Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Pretargeted radioimmunoterapi baserat på den inversa Electron efterfråge Diels-Alder reaktionen

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

Det här protokollet beskriver syntes och karakterisering av en trans- cyclooctene (TCO)-den antikropp och en 177Lu-märkt tetrazine (Tz) radioligand för pretargeted radioimmunoterapi (PRIT). Dessutom specificerar det användning av dessa två konstruktioner för i vivo biodistribution och longitudinella studier i en murin modell av kolorektal cancer.

Abstract

Radioimmunoterapi (RIT) är en lovande strategi för behandling av cancer, kan den långa farmakokinetiska halveringstiden av radiomärkt antikroppar resultera i höga stråldoser till friska vävnader. Kanske inte helt överraskande, har flera olika strategier utvecklats för att kringgå denna oroande begränsning. En av de mest lovande av dessa metoder är pretargeted radioimmunoterapi (PRIT). PRIT bygger på frikoppling radionukliden från immunglobulin, injicera dem separat och sedan låter dem att kombinera i vivo på målvävnaden. Denna strategi utnyttjar de exceptionella tumör-inriktning egenskaperna av antikroppar medan lister deras farmakokinetiska nackdelar, därmed sänka stråldoser till målarter vävnader och underlätta användningen av radionuklider med halveringstider som är anses vara för kort för användning i traditionella radioimmunoconjugates. De senaste fem åren har har vårt laboratorium och andra utvecklat en strategi att i vivo pretargeting baserat på omvänd elektron-efterfrågan Diels-Alder (IEDDA) reaktionen mellan trans- cyclooctene (TCO) och tetrazine (Tz). Denna strategi har tillämpats framgångsrikt på pretargeted positron emissions tomografi (PET) och single-photon utsläpp datortomografi (SPECT) imaging med en mängd antikropp-antigen system. I ett par av de senaste publikationerna, har vi visat effekten av IEDDA-baserade PRIT i murina modeller av pankreas duktal adenokarcinom och kolorektal carcinom. I detta protokoll, beskriver vi protokoll för PRIT använder en 177Lu-DOTA-märkt tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) och en TCO-modifierad variant av kolorektal cancer inriktning huA33 antikropp (huA33-TCO). Mer specifikt kommer vi att beskriva byggandet av huA33-TCO, syntes och radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz, och prestanda i vivo biodistribution och longitudinella studier i murina modeller av kolorektal cancer.

Introduction

Radioimmunoterapi (RIT) — användning av antikroppar för leverans av terapeutiska radionuklider till tumörer — har länge varit en lockande strategi för behandling av cancer1,2. Faktiskt, detta löfte har varit ministerkvartetten United States Food and Drug Administration godkännande av två radioimmunoconjugates för behandling av Non-Hodgkins lymfom: 90Y-ibritumomab tiuxetan och 131-tositumomab3 , 4. men även från dess tidigaste dagar, kliniska utsikterna för RIT har hämmats av en kritisk komplikation: hög strålning dosrater till friska vävnader5,6. Generellt sett radioimmunoconjugates för RIT är märkta med långlivade radionuklider (t.ex. 131jag [t½ = 8,0 dagar] och 90Y [t½ = 2,7 dagar]) med fysiska halveringstider som sammanfaller väl med den långa farmakokinetiska halveringstider av immunglobuliner. Detta är viktigt, eftersom det säkerställer att tillräcklig radioaktivitet förblir när antikroppen har nått sin optimala biodistribution efter flera dagar av cirkulation. Dock resulterar denna kombination av lång residence gånger i blod och länge fysikaliska halveringstider oundvikligen i bestrålning av friska vävnader, därmed minska terapeutiska nyckeltal och begränsar effekten av terapi7. Flera strategier har utforskats för att kringgå detta problem, inklusive användning av trunkerade antikroppsfragment som Fab, Fab', F(ab')2, minibodies och nanobodies8,9,10. Det är en av de mest lovande och fascinerande ändå onekligen komplexa, alternativa metoder i vivo pretargeting11.

In vivo pretargeting är ett förhållningssätt till Kärn avbildning och terapi som syftar till att utnyttja den utsökta affinitet och selektivitet av antikroppar medan lister deras farmakokinetiska nackdelar11,12,13. Därför är det radioaktivt märkt antikropp som används i traditionella radioimmunoterapi dekonstrueras i två komponenter: en liten molekyl radioligand och en immunoconjugate som kan binda både en tumör antigen och den ovannämnda radioligand. Immunoconjugate är injiceras först och gett en 'head start', ofta flera dagar, under vilken det ackumuleras i målvävnaden och rensar från blodet. Därefter, den liten molekyl radioligand administreras och kombinerar med immunoconjugate på tumören eller snabbt försvinner från kroppen. I huvudsak åberopat i vivo pretargeting utför radiokemi inom kroppen själv. Genom att minska cirkulationen av radioaktiviteten, detta tillvägagångssätt samtidigt minskar stråldoser till friska vävnader och underlättar användningen av radionuklider (t.ex. 68Ga, t½ = 68 min211; Som, t½ = 7,2 h) med halveringstider som vanligtvis anses oförenligt med antikroppsbaserade vektorer.

Start i slutet av 1980, en handfull olika förhållningssätt till i vivo pretargeting har utarbetats, inklusive strategier baserade på bispecific antikroppar, samspelet mellan streptividin och biotin, och hybridisering av kompletterande oligonukleotider14,15,16,17,18. Ännu har var hållits tillbaka till varierande grad av komplikationer, mest bekant potent immunogeniciteten hos streptividin-modifierade antikroppar19,20. De senaste fem åren, har vår grupp och andra utvecklat en strategi att i vivo pretargeting baserat på den snabba och bioorthogonal omvänd elektron efterfrågan Diels-Alder ligering mellan trans- cyclooctene (TCO) och tetrazine (Tz) 21,22,23,24. Den mest framgångsrika av dessa strategier har anställt en TCO-modifierade antikropp och en Tz-bärande radioligand, som TCO är vanligtvis stabilare i vivo än dess Tz partner (figur 1)25,26. Liksom andra pretargeting metoder, är den mAb-TCO immunoconjugate administreras först och ges tid att rensa från cirkulationen och ackumuleras i tumörvävnad. Därefter sprutas den liten molekyl Tz radioligand, varefter den klick med immunoconjugate inom målvävnaden eller rensar snabbt från kroppen. Här i vivo pretargeting strategi har visat sig mycket effektiv för PET och SPECT imaging med flera olika antikropp/antigen system, konsekvent producera bilder med hög kontrast och möjliggör användning av kortlivade radionuklider såsom 18 F (t½ = 109 min) och 64Cu (t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Effekten av Klicka-baserade pretargeted radioimmunoterapi (PRIT) har nyligen visats i murina modeller av pankreas duktal adenokarcinom (PDAC) och kolorektal carcinom27,28. För detta ändamål, den terapeutiska radionuklid 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 dagar) var anställd i samband med två olika antikroppar: 5B1, som riktar sig till kolhydrater antigen 19,9 (CA19.9) ubiquitously uttryckt i PDAC , och huA33, som riktar A33, en transmembrana glykoprotein uttryckt i > 95% av kolorektal cancer. I båda fallen detta tillvägagångssätt till 177Lu-PRIT gav hög aktivitetskoncentrationer i tumörvävnad, skapat en dosberoende terapeutiska effekt och samtidigt minskat aktivitetskoncentrationer i friska vävnader jämfört med traditionella direkt-märkt radioimmunoconjugates.

I den här artikeln beskriver vi protokoll för PRIT använder en 177Lu-DOTA-märkt tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) och en TCO-modifierad variant av huA33 antikropp (huA33-TCO). Mer specifikt beskriver vi byggandet av huA33-TCO (figur 2), syntes och radiolabeling [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (figur 3 och figur 4) och prestanda i vivo biodistribution och longitudinella studier i murina modeller av kolorektal cancer. Dessutom i den representativa resultat och diskussion, vi presenterar ett prov data set, adress möjliga strategier för optimering av denna strategi, och överväga denna strategi i ett större sammanhang i vivo pretargeting och PRIT. Slutligen är det viktigt att notera att medan vi har valt att fokusera på pretargeting med huA33-TCO och [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz i detta protokoll, denna strategi är mycket modulärt och kan anpassas för att passa ett brett spektrum av antikroppar och radionuklider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla i vivo djurförsök beskrivs i detta arbete var utfört enligt godkända protokoll och avrättades under de etiska riktlinjerna av Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center och Hunter College Institutionella djurens vård och användning kommittéer (IACUC).

1. förberedelse av huA33-TCO

Obs: Syntes av huA33-TCO har funnits tidigare rapporterade29. Men för att underlätta för läsaren replikeras den här med justeringar för optimala förhållanden.

  1. I ett 1,7 mL mikrocentrifug rör, Bered en 125 μL av (E) - cyclooct - 4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl karbonat (TCO-NHS) i torr dimetylformamid (DMF) vid en koncentration på 40 mg/mL (0,15 M). Denna lösning kan vara aliquoted och fryst vid-80 ° C för användning i framtida experiment.
  2. I en separat 1,7 mL mikrocentrifug rör, förbereda en 5 mg/mL lösning av huA33 i 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 2,7 mM kaliumklorid, natriumklorid 137 mM och 11,9 mM kalium fosfatbuffert, pH 7,4).
  3. Med hjälp av små delprover (< 5 μL) av 0,1 M Na2CO3, justera pH av antikropp lösningen från steg 1,2 8,8-9,0. Använd antingen pH-papper eller en pH-mätare med en mikroelektrod att övervaka pH och försiktig att pH inte överstiger 9.0.
  4. Den antikropp-lösningen som beskrivs i steg 1.3, långsamt lägga till en volym som motsvarar 40 molar motsvarigheter till TCO-NHS i förhållande till mängden antikroppar. Exempelvis om 5 mg (30 nmol) huA33 i lösningen, lägga till 9,0 μL (1.20 μmol) 40 mg/mL (0,15 M) lösningen av TCO-NHS.
    Obs: TCO-NHS är hydrofoba. När du lägger det till lösningen av antikropp, lägga till den långsamt och med agitation att förhindra nederbörd. Överskrid inte 10% DMF volym i den slutliga reaktion-lösningen.
  5. Låt reaktionen på Inkubera vid 25 ° C på en thermomixer för 1 h med mild agitation (500 rpm).
  6. Efter 1 h, rena den huA33-TCO immunoconjugate använder en färdigförpackade disponibla utslagning avsaltning i kolumnen storlek.
    1. Temperera kolumnen storlek utslagning som beskrivs av leverantören att ta bort några konserveringsmedel som finns i kolumnen under lagring. En typisk förfarande innebär tvättning kolumnen 5 x med en volym av PBS som motsvarar volymen av kolumnen: 5 x 2,5 mL PBS.
    2. Lägga till reaktionsblandningen i kolumnen storlek uteslutning att notera volymen av reaktionsblandningen.
    3. När reaktionsblandningen har angett kolumnen, tillsätt en lämplig mängd PBS att föra den totala volymen av lösningen tillsätts kolumnen upp till 2,5 mL. Till exempel om konjugation reaktionen resulterade i en total volym på 1,3 mL, lägga till 1,2 mL av ytterligare PBS till kolumnen.
    4. Samla in produkten med 2 mL PBS som eluenten.
      Obs: Detta steg kommer att ge de slutliga konstruktion huA33-TCO i 2 mL PBS, pH 7,4.
  7. Mätning av koncentrationen av huA33-TCO med en UV-Vis spektrofotometer övervakning 280 nm våglängd. Den molära extinktionskoefficient för de flesta IgG (ε280) är 210 000 M-1cm-1.
  8. Om en lösning med en högre koncentration av immunoconjugate önskas, koncentrera sig om huA33-TCO lösningen med en centrifugal filterenhet med en 50.000 molekylvikt cut-off efter tillverkarens anvisningar.
    Obs: Många antikroppar har varit kända för att aggregera eller fällning under koncentration. När du försöker detta förfarande med en ny antikropp, forskare bör skjuta upp till litteraturen eller egen erfarenhet av att hantera antikroppen i fråga.
  9. Lagra den ifyllda huA33-TCO immunoconjugate vid 4 ° C i mörker om det behövs omedelbart. Om det skall användas mer än 4 dagar i framtiden, förvara den vid-80 ° C i mörker.
    Obs: Detta är en godtagbar stoppställe i förfarandet. Den ifyllda huA33-TCO immunoconjugate bör vara stabil för minst 6 månader lagring vid-80 ° C i mörker.

2. syntesen av Tz-PEG7- NHBoc

  1. I ett 1,7 mL mikrocentrifug rör, lös 5 mg av tetrazine N- hydroxysuccinimidyl ester (Tz-NHS; 12,6 μmol) i 0,15 mL vattenfri dimetyl sulfoxid (DMSO).
  2. I ett separat 1,7 mL mikrocentrifug rör, lös 8 mg Boc-skyddade aminosyror PEG polymeren, O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glykol (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) i 0,15 mL vattenfri DMSO.
  3. Till lösningen av Tz-NHS, tillsätt 3 μL (21,3 μmol, 1.7 molar medel) av trietylamin (TEA) och blanda väl.
  4. Lägger till den rosa tetrazine lösningen i NHBoc-PEG7-NH2 lösningen från steg 2.2 och inkubera reaktionsblandningen i 30 min i rumstemperatur (RT) med mild omskakning.
  5. Efter 30 minuter, späd reaktionen 1:1 i H2O och rena reaktionen för att skilja någon oreagerad Tz-NHS från Tz-PEG7med omvänd fas C18 högpresterande vätskekromatografi (HPLC) - NHBoc. Använd lösningsmedel utan syra för att förhindra för tidig borttagning av de Boc skydda gruppen. Övervaka både Tz-PEG-7- NHBoc och Tz-NHS vid en våglängd på 525 nm.
    Obs: Retentionstiderna är naturligtvis starkt beroende av HPLC-utrustningen av varje laboratorium (pumpar, kolumner, slangar, osv.), och lämpliga kontroller bör köras före rening. Dock att presentera ett exempel, om en gradient av 5:95 MeCN/H2O (båda utan någon tillsats) till 95:5 MeCN/H2O över 30 min, ett flöde av 1 mL/min och en analytisk 4,6 x 250 mm C18kolumn används , retentionstiderna för Tz-NHS och Tz-PEG7- NHBoc är runt 16 min och 18 min, respektive.
  6. Frysa insamlade HPLC eluenten med hjälp av flytande kväve och Linda nu-fryst samling röret i aluminiumfolie. Plats frysta samling röret på en lyophilizer över natten att ta bort den Rörlig fas för HPLC. Produkten är en karakteristisk ljusa rosa solid.
    Obs: Om flytande kväve inte är tillgänglig, frysa insamlade HPLC eluenten i torris eller över natten i-80 ° C frys.

3. syntesen av Tz-PEG7-NH2

  1. Produkt från steg 2,6, Tz-PEG7- NHBoc, tillsätt 1,5 mL diklormetan (DCM) och överför lösningen till en liten runda-botten-kolv.
  2. Lägger till 0,25 mL trifluorättiksyra (TFA) droppvis i rosa lösningen från steg 3.1.
  3. Låt reaktionen på Inkubera i 30 min på RT med mild agitation.
  4. Efter 30 min, avdunsta lösningsmedel via roterande avdunstningen. Överskrid inte en vatten bad temperatur av 37 ° C.
  5. Beredes rosa trögflytande produkten i 0,5 mL vatten.
  6. Rena produkten med omvänd fas C18 HPLC för att separera Tz-PEG7-NH2 från Boc-skyddade föregångaren. Övervaka både Tz-PEG-7- NHBoc och Tz-PEG7-NH2 vid en våglängd på 525 nm.
    Obs: Retentionstiderna är naturligtvis starkt beroende av HPLC-utrustningen av varje laboratorium (pumpar, kolumner, slangar, osv.), och lämpliga kontroller bör köras före rening. Dock att presentera ett exempel, om en gradient av 5:95 MeCN/H2O (båda med 0,1% TFA) till 95:5 MeCN/H2O över 30 min, ett flöde av 1 mL/min och en analytisk 4,6 x 250 mm C18kolumn används , retentionstiderna Tz-PEG7- NHBoc och Tz-PEG7-NH2 är ca 18 min 13 min, respektive.
  7. Frysa insamlade HPLC eluenten med hjälp av flytande kväve och Linda nu-fryst samling röret i aluminiumfolie. Plats frysta samling röret på en lyophilizer över natten att ta bort den Rörlig fas för HPLC. Produkten är en ljust rosa solid.
  8. Beredes produkten från steg 3,7, Tz-PEG7-NH2med 150 μl av DMSO och överföring till ett 1,7 mL mikrocentrifug rör.
  9. Mätning av koncentrationen av Tz-PEG7-NH2 med hjälp av en UV-Vis spektrofotometer övervakning 525 nm våglängd. Den molära extinktionskoefficient för Tz-PEG7-NH2 (ε525) är 535 M-1cm-1.

4. syntesen av Tz-PEG7- DOTA

  1. Lös Tz-PEG7-NH2 (4,5 mg, 6,9 μmol) i 0,15 mL DMSO (eller helt enkelt fortsätta med den lösning som skapats i steg 3.8).
  2. Lägga till 22 molar medel te (21 μL, 0,15 mmol) till tetrazine-innehållande lösning från steg 4.1.
  3. Tillsätt 10 mg (14,2 μmol) p- SCN-Bn-DOTA som en solid och vortex lösningen i ca 2 min eller tills materialet är helt upplöst.
  4. Låt reaktionen på Inkubera i 30 min på RT med mild agitation.
  5. Efter 30 min, späd reaktionen 1:1 i H2O och rena produkten med omvänd fas C18 HPLC ta bort oreagerad p- SCN-Bn-DOTA. Den p- SCN-Bn-DOTA kan övervakas vid en våglängd på 254 nm, medan den Tz-PEG7- DOTA övervakas bäst vid en våglängd på 525 nm.
    Obs: Retentionstiderna är naturligtvis starkt beroende av HPLC-utrustningen av varje laboratorium (pumpar, kolumner, slangar, osv.), och lämpliga kontroller bör köras före rening. Dock att presentera ett exempel, om en gradient av 5:95 MeCN/H2O (båda med 0,1% TFA) till 95:5 MeCN/H2O över 30 min och en analytisk 4.6 x 250 mm C18kolumn används, Tz-PEG7- DOTA och p-SCN-Bn-DOTA har retentionstiderna för cirka 15,6 min och 16,1 min, respektive.
  6. Frysa insamlade HPLC eluenten med hjälp av flytande kväve och Linda nu-fryst samling röret i aluminiumfolie. Plats frysta samling röret på en lyophilizer över natten att ta bort den Rörlig fas för HPLC. Produkten är ett ljust rosa pulver.
  7. Bereda produkten i 0,15 mL av DMSO och mäta koncentrationen med en UV-Vis spektrofotometer övervakning 525 nm våglängd. Den molära extinktionskoefficient för Tz-PEG7- DOTA (ε525) är 535 M-1cm-1.
  8. Analysera den slutliga föreningen av kärnmagnetisk resonans (NMR) och högupplösande masspektrometri (HRMS) för att verifiera att syntes var framgångsrik. Se tabell 1 för experimentellt bestämd kemiska förskjutningarna och molekylvikt av alla de föreningar som diskuteras i detta arbete.
  9. Lagra renat Tz-PEG7- DOTA lösningen i mörker vid-80 ° C.
    Obs: Detta är en godtagbar stoppställe i förfarandet. Slutförda Tz-PEG7- DOTA föregångaren är stabil i minst 1 år under dessa förhållanden.

5. 177Lu Radiolabeling av Tz-PEG7- DOTA

Varning: Detta steg av protokollet innebär hantering och manipulering av radioaktivitet. Innan du utför dessa steg — eller utföra något annat arbete med radioaktivitet — forskare bör rådgöra med sin hem institutets strålning säkerhetsavdelningen. Vidta alla möjliga åtgärder för att minimera exponering för joniserande strålning.

Obs: När du arbetar med små mängder av radiometals rekommenderas att alla buffertar är fri från spårmetaller att förebygga störningar i samordningen bindning.

  1. I ett 1,7 mL centrifugrör, lägga till 200 μL av 0,25 M ammonium acetatbuffert justeras med portioner av 1 M HCl pH 5,5.
    Obs: Om du använder mindre än 370 MBq av aktivitet för märkning, volymen av buffert används minskas till 100 µL.
  2. Tillsätt önskad mängd [177Lu] LuCl3 till buffertlösningen. Tillsatta mängden kommer att vara beroende av antalet försökspersoner i experimentet och radioaktiva doser som administreras. Det rekommenderas att 1-2 extra doser värt av radioaktivitet läggas till som en försiktighetsåtgärd för att kompensera för den potentiella förlusten av radioaktiviteten under reningssteg.
  3. Lägg till Tz-PEG7- DOTA i DMSO steg 5.2 radioaktiva blandningen. Mängden Tz-PEG7- DOTA är beroende av antalet försökspersoner testas. Mer information om detta ämne kan hittas i steg 6.2.2.2.
  4. Låt lösningen Inkubera vid 37 ° C i 20 min.
  5. Kontrollera att radiolabeling är komplett med radio instant tunnskiktskromatografi (radio-iTLC) med 50 mM EDTA, pH 5,5 som den mobila fasen. Den märkta [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz förblir baslinjen — Rf = 0 — medan gratis [177Lu] Lu3 + kommer att samordnas av EDTA och åker med lösningsmedel framsidan, Rf = 1.0 (figur 3B).
  6. Om kvantitativa märkning inte uppnås, lägga till ytterligare ligand för att samordna den gratis radiometal. Alternativt, rena den märkta [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz använder en C18 patron. Följ tillverkarens anvisningar för användning. Nedan ges ett exempel procedur.
    1. Prime patronen som långsamt passerar genom 5 mL etanol genom patronen med en stor spruta. Sedan, passera genom 5 mL acetonitril och sedan 5 mL avjoniserat vatten (DI) H2O.
    2. Dra upp radioligand lösningen från steg 5.3 i en mindre spruta och injicera långsamt på C18 patronen. Sedan obundna Tvätta patronen med 10 mL DI H2O ta bort någon [177Lu] LuCl3.
    3. Eluera med 500 µL etanol. Ta bort eventuella etanol från slutprodukten genom att föra över fartyget med lågt flöde av torrt kväve eller argon för 10-15 min. Därefter blandas radioligand i saltlösning i en volym som bestäms i steg 6.2.2.2.

6. in vivo studier

FÖRSIKTIGHET: Som i avsnitt 5, detta steg av protokollet innebär hantering och manipulering av radioaktivitet. Innan du utför dessa steg, bör forskare rådgöra med sin hem institutets strålning säkerhetsavdelningen. Vidta alla möjliga åtgärder för att minimera exponering för joniserande strålning.

  1. Förberedelse av djuren
    1. I kvinnliga atymiska naken möss, subkutant implantat 5 x 106 SW1222 kolorektal cancerceller upphängd i 150 μL av en 1:1 blandning av cell media och matrix (t.ex., Matrigel) och tillåter dessa att växa till en 100-150 mm3 xenograft (14-18 dagar efter inympningen).
    2. Sortering av djur för en biodistribution experiment
      1. När tumörerna är av tillräcklig storlek som bestäms av bromsok mätning, sortera djuren för att säkerställa att varje kohort har ungefär samma genomsnittliga tumör volym. Djuren kan särskiljas i varje bur genom märkning på svansen med outplånligt bläck (ett band, två band, etc.).
    3. Sortering av djur för en längsgående terapi studie
      1. När tumörerna är av tillräcklig storlek som bestäms av bromsok mätning, bifoga öronmärken till vart och ett av de djur för att garantera korrekt spårning hela experimentet.
        Obs: Numeriska öronmärken kan falla av under hela försöket. Som ett resultat, det rekommenderas att följa dessa fysiska Taggar med örat skårorna på ett systematiskt sätt (dvs., höger, vänster, bilaterala, rätt x 2, vänster x 2).
      2. Sortera djuren så att den genomsnittliga tumör volymen i varje kohort är ungefär lika. Följande metod för sortering av djur kan utföras med ett kalkylprogram.
        1. Lista de djurens identifikationsnummer, öra notch mönster och tumör volym i tre separata kolumner.
        2. Sortera data från minsta till största tumör volym.
        3. I den fjärde spalten tilldela varje djur en bur nummer och cykel genom burar i ett ormliknande mönster. Till exempel om det finns 5 burar, denna spalt skulle vara fylld ”5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5...” tills alla djur tilldelas en bur.
        4. När burarna är tilldelat, sortera data efter bur nummer. Om örat skårorna som används, kontrollera att varje djur i en viss bur har en unik öra notch mönster. Om det finns dubbletter (två eller fler av samma mönster) i en given bur, har swap en mus med en från en annan bur med saknade mönster tills varje bur djur med unika öra notch mönster.
  2. Formuleringar och injektioner
    Obs: Sekvensen av injektion för både biodistribution och terapi studien fortsätter så här: huA33-TCO injiceras först, följt av [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz efter ett förutbestämt intervall.
    1. Immunoconjugate
      1. Späd en alikvot av den huA33-TCO lösningen från steg 1,9 till en koncentration på 0,8 mg/mL 0.9% steril koksaltlösning.
      2. Rita doser på 150 µL (100 µg) huA33-TCO lösning i sprutor som förbehandlats med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS och lagra dessa sprutor på is.
        Obs: BSA behandling minskar icke-specifik bindning av antikroppen till väggarna i sprutan.
      3. Varma djuren under en värmelampa i 3 minuter för att vidga svans venen.
      4. HuA33-TCO lösningen injiceras i svansen venen xenograft-bärande musen. Tillåt 24 h (eller olika förutbestämda tidsintervall) för huA33-TCO att ackumuleras i tumören av musen.
    2. Radioligand
      1. Radiomärkas Tz-PEG7- DOTA som beskrivs i avsnitt 5.
      2. Rita doser i 150 μL av 0.9% steril saltlösning som innehåller 1.1 molar medel av Tz-PEG7- DOTA i förhållande till mängden huA33-TCO administreras. Som ett exempel, om 100 μg (0.67 nmol) av huA33-TCO injicerades i djuret och [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz reaktionsblandningen gjordes med en specifik aktivitet av 12,4 GBq/μmol, ritas sedan doser som innehåller 9,14 MBq av aktivitet varje. Detta motsvarar 0,74 nmol av Tz (1.1 molar eq. släkting till huA33-TCO).
      3. Varma djuren under en värmelampa för 3 min att vidga svans venen.
      4. Injicera dosen av radioligand i svansen ven xenograft-bärande musen. Aktiviteten ska injiceras bestäms av forskaren. Publicerade data har visat dosberoende terapeutiska effekter på tumörens storlek inom ett intervall på 7,4-55,5 MBq.
  3. Biodistribution
    1. Vid önskad tidpunkt efter administrering av radioligand, avliva varje kohort av möss med 2% O2 / 6% CO2 gas blandning.
      Obs: Följ alla institutionella krav angående metoder för sekundära fysiska dödshjälp (t.ex. cervikal dislokation).
    2. För varje djur, ta bort alla organ av intresse, tvätta dem i vattenbad ta bort överflödigt blod och torka dem på hushållspapper i öppen luft för 5 min. prov orgel listan i föreslagna ordning: blod, tumör, hjärtat, lungorna, levern, mjälten, magsäcken, tunntarmen , tjocktarm, njurar, muskel, ben, hud, svans.
    3. När tillräckligt torkat, placera organ i förväg vägda disponibla kultur rör. Väg nu-fyllda rören igen för att få massan av varje organ eller vävnad.
    4. Mäta aktiviteten i vart och ett av rören med en gamma räknare. Kalibrera den uppmätta aktiviteten i räknaren gamma till detektorn används för att mäta den dragna dosen. Räkna radioaktiva standarder 177Lu på varje instrument och fastställa en kalibreringsfaktor för omvandling mellan aktivitet och räknas per minut (cpm).
    5. Rita biodistribution data som ett stapeldiagram (se figur 5) med medelvärde normaliserade upptag för varje organ som visas tillsammans med en bar som betecknar en standardavvikelse. Statistiska skillnader i upptag mellan prov grupper kan bedömas av ett oparat t-test, där betydelsen uppnås när p < 0,05.
  4. Av behandlingen
    1. Använda bromsok, mäta den längsta sidan av avlånga tumören (längd) samt bredd, som är vinkelrät mot längden. Beräkna volymen med hjälp av formeln för volymen av en ellipsoid: (4/3) πL· W· H, vilket förenklar till ½L· W2, förutsatt att höjden är ungefär lika med bredden.
      Obs: Det är också möjligt att använda en handhållen tumör mätanordning om en är tillgängliga (se Tabell för material).
    2. Väga varje mus på en balans att spåra viktökning eller viktminskning över tid.
    3. Ännu viktigare, övervaka varje djurets utseende för tecken på ångest, som ryckte tillbaka eller spruckna kutan blodkärl (som kan indikera hematotoxicitet).
      Obs: Tumör mätningar bör samlas varje 1-2 dagar under studiens longitudinella terapi.
    4. Ritdata från längsgående terapin studera så genomsnittliga tumör volymer tiden och normalisera att starta tumör volym om så önskas. Statistiska skillnader i upptag samma dag mellan prov grupper kan bedömas av ett oparat t-test, där betydelsen uppnås när P < 0,05. Mer omfattande statistiska analyser kan och bör utföras som rekommenderas av en utbildad biostatistiker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Konjugationen av TCO att huA33 bygger på kopplingen mellan amine-reaktivt TCO-NHS och lysin rester på ytan av immunglobulin. Denna metod är mycket robust och reproducerbara och ger tillförlitligt en grad-av-märkning av 2-4 TCO/mAb. I det här fallet var MALDI-ToF masspektrometri anställd för att bekräfta en viss märkning av cirka 4,0 TCO/mAb; ett liknande värde erhölls med en fluorophore modifierade tetrazine som en reporter24. Syntesen av tetrazine liganden utförs i tre steg: (1) koppling av Tz-NHS till en mono-Boc-skyddade PEG länkare (2) deprotection av detta mellanliggande till avkastning Tz-PEG7-NH2, och (3) bildandet av en tiourea koppling mellan p- SCN-Bn-DOTA och Tz-PEG7-NH2. Detta förfarande är relativt lättköpt och ger Tz-PEG7- DOTA i en övergripande avkastning av ~ 75%. Var och en av intermediärer har präglats av HRMS och 1H-NMR; informationen presenteras i tabell 1.

Går vidare till den radiolabeling, erhålls 177Lu3 + vanligtvis från kommersiella leverantörer som en klorid salt [177Lu] LuCl3 i 0,5 M HCl. Den radiolabeling av Tz-PEG7- DOTA med 177Lu ge den radioligand [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz är mycket enkel: på bara 20 min, reaktionen är klar, producera den önskade produkten i > 99% radiokemiska renhet som bestäms av radio-iTLC. Inga ytterligare reningen är vanligtvis nödvändigt före formulering. En undersökning av litteraturen om Tz/TCO-baserade pretargeting tyder på att Tz:mAb molar förhållandet ~ 1:1 producerar de bästa i vivo data10. Det är därför inte nödvändigt att erhålla radioligand i aktiviteten för högsta möjliga molar. Till exempel biodistribution experiment diskuteras här anställa [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz med en molar aktivitet av ~ 12 GBq/µmol. För longitudinella studier, däremot [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz med högre molar aktivitet var används för att underlätta administrationen av större doser av radioaktivitet utan att ändra antalet injicerade födelsemärken av tetrazine.

Som kommer att behandlas vidare i diskussionen, biodistribution experiment är av största vikt att förstå och optimera varje strategi för PRIT. I det här fallet utfördes biodistribution experiment för att bestämma den optimala tidsintervall mellan förvaltningen av immunoconjugate och injektion av radioligand. I detta syfte anställt vi atymiska naken möss med subkutan A33 antigen-uttryckande SW1222 xenograft på sin högra axel. Dessa djur fick 100 µg (0.67 nmol) av huA33-TCO 24, 48, 72 eller 120 h före injektion av [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (9,14 MBq, 0.74 nmol). Figur 5 visar att alla injektion intervall ger hög aktivitetskoncentrationer i tumörvävnad samt låg aktivitetskoncentrationer i friska organ. 24 h injektion intervallet ger högsta tumoral upptaget på 120 h efter injektion: 21,2 ± 2.9%ID/g. Varje uppsättning villkor producerar också imponerande tumör-till-organ verksamhet koncentration nyckeltal. Pretargeting med 24 h intervall, exempelvis ger tumör-till-blod, tumör-till-lever och tumör-till-muskel nyckeltal på 20 ± 5, 37 ± 7 och 184 ± 30, respektive 120 h efter administrering av radioligand. Baserat på dessa fynd, valdes ett 24 h intervall för efterföljande longitudinella terapi studien (se nedan).

För den i vivo längsgående behandlingsstudie, kohorter (n = 10) av atymiska naken möss med subkutan SW1222 xenograft på sin högra flank var administrerade huA33-TCO (100 ug, 0,67 nmol) 24 timmar före injektion av [177Lu] Lu-DOTA-PEG 7- Tz. Tre olika experimentella kohorter var anställda, ta emot 18,7, 37 eller 55,5 MBq [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (motsvarande molar verksamhet 24, 45 och 70 GBq/µmol). Dessutom två kontroll kohorter fick en halv av PRIT regimen: antingen huA33-TCO (100 ug, 0,67 nmol) utan [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz eller [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (55,5 MBq, 0.74 nmol) utan huA33-TCO. Dessa är väsentliga kontroller för att säkerställa att det terapeutiska svaret inte framkallas av antingen immunoconjugate eller radioligand ensam. Volymerna av tumörerna mättes varje 3 dagar för de första tre veckorna av studien och sedan en gång per vecka fram till dess att experimentet (70 dagar, 10 halveringstider 177Lu). Som ses i figur 6, finns det en skarp skillnad i svaret av de experimentella kohorter jämfört med kontrollgrupperna. Medan tumörerna i möss som fick endast en komponent i strategin PRIT fortsätter att växa okontrollerat, tumörer av möss som fick den fullständiga PRIT slutar växa och slutligen krympa till volymer långt under de som mättes i början av studien. Viktigast av allt, inga giftiga biverkningar observerades, och alla djur underhålls en vikt inom 20% av sin ursprungliga massa (figur 7A). En Kaplan-Meier tomt av data ger en ännu mer slående visualisering av studien: medan alla möss i kontroll kohorterna hade till vara euthanized inom några veckor, mössen på experimentell kohorterna hade en perfekt post överlevnad vid slutet av den utredning ( Figur 7B).

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild tecknad av pretargeted radioimmunoterapi baserat på omvänd elektron efterfrågan Diels-Alder reaktionen. Denna siffra har ändrats från referens #28. Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted radioimmunoterapi av kolorektalcancer. Molekylär farmaceutisk kemi. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk av byggandet av huA33-TCO. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schematisk av syntesen av Tz-PEG7- DOTA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: (A) Schematisk bild av den radiolabeling [ 177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz; B representativa radio-iTLC kromatogrammet visar den > 98% strålningskemisk renhet [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Biodistribution i av i vivo pretargeting med huA33-TCO och [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz i atymiska naken möss med subkutan SW1222 mänskliga kolorektal cancertumörer med pretargeting intervall 24 (lila), 48 (grön) , 72 (orange) eller 120 (blå) timmar. Data med standardfel från kohorter av n = 4; Statistisk analys utfördes av en oparade Students t-test, **p < 0,01. Denna siffra har ändrats från referens #28. Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted radioimmunoterapi av kolorektalcancer. Molekylär farmaceutisk kemi. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: längsgående behandlingsstudie av 5 grupper av möss (n = 10 varje) uthärda subkutan SW1222 tumörer skildras i genomsnitt tumör volym som en funktion av tid a; och tumör volym normaliserad till ursprunglig volym som en funktion av tiden (B). Kontrollgrupperna fick antingen immunoconjugate utan radioligand (blå) eller radioligand utan immunoconjugate (röd). Tre behandling grupper fick huA33-TCO (100 µg, 0,6 nmol) följt 24 h senare av antingen 18,5 (grön), 37,0 (lila) eller 55,5 (orange) MBq (~0.8 nmol i varje fall) [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz. Genom log-rank (Mantel-Cox) testa, överlevnad var signifikant (p < 0,0001) för alla behandlingsgrupper. Denna siffra har ändrats från referens #28. Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted radioimmunoterapi av kolorektalcancer. Molekylär farmaceutisk kemi. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: vikt kurvor för djur under längsgående terapi studien av 5 grupper av möss (n = 10 vardera) med subkutan SW1222 tumörer (A), motsvarande Kaplan-Meier överlevnad kurva (B). Kontrollgrupperna fick antingen immunoconjugate utan radioligand (blå) eller radioligand utan immunoconjugate (röd). Tre behandling grupper fick huA33-TCO (100 µg, 0,6 nmol) följt 24 h senare av antingen 18,5 (grön), 37,0 (lila) eller 55,5 (orange) MBq (~0.8 nmol i varje fall) [177Lu] - DOTA - PEG7- Tz. Denna siffra har ändrats från referens #28. Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., & Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted radioimmunoterapi av kolorektalcancer. Molekylär farmaceutisk kemi. 15 (4), 1729-1734 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Förening 1 H-NMR Skift HRMS (ESI)
500 MHz, DMSO
TZ-PEG7- NHBoc 10,52 (s, 1H), 8,50 (m, 3H), 7,82 (t, 1H), 7,46 (d, 2H), 6,69 (t, 1H), 4,33 (d, 2H), 3,42 (m, 22H), 3.33 (t, 2H), 3,31 (t, 2H), 3.12 (q, 2H), 2,99 (q, 2H), 2.12 (t, 2H), 2,03 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,70 (q, 2H), 1.29 (s 9 H) m/z Beräknat årligt belopp. för C35H57N7O11Na: 774.4005; hittade: 774.4014.
TZ-PEG7-NH2 10,58 (s, 1H), 8,46 (m, 2H), 7.87 (t, 1H), 7,75 (d, 2H), 7,52 (1H, d), 4,40 (d, 2H), 3,60-3,50 (m, 26H), 3,40 (t, 2H), 3,32 (bs, 2H), 3.20 (q, 2H), 2,99 (bs, 2H), 2.19 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,79 (q, 2H). m/z Beräknat årligt belopp. för C30H50N7O9: 652.3670; hittade: 652.3676.
TZ-PEG7- DOTA 10.57 (s, 1H), 9.63 (bs, 1H), 8,45 (m, 3H), 7.86 (m, 1H), 7,73 (bs, 1H), 7,54 (d, 2H), 7,41 (m, 2H), 7.19 (m, 2H), 6,54 (bs, 1H), 4,40 (d, 2H), 4,00-3.20 (m, 55H) 2,54 (s, 1H), 2.10 (t, 3H), 2,18 (t, 3H), 3.20 (q, 4H), 1,76 (q 2 H). m/z Beräknat årligt belopp. för C50H76N11O15S: 1202.56; hittade: 1203.5741.

Tabell 1. Karakterisering data för de organiska föreningar som beskrivs i detta protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En av styrkorna i detta förhållningssätt till i vivo pretargeting — särskilt när det gäller strategier bygger på bispecific antikroppar och radioaktivt haptener — är dess modularitet: trans- cyclooctene beståndsdelarna kan läggas till någon antikropp, och tetrazine radioligands kan vara märkt med en extra mängd radionuklider utan att försämra deras förmåga att reagera med deras Klicka partners. Anpassning av detta förhållningssätt till andra antikropp/antigen-systemet är ännu inte så enkelt som att duplicera i protokollet som beskrivs här. Naturligtvis, bör varje försök att skapa en ny mAb-TCO-immunoconjugate eller en roman tetrazine-bärande radioligand åtföljas av lämpliga kemisk och biologisk karaktärisering analyserna, inklusive tester för stabilitet och reaktivitet. Men utöver detta finns det två variabler som är särskilt viktiga att utforska och optimera: (1) massa mAb-TCO immunoconjugate administreras och (2) tidsintervall mellan injektion av mAb-TCO och administrationen av radioligand. Båda faktorerna kan dramatiskt påverka beteendet i vivo med pretargeting systemet. Exempelvis kan användning av alltför höga doser av immunoconjugate eller intervall perioder som är för korta resultera i oönskat hög aktivitet halter i blodet på grund av Klicka på reaktioner mellan radioligand och immunoconjugate kvar i omlopp. Däremot kan minska sysselsätter massorna av immunoconjugate som är alltför låga eller alltför långa intervall perioder i onödan aktivitetskoncentrationer i tumören på grund av underlåtenhet att mätta antigenet eller den obevekliga (även långsamma) isomerisering av den trans - cyclooctene till inaktiva cis- cyclooctene. Längs dessa linjer, kan utför biodistribution experiment med hjälp av en rad massa immunoconjugate och pretargeting intervaller vara utomordentligt bra. Naturligtvis, rekommenderas det också att lämpliga kontroller köras parallellt med några in-vivo -experiment. Dessa inkluderar, men begränsas inte till — experiment med antigen-negativ cellinjer, blockerar kohorter som tar emot ett stort överskott av okonjugerat antikropp, förvaltning av radioligand ensam, injektion av den radioligand efter en TCO- saknar immunoconjugate, och i vivo pretargeting använder en icke-specifik, isotyp kontroll TCO-bärande immunoconjugate.

Imaging experiment kan alternativt användas för optimering om terapeutiska radionukliden avger positroner eller 'skrivbara' fotoner eller om en 'skrivbara' isotopologue av terapeutiska radionukliden är tillgängligt. Slutligen, uppsättningarna av variabler som ger den bästa balansen mellan hög tumoral aktivitetskoncentrationer och hög tumör till bakgrunden aktivitet koncentration nyckeltal bör vara valt för efterföljande longitudinella studier. I fall presenteras här, 100 µg av huA33-TCO injicerades med ett intervall på 24 h. dosimetri beräkningar – särskilt de som möjliggör beräkning av tumör doser och terapeutiska förhållanden — kan också vara till hjälp under processen för optimering.

Det är viktigt att notera att även de lovande [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz/huA33-TCO system som har utvecklats kan dra nytta av ytterligare optimering. En jämförelse mellan dosimetri data från detta förhållningssätt till PRIT och traditionell RIT med en 177Lu-märkt variant av huA33 visar att tumören dosen av PRIT ligger lägre än för traditionella RIT. Dessutom den effektiva dosen av PRIT systemet (0,054 mSv/MBq) bara är något lägre än för traditionella RIT (0,068 mSv/MBq).

Två rättsmedel för att dessa frågor undersöks för närvarande. Först utvecklats en dendritiska byggnadsställning kan öka antalet TCOs bifogas varje antikropp30. I samband med pretargeted PET imaging, detta tillvägagångssätt ökar dramatiskt tumoral aktivitetskoncentrationen, och liknande experiment med [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz pågår. Andra, användning av tetrazine-bärande clearing agenter kan vara användbar i samband med PRIT. Administrering av clearing agenter före injektion av radioligand har utnyttjats i en mängd olika pretargeting metoder som ett sätt att sänka koncentrationen av kvarvarande immunoconjugate i blodet och därmed minska aktivitetskoncentrationer i friska organ23,31. Användning av clearing agenter är inte utan sina nackdelar, men; det mest anmärkningsvärda som ökar komplexiteten i ett redan visserligen komplicerade terapeutiska modalitet. Dock publicerat forskare vid Memorial Sloan Kettering Cancer Center nyligen en övertygande rapport om inrättandet en Tz-märkt dextran clearing agent för pretargeted PET imaging och data om användningen av denna konstruktion i samband med [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz och huA33-TCO är kommande32. En annan metod att maximera dosimetriska fördelarna med PRIT är användning av radionuklider med kortare fysiska halveringstider. Detta har visat sig mycket effektiv för avbildning; terapeutiska radionuklider med kort fysikaliska halveringstider är dock få och långt mellan.

Slutligen skulle vi vara försumlig om vi misslyckades med att ordentligt ta itu med några av de inneboende begränsningarna av pretargeting baserat på omvänd elektron efterfrågan Diels-Alder reaktionen. Först av dessa problem är inneboende till alla sätt att i vivo pretargeting: antikroppen anställd kan inte vara internaliserad vid bindning till målvävnaden. Detta, naturligtvis, är väsentliga, som antikroppen måste förbli tillgängliga för radioligand snarare än binds i en intracellulär fack. Denna begränsning är visserligen svårt att kringgå, även det har visats nyligen att antikroppar med långsam till måttlig andelen internalisera kan användas för in-vivo pretargeting33,34. För det andra, den långsamma i vivo isomerisering av reaktiva trans -cyclooctene till inaktiva cis -cyclooctene har potential att begränsa längden på intervallet mellan administrationen av de TCO-bärande immunoconjugate och den injektion av radioligand. Intervaller på upp till 120 h har kritiskt, fortfarande gett utmärkta resultat inom ramen för båda pretargeted PET imaging och PRIT. Användningen av dessa längre intervall är dock nästan alltid åtföljs av liten minskning tumoral aktivitetskoncentrationen, ett resultat som kan härröra från detta isomerisering. För att lösa problemet, har flera laboratorier försökt att skapa stabilare trans- cyclooctenes utan att kompromissa med reaktivitet, medan andra har försökt att utveckla helt nya dienophiles kan reagera med tetrazine35 . Under de kommande åren är det vår förhoppning att dessa kemiska utvecklingen kommer att utnyttjas för PRIT.

I slutändan är PRIT baserat på den inversa elektron efterfrågan Diels-Alder ligation onekligen en framväxande och något omogen teknik. Vi uppmuntras dock ändå av de prekliniska resultat vi har fått och upphetsad för kliniska löftet om denna strategi. Vi hoppas innerligt att detta protokoll uppmuntrar andra att utforska och optimera detta tillvägagångssätt och därmed bränsle sin resa från laboratoriet till kliniken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr Jacob Houghton för bra konversationer. Författarna vill även tacka NIH för sin generösa finansiering (R00CA178205 och U01CA221046).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
  2. Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
  3. Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
  4. Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
  5. Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin's Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
  6. Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
  7. Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
  8. Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
  9. Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
  10. van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
  11. Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
  12. Goldenberg, D. M., Chatal, J. -F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
  13. Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
  14. Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
  15. Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Cancer Research. 76 (22), 6669 (2016).
  16. Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
  17. Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
  18. Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
  19. Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
  20. Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
  21. Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
  22. Meyer, J. -P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
  23. Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
  24. Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  26. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
  27. Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
  28. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
  29. Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
  30. Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
  31. Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
  32. Meyer, J. -P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
  33. Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
  34. Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
  35. Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).

Tags

Kemi fråga 143 radioimmunoterapi pretargeted radioimmunoterapi pretargeting omvänd elektron efterfrågan Diels-Alder-reaktionen tetrazine trans- cyclooctene huA33 A33 antigen lutetium-177
Pretargeted radioimmunoterapi baserat på den inversa Electron efterfråge Diels-Alder reaktionen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis,… More

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis, B. M. Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (143), e59041, doi:10.3791/59041 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter