Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Pretargeted Radioimmunotherapy ters elektron talep Diels-Alder reaksiyonu üzerinde dayalı

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/59041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

Sentez ve karakterizasyonu bir trans- cyclooctene (TCO) bu protokolünü açıklar-modifiye antikor ve 177Lu etiketli tetrazine (Tz) radioligand pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) için. Buna ek olarak, bu iki yapıları kullanımı vivo içinde biodistribution ve boyuna terapi çalışmaları kolorektal kanser, bir fare modeli için ayrıntıları.

Abstract

Radioimmunotherapy (RIT) kanser tedavisi için umut verici bir yaklaşım olmakla birlikte, uzun farmakokinetik half-life radiolabeled antikorların yüksek radyasyon dozlarda sağlıklı dokulara yol açabilir. Belki de doğal olarak, birkaç farklı stratejileri rahatsız bu sınırlamayı aşmak için geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar en umut verici pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) biridir. PRIT radyonüklid üzerinden immünglobulin ayırımı, onları ayrı ayrı enjekte ve sonra onları izin üzerinde vivo içinde hedef doku, birleştirmek için esas olan. Bu yaklaşım süre onların farmakokinetik sakıncaları Süpürgelik, böylece radyasyon doz olmayan hedef dokulara düşürücü ve çoğu yarı ömrü olan radyonükleidler kullanımını kolaylaştırması antikorlar tümör hedefleme olağanüstü özelliklerini koşum geleneksel radioimmunoconjugates için çok kısa kullanımda kabul. Son beş yıl içinde bizim laboratuvar ve diğerleri ters elektron isteğe Diels-Alder (IEDDA) tepki trans- cyclooctene (TCO) ve tetrazine (Tz) arasındaki temel vivo içinde pretargeting bir yaklaşım geliştirdik. Bu strateji pretargeted pozitron emisyon tomografisi (PET) başarıyla uygulandı ve tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi (SPECT) çeşitli antikor-antijen sistemlerini görüntüleme. Son yayınlar bir çift içinde IEDDA tabanlı PRIT pankreas duktal adenokarsinom ve kolorektal karsinom fare modellerinde etkinliğini göstermiştir. Bu protokol için 177tetrazine Lu DOTA etiketli radioligand kullanarak PRIT için protokolleri açıklamak ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) ve huA33 antikor (huA33-TCO) hedefleme kolorektal kanser TCO-modified çesidi. Daha ayrıntılı olarak, biz huA33-toplam sahip olma maliyeti, sentez ve [177Lu] radiolabeling Lu-DOTA-PEG7inşaatı anlatacağız - Tz ve in vivo biodistribution ve fare modelleri çalışmalarda uzunlamasına terapi performansını Kolorektal karsinom.

Introduction

Terapötik radyonükleidler teslim edilmek üzere tümör antikor kullanımı Radioimmunotherapy (RIT) — — uzun tedavi kanser1,2için cazip bir yaklaşım olmuştur. Nitekim, bu söz Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi'nin onayı ile Non-Hodgkin Lenfoma tedavisi için iki radioimmunoconjugates tarafından vurguladı: 90Y-ibritumomab tiuxetan ve 131-tositumomab3 , 4. henüz bile onun ilk günlerinden itibaren RIT klinik umutları tarafından kritik bir komplikasyon engel olmuştur: yüksek radyasyon doz hızları sağlıklı dokulara5,6. Genel olarak, radioimmunoconjugates RIT için uzun ömürlü radyonükleidler ile etiketlenir (Örneğin, 131ben [t½ 8.0 gün =] ve 90Y [t½ 2,7 gün =]) ile iyi kurtağzı fiziksel yarı ömrü olan uzun farmakokinetik yarı hayat immünglobulin. Bir kez antikor dolaşım birkaç gün sonra onun en iyi biodistribution ulaştı bu yeterli radyoaktivite kalır sağlar gibi bu önemlidir. Ancak, bu kombinasyon uzun ikamet kez kan ve uzun fiziksel yarı-hayat kaçınılmaz olarak sağlıklı dokulara, böylece tedavi oranları azaltılması ve terapi7etkinliğini sınırlayıcı ışınlama içinde sonuç. Fab, Fab gibi kesilmiş antikor parçaları dahil olmak üzere bu sorunu aşmak için çeşitli stratejiler incelemiş bulunuyoruz ', F(ab')2, minibodies ve nanobodies8,9,10. Biri en umut verici ve büyüleyici henüz inkar edilemez karmaşık, alternatif yaklaşımlar içinde vivo 11pretargeting var.

Vivo pretargeting nükleer görüntüleme ve zarif benzeşme ve seçicilik antikorların onların farmakokinetik sakıncaları11,12,13süpürgelik koşum istiyor tedavi yaklaşımıdır. Bu amaçla, geleneksel radioimmunotherapy kullanılan radiolabeled antikor iki bileşeni deconstructed: küçük molekül radioligand ve hem bir tümör antijen ve söz konusu radioligand bağlayabilirsiniz bir immunoconjugate. İmmunoconjugate ilk enjekte ve bir 'Başlangıç', hangi boyunca hedef dokuda birikir ve kan temizler genellikle birkaç gün, verilen. Daha sonra küçük molekül radioligand yönetilen ve ya tümör, immunoconjugate ile birleştirir veya hızla vücuttan temizler. Özünde, vivo içinde pretargeting radiochemistry içinde vücut kendini gerçekleştirme üzerine dayanır. Radyoaktivite dolaşımını azaltarak, bu yaklaşım aynı anda radyasyon doz sağlıklı dokulara azaltır ve radyonükleidler kullanımını kolaylaştırmaktadır (Örneğin, 68Ga, t½ 68 dk.211=; Olarak, t½ 7.2 h =) genellikle antikor tabanlı vektörleri ile uyumsuz olarak kabul edilen yarı ömrü olan.

1980'lerin sonlarında başlayan, a avuç-in vivo pretargeting için farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir, bispecific antikorlar, biotin, arasındaki streptavidin etkileşimi temel stratejileri de dahil olmak üzere ve tamamlayıcı hibridizasyon oligonucleotides14,15,16,17,18. Henüz her geri farklı derecelerde komplikasyonlar, en meşhuru güçlü immünojenisite antikorlar streptavidin değiştirilme tarihi19,20gerçekleştirildi. Son beş yılda, bizim grup ve diğerleri vivo içinde trans- cyclooctene (TCO) ve tetrazine (Tz) arasında hızlı ve bioorthogonal ters elektron talep Diels-Alder ligasyonu dayalı pretargeting bir yaklaşım geliştirdik 21,22,23,24. Toplam sahip olma maliyeti genellikle daha istikrarlı vivo içinde onun Tz ortağı (Şekil 1)25,26daha olduğu gibi bu stratejileri en başarılı bir toplam sahip olma maliyeti-modified antikor ve Tz taşıyan radioligand, istihdam. Pretargeting diğer yöntemlerden olduğu gibi mAb-TCO immunoconjugate ilk idare ve dolaşımdan temizleyin ve tümör dokusunda biriktikçe zaman göz önüne alındığında. Daha sonra küçük molekül Tz radioligand, hangi sonra hedef doku içinde immunoconjugate ile tıklama ya da hızla vücuttan temizler enjekte edilir. Bu strateji pretargeting vivo içinde evde beslenen hayvan ve SPECT ile birkaç farklı antikor/antijen görüntüleme, sürekli olarak yüksek kontrastlı görüntüler üreten ve kısa ömürlü radyonükleidler kullanımı gibi etkinleştirme için son derece etkili kanıtlamıştır 18 F (t½ 109 dk =) ve 64Cu (t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Daha yakın zamanlarda, pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) tıklayın tabanlı etkinliğini pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) ve kolorektal karsinom27,28fare modellerinde göstermiştir. Bu amaçla, terapötik radyonüklid 177Lu (βmax 498 = keV, t1/2 = 6,7 gün) iki farklı antikorlar ile birlikte istihdam edildi: ubiquitously PDAC içinde ifade karbonhidrat antigen 19,9 (CA19.9) hedefleyen 5B1 , ve A33 hedefler, huA33 bir transmembran glikoprotein ifade > kolorektal kanserlerin % 95'i. Her iki durumda da, 177Lu-PRIT bu yaklaşım tümör dokusu yüksek aktivite konsantrasyonlarda vermiştir, bir doz bağımlı tedavi etkisi yaratılmıştır ve aynı anda faaliyet konsantrasyonlarda sağlıklı dokularda için geleneksel göre azaltılmış etiketli-doğrudan radioimmunoconjugates.

Bu makalede, 177tetrazine Lu DOTA etiketli radioligand kullanarak PRIT için protokolleri açıklamak ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz) ve huA33 antikor (huA33-TCO) toplam sahip olma maliyeti değiştiren bir türevi. Daha ayrıntılı olarak, biz huA33-TCO (resim 2), sentez ve [177Lu] radiolabeling Lu-DOTA-PEG7inşaatı tarif - Tz (Şekil 3 ve Şekil 4) ve içinde vivo performansını biodistribution ve kolorektal karsinom fare modelleri çalışmalarda uzunlamasına terapisi. Ayrıca, temsilcisi sonuçları ve tartışma, biz örnek veri kümesi, bu yaklaşımın optimizasyonu için adres olası stratejileri sunmak ve bu strateji vivo içinde pretargeting ve PRIT daha geniş bağlamda düşünün. Son olarak, biz huA33-toplam sahip olma maliyeti ve [177Lu] kullanarak pretargeting üzerinde odaklanmak seçtim iken Lu-DOTA-PEG7Tz - bu iletişim kuralı, bu strateji oldukça modüler ve antikor çeşitli uyacak şekilde adapte edilebilir olduğunu unutmamak önemlidir ve radyonükleidler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada açıklanan tüm in vivo hayvan deneyleri onaylı protokolleri göre gerçekleştirilen ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi, Weill Cornell Tıp Merkezi ve Hunter College etik kuralları altında yürütülen Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteler (IACUC).

1. huA33-TCO hazırlanması

Not: HuA33-toplam sahip olma maliyeti sentezi daha önce raporlanmış29oldu. Ancak, okuyucu kolaylaştırmak için bu burada düzeltmeleri için optimal koşullar ile çoğaltılır.

  1. 1.7 mL microcentrifuge tüp (E) - cyclooct - 4 125 μL çözeltisi hazırlamak-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl 40 mg/mL (0.15 M) bir konsantrasyon, Kuru dimetil formamide (DMF) (TCO-NHS) karbonat. Bu çözüm bölünmemeli ve gelecekteki deneyler kullanmak için-80 ° C'de donmuş olabilir.
  2. Ayrı 1.7 mL microcentrifuge tüp huA33 fosfat tamponlu tuz (PBS; 2.7 mM potasyum klorür, 137 mM sodyum klorür ve 11.9 mM potasyum fosfat, pH 7,4) 1 ml 5 mg/mL çözeltisi hazırlamak.
  3. Küçük aliquots kullanarak (< 5 μL) 0.1 M Na2CO3/, adım 1.2 antikor çözümden 8.8 9.0 için pH ayarlama. PH kağıt ya da bir pH metre bir elektrot ile dikkatli olun pH 9.0 fazla olamaz ve pH izlemek için kullanın.
  4. Adım 1. 3'açıklanan antikor, yavaş yavaş TCO-NHS antikor miktarı göre 40 molar karşılıkları karşılık gelen bir birimi ekleyin. HuA33 5 mg (30 nmol) çözümde ise, örneğin, 9.0 μL (1.20 μmol) toplam sahip olma maliyeti-NHS 40 mg/mL (0.15 M) çözüm ekleyin.
    Not: Toplam sahip olma maliyeti-NHS hidrofobik. Antikor çözüm eklerken, yavaş yavaş ve ajitasyon yağış engellemek için ekleyin. % 10 fazla olamaz DMF son tepki çözüm cilt tarafından.
  5. 25 ° c hafif ajitasyon (500 rpm) ile 1 h için thermomixer üzerinde kuluçkaya tepki sağlar.
  6. 1 saat sonra ambalajlı tek kullanımlık boyutu dışlama desalting sütun kullanarak huA33 TCO immunoconjugate arındırmak.
    1. Boyutu dışlama sütun sütun mevcut herhangi bir koruyucu Muhafazası sırasında kaldırmak için tedarikçi tarafından açıklandığı gibi equilibrate. Sütun 5 yıkama tipik bir yordam içerir sütun birime karşılık gelen PBS hacmi ile x: PBS 5 x 2, 5 mL.
    2. Reaksiyon karışımı tepki karışımı hacmi belirterek boyutu dışlama sütunu ekleyin.
    3. Reaksiyon karışımı sütun girdikten sonra PBS çözüm için sütun eklenen toplam hacmi getirmek için uygun bir miktar eklemek 2.5 mL. Örneğin, konjugasyon reaksiyon toplam hacmi 1.3 mL içinde oluştuysa, ek PBS 1.2 mL sütununu ekleyin.
    4. PBS 2 mL eluent kullanarak ürün toplamak.
      Not: Bu adımı son yapı huA33-TCO PBS, pH 7.4 2 ml ortaya çıkarır.
  7. Bir UV-VIS spektrofotometre 280 nm dalga boyu izleme kullanarak huA33 TCO konsantrasyonu ölçmek. 210.000 M-1cm-1en IgGs (ε280) için molar tükenme katsayısıdır.
  8. İmmunoconjugate daha yüksek bir konsantrasyon ile bir çözüm isteniyorsa, santrifüj filtre ünitesi ile 50.000 molekül ağırlığı kesme kullanarak huA33 TCO çözüm konsantre üretici talimatları.
    Not: Birçok antikorlar toplamak veya toplama sırasında çökelti olduğu biliniyor. Bu yordam yeni bir antikor ile çalışırken, araştırmacılar edebiyat veya kendi deneyimlerini antikor söz konusu işleme için ertelemek.
  9. Hemen gerekirse karanlıkta tamamlanmış huA33-toplam sahip olma maliyeti immunoconjugate 4 ° C'de depolayın. Eğer 4 günden fazla gelecekte kullanılmak üzere, karanlıkta-80 ° C'de depolayın.
    Not: Bu yordam bir kabul edilebilir durdurma noktasıdır. Tamamlanmış huA33-toplam sahip olma maliyeti immunoconjugate karanlıkta-80 ° C'de en az 6 ay depolama için kararlı olmalıdır.

2. Tz-PEG7- NHBoc sentezi

  1. 1.7 mL microcentrifuge tüp tetrazine N- hydroxysuccinimidyl ester (Tz-NHS; 12.6 μmol) susuz dimetil sülfoksit (DMSO) 0,15 ml 5 mg geçiyoruz.
  2. Ayrı 1.7 mL microcentrifuge tüp Boc korumalı amino PEG polimer, susuz DMSO 0.15 ml O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glikol (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) 8 mg geçiyoruz.
  3. Tz-NHS çözüme, trietilamin (çay) 3 μL (21,3 μmol, 1.7 molar eşdeğerleri) ekleyip iyice karıştırın.
  4. Pembe tetrazine çözüm NHBoc-PEG7-NH2 adım 2.2 ekleyin ve reaksiyon karışımı (RT) Oda sıcaklığında hafif ajitasyon 30 dk için kuluçkaya.
  5. 30 dakika sonra reaksiyon 11: H2O sulandırmak ve herhangi bir unreacted Tz NHS Tz-PEG7' den ayırmak için ters faz C18 yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) kullanarak tepki arındırmak - NHBoc. Çözücüler asit olmadan grup korumak Boc erken kaldırılmasını engellemek için kullanın. Her iki Tz-PEG7izlemek - NHBoc ve Tz-NHS, dalga boyu 525 nm.
    Not: Saklama kez belli ki son derece (pompalar, sütun, boru, vb) her laboratuvar HPLC donatımın bağımlıdır ve uygun kontroller arıtma önce çalıştırılmalıdır. Ancak, Eğer 5:95 MeCN/H2O bir degrade bir örnek sunmak için (her iki olmadan hiçbir katkı maddesi) 95:5 için MeCN/H2O 30 dk, 1 mL/dk bir akış hızı ve bir analitik 4.6 mm x 250 mm C18sütun kullanılır , saklama kez Tz-NHS ve Tz-PEG7- NHBoc are 16 dk ve 18 dk, çevresinde anılan sıraya göre.
  6. Sıvı nitrojen kullanarak toplanan HPLC eluent donma ve şimdi donmuş toplama tüp alüminyum folyo sarın. Yer bir lyophilizer donmuş koleksiyonu metroyla gece HPLC mobil faz kaldırmak için. Ürün-ecek var olmak sağlam bir karakteristik parlak pembe.
    Not: sıvı azot yoksa, Kuru buz içinde toplanan HPLC eluent dondurma veya-80 ° C dondurucuda bir gecede.

3. Tz-PEG7-NH2 sentezi

  1. Adım 2.6, Tz-PEG7üründen için - NHBoc, 1.5 mL diklorometan (DCM) ekleyin ve bu çözüm için küçük bir yuvarlak alt şişesi transfer.
  2. Trifluoroacetic asit (TFA) 0.25 mL dropwise pembe adım 3.1 ekleyin.
  3. RT, 30 dk hafif ajitasyon ile için kuluçkaya tepki sağlar.
  4. 30 dakika sonra döner buharlaşma çözücü üzerinden buharlaşır. Bir su banyo sıcaklığı 37 ° c fazla olamaz
  5. 0.5 mL su pembe viskoz üründe sulandırmak.
  6. Tz-PEG7-NH2 Boc korumalı habercisi ayırmak için ters faz C18 HPLC kullanarak ürün arındırmak. Her iki Tz-PEG7izlemek - NHBoc ve Tz-PEG7-NH2 ' de bir dalga boyu 525 nm.
    Not: Saklama kez belli ki son derece (pompalar, sütun, boru, vb) her laboratuvar HPLC donatımın bağımlıdır ve uygun kontroller arıtma önce çalıştırılmalıdır. Ancak, Eğer 5:95 MeCN/H2O bir degrade bir örnek sunmak (% 0,1 ile her ikisi de TFA) 95:5 için MeCN/H2O 30 dk, 1 mL/dk bir akış hızı ve bir analitik 4.6 mm x 250 mm C18sütun kullanılır , saklama kez Tz-PEG7- NHBoc ve Tz-PEG7-NH2 civarında 18 dk ve 13 dk, sırasıyla vardır.
  7. Sıvı nitrojen kullanarak toplanan HPLC eluent donma ve şimdi donmuş toplama tüp alüminyum folyo sarın. Yer bir lyophilizer donmuş koleksiyonu metroyla gece HPLC mobil faz kaldırmak için. Ürün-ecek var olmak sağlam bir parlak pembe.
  8. Adım 3.7, Tz-PEG7-NH2, 150 μL DMSO ve transfer 1.7 mL microcentrifuge tüp ile ürün sulandırmak.
  9. Bir UV-VIS spektrofotometre 525 nm dalga boyu izleme kullanarak Tz-PEG7-NH2 konsantrasyonu ölçmek. 535 M-1cm-1Tz-PEG7-NH2 (ε525) için molar tükenme katsayısıdır.

4. Tz-PEG7- DOTA sentezi

  1. TZ-PEG7-NH2 (4.5 mg, 6.9 μmol) 0,15 mL DMSO dağıtılması (ya da sade bir şekilde adım 3.8 içinde oluşturulan çözüm devam).
  2. Molar karşılıkları 22: çay (21 μL, 0.15 mmol) tetrazine içeren adım 4.1 ekleyin.
  3. P- SCN-Bn-DOTA katı ve girdap yaklaşık 2 dakika ya da malzeme tamamen eriyene kadar çözüm olarak, 10 mg (14,2 μmol) ekleyin.
  4. RT, 30 dk hafif ajitasyon ile için kuluçkaya tepki sağlar.
  5. 30 dk sonra reaksiyon 11: H2O sulandırmak ve unreacted p- SCN-Bn-DOTA kaldırmak için ters faz C18 HPLC kullanarak ürün arındırmak. P- SCN-Bn-DOTA dalga boyu 254 izlenebilir nm, Tz-PEG7süre - DOTA en iyi dalga boyu 525 izlenen nm.
    Not: Saklama kez belli ki son derece (pompalar, sütun, boru, vb) her laboratuvar HPLC donatımın bağımlıdır ve uygun kontroller arıtma önce çalıştırılmalıdır. Ancak, Eğer 5:95 MeCN/H2O bir degrade bir örnek sunmak (% 0,1 ile her ikisi de TFA) 95:5 MeCN/H2O 30 dk ve bir analitik 4.6 x 250 mm C18sütun kullanılır, Tz-PEG7- DOTA ve p-SCN-Bn-DOTA var saklama kez 15.6 dk civarında ve 16,1 min, anılan sıraya göre.
  6. Sıvı nitrojen kullanarak toplanan HPLC eluent donma ve şimdi donmuş toplama tüp alüminyum folyo sarın. Yer bir lyophilizer donmuş koleksiyonu metroyla gece HPLC mobil faz kaldırmak için. Ürün parlak pembe toz olacak.
  7. DMSO 0.15 ml ürün yeniden oluşturma ve izleme 525 nm dalga boyunda UV-VIS spektrofotometre kullanarak toplama ölçün. Molar tükenme katsayısı için Tz-PEG7- DOTA (ε525) 535 M-1cm-1olduğunu.
  8. Nükleer manyetik rezonans (NMR) tarafından son bileşik analiz ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) bu sentez doğrulamak için başarılı oldu. Deneysel olarak kararlı kimyasal değişimler ve moleküler ağırlık bu çalışmada ele bileşiklerin bkz. Tablo 1 .
  9. Mağaza arıtılmış Tz-PEG7- DOTA çözüm-80 ° C'de karanlıkta
    Not: Bu yordam bir kabul edilebilir durdurma noktasıdır. Tamamlanan Tz-PEG7- DOTA için en az 1 yıl bu koşullarda kararlı öncüsüdür.

5. 177Lu Tz-PEG7- DOTA Radiolabeling.

Dikkat: Bu adım Protokolü'nün işleme ve düzenleme radyoaktivite içerir. Aşağıdaki adımları gerçekleştirmeden önce — veya radyoaktivite ile başka bir iş yapmak — araştırmacılar onların ev kurumun radyasyon güvenliği bölümü ile danışmak. İyonizan radyasyon en aza indirmek için tüm olası adımları da gerçekleştirin.

Not: radiometals küçük miktarda ile çalışırken tüm arabellekleri koordinasyon sitesi bağlamadaki etkilenmemesi için izleme metallerden boş olması önerilir.

  1. 1.7 mL santrifüj tüpü aliquots 1 M HCl pH 5.5 için 0.25 M amonyum asetat arabelleği 200 μL ayarlamasının yapılacağı ekleyin.
    Not: faaliyet daha az 370 MBq etiketleme için kullanılıyorsa, 100 µL için kullanılan arabellek hacmi azaltılmalıdır.
  2. [177Lu] LuCl3 istenilen miktarda arabellek ekleyin. Eklenmiş tutar konular deneme ve yönetilen radyoaktif dozlarda sayısına bağlı olacaktır. Bu değer 1-2 ekstra doz radyoaktivite radyoaktivite potansiyel kaybı için arıtma adımları sırasında telafi etmek için bir önlem olarak eklenmesi önerilir.
  3. TZ-PEG7ekleyin DOTA - DMSO adım 5.2 radyoaktif karışımı için. Tz-PEG7- DOTA test edilen konular sayısına bağlıdır. Bu konu hakkında daha fazla ayrıntı adım 6.2.2.2 bulunabilir.
  4. Çözüm için 20 dk 37 ° C'de kuluçkaya izin verin.
  5. Radiolabeling radyo anlık ince tabaka Kromatografi (radyo-iTLC) ile 50 mM EDTA, pH 5.5 mobil faz olarak kullanarak tamamlandıktan doğrulayın. Etiketli [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz temel kalır — Rf = 0 — süre ücretsiz [177Lu] Lu3 + EDTA tarafından koordine ve solvent açık, Rf ile seyahat edecek = 1.0 (Şekil 3B).
  6. Nicel etiketleme elde değil, ücretsiz radiometal koordine etmek için ek ligand ekleyin. Alternatif olarak, etiketli arındırmak [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz C18 kartuş kullanarak. Kullanım için üreticinin yönergelerini izleyin. Bir örnek yordam aşağıda verilmiştir.
    1. Kartuş yavaş yavaş 5 mL etanol Kartuşu ile de büyük bir şırınga geçerek Başbakan. Daha sonra Asetonitril 5 mL ve 5 mL deiyonize (DI) H2o geçmek
    2. Radioligand çözüm kadar adım 5.3 içinde daha küçük bir şırınga çizmek ve yavaş yavaş C18 kartuş enjekte etmek. Sonra yıkama herhangi kaldırmak için DI H2O 10 mL kartuşla [177Lu] LuCl3ilişkisiz.
    3. Etanol 500 µL ile elute. Herhangi bir etanol kuru azot veya argon için 10-15 dk bir düşük akış hızı ile gemi üzerine geçirerek nihai ürün kaldırın. Daha sonra radioligand 6.2.2.2. adımda belirlenen birim salin içinde resuspend.

6. in vivo çalışmalar

Dikkat: Bölüm 5 olduğu gibi bu adım Protokolü'nün işleme ve düzenleme radyoaktivite içerir. Aşağıdaki adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar onların ev kurumun radyasyon güvenliği bölümü ile danışmalısınız. İyonizan radyasyon en aza indirmek için tüm olası adımları da gerçekleştirin.

  1. Hayvanlar hazırlanması
    1. Kadın korele Çıplak fareler, subkutan 5 x 106 SW1222 kolorektal kanser hücrelerinin hücre medya ve matris 1:1 karışımı 150 μL içinde askıya implant (Örn., Matrigel) ve bunlar 100-150 mm3 xenograft (14-18 gün büyümeye izin aşı sonra).
    2. Biodistribution deneme için hayvanların sıralama
      1. Tümörler, yeterli boyuta Halife ölçüm bilgisi tarafından belirtildiği gibi olduğunda, her kohort yaklaşık aynı ortalama tümör hacme sahip emin olmak için hayvanlar sıralayın. Hayvanlar her kafes içinde (bir grup, iki grup, vb) silinmez mürekkeple kuyruk üzerindeki işaretleri tarafından ayırt edici olabilir.
    3. Hayvanlar için bir boyuna terapi çalışma sıralanması
      1. Tümörler, yeterli boyuta Halife ölçüm bilgisi tarafından belirtildiği gibi olduğunda, her deneme boyunca doğru izleme sağlamak için hayvanların kulak Etiketler ekleyin.
        Not: Sayısal kulak Etiketler deneme ders boyunca düşebilir. Sonuç olarak, bu fiziksel etiketleri ile kulak çentikler sistematik bir şekilde eşlik tavsiye edilir (i.e., sağ, sol, ikili, sağ x 2, sol x 2).
      2. Hayvanlar her kohort ortalama tümör hacminde kabaca eşit şekilde sıralayın. Hayvan sıralamak için aşağıdaki yöntemi bir elektronik tablo programı kullanılarak gerçekleştirilebilir.
        1. Hayvan kimlik numaraları, kulak çentik desen ve tümör hacminde üç ayrı sütun listesi.
        2. En küçük verilerden en büyük tümör birimine sıralayın.
        3. Dördüncü bir sütun, her hayvan bir kafes numarası ve devir-den geçerek snakelike desen kafeslerde atayın. Örneğin, 5 kafesleri iseniz, bu sütun olur kadar bütün hayvanlar kafese atanmış olan "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." dolu.
        4. Bir kez kafesleri atandıktan sonra kafes numarasını tarafından verileri sıralama. Kulak çentikler kullanılıyorsa, her hayvan belirli bir kafes içinde bir benzersiz kulak çentik desen olduğundan emin olun. Belirli bir kafese çoğaltmaları (iki veya daha fazla aynı model) varsa, takas bir fare bir desen her kafes kadar eksik ile başka bir kafes hayvan benzersiz kulak çentik desenleri ile vardır.
  2. Formülasyonları ve enjeksiyon
    Not: Enjeksiyon için biodistribution ve terapi çalışma sırası aşağıdaki gibi gelirleri: huA33-toplam sahip olma maliyeti ilk olarak, [177Lu] Lu-DOTA-PEG7tarafından takip enjekte Tz - önceden belirlenmiş bir zaman aralığından sonra.
    1. Immunoconjugate
      1. Adım 1.9 huA33 TCO çözümden 0,8 mg/mL % 0,9 steril serum fizyolojik bir konsantrasyon için bir aliquot oranında seyreltin.
      2. 150 µL (100 µg) doz huA33 TCO çözüm %1 sığır serum albumin (BSA) PBS içinde ön işleme şırıngalar içinde çizmek ve buz bu şırıngaları depolamak.
        Not: Antikor şırınga duvarları için non-spesifik bağlama BSA tedavi azaltır.
      3. A ısı lamba kuyruk ven genişletmek 3 dakika altında hayvanlar sıcak.
      4. HuA33-toplam sahip olma maliyeti çözüm xenograft taşıyan fare kuyruğu damar içine enjekte. 24 h (veya farklı önceden belirlenmiş zaman aralığı) fare tümör toplamaya huA33 TCO sağlar.
    2. Radioligand
      1. TZ-PEG7radiolabel - DOTA Bölüm 5'te belirtildiği gibi.
      2. Doz % 0,9 serum fizyolojik içeren 1.1 molar eşdeğerleri Tz-PEG7- DOTA huA33 TCO miktarı göre yönetilen steril 150 μL içinde çizin. Örnek olarak, Eğer 100 μg (0.67 nmol) huA33-TCO hayvana enjekte ettiler ve [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz tepki karışımı 12.4 GBq/μmol, belirli bir etkinliği ile yapıldı sonra doz faaliyet her 9.14 MBq içeren çizilecektir. Bu 0,74 nmol Tz (1.1 molar EQ göreceli olarak huA33 TCO) karşılık gelir.
      3. A ısı lamba kuyruk ven genişletmek 3 dakika altında hayvanlar sıcak.
      4. Radioligand doz xenograft taşıyan fare kuyruğu damar içine enjekte. Etkinlik enjekte edilir araştırmacı tarafından belirlenir. Yayımlanan veri tümör boyutu 7,4-55.5 MBq aralıklarındaki doz bağımlı tedavi edici etkileri göstermiştir.
  3. Biodistribution
    1. Radioligand yönetim sonra istenen saat noktada her kohort bir 2 O2 kullanmaya farelerin ötenazi / %6 CO2 gaz karışımı.
      Not: herhangi bir kurumsal koşulları için ikincil fiziksel ötenazi (Örneğin, servikal çıkığı) yöntemleri ile ilgili olarak uygulayın.
    2. Her hayvan için ilgi tüm organları çıkarmak, onları herhangi bir aşırı kan kaldırmak için bir su banyosunda yıkamak ve kuru onları bir kağıt havlu ile 5 dk. örnek organ listesi önerilen sırayla için açık hava Tarih: kan, tümör, kalp, akciğerler, karaciğer, dalak, mide, ince bağırsak , kalın bağırsak, böbrek, kas, kemik, deri, kuyruk.
    3. Yeterince kuru kez organları önceden ağırlığını tek kullanımlık kültür tüplerde yerleştirin. Bir kez daha her organ veya doku kütlesi elde etmek için şimdi dolu tüpler tartın.
    4. Faaliyetin her bir gama sayacı kullanarak tüplerinin ölçmek. Gama Counter çizilmiş doz ölçmek için kullanılan Detector ölçülen faaliyet kalibre. 177Lu her cihazda radyoaktif standartlarının saymak ve şekilde aktivite ve dakika başına sayıları (BGBM) arasında için bir kalibrasyon faktörü belirlemek.
    5. Bir çubuk grafik olarak biodistribution veri arsa (bkz Şekil 5) için bir bar ile birlikte görüntülenen her organ alımı ortalama ile normalleştirilmiş bir standart sapmayı ifade eden. İstatistiksel alımını örnek gruplar arasındaki farkları bir unpaired t-önemi elde sınaması tarafından değerlendirildi zaman p < 0,05.
  4. Terapi izleme
    1. Çap pergeli kullanarak, dikdörtgen tümör (uzunluk) en uzun tarafında yanı sıra uzunluğu için dikey olarak genişliğini ölçmek. Bir elipsoid hacmi için formül kullanarak birimi hesaplamak: (4/3) πL· W· H, ½L· için kolaylaştırır Yüksekliği genişliği yaklaşık olarak eşit olduğu varsayımıyla W2.
      Not: Eğer bir kullanılabilir (bakınız Tablo reçetesi) ölçüm cihazı el tümör kullanmak mümkündür.
    2. Kilo alma veya kilo kaybı zaman içinde izlemek için bir denge üzerinde her fare tartın.
    3. Önemlisi, her hayvanın fiziksel görünüm için sıkıntı gibi geri kamburlaşmış, veya parçalanmış kutanöz kan damarları (hangi haematotoxicity gösterebilir) belirtileri izlemek.
      Not: 1-2 günde boyuna terapi çalışma ders sırasında tümör ölçümleri toplanmalıdır.
    4. Boyuna terapi verilerden Arsa olarak ortalama tümör birimleri zaman içinde çalışma ve istenirse tümör birimi başlangıç için normalleştirmek. Aynı gün alımı örnek gruplar arasında farklılıklar istatistiksel bir unpaired t-önemi elde sınaması tarafından değerlendirildi zaman P < 0,05. Daha kapsamlı istatistiksel analiz edebilir ve eğitimli bir biostatistician tarafından tavsiye edilen şekilde yapılmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Toplam sahip olma maliyeti konjugasyon huA33 için kaplin amin-reaktif TCO-NHS ve immünglobulin yüzey üzerinde lizin artıkları arasında esas olan. Bu yöntem son derece sağlam ve tekrarlanabilir ve güvenilir bir derecesi--etiketlerine göre 2-4 toplam sahip olma maliyeti/mAb, verim. Bu durumda, maldı-ToF kütle spektrometresi yaklaşık 4,0 toplam sahip olma maliyeti/mAb etiketleme, bir ölçüde onaylamak için istihdam edildi; benzer bir değer bir muhabir24fluorophore-modified tetrazine kullanarak elde edildi. Tetrazine ligand sentezi üç adımda gerçekleştirilir: Tz-NHS (1 kaplin bir mono-Boc korumalı PEG bağlayıcı (2 deprotection bu verim Tz-PEG7-NH2ara ve (3) arasında Tioüre bağlantı oluşumu için p- SCN-Bn-DOTA ve Tz-PEG7-NH2. Bu yordam nispeten facile olup Tz-PEG7affords DOTA - genel bir verim % ~ 75. Her ara ürün HRMS ve 1H-NMR ile karakterize; Bu veriler Tablo 1' de sunulmuştur.

Bir klorür tuz gibi [177Lu] LuCl3 0,5 M HCl'radiolabeling için devam ediyoruz, 177Lu3 + genellikle ticari terdarikçilerin elde edilir. Tz-PEG7/ radiolabeling - DOTA ile 177radioligand [177Lu] Lu-DOTA-PEG7vermeye Lu - Tz çok basit: sadece 20 dakika içinde tam, istenen ürün üreten reaksiyondur > %99 radiochemical Radyo-iTLC tarafından belirlenen saflık. Genellikle, başka hiçbir arıtma formülasyonu önce gereklidir. Edebiyatının Tz/TCO tabanlı pretargeting üzerinde bir anket öneriyor bir Tz:mAb molar oranı ~ 1:1 en iyi vivo içinde veri10üretir. Sonuç olarak, en yüksek olası molar faaliyette radioligand elde etmek için gerekli değildir. Örneğin, biodistribution deneyler burada istihdam [177Lu] Lu-DOTA-PEG7ele Tz-~ 12 GBq/µmol molar bir aktivite ile. Boyuna terapi çalışmaları için buna ek olarak, [177Lu] Lu-DOTA-PEG7Tz - yüksek molar etkinlik yapıldı. Yönetim radyoaktivite daha büyük dozlarda enjekte mol sayısı değiştirmeden kolaylaştırmak amacıyla kullanılan tetrazine.

Ele alınması gibi daha fazla anlayış ve herhangi bir yaklaşım PRIT için en iyi duruma getirme büyük önem biodistribution deneyler tartışmada, vardır. Bu durumda, immunoconjugate yönetim ve radioligand enjeksiyon arasında optimum aralığı zaman belirlemek için biodistribution deneyler yapılmıştır. Bu amaçla, subkutan A33 antijen ifade SW1222 xenografts onların sağ omuz üzerinde taşıyan korele Çıplak fareler çalıştırmaya başladık. Bu hayvanların 100 µg (0.67 nmol) huA33-TCO 24, 48, 72 veya 120 s [177Lu] Lu-DOTA-PEG7enjeksiyon öncesinde alınan - Tz (9.14 MBq, 0,74 nmol). Şekil 5 tüm enjeksiyon aralıkları yüksek aktivite konsantrasyonları tümör dokusunda yanı sıra sağlıklı organlar konsantrasyonlarda düşük etkinlik üretmek gösterir. 24 h enjeksiyon aralığı en yüksek tumoral alımı, 120 h sonrası enjeksiyon tanıyor: 21.2 ± 2.9%ID/g. Her koşul kümesi da etkileyici tümör organ etkinlik konsantrasyon oranı üretir. Bir 24 saat aralığı ile Örneğin, pretargeting verimleri tümör kan, tümör karaciğer ve tümör kas oranları 20 ± 5, 37 ± 7 ve 184 ± 30, sırasıyla, 120 h radioligand yönetim sonra. Bu bulgulara dayanarak, bir 24 saat aralığı sonraki boyuna terapi çalışma (aşağıya bakın) seçildi.

Vivo boyuna terapisi eğitim tabur (n = 10) korele Çıplak fareler subkutan SW1222 taşıyan xenografts onların sağ kanatta yönetilen huA33 TCO (100 ug, 0.67 nmol) 24 saat [177Lu] enjeksiyon öncesine edildi Lu-DOTA-PEG 7- Tz. Üç farklı deneysel tabur 18,7, 37 veya [177Lu] Lu-DOTA-PEG755,5 MBq alma istihdam - Tz (24, 45 ve 70 GBq/µmol molar işlemlerine karşılık gelir). Buna ek olarak, iki denetim tabur aldı PRIT rejimi yarısı: her iki huA33-toplam sahip olma maliyeti (100 ug, 0.67 nmol) [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz veya [177Lu] Lu-DOTA-PEG7olmadan - Tz (55,5 MBq, 0,74 nmol) huA33-toplam sahip olma maliyeti olmadan. Bu tedavi yanıt immunoconjugate veya radioligand yalnız tarafından elicited değil emin olmak için gerekli denetimleri vardır. Tümör hacimleri ilk üç haftalık bir çalışma ve deneme (70 gün, 10 yarı-yaşamlarını 177Lu) sonuç kadar haftada sonra bir kez her 3 günde ölçüldü. Şekil 6' da görüldüğü gibi kontrol gruplarına göre deneysel tabur yanıt stark bir fark yoktur. Tek bir bileşen PRIT strateji alma farelerde tümör denetlenmeyen büyümeye devam ederken, tümör tam PRIT rejimi alma farelerin büyüyen durdurmak ve sonuçta birimlerine bu çalışmanın başında ölçülen altında küçültmek. Da önemlisi, hiçbir toksik yan etkisi gözlendi ve bütün hayvanlar bir ağırlık onların ilk kitle (Şekil 7A) % 20'si içinde saklanır. Verileri bir Kaplan-Meier Arsa çalışmanın daha da çarpıcı bir görselleştirme sağlar: bir kaç hafta içinde euthanized denetim tabur tüm fareler vardı, deneysel tabur fareler hayatta kalma soruşturma (sonunda mükemmel bir kaydı vardı Şekil 7B).

Figure 1
Şekil 1: pretargeted radioimmunotherapy çizgi film şeması temel üzerinde ters elektron talep Diels-Alder reaksiyonu. Bu rakam yapılan başvuruyu #28 değiştirildi. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, izni ile yayımlanmaktadır (uyarlama) K., Lewis, J. S. ve Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy, kolorektal karsinom. Moleküler ilaç sanayii. 15 (4), 1729-1734 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: huA33-toplam sahip olma maliyeti inşaat şematik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: şematik Tz-PEG7sentezi - DOTA. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: [ 177Lu] Lu-DOTA-PEG7/ radiolabeling (A) şematik - Tz; (B) temsilcisi radyo-iTLC kromatografik gösteren > % 98'i radiochemical saflık [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: huA33-toplam sahip olma maliyeti ve [177Lu] ile vivo içinde pretargeting, Biodistribution - DOTA - PEG7- Tz korele çıplak farelerde taşıyan pretargeting aralıklarla 24 (mor), 48 (yeşil) kullanarak subkutan SW1222 insan kolorektal kanser tümörleri , 72 (turuncu) veya 120 (mavi) saat. Standart hataları tabur n gelen verilerle = 4; İstatistiksel analiz unpaired bir öğrenci t-testi, tarafından gerçekleştirilen **p < 0,01. Bu rakam yapılan başvuruyu #28 değiştirildi. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, izni ile yayımlanmaktadır (uyarlama) K., Lewis, J. S. ve Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy, kolorektal karsinom. Moleküler ilaç sanayii. 15 (4), 1729-1734 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: boyuna terapi çalışma fareler 5 grubunun (n = 10 her) ortalama tümör hacminde bir fonksiyonu zaman (A); olarak tasvir taşıyan subkutan SW1222 tümörler ve ilk birime bir fonksiyonu olarak normalleştirilmiş tümör birim zaman (B). Kontrol grubu radioligand (mavi) olmadan immunoconjugate ya da immunoconjugate (kırmızı) olmadan radioligand aldı. Üç tedavi grupları alınan huA33-TCO (100 µg, 0.6 nmol) 24 saat sonra 18,5 (yeşil), 37.0 (mor) veya 55,5 (turuncu) MBq (~0.8 nmol her durumda), [177Lu] tarafından takip - DOTA - PEG7- Tz. Günlük-sırası tarafından (şömine-Cox) testi, hayatta kalma önemli (p < 0.0001) tüm tedavi grupları için yapıldı. Bu rakam yapılan başvuruyu #28 değiştirildi. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, izni ile yayımlanmaktadır (uyarlama) K., Lewis, J. S. ve Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy, kolorektal karsinom. Moleküler ilaç sanayii. 15 (4), 1729-1734 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: 5 farelerin grupları boyuna terapi çalışma sırasında kilo hayvanlar için eğrileri (n = 10 her) subkutan SW1222 tümörler (A); taşıyan karşılık gelen Kaplan-Meier sağkalım eğrisi (B). Kontrol grubu radioligand (mavi) olmadan immunoconjugate ya da immunoconjugate (kırmızı) olmadan radioligand aldı. Üç tedavi grupları alınan huA33-TCO (100 µg, 0.6 nmol) 24 saat sonra 18,5 (yeşil), 37.0 (mor) veya 55,5 (turuncu) MBq (~0.8 nmol her durumda), [177Lu] tarafından takip - DOTA - PEG7- Tz. Bu rakam yapılan başvuruyu #28 değiştirildi. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, izni ile yayımlanmaktadır (uyarlama) K., Lewis, J. S. ve Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy, kolorektal karsinom. Moleküler ilaç sanayii. 15 (4), 1729-1734 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşik 1 H-NMR vardiya HRMS (ESI)
500 MHz, DMSO
TZ-PEG7- NHBoc 10.52 (s, 1H), 8,50 (m, 3H), 7.82 (t, 1H), 7.46 (d, 2H), 6,69 (t, 1H), 4,33 (d, 2H), 3.42 (m, 22H), 3,33 (t, 2H), 3.31 (t, 2H), 3.12 (q, 2H), (q, 2H) 2.99, 2.12 (t, 2H), 2.03 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1.70 (q, 2H), 1.29 (s 9 H) m/z Hspln. C35H57N7O11Na için: 774.4005; bulundu: 774.4014.
TZ-PEG7-NH2 10.58 (s, 1H), 8.46 (m, 2H), 7.87 (t, 1H), 7,75 (d, 2H), (d, 1H) 7,52, 4,40 (d, 2H), 3,60-3,50 (m, 26H), 3.40 (t, 2H), 3,32 (bs, 2H), 3,20 (q, 2H), (bs, 2H) 2.99, 2.19 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 1,79 (q, 2H). m/z Hspln. C30H50N7O9: 652.3670; bulundu: 652.3676.
TZ-PEG7- DOTA 10.57 (s, 1H), 9,63 (bs, 1H), 8.45 (m, 3H), 7.86 (m, 1H), 7,73 (bs, 1H), (d, 2H) 7,54, 7,41 (m, 2H), 7.19 (m, 2H), 6.54 (bs, 1H), 4,40 (d, 2H), 4,00-3,20 (m, 55H), (q, 4H) 3,20, 2.54 (s, 1H), (t, 3H) 2.18, 2.10 (t, 3H), 1.76 (q 2 H). m/z Hspln. C50H76N11O15için S: 1202.56; bulundu: 1203.5741.

Tablo 1. Bu protokol için açıklanan organik bileşikler için karakterizasyonu verileri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bir vivo pretargeting bu yaklaşım güçlü — özellikle stratejileri ile ilgili olarak esas bispecific antikorlar ve radiolabeled anhidridler — onun modülerlik olduğunu: trans- cyclooctene moieties eklenen herhangi bir antikor, ve tetrazine radioligands radyonükleidler olağanüstü bir çeşitlilik ile tıklama eşleri ile tepki yeteneğini bozulması olmadan radiolabeled. Henüz bu yaklaşım diğer antikor/antijen sisteme adaptasyon burada açıklanan protokol çoğaltma olarak kadar basit değil. Tabii ki, yeni bir mAb-TCO immunoconjugate veya bir roman tetrazine taşıyan radioligand oluşturmak için herhangi bir girişimi istikrar ve reaktivite testleri de dahil olmak üzere uygun kimyasal ve biyolojik karakterizasyonu deneyleri eşlik. Bunun ötesinde, orada ama keşfetmek ve en iyi duruma getirmek için özellikle önemli olan iki değişken: (1) yönetilen mAb-TCO immunoconjugate kütlesi ve (2) mAb-toplam sahip olma maliyeti enjeksiyon ve radioligand yönetim arasındaki zaman aralığı. İki faktör önemli ölçüde pretargeting sistemi içinde vivo davranışını etkileyebilir. Örneğin, çok kısa immunoconjugate veya Aralık dönemi aşırı yüksek doz kullanımı tıklayın reaksiyonlar arasında radioligand ve dolaşımda kalan immunoconjugate nedeniyle kan konsantrasyonlarda açabileceğinin yüksek aktivite neden olabilir. Bunun tersi olarak, çok düşük immunoconjugate ya da aşırı uzun Aralık dönemleri kitleler istihdam gereksiz yere antijen veya trans amansız rağmen (yavaş) isomerization doyurmak için bir başarısızlık nedeniyle tümör faaliyet konsantrasyonlarda azaltabilir - cyclooctene için etkin olmayan CIS- cyclooctene. Bu doğrultuda, biodistribution deneyler bir dizi kitleler immunoconjugate ve pretargeting aralıkları kullanarak performans olağanüstü yararlı olabilir. Tabii ki, bu da uygun denetimleri herhangi bir in vivo deneyler ile tandem çalıştırılması önerilir. Bunlar içerir — ama bunlarla sınırlı değildir — antijen-negatif hücre hatları featuring, çekimsiz antikor, yalnız radioligand yönetim, toplam sahip olma maliyeti takip radioligand enjeksiyon geniş bir fazlalığı almak tabur engelleme deneyler eksik immunoconjugate ve in vivo kullanarak bir belirsiz, izotip kontrol TCO-yatak immunoconjugate pretargeting.

Alternatif olarak, görüntüleme deneyler optimizasyonu için tedavi radyonüklid pozitron yayar veya 'görüntülenebilir' fotonlar veya tedavi radyonüklid 'görüntülenebilir' bir isotopologue kullanılabilir kullanılabilir. Sonuçta, yüksek tumoral aktivite konsantrasyonları ve yüksek tümör arka plan etkinliği toplama oranları en iyi dengeyi sağlamak değişkenleri kümesi sonraki boyuna terapi çalışmaları için seçilmesi gerekir. Burada sunulan durumda huA33-toplam sahip olma maliyeti 100 µg 24 h Dosimetry hesaplamalar zaman aralığı ile enjekte edildi — özellikle de tümör doz ve tedavi oranlarının hesaplanması için sağlar — en iyi duruma getirme işlemi sırasında da yardımcı olabilir.

Geliştirilmiştir bile umut verici [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz/huA33-toplam sahip olma maliyeti sistemi ek optimizasyon faydalı olacağını unutmamak gerekir. Bu yaklaşım PRIT dosimetry verilerden ve huA33 177Lu etiketli çesidi ile geleneksel RIT arasında bir karşılaştırma PRIT tümör doz bunun geleneksel efendim altında yatıyor ortaya çıkarır Ayrıca, PRIT sistemi (0,054 mSv/MBq) etkili doz sadece biraz geleneksel RIT daha düşük (0.068 mSv/MBq).

Bu konulara iki ilaçlar şu anda incelenmiştir. İlk olarak, bir dendritik iskele her antikor30' a eklenen TCOs sayısını artırma yeteneğine geliştirilmiştir. Pretargeted evde beslenen hayvan görüntüleme bağlamında, bu yaklaşım tumoral aktivite konsantrasyonları, önemli ölçüde artırır ve [177Lu] Lu-DOTA-PEG7ile benzer deneyler - Tz çalışmalar devam etmektedir. İkinci olarak, tetrazine taşıyan takas ajanlar kullanımı PRIT bağlamında yararlı olabilir. Ajanlar radioligand enjeksiyon önce açıklığın yönetim metodolojileri arta kalan immunoconjugate kan konsantrasyonu azaltmak ve böylece etkinlik konsantrasyonlarda azaltmak için bir yol olarak pretargeting çeşitli içinde istismar sağlıklı organlar23,31. Ajanlar açıklığın onun dezavantajı, yine de işe yarayacak; en önemli olan zaten kuşkusuz karmaşık bir tedavi modalitesi karmaşıklığı artıyor. Yine de, Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi araştırmacılar son zamanlarda pretargeted evde beslenen hayvan görüntüleme ve veri bu yapıyı [177Lu] ile birlikte kullanımı için ajan temizleme Tz etiketli dextran oluşturma zorlayıcı bir rapor yayınladı Lu-DOTA-PEG7- Tz ve huA33 toplam sahip olma maliyeti vardır yaklaşan32. PRIT Dozimetrik yararları maksimize etmek için başka bir yaklaşım daha kısa fiziksel yarı-ömrü olan radyonükleidler kullanmaktır. Bu görüntüleme için son derece etkili kanıtlamıştır; Ancak, tedavi edici radyonükleidler kısa fiziksel yarı-ömrü olan ve seyrek vardır.

Biz düzgün bazı ters elektron talep Diels-Alder reaksiyonu tabanlı pretargeting içsel sınırlamaları gidermek başarısız olursa son olarak, biz ihmalci olurdu. Bu sorunlardan ilki vivo içinde pretargeting Tüm yaklaşımlara doğasında vardır: istihdam antikor bağlama hedef doku üzerine içselleştirilmiş olamaz. Antikor yerine hücre içi bir kompartımanda münzevi radioligand için erişilebilir kalması gerekir gibi bu, tabii ki, önemlidir. Bu sınırlamayı aşmak, son zamanlarda bu antikorlar olabilir özümseyerek yavaş orta oranları ile gösterilmiştir rağmen33,34pretargeting vivo içinde için kullanılması kuşkusuz zordur. İkinci olarak, reaktif trans -cyclooctene etkin olmayan CIS -cyclooctene için yavaş in vivo isomerization TCO-yatak immunoconjugate yönetim arasındaki aralığın uzunluğunu sınırlamak potansiyeline sahiptir ve radioligand enjeksiyon. Eleştirel, en fazla 120 saat aralıklarla ve PRIT düşsel her iki pretargeted evde beslenen hayvan içinde belgili tanımlık bağlam mükemmel sonuçlar vermişlerdir. Ancak, bu daha uzun aralıklarla kullanımı hemen hemen her zaman tumoral aktivite konsantrasyonları, bu isomerization kaynaklanıyor bir sonucu hafif düşüşler eşlik ediyor. Bu sorunu gidermek için birkaç laboratuar diğerleri tamamen yeni dienophiles tetrazine35 ile tepki yeteneği geliştirmek çalışırken reaktivite, ödün vermeden daha istikrarlı trans- cyclooctenes oluşturmak için çalıştılar . Önümüzdeki yıllarda bu kimyasal gelişmeler PRIT için kullanılacak olabilir bizim umudumuz.

Sonunda, PRIT ters elektron talep Diels-Alder ligasyonu üzerinde dayalı inkar edilemez bir acil ve biraz çocukça teknolojisidir. Ancak, biz yine de biz elde edilen ve bu strateji klinik söz için heyecanlı preklinik sonuçlarına göre teşvik edilmektedir. Bu iletişim kuralı keşfetmek ve bu yaklaşım en iyi duruma getirmek ve böylece yakıt laboratuvarından yolculuğuna kliniğe başkalarına teşvik umuyorum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Dr. Jacob Houghton yararlı konuşmaları için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca NIH (R00CA178205 ve U01CA221046) cömert kendi finansman için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN) Fisher Scientific A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc) Fisher Scientific A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) Sigma-Aldrich 70023 Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM) Fisher Scientific D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Fisher Scientific D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit Fisher Scientific UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous Fisher Scientific AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 70-011-044 10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -20 °C
Triethylamine (TEA) Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific A116-50
Tumor measuring device Peira TM900 Peira TM900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
  2. Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
  3. Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
  4. Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
  5. Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin's Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
  6. Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
  7. Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
  8. Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
  9. Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
  10. van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
  11. Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
  12. Goldenberg, D. M., Chatal, J. -F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
  13. Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
  14. Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
  15. Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Cancer Research. 76 (22), 6669 (2016).
  16. Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
  17. Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
  18. Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
  19. Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
  20. Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
  21. Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
  22. Meyer, J. -P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
  23. Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
  24. Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  26. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
  27. Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
  28. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
  29. Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
  30. Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
  31. Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
  32. Meyer, J. -P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
  33. Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
  34. Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
  35. Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).

Tags

Kimya sayı 143 radioimmunotherapy pretargeted radioimmunotherapy pretargeting ters elektron talep Diels-Alder reaksiyonu tetrazine trans- cyclooctene huA33 A33 antijen Lutesyum-177
Pretargeted Radioimmunotherapy ters elektron talep Diels-Alder reaksiyonu üzerinde dayalı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis,… More

Membreno, R., Cook, B. E., Zeglis, B. M. Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (143), e59041, doi:10.3791/59041 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter