pharmacokinetic 절반-삶입니다. 이것은 필수, 그 충분 한 방사능 항 체의 최적의 biodistribution 순환의 몇 일 후에 도달 되 면 남아 보장. 그러나,이 긴 거주 시간 혈액에 긴 물리적 반감기의 필연적 결과이 조합 하지 함으로써 치료 비율을 감소 하 고 제한 치료7의 효능 건강 한 조직에의 방사선 조사에. 여러 전략 잘린된 항 체 파편 팹, 팹 등의 사용을 포함 하 여이 문제를 회피 하 탐험 되어 ', F(ab')2, minibodies, 및 nanobodies8,,910. 한의 가장 유망 하 고 매혹적인, 아직 명백 하 게 복잡 한, 대체 접근에 vivo에서 11pretargeting입니다.
Vivo에서 pretargeting 핵 영상과 치료 그들의 pharmacokinetic 단점11,,1213를 굽 도리 널 하면서 절묘 한 선호도 및 항 체의 선택도 활용 하고자 하는 접근 이다. 이 위해, 전통적인 radioimmunotherapy에서 이용 된 방사선된 항 체는 두 가지 구성 요소에 deconstructed: 작은 분자 radioligand와는 immunoconjugate 종양 항 원 및 상기 radioligand 모두 바인딩할 수 있습니다. immunoconjugate 먼저 주입 하 고 주어진 ' 시작 ', 종종 몇 일 동안 그것은 대상 조직에 축적 하 고 혈액에서 지웁니다. 그 후, 작은 분자 radioligand 관리 하 고 종양에 immunoconjugate와 결합 하거나 빠르게 시체에서 지웁니다. 본질적으로, vivo에서 pretargeting radiochemistry 본문 자체 내에서 수행 시 사용 합니다. 방사능의 순환을 줄임으로써,이 이렇게 동시에 건강 한 조직에 방사선 복용량을 감소 하 고 방사성 핵의 사용을 용이 하 게 (예를 들어, 68가 t½ = 68 분211; 로, t½ = 7.2 h) 일반적으로 항 체 기반 벡터와 호환 되지 않는 여겨진다 절반 생활.
1980 년대 후반에 시작, vivo에서 pretargeting에 다른 접근의 개발 되었으며, bispecific 항 체, streptavidin 비타민 b 복합체, 사이 상호 작용에 따라 전략을 포함 하 여 및 보완의 교 잡 oligonucleotides14,15,,1617,18. 아직 각 개최 되었습니다 다시 다양 한 각도에 합병증, 항 체 streptavidin 수정19,20의 가장 고 명 하 게 강력한 immunogenicity 여. 지난 5 년 동안, 우리의 그룹 및 다른 사람 vivo에서 pretargeting는 급속 및 bioorthogonal 역 전자 수요 Diels 오리 나무 결 찰 트랜스-cyclooctene (TCO) 및 tetrazine (Tz) 사이 기반에 대 한 접근을 개발 했습니다. 21,22,,2324. 이 전략의 가장 성공적인 고용 했다 TCO 수정 항 체 및 Tz 베어링 radioligand, TCO는 일반적으로 더 안정 된 vivo에서 Tz 파트너 (그림 1)25,26보다. 다른 pretargeting 방법론에서 mAb TCO immunoconjugate 먼저 관리 하 고 순환에서 하 고 종양 조직에 축적 하는 시간을 주어진. 그 후, 작은 분자 Tz radioligand은 주입 후 대상 조직 내의 immunoconjugate와 함께 클릭 하거나 시체에서 급속 하 게 지웁니다. 이 비보에 전략 pretargeting 입증 되었습니다 매우 효과적인 애완 동물 SPECT 여러 다른 항 체/항 원 시스템 이미징, 지속적으로 높은 콘트라스트 이미지를 생산 및 같은 수명이 짧은 방사성 핵의 사용을 활성화 18 F (t½ = 109 분)와 64Cu (t1/2 = 12.7 h)21,,2224. 더 최근에, 클릭에 기초를 둔 pretargeted radioimmunotherapy (PRIT)의 효능 췌 장 ductal 선 (PDAC) 암 및 대 장 암27,28murine 모델에서 증명 되었습니다. 이 위해 치료 방사성 핵 종 177루 (β최대 498 = 케빈, t1/2 = 6.7 일) 두 개의 서로 다른 항 체와 함께에서 고용 되었다: 5B1, 탄수화물 항 원 19.9 (CA19.9) 편 PDAC 표현 대상 huA33, A33, 대상 막 횡단 당단백질 표현 > 대 장 암의 95%. 두 경우 모두, 177Lu PRIT를이 이렇게 종양 조직에 높은 활동 농도 굴복, 복용량-의존 치료 효과 만들고 동시에 전통에 비해 건강 한 조직에 활동 농도 감소 직접 표시 된 radioimmunoconjugates입니다.
이 문서에서는, 우리는 177루 DOTA 라는 tetrazine radioligand를 사용 하 여 PRIT에 대 한 프로토콜을 설명 ([177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz)와 huA33 항 체 (huA33-TCO)의 TCO 수정 변종. 좀 더 구체적으로, 우리는 huA33-TCO (그림 2), 합성 및 [177루]의 radiolabeling 루-DOTA-말뚝7의 건축 설명-Tz (그림 3 및 그림 4), 그리고 에 비보 의 성능 biodistribution 고 대 장 암의 murine 모델에 경도 치료 연구. 또한, 대표적인 결과에 토론, 우리 샘플 데이터 집합,이 방법의 최적화에 대 한 주소 가능한 전략을 제시 하 고 vivo에서 pretargeting 및 PRIT의 넓은 맥락에서이 전략을 고려 하십시오. 마지막으로, 우리 huA33-TCO와 [177루]를 사용 하 여 pretargeting에 초점을 선택 하는 동안 루-DOTA-말뚝7이 프로토콜,이 전략에서에서-Tz 높은 모듈식 이며 다양 한 항 체에 맞게 적용할 수 있습니다 중요 하다 고 방사성 핵 종입니다.
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Protocol
모든 vivo에서 동물 실험이이 작업에 설명 된 승인 된 프로토콜에 따라 수행 되었고 기념 슬로 안 Kettering 암 센터, Weill 코넬 의료 센터, 그리고 사냥꾼 대학의 윤리 지침에 따라 실행 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC)
1. huA33-TCO의 준비
참고: huA33 TCO의 합성 이전에 보고 된29되었습니다. 그러나, 독자의 용이성, 그것은 복제 여기 최적의 조건에 대 한 조정.
- 1.7 mL microcentrifuge 튜브에서 준비 (E)-cyclooct-4의 125 μ 솔루션-enyl 2, 5-dioxo-1-pyrrolidinyl (0.15 M) 40 mg/mL의 농도에서 건조 디 메 틸 formamide (DMF)에서 (TCO-보 건국) 탄산염. 이 솔루션은 aliquoted 미래 실험에 사용 하기 위해-80 ° C에서 냉동 수 있습니다.
- 별도 1.7 mL microcentrifuge 튜브에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS, 2.7 m m 염화 칼륨, 염화 나트륨 137 m m, 및 11.9 mM 칼륨 인산 염, pH 7.4)의 1 mL에 huA33의 5 mg/mL 해결책을 준비 합니다.
- 작은 aliquots를 사용 하 여 (< 5 μ) 0.1 m M 나2CO3, 단계 1.2에서 8.8-9.0에 대 한 항 체 해결책의 pH를 조정. PH 모니터링 및 pH 9.0을 초과 하지 않도록 조심 하는 microelectrode와 pH 종이 또는 pH 미터를 사용 합니다.
- 1.3 단계에서에서 설명한 항 체 솔루션을 천천히 TCO-항 체의 양 기준으로 NHS의 40 어 금 니을 해당 볼륨을 추가 합니다. 예를 들어 huA33의 5 밀리 그램 (30 nmol) 솔루션에 경우에, TCO NHS의 40 mg/mL (0.15 M) 솔루션의 9.0 μ (1.20 μmol)을 추가 합니다.
참고: TCO NHS는 소수. 항 체 해결책에 그것을 추가할 때 천천히 그리고 강 수를 방지 하기 위해 동요와 함께 그것을 추가 합니다. 10%를 초과 하지 않도록 최종 반응 솔루션에서 볼륨으로 DMF. - 온화한 동요 (500 rpm)와 함께 1 시간에 대 한 thermomixer에 25 ° C에서 품 어에 반응을 수 있습니다.
- 1 시간 후 사전 포장된 일회용 크기 제외 염 열을 사용 하 여 huA33-TCO immunoconjugate 정화.
- 어떤 부식 방지 제는 열에 저장 하는 동안 제거 하는 공급자에 의해 설명 된 대로 크기 제외 열을 equilibrate. 전형적인 절차 5 열 세척 포함 열의 볼륨에 해당 하는 PBS의 볼륨 x: 5 x 2.5 mL PBS의.
- 지적 반응 혼합물의 볼륨 크기 제외 열에 반응 혼합물을 추가 합니다.
- 반응 혼합물이 열을 입력 한 후 추가 열에 추가 솔루션의 전체 볼륨을가지고 PBS의 적절 한 금액 최대 2.5 mL. 예를 들어 활용 반응 1.3 mL의 전체 볼륨에 있는 경우, 열에 추가 PBS의 1.2 mL를 추가 합니다.
- Eluent는 PBS의 2 개 mL를 사용 하 여 제품을 수집 합니다.
참고:이 단계는 최종 구성 huA33-2 ml PBS, pH 7.4의 TCO를 얻을 것입니다.
- 280 nm 파장 모니터링 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 huA33 TCO의 농도 측정 합니다. 대부분 IgGs (ε280)에 대 한 어 금 니 소멸 계수 210000 M-1c m-1이다.
- Immunoconjugate의 높은 농도 가진 해결책을 원하는 경우 집중 50000 분자량 컷오프와 원심 필터 단위를 사용 하 여 huA33-TCO 솔루션 제조업체 지침에 따라.
참고: 많은 항 체는 집계 하거나 집중 하는 동안 침전 알려져 있습니다. 새로운 항 체로이 절차 때, 연구원 문학 또는 그들의 자신의 경험에 항 체를 처리 지연 해야 합니다. - 즉시 필요한 경우에 어둠 속에서 4 ° C에서 완료 된 huA33-TCO immunoconjugate를 저장 합니다. 나중에 4 일 이상 사용할 경우, 어둠 속에서-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
참고:이 절차에서 허용 중지 지점입니다. 완성 된 huA33-TCO immunoconjugate 어둠 속에서-80 ° C에 적어도 6 개월 저장 안정 해야 합니다.
2. Tz 말뚝7-NHBoc의 합성
- 1.7 mL microcentrifuge 튜브, tetrazine Nhydroxysuccinimidyl-에스테 르 (Tz-보 건국, 12.6 μmol) 무수 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 0.15 ml의 5 mg을 디졸브.
- 별도 1.7 mL microcentrifuge 튜브에서 Boc 보호 아미노 못 폴리머, 무수 DMSO의 0.15 ml에서 O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene 글리콜 (NHBoc-PEG7-NH2; 17.1 μmol)의 8 mg을 디졸브.
- Tz-NHS의 솔루션 triethylamine (차)의 3 μ (21.3 μmol, 1.7 어 금 니 동등 물)를 추가 하 고 철저 하 게 혼합.
- 2.2 단계에서에서 핑크 tetrazine 솔루션 NHBoc 말뚝7-NH2 솔루션을 추가 하 고 온화한 동요와 함께 실 온 (RT)에서 30 분 동안 반응 혼합물을 품 어.
- 30 분 후 반응 H2O에서에서 1:1 희석 하 고 Tz 말뚝7에서 어떤 unreacted Tz-보 건국을 반대 상 C18 -고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용 하 여 반응 정화-NHBoc. 산 하지 않고 용 매를 사용 하 여 Boc 그룹 보호의 조기 제거를 방지 하기 위해. 모두 Tz 말뚝7모니터링-NHBoc 및 Tz-보 건국에 525의 파장 nm.
참고: 보존 회는 분명히 매우 (펌프, 열, 튜브 등),각 연구실의 HPLC 장비에 의존 하 고 적절 한 컨트롤 정화 하기 전에 실행 해야 합니다. 그러나, 만약과 MeCN/H2O의 그라데이션 예제를 제시 (두 없이 어떤 첨가물) 95:5 MeCN/H2O 30 분 이상, 1 mL/min의 유량과 분석 4.6 mm x 250 m m C18칼럼을 사용 Tz NHS와 Tz 못7의 정체 시간-NHBoc는 16 분 및 18 분, 각각. - 액체 질소를 사용 하 여 수집 된 HPLC eluent 동결 하 고 지금 냉동 컬렉션 튜브 알루미늄 호 일에 포장. 장소는 lyophilizer에 언된 컬렉션 튜브 HPLC 모바일 단계를 제거 하려면 하룻밤. 제품 특성 밝은 핑크 솔리드 될 것입니다.
참고: 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 드라이 아이스에서 수집 된 HPLC eluent 동결 또는-80 ° C 냉장고에 하룻밤.
3. Tz 말뚝7-NH2 의 합성
- Tz-말뚝7단계 2.6에서 제품-NHBoc, dichloromethane (DCM)의 1.5 mL를 추가 하 고 작은 둥근 바닥 플라스 크에이 솔루션을 전송.
- Trifluoroacetic 산 (TFA)의 0.25 mL dropwise 핑크 솔루션에서 추가할 단계 3.1.
- 온화한 동요와 RT에 30 분 동안 품 어에 반응을 수 있습니다.
- 30 분 후 용 매 를 통해 로타리 증발 증발. 물 목욕 온도 37 ° c를 초과 하지 않는
- 물 0.5 mL에 분홍색 점성 제품 reconstitute
- Boc 보호 전조에서 Tz 말뚝7-NH2 분리 반대 상 C18 HPLC를 사용 하 여 제품을 정화. 모두 Tz 말뚝7모니터링-NHBoc 및 Tz 말뚝7-NH2 525의 파장 nm.
참고: 보존 회는 분명히 매우 (펌프, 열, 튜브 등),각 연구실의 HPLC 장비에 의존 하 고 적절 한 컨트롤 정화 하기 전에 실행 해야 합니다. 그러나, 만약과 MeCN/H2O의 그라데이션 예제를 제시 (모두 0.1 %TFA) 95:5 MeCN/H2O 30 분 이상, 1 mL/min의 유량과 분석 4.6 mm x 250 m m C18칼럼을 사용 보존 시간 Tz 말뚝7-NHBoc 및 Tz 말뚝7-NH2 는 약 18 분 및 13 분, 각각. - 액체 질소를 사용 하 여 수집 된 HPLC eluent 동결 하 고 지금 냉동 컬렉션 튜브 알루미늄 호 일에 포장. 장소는 lyophilizer에 언된 컬렉션 튜브 HPLC 모바일 단계를 제거 하려면 하룻밤. 제품에는 밝은 핑크 솔리드 될 것입니다.
- Tz-말뚝7-NH2와 DMSO 및 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 150 μ 단계 3.7에서 제품 reconstitute
- Tz-말뚝7-NH2 525 nm 파장 모니터링 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정 합니다. Tz-말뚝7-NH2 (ε525)에 대 한 어 금 니 소멸 계수 535 M-1c m-1이다.
4. Tz 말뚝7-DOTA의 합성
- DMSO의 0.15 ml에서 Tz 말뚝7-NH2 (4.5 mg, 6.9 μmol) 해산 (또는 단순히 진행 단계 3.8에서 만든 솔루션).
- 차 (21 μ, 0.15 mmol)의 22 어 금 니 동등을 단계 4.1에서 tetrazine 포함 된 솔루션에 추가할.
- P-SCN-Bn-DOTA 고체와 소용돌이 약 2 분 또는 물자 완전히 해산 때까지 솔루션의 10 mg (14.2 μmol)를 추가 합니다.
- 온화한 동요와 RT에 30 분 동안 품 어에 반응을 수 있습니다.
- 30 분 후 반응 H2O에서에서 1:1 희석 하 고 반전 단계 C18 HPLC를 사용 하 여 unreacted p-SCN-Bn-DOTA를 제거 하는 제품을 정화. P-SCN-Bn-DOTA 254의 파장에서 모니터링할 수 있습니다 동안 Tz 말뚝7nm-DOTA는 525의 파장에서 가장 모니터링 nm.
참고: 보존 회는 분명히 매우 (펌프, 열, 튜브 등),각 연구실의 HPLC 장비에 의존 하 고 적절 한 컨트롤 정화 하기 전에 실행 해야 합니다. 그러나, 경우과 MeCN/H2O의 그라데이션 예제를 제시 (모두 0.1 %TFA)에 95:5 MeCN/H2O 30 분 이상 및 분석 4.6 x 250 m m C18칼럼, 이용 된다 Tz 말뚝7및 p-SCN-Bn-DOTA-DOTA의 정체 시간을가지고 약 15.6 분 및 16.1 분, 각각. - 액체 질소를 사용 하 여 수집 된 HPLC eluent 동결 하 고 지금 냉동 컬렉션 튜브 알루미늄 호 일에 포장. 장소는 lyophilizer에 언된 컬렉션 튜브 HPLC 모바일 단계를 제거 하려면 하룻밤. 제품 밝은 핑크 파우더를 될 것입니다.
- DMSO의 0.15 mL에 제품을 다시 구성 하 고 모니터링 525 nm 파장 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정 한다. 어 금 니 소멸 계수 Tz 말뚝7-DOTA (ε525) 535 M-1c m-1이다.
- 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 최종 화합물을 분석 하 고 고해상도 질량 분석 (HRMS) 그 합성을 확인 하는 성공적 이었다. 실험적 결정 화학 변화와이 작품에서 설명 하는 모든 화합물의 분자 무게에 대 한 표 1 을 참조 하십시오.
- -80 ° c.에 어둠 속에서 순화 Tz 말뚝7-DOTA 솔루션 저장
참고:이 절차에서 허용 중지 지점입니다. 완성 된 Tz 말뚝7-DOTA 전조가이 조건 하에서 1 년 이상에 대 한 안정적입니다.
5. 177루 Radiolabeling Tz 말뚝7-DOTA의
주의:이 단계는 프로토콜의 처리와 방사능의 조작 포함 됩니다. 이러한 단계를 수행 하기 전에-방사능으로 다른 작업을 수행 하는 또는-연구원은 그들의 가정 기관 방사선 안전 부서와 상의 해야 한다. 이온화 방사선에 노출을 최소화 하기 위해 모든 가능한 조치를 취해야.
참고: radiometals의 적은 양을 작업할 때는 모든 버퍼 조정 사이트 바인딩에 간섭을 방지 하기 위해 추적 금속에서 자유로울 것이 좋습니다.
- 1.7 mL 원심 분리기 튜브에서 200 μ 0.25 M 염화 아세테이트 버퍼의 pH 5.5에 1 M HCl의 aliquots 조정 추가.
참고: 경우에 라벨에 대 한 활동의 미만 370 MBq을 사용 하 여, 사용 하는 버퍼의 볼륨 100 µ L를 감소 한다. - 버퍼 솔루션에 [177루] LuCl3 의 원하는 금액을 추가. 추가 금액은 실험 및 관리 되 고 방사성 복용량의 수에 있을 것입니다. 정화 단계 동안 방사능의 잠재적인 손실을 보상 하기 위한 방사능의 가치 1-2 여분 복용량을 추가 하는 것이 좋습니다.
- Tz-말뚝7단계 5.2에서 방사성 혼합물에 DMSO에 DOTA-. Tz-말뚝7의 금액-DOTA 테스트 중인 과목의 수에 따라 달라 집니다. 6.2.2.2 단계에서이 주제에 더 많은 정보를 찾을 수 있습니다.
- 20 분 동안 37 ° C에서 품 어에 솔루션을 수 있습니다.
- 확인는 radiolabeling 50 mM EDTA, pH 5.5로 모바일 단계와 라디오 인스턴트 얇은 층 착 색 인쇄기 (라디오-iTLC)를 사용 하 여 완료 합니다. 레이블이 [177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz 기준선에 남습니다-Rf = 0-무료 [177루] 동안 루3 + EDTA에 의해 조정 될 것입니다 및 용 매 전면 Rf 여행 = 1.0 (그림 3B).
- 양적 라벨은 달성 되지 않은 경우 무료 radiometal 조정 추가 ligand를 추가 합니다. 또는, 정화는 레이블이 [177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz C18 카트리지를 사용 하 여. 사용에 대 한 제조 업체의 지침을 따릅니다. 샘플 프로시저는 아래 제공 됩니다.
- 큰 주사기 카트리지를 통해 에탄올 5 mL를 천천히 통과 하 여 카트리지를 프라임. 그럼, 이기의 5 mL 그리고 이온된 (DI) H2o.의 5 mL를 통과
- Radioligand 솔루션을 단계 5.3에서 작은 주사기에 그리고 C18 카트리지에 천천히 주입. 그런 다음 세척 디 H2O를 제거의 10ml와 카트리지 [177루] LuCl3언바운드.
- 에탄올의 500 µ L을 elute. 건조 질소 또는 아르곤 10-15 분의 낮은 유량과 그릇 전달 하 여 최종 제품에서 모든 에탄올을 제거 합니다. 그 후, 볼륨 단계 6.2.2.2에서에서 결정 염 분에는 radioligand resuspend.
6. vivo에서 연구
주의: 섹션 5에서이 단계는 프로토콜의 포함 한다 처리 및 방사능의 조작. 이러한 단계를 수행 하기 전에 연구자는 그들의 가정 기관 방사선 안전 부서와 상담 해야 한다. 이온화 방사선에 노출을 최소화 하기 위해 모든 가능한 조치를 취해야.
- 동물의 준비
- 여성 athymic 누드 마우스에 피하 임 플 란 트 5 x 106 SW1222 대 장 암 세포 세포 미디어와 매트릭스의 1:1 혼합물의 150 μ에서 일시 중단 (예., Matrigel)는 100-150 m m3 이 종이 식 (14-18 일에 성장 하는 것이 허용 하는 고 후 접종).
- Biodistribution 실험 동물의 분류
- 캘리퍼스 측정에 의해 결정으로 충분 한 크기의 종양은, 일단 각 코 호트가 대략 동일한 평균 종양 볼륨 동물을 정렬 합니다. 동물 꼬리 씻을 수 없는 잉크 (한 밴드, 두 밴드, 등)에 표시 하 여 각 장에 고유 수 있습니다.
- 경도 치료 연구를 위한 동물의 분류
- 일단 종양 캘리퍼스 측정에 의해 결정으로 충분 한 크기의, 각 실험을 통해 정확한 추적을 위해 동물의 귀 태그를 연결 합니다.
참고: 숫자 귀 태그 실험의 과정을 통해 빠지다 수 있습니다. 그 결과, 체계적인 방식으로 이러한 실제 태그 귀 노치와 동반 것이 좋습니다 (즉., 오른쪽, 왼쪽, 양자, x 2, 오른쪽 왼쪽 x 2). - 각 코 호트에서 평균 종양 볼륨은 대략 동일한 동물을 정렬 합니다. 동물 분류에 대 한 다음 메서드는 스프레드시트 프로그램을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
- 동물 식별 번호, 귀 노치 패턴, 및 3 개의 별도 열에 종양 볼륨을 나열 합니다.
- 작은에서 큰 종양 볼륨에 데이터를 정렬 합니다.
- 네 번째 열에서 케이지 번호와 사이클 snakelike 패턴에 연습장을 통해 각 동물을 할당 합니다. 예를 들어 5 연습장 인 경우이 열 것 "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." 모든 동물 감 금 소 할당 될 때까지 가득.
- 감 금 소에 할당 되 면 케이지 번호로 데이터 정렬. 귀 노치는 사용 되 고, 각 동물에 주어진 독특한 귀 노치 패턴을가지고 확인 합니다. 주어진에 중복 (두 개 이상의 동일한 패턴의) 경우, 모든 새 장까지 누락 된 패턴으로 다른 장에서 한 스왑 한 마우스 독특한 귀 노치 패턴과 동물 있다.
- 일단 종양 캘리퍼스 측정에 의해 결정으로 충분 한 크기의, 각 실험을 통해 정확한 추적을 위해 동물의 귀 태그를 연결 합니다.
- 공식 및 주사
참고: biodistribution와 치료 연구에 대 한 주입의 순서는 다음과 같이 진행: huA33 TCO [177루] 루-DOTA-말뚝7다음 먼저, 주입은 미리 결정 된 간격 후-Tz.- Immunoconjugate
- 0.9% 멸 균 식 염 수에 0.8 mg/mL의 농도에 단계 1.9에서 huA33-TCO 솔루션의 약 수를 희석.
- PBS에서 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 청소용된 주사기에 huA33-TCO 솔루션의 150 µ L (100 µ g)의 복용량 그리고 얼음이 주사기를 저장.
참고: BSA 치료 주사기의 벽에 항 체의 비 특정 바인딩을 줄일 수 있습니다. - 동물 꼬리 정 맥을 팽창에 3 분 동안 열 램프 아래 따뜻한.
- HuA33-TCO 솔루션이 종이 식 베어링 마우스의 꼬리 정 맥에 주사. 24 시간 (또는 다른 미리 정해진된 시간 간격) huA33-TCO는 마우스의 종양에 축적 수 있습니다.
-
Radioligand
- Tz-말뚝7radiolabel-DOTA 섹션 5에 설명 된 대로.
- Tz-말뚝7의 1.1 어 금 니 동등을 포함 된 염 분 DOTA-huA33-TCO의 금액을 기준으로 관리 살 균 0.9%의 150 μ에 복용량을 그립니다. 예를 들어, huA33-TCO의 100 μ g (0.67 nmol) 동물에 주입 했다 고 [177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz 반응 혼합물 12.4 GBq/μmol의 특정 활동으로 만들어진 다음 복용량 그려집니다 각 활동의 9.14 MBq 포함. 이 Tz (huA33-TCO를 1.1 어 금 니 식 상대)의 0.74 nmol에 해당합니다.
- 동물 꼬리 정 맥을 팽창에 3 분 동안 열 램프 아래 따뜻한.
- 이 종이 식 베어링 마우스의 꼬리 정 맥에 radioligand의 복용량을 주사. 주입을 활동의 금액은 연구원에 의해 결정 됩니다. 게시 된 데이터는 복용량-의존 치료 효과 7.4 55.5 MBq의 범위 내에서 종양 크기에 나타났습니다.
- Immunoconjugate
- Biodistribution
- radioligand의 후 원하는 시간 때에는 2% O2 를 사용 하 여 마우스의 각 코 호트를 안락사 / 6% CO2 가스 혼합물.
주: 보조 실제 안락사 (예: 자 궁 경부 전위)를 위한 방법에 관한 어떤 제도적 요구 사항을 따릅니다. - 각 동물에 대 한 관심의 모든 장기를 제거, 어떤 과잉 혈액을 제거 하는 물 목욕에서 그들을 씻어 및 제안 순서 대로 5 분 샘플 기관 목록에 대 한 오픈에 어에 종이 타월에 건조: 혈액, 종양, 심장, 폐, 간, 비장, 위, 작은 창 자 대 장, 신장, 근육, 뼈, 피부, 꼬리.
- 충분히 건조 되 면 미리 무게 일회용 문화 관에서 장기를 놓습니다. 각 기관 또는 직물의 질량을 다시 한 번 지금 채워진 튜브 무게.
- 감마 카운터를 사용 하 여 튜브의 각 활동을 측정 합니다. 보정 감마 카운터 그려진된 복용량을 측정 하는 데 사용 되는 검출기에서에서 측정 된 활동. 각 악기에 177루의 방사능 기준 세 고 활동 카운트 당 분 (cpm) 사이 interconversion에 대 한 보정 계수를 결정.
- 막대 그래프로 biodistribution 데이터 ( 그림 5참조)는 뜻으로 정규화는 바 표시 각 기관에 대 한 이해 한 표준 편차를 나타내는. 샘플 그룹 간의 이해에 통계적 차이 짝이 없는 t-검정, 의미를 달성 하 여 사정 될지도 모른다 때 p < 0.05.
- radioligand의 후 원하는 시간 때에는 2% O2 를 사용 하 여 마우스의 각 코 호트를 안락사 / 6% CO2 가스 혼합물.
- 치료 모니터링
- 캘리퍼스를 사용 하 여 수직 길이 폭 뿐만 아니라 직사각형 종양 (길이)의 가장 긴 측을 측정 합니다. 타원 면의 볼륨에 대 한 수식을 사용 하 여 볼륨 계산: (4/3) πL· W· H, ½L·에는 W2, 그 높이 약 너비 가정.
참고: 그것은 또한 휴대용 종양 경우 제공 ( 테이블의 자료참조) 측정 장치를 사용 하 여. - 시간이 지남에 따라 체중 증가 또는 체중 감소를 추적 하는 균형에 각 마우스 무게.
- 중요 한 것은, 각 동물의 외모 고민와 같은 다시 hunched 또는 파열된 피부 혈관 (haematotoxicity를 나타낼 수 있습니다)의 흔적에 대 한 모니터링 합니다.
참고: 종양 측정 경도 치료 연구 과정 1-2 일 마다 수집 한다. - 경도 치료에서 플롯 데이터 시간이 지남에으로 평균 종양 볼륨을 공부 하 고 원하는 경우 종양 볼륨 시작을 정상화. 샘플 그룹 사이 같은 날에 통풍 관에 통계적 차이 짝이 없는 t-검정, 의미를 달성 하 여 책정 때 P < 0.05. 더 광범위 한 통계 분석 및 수 있습니다 훈련 된 biostatistician에 의해 권장 하는 대로 실행 되어야 한다.
- 캘리퍼스를 사용 하 여 수직 길이 폭 뿐만 아니라 직사각형 종양 (길이)의 가장 긴 측을 측정 합니다. 타원 면의 볼륨에 대 한 수식을 사용 하 여 볼륨 계산: (4/3) πL· W· H, ½L·에는 W2, 그 높이 약 너비 가정.
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Representative Results
HuA33에 TCO의 활용 아민 반응 TCO NHS와는 면역 글로불린의 표면에 리 진 잔류물 간의 결합에 입각 한입니다. 이 메서드는 매우 강력 하 고 재현할 수 하 고 안정적으로도-의-라벨 2-4 TCO/mAb의 생성 합니다. 이 경우, MALDI ToF 질량 분석 약 4.0 TCO/mAb;의 라벨의 정도 확인 하 고용 했다 비슷한 가치 기자24fluorophore 수정 tetrazine를 사용 하 여 얻은 했다. Tetrazine ligand의 합성은 3 단계에서 수행 됩니다: (1) 결합 Tz NHS의 모노 Boc 보호 못 링커가 항복 Tz 말뚝7-NH2, 중간의 deprotection (2) 및 (3) 사이 thiourea 결합의 형성 p-SCN-Bn-DOTA과 Tz 말뚝7-NH2. 이 절차는 상대적으로 손쉬운 고 Tz 말뚝7월급-DOTA ~ 75%의 전반적인 수확량에서. 중간의 각 특징 되었습니다 HRMS, 1H NMR; 이 데이터는 표 1에 표시 됩니다.
이동는 radiolabeling, 177루3 + 는 일반적으로 얻어진 다 상업용 공급 업체에서는 염화 소금 0.5 M HCl에 [177루] LuCl3 으로. Tz-말뚝7radiolabeling- 177radioligand [177루] 루-DOTA-말뚝7를 루와 DOTA-Tz는 매우 간단 합니다: 그냥 20 분에 반응이 완료에 원하는 제품을 생산 > 99% 방사선 화학 라디오 iTLC 정한 순도입니다. 일반적으로, 아니 더 정화 배합 전에 필요 하다. Pretargeting Tz/TCO 기반에 문학의 조사 나왔다는 ~ 1 Tz:mAb 어 금 니 비율: 1 생산 최고의 vivo에서 데이터10. 그 결과, 가장 높은 가능한 어 금 니 활동에서 radioligand를 필수 아니다. 예를 들어 biodistribution 실험 논의 여기 고용 [177루] 루-DOTA-말뚝7~ 12 GBq/µ의 어 금 니 활동-Tz. 경도 치료 연구에 대 한 반면, [177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz 높은 어 금 니 활동은 주입 된 두더지의 수를 변경 하지 않고 방사능의 큰 복용량의 관리를 용이 하 게 사용 tetrazine입니다.
로 해결 될 것입니다 더 토론에 biodistribution 실험은 파라마운트 중요성의 이해 하 고 PRIT에 어떤 접근을 최적화. 이 경우에 immunoconjugate의 관리는 radioligand의 주입 사이의 최적의 간격 시간을 결정 하 biodistribution 실험 실시 했다. 이 위해, 우리는 그들의 오른쪽 어깨에 피하 A33 항 원 표현 SW1222 xenografts 베어링 athymic 누드 마우스 고용. 이 동물 받은 huA33-TCO 24, 48, 72, 또는 120 [177루] 루-DOTA-말뚝7의 주입 전에 h의 100 µ g (0.67 nmol)-Tz (9.14 MBq, 0.74 nmol). 그림 5 모든 주입 간격 생성 종양 조직에 높은 활동 농도 뿐만 아니라 건강 한 장기에 낮은 활동 농도 보여 줍니다. 24 시간 주입 간격 월급 120 h 후 주입에 가장 높은 종양 글귀: 21.2 ± 2.9%ID/g. 각 조건 집합 또한 인상적인 종양 기관 활동 농도 비율을 생성합니다. 20 ± 5, 종양 혈액, 종양 간, 그리고 종양 근육 비율을 생성 예를 들어 24 시간 간격으로 pretargeting 37 ± 7, 그리고 184 ± 30, 각각, 120 h는 radioligand의 관리 후. 이러한 결과에 따라, 24 h 간격 후속 경도 치료 연구 (아래 참조)에 대 한 선정 되었습니다.
Vivo에서 경도 치료 연구, 동료에 대 한 (n = 10) athymic 누드 마우스 피하 SW1222 베어링의 그들의 맞은 측면에 xenografts 했다 huA33-TCO 관리 (100 ug, 0.67 nmol) 24 시간 [177루]의 주사 전에 루-DOTA-못 7-Tz. 3 다른 실험 동료 고용, 18.7, 37, 또는 [177루] 루-DOTA-말뚝7의 55.5 MBq-Tz (24, 45, 및 70 GBq/µ의 어 금 니 활동에 해당). 또한, 두 명의 제어 동료 받은 PRIT 처방의 절반: 어느 huA33-TCO (100 ug, 0.67 nmol) [177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz 또는 [177루] 루-DOTA-말뚝7없이-Tz (55.5 MBq, 0.74 nmol) huA33-TCO 없이. 이 치료 응답 immunoconjugate 또는 radioligand 혼자 elicited 하지 있도록 필수 컨트롤입니다. 종양의 볼륨 연구 한 주 (70 일, 177루의 10 반감기) 실험의 결론까지 다음 번의 첫 3 주 동안 3 일 마다 측정 되었다. 그림 6에서 보듯이 컨트롤 그룹에 비해 실험 동료의 응답에 뚜렷한 차이가 있다. PRIT 전략의 한 구성 요소를 수신 하는 쥐에 있는 종양 억제 되지 않은 성장을 계속, 하는 동안 전체 PRIT 처방 받은 쥐의 종양 성장을 중지 하 고 궁극적으로 그 연구의 시작 부분에서 측정 아래 볼륨 축소. 중요 한 것은, 독성 부작용 관찰 했다, 그리고 그들의 초기 질량 (그림 7A)의 20% 내에서 체중을 유지 하는 모든 동물. 연구의 훨씬 더 눈에 띄는 시각화를 제공 하는 데이터의 카 플 란-마이어 줄거리: 실험 동료 쥐 조사 (의 끝에 생존의 완벽 한 기록 했다 모든 마우스 제어 동료에서 몇 주 안에 안락사를 했다, 그림 7B)입니다.
그림 1: 역 전자 수요 Diels 오리 나무 반응을 기반으로 하는 pretargeted radioimmunotherapy의 만화 회로도. 이 그림은 참조 # 28에서에서 수정 되었습니다. (적응) Membreno, R., 쿡, B. E., 봉에서 허가로 증 쇄 K., 루이스, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy의 대 장 암. 분자 조제 학. 15 (4), 1729-1734 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: huA33 TCO의 건설의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Tz 말뚝7의 합성의 도식-DOTA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: radiolabeling [ 177루] 루-DOTA-말뚝7의 (A) 회로도-Tz; (B) 대표 라디오 iTLC 크로마 시연은 > 98% [177루] 루-DOTA-말뚝7의 방사선 화학 순수성-Tz. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: Biodistribution에서 vivo에서 [177루] huA33-TCO와 pretargeting의-DOTA-말뚝7-Tz athymic 누드 마우스 24 (보라색), 48 (녹색)의 pretargeting 간격을 사용 하 여 피하 SW1222 인간 대 장 암 종양을 베어링에 72 (오렌지) 또는 120 (파란색) 시간. N의 동료에서 표준 오류와 데이터 = 4; 통계 분석은 짝이 없는 학생의 t-검정에 의해 수행 되었다 * *p < 0.01. 이 그림은 참조 # 28에서에서 수정 되었습니다. (적응) Membreno, R., 쿡, B. E., 봉에서 허가로 증 쇄 K., 루이스, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy의 대 장 암. 분자 조제 학. 15 (4), 1729-1734 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 마우스의 5 개 그룹의 경도 치료 연구 (n = 10 각)의 시간 (A); 기능으로 평균 종양 볼륨에 묘사 된 베어링 피하 SW1222 종양과 종양 볼륨의 기능으로 초기 볼륨 정규화 된 시간 (B). 제어 그룹 (블루) radioligand 없이 immunoconjugate 또는 immunoconjugate (적색) 없이 radioligand를 받았다. 3 치료 받은 그룹 huA33-TCO (100 µ g, 0.6 nmol) 다음 24 h 나중 18.5 (녹색), 37.0 (보라색), 또는 [177루]의 55.5 (오렌지) MBq (각 경우에 ~0.8 nmol)-DOTA-말뚝7-Tz. 테스트 로그-순위 (벽난로-콕스), 생존은 상당한 (p < 0.0001) 모든 치료 그룹에 대 한. 이 그림은 참조 # 28에서에서 수정 되었습니다. (적응) Membreno, R., 쿡, B. E., 봉에서 허가로 증 쇄 K., 루이스, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy의 대 장 암. 분자 조제 학입니다. 15 (4), 1729-1734 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 마우스의 5 개 그룹의 경도 치료 연구 기간 동안 동물에 대 한 곡선을 무게 (n = 10 각) 베어링 피하 SW1222 종양 (A); 해당 카 플 란-마이어 생존 곡선 (B). 제어 그룹 (블루) radioligand 없이 immunoconjugate 또는 immunoconjugate (적색) 없이 radioligand를 받았다. 3 치료 받은 그룹 huA33-TCO (100 µ g, 0.6 nmol) 다음 24 h 나중 18.5 (녹색), 37.0 (보라색), 또는 [177루]의 55.5 (오렌지) MBq (각 경우에 ~0.8 nmol)-DOTA-말뚝7-Tz. 이 그림은 참조 # 28에서에서 수정 되었습니다. (적응) Membreno, R., 쿡, B. E., 봉에서 허가로 증 쇄 K., 루이스, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy의 대 장 암. 분자 조제 학. 15 (4), 1729-1734 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 화합물 | 1 H NMR 교대 | HRMS (ESI) |
| 500 MHz, DMSO | ||
| Tz-말뚝7-NHBoc | 10.52 (s, 1 시간), 8.50 (m, 3 H) 7.82 (t, 1 시간), 7.46 (d, 2 H), 6.69 (t, 1 시간), 4.33 (d, 2 H), 3.42 (남, 22 H), 3.33 (t, 2 H), 3.31 (t, 2 H), 3.12 (q, 2 H), 2.99 (q, 2 H), 2.12 (t, 2 H), 2.03 (t, 2 H), 2.12 (t, 2 H), 1.70 (q, 2 H), 1.29 (s 9 H) | m/z calcd입니다. C35H57N7O11나에 대 한: 774.4005; 발견: 774.4014. |
| Tz-말뚝7-NH2 | 10.58 (s, 1 시간), 8.46 (m, 2 시간), 7.87 (t, 1 시간), 7.75 (d, 2 H), 7.52 (d, 1 시간), 4.40 (d, 2 시간), (남, 26 H) 3.60-3.50, 3.40 (t, 2 H), 3.32 (학사, 2 H), 3.20 (q, 2 H), 2.99 (학사, 2 H), 2.19 (t, 2 H), 2.12 (t, 2 H), 1.79 (q, 2 H). | m/z calcd입니다. C30H50N7O9: 652.3670; 발견: 652.3676. |
| Tz-말뚝7-DOTA | 10.57 (s, 1 시간), 9.63 (학사, 1 시간), 8.45 (m, 3 H), 7.86 (m, 1 시간), 7.73 (학사, 1 시간), 7.54 (d, 2 H), 7.41 (m, 2 시간), 7.19 (m, 2 시간), 6.54 (학사, 1 시간), 4.40 (d, 2 H), 4.00-3.20 (m, 55 H) 3.20 (q, 4 H), 2.54 (s, 1 시간), 2.18 (t, 3 H), (t, 3 H) 2.10, 1.76 (q 2 H). | m/z calcd입니다. C50H76N11O15s 1202.56;: 발견: 1203.5741. |
표 1. 이 프로토콜에서 설명 하는 유기 화합물에 대 한 특성 데이터입니다.
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Discussion
Vivo에서 pretargeting에이 방법의 장점 중 하나-bispecific 항 체에 입각 한 전략에 관하여 특히 고 haptens 방사선-그것의 모듈화는: 트랜스-cyclooctene moieties 어떤 항 체에 추가 될 수 있습니다 그리고 tetrazine radioligands 자신의 클릭 파트너와 함께 반응 하는 능력을 방해 하지 않고 방사성의 특별 한 다양 한 방사선 될 수 있습니다. 아직 다른 항 체/항 원 시스템에이 방법의 적응 하기만 하면 여기에 설명 된 프로토콜을 복제 되지 않습니다. 물론, 새로운 mAb TCO immunoconjugate 또는 소설 tetrazine 베어링 radioligand을 만드는 어떤 시도 든 지 안정성과 반응성에 대 한 테스트를 포함 하 여 적절 한 화학 및 생물 학적 특성 분석 실험에 의해 동반 해야 합니다. 그러나,이 외에 두 개의 변수를 특히 탐구 하 고 최적화 하는 것이 중요 있다: (1) 관리 하는 mAb TCO immunoconjugate의 질량 그리고 mAb TCO의 주사와는 radioligand의 관리 사이 간격 시간 (2). 두 요인 극적으로 pretargeting 시스템의 비보에 행동을 좌우할 수 있다. 예를 들어 immunoconjugate 또는 간격 기간 너무 짧은의 지나치게 높은 복용량의 사용 undesirably 높은 활동 농도 radioligand immunoconjugate 순환에서 남아 있는 사이 클릭 반응으로 인해 혈액에 발생할 수 있습니다. 반대로 너무 낮은 immunoconjugate 또는 지나치게 긴 간격 기간 중 고용 불필요 하 게 줄일 수 종양 항 원 또는 (비록 천천히) 냉 혹한 isomerization 트랜스의 포화를 못했기 때문에 활동 농도 -비활성 ciscyclooctene에 cyclooctene. 이 라인을 따라 biodistribution 실험의 immunoconjugate 및 pretargeting 간격의 범위를 사용 하 여 수행 매우 도움이 될 수 있습니다. 물론, 그것은 또한 어떤 vivo에서 실험에 적절 한 컨트롤 실행 될 권장. 이러한 포함-에 국한 되지 않습니다-항 원 네거티브 셀 라인을 갖춘, 결합형된 항 체, 혼자 radioligand의 관리, TCO 다음 radioligand의 주입의 광대 한 초과 수신 하는 동료를 차단 하는 실험 부족 한 immunoconjugate, vivo에서 일반적인, isotype 제어 TCO 베어링 immunoconjugate를 사용 하 여 pretargeting 및.
또는, 이미징 실험 치료 방사성 핵 종 양전자 방출 또는 '인쇄' 광자 또는 경우 치료 방사성 핵 종에의 한 '인쇄' isotopologue 사용할 수 있는 최적화를 위해 사용할 수 있습니다. 궁극적으로, 높은 종양 활동 농도 및 높은 종양 대 배경 활동 농도 비율의 최적 균형을 제공 하는 변수의 집합 후속 경도 치료 연구를 위해 선택 되어야 합니다. 여기에 제시 된 경우, huA33-TCO의 100 µ g 24 h. 원 계산의 간격으로 주사-종양 복용 및 치료 비율의 계산을 허용 하는 특히 그들-또한 최적화 과정에서 도움이 될 수 있습니다.
심지어는 유망 [177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz/huA33-TCO 시스템 개발 된 추가 최적화 도움이 될 것 중요 하다. PRIT에이 접근에서 원 데이터와 177루 라는 변종 huA33의 전통적인 미 모 비교 보여 종양 복용량 PRIT의 전통적인 RIT.의 아래 거짓말 또한, PRIT 시스템 (0.054 mSv/MBq)의 효과적인 복용량은 전통 미 모 보다 약간 낮은 (0.068 mSv/MBq).
이러한 문제에 두 구제 현재 탐구 되 고 된다. 첫째, 수지상 비 계 각 항 체30에 추가 하는 TCOs의 수를 증가 능력 개발 했습니다. Pretargeted 애완 동물 화상 진 찰의 맥락에서이 이렇게 극적으로 종양 활동 농도 향상 그리고 유사한 실험 [177루] 루-DOTA-말뚝7-Tz 진행. 둘째, tetrazine 베어링 청소 요원의 사용 PRIT의 문맥에 유용할 수 있습니다. 관리 에이전트는 radioligand의 주입 전에 비운의 혈액에서 잔여 immunoconjugate의 농도 감소 하 고 따라서 활동 농도 줄일 수 있는 방법으로 방법론을 pretargeting의 다양 한에서 이용 되 건강 한 장기23,31 청소 요원의 사용은 그것의 단점 없이 하지만; 가장 유명한은 이미 명백 하 게 복잡 한 치료 양식 적임의 복잡성을 증가 하 고 있다. 그럼에도 불구 하 고, 기념 슬로 안 Kettering 암 센터에 연구원은 최근 보고서를 발표 강력한 창조에 Tz 라는 dextran pretargeted 이미징, 애완 동물 및 데이터 [177루]와 함께에서이 구문 사용에 대 한 에이전트를 삭제 루-DOTA-말뚝7-Tz 및 huA33-TCO는 차기32. 또 다른 방법은 PRIT의 dosimetric 혜택을 극대화 하는 짧은 물리적 반감기를 가진 방사성 핵의 사용 이다. 이 영상; 대 한 매우 효과적인 입증 그러나, 짧은 물리적 반감기와 치료 방사성 멀리 사이 몇 가지 있습니다.
우리가 제대로 역 전자 수요 Diels 오리 나무 반응에 따라 pretargeting의 본질적인 제한 중 일부를 해결 하는 데 실패 하는 경우 마지막으로, 우리는 놓칠 것입니다. 이러한 문제 중 첫 번째는 vivo에서 pretargeting에 모든 접근에 내재: 고용 항 체 바인딩 대상 조직에 따라 내 면 될 수 없습니다. 이것, 물론, 필수적 이다로 항 체는 세포내 구획에 압수 보다는 radioligand에 액세스할 수 있어야 합니다. 이 제한을 우회, 비록 보였다 최근 수 internalizing의 느린 보통 속도와 그 항 체 사용 될 vivo에서 33,34pretargeting 보면 어렵다. 둘째, 비활성 cis-cyclooctene 반응 트랜스-cyclooctene의 느린 vivo에서 isomerization는 TCO 베어링 immunoconjugate의 관리 사이 간격의 길이 제한 하 고 radioligand 주입 비판적으로, 최대 120 h의 간격으로 여전히 제공 두 pretargeted 애완 동물의 맥락에서 우수한 결과 이미징 및 PRIT. 그러나,이 더 긴 간격의 사용은 거의 항상 동반 종양 활동 농도,이 isomerization에서 줄기 수 있습니다 결과에 약간의 감소. 이 문제를 해결 하려면 여러 실험실 다른 완전히 새로운 dienophiles tetrazine35와 반응의 능력을 개발 하려고 하는 동안 반응성, 타협 하지 않고 더 안정적인 트랜스-cyclooctenes를 만들려고 시도 했습니다. . 향후 몇 년 동안, 그것은 우리의 희망이 화학 개발 PRIT에 대 한 활용 될 것입니다.
결국, 역 전자 수요 Diels 오리 나무 결 찰에 따라 PRIT는 명백 하 게 긴급 하 고 다소 미 숙 기술. 그러나, 우리는 그럼에도 불구 하 고 우리가 획득 하 고 흥분이 전략의 임상 약속에 대 한 전 임상 결과 의해 격려 된다. 우리는 진심으이 프로토콜 탐험이 접근을 최적화 하 고 따라서 연료 병원 실험실에서 그것의 여행에 다른 사람을 격려 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 박사 야 곱 Houghton 도움이 대화 감사. 저자는 또한 그들의 관대 한 자금 (R00CA178205 및 U01CA221046)에 대 한 NIH를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | Store at -80 °C |
| 2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Store at -80 °C |
| Acetonitrile (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Ammonium Acetate (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
| Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Store at -20 °C |
| Dichloromethane (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Fisher Scientific | D12345 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC205024 | |
| GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous | Fisher Scientific | AC610941000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x Concentrated |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -20 °C |
| Triethylamine (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
| Tumor measuring device | Peira TM900 | Peira TM900 |
References
- Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
- Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
- Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
- Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
- Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin's Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
- Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
- Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
- Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
- Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
- van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
- Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
- Goldenberg, D. M., Chatal, J. -F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
- Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
- Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
- Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Cancer Research. 76 (22), 6669 (2016).
- Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
- Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
- Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
- Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
- Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
- Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
- Meyer, J. -P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
- Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
- Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
- Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
- Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
- Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
- Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
- Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
- Meyer, J. -P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
- Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
- Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
- Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).
