Summary
Her introduserte protokollen tillater karakteristikk av homing lungekapasitet av primære menneskelige lymfocytter under i vivo inflammatoriske tilstander. Lunge infiltrasjon av adoptively overførte menneskelige immunceller i en musemodell av allergiske betennelse kan avbildes og kvantifisert ved lys arks fluorescens mikroskopi av kjemisk ryddet lungevev.
Abstract
Overveldende vev opphopning av svært aktivert immunceller representerer et kjennetegn på ulike kroniske inflammatoriske sykdommer og dukket opp som en attraktiv terapeutiske mål i klinisk forvaltning av pasientene påvirkes. For å ytterligere optimalisere strategier sikte på terapeutisk regulering av patologisk ubalanserte vev infiltrasjon av pro-inflammatoriske immunceller, vil det være spesielt viktig å oppnå bedre innsikt i sykdommen - og organ-spesifikke homing egenskapene til perifere lymfocytter. Her beskrives eksperimentelle protokollen kan overvåke lunge akkumulering av fluorescently merket og adoptively overførte menneskelige lymfocytter i sammenheng med papain-indusert lungebetennelse. I motsetning til standard in vitro analyser brukte for analyse av immun celle migrasjon og chemotaxis, tar nå innført i vivo innstillingen konto lunge-spesifikke aspekter av vev organisasjon og påvirkning av komplekset inflammatorisk scenariet skjer i den levende murine organismen. Videre tredimensjonale cross-sectional lys arks fluorescens mikroskopiske imaging gir ikke bare kvantitative data på infiltrere immunceller, men også viser mønsteret av immun celle lokalisering i betente lungene. Samlet er vi kunne introdusere en innovativ teknikk av høy verdi for immunologiske forskning innen kronisk inflammatorisk lungesykdommer, som lett kan brukes ved å følge den angitte trinnvise protokollen.
Introduction
Klassisk inflammatoriske lidelser i lungene, som allergisk astma og kroniske hindrende lunge sykdom (COPD), er kjent for å være drevet av en større rekruttering av aktivert lymfocytter i lunge vev1,2. Lymfocytt utgitt cytokiner (f.eks, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ og TNF-α) fremme chemotaxis av medfødte og adaptive immunceller, indusere fibrotiske airway ombygging eller direkte skade lungene parenchyma2. Så langt, er de underliggende mekanismene ansvarlig for patologisk akkumulering av lymfocytter i lungevev ennå ikke fullt ut forstått. I analogi til vev-selektiv T celle preging på gut og hud homing, lunge dendrittiske celler (DCs) er åpenbart kunne prime perifere T celler for fortrinnsrett lunge infiltrasjon, delvis via induksjon av CCR4 uttrykk på den overflaten av lymfocytter3. Foruten CCR4, er airway-infiltrere T-celler også preget av en spesielt økt uttrykk av chemokine reseptorer CCR5 og CXCR3 forhold til T-celler i perifert blod1,4,5. Samlet, eksisterende data er konsistent med konseptet at lunge homing av T-lymfocytter under fysiologiske eller inflammatorisk forhold innebærer en rekke ulike chemokine reseptorer og deres respektive ligander og derfor avgjørende avhengig av en tett kontrollert samarbeid mellom medfødte og adaptive immunceller1. Spesielt i den innledende fasen av patogen eller allergen svare cellene av medfødte immunforsvaret TLR stimulering eller IgE-medierte cross-linking av umiddelbar løslatelse av forskjellige chemoattractants, som LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 og PGD21,6,7. Som et godt eksempel, samspillet mellom PGD2 og chemoattractant reseptoren CRTh2 er kjent for å være spesielt viktig for chemotaxis Th2 celler og dermed dukket opp som lovende terapeutisk mål i klinisk forvaltning av astma. Faktisk moderat astmapasienter viste en forbedring av symptomer og en betydelig økning av forsert ekspiratorisk volum i ett sekund (FEV1) etter behandling med en selektiv CRTh2 antagonist forhold til placebo gruppen8 ,9. I en mer progressed tilstand av inflammatorisk respons kan allerede rekrutterte T celler ytterligere forsterke lunge lymfocytt akkumulering via utgivelsen av IL-4 og IL-13 som potent stimuli for lunge DCer. Deretter regulere disse myelogen-avledet medfødte celler opp-uttrykk for CCL17 og CCL22 i en STAT6-avhengige måte1,10,11. Selv om kompleksiteten i beskrevet scenariet fortsatt hindrer en fullstendig forståelse av T celle lunge homing, tilbyr det en mengde molekylære mål for en potensielt optimalisert terapeutiske kontroll av inflammatoriske eller allergisk lungesykdommer. Derfor er det et stort behov for innovative eksperimentelle teknikker, som kan videre utdype og utfylle vår kunnskap i T celle chemotaxis og lunge homing.
Skyldes at lunge homing av lymfocytter i kroppen påvirkes av flere mobilnettet, humoral og fysiske1, kan de fleste av de eksisterende eksperimentelle metodene ikke modell hele kompleksiteten i denne immunologiske prosessen. I stedet fokus mange standardprotokoller for analyse av lunge homing selektivt på et bestemt aspekt involvert i kaskade av lymfocytt attraksjon, vedheft, migrasjon og oppbevaring. Foruten en beskrivende fastsettelse av mRNA eller protein uttrykksmønster av integrins og chemokine reseptorer på ytre eller lunge-infiltrere lymfocytter og komplementære måling av respektive chemokine nivåer i blod, bronchoalveolar lavage (BAL) eller lunge vev12,13,14,15, etablert i vitro celle kultur analyser tillate funksjonell karakteristikk av lymfocytt heft eller chemotaxis på definert eksperimentelle forhold16,17,18. I prinsippet overvåke statisk i vitro vedheft analyser bindende kapasiteten på kulturperler lymfocytter en endotelial monolayer eller glass lysbilder belagt med rekombinant endothelial vedheft molekyler (f.eks MAdCAM-1, VCAM-1), mens standard i vitro chemotaxis analyser brukes vanligvis for å kvantifisere evnen lymfocytter overføre langs chemokine gradering i et transwell system19. Både i vitro innstillinger kontrollert justering og modulering av eksperimentelle forhold, men derimot mangler viktige variabler kjent kritisk virkning på i vivo chemotaxis og vedheft av lymfocytter. Overveiende, statisk celle kultur analyser Ignorer påvirkning av skjær krefter forårsaket av permanent blodet flyt19 og forsømmelse potensielt involvering av omkringliggende immunologiske miljøet og samspill ikke-lymfocytt immunceller, både i en levende organisme. For å overvinne disse begrensningene, tolkningen av resultater i statisk in vitro chemotaxis eller tilslutning analyser trenger ytterligere validering i dynamiske vedheft eksperimenter under flyt forhold20,21 og i i vivo modeller av inflammatoriske orgel patologi19. Faktisk viktig konklusjoner om regulering av T celle lunge homing under inflammatoriske eller allergiske forhold kan trekkes fra dyrestudier analysere genetisk endret mus i definerte modeller av forskjellige lungesykdommer3, 22 , 23. kvantitativ sammenligningen av lunge infiltrere lymfocytter mellom wildtype mus og mus med mangel for en bestemte genet av interesse representerer en veletablert og bredt brukt verktøy for å definere effekten av bestemt mobilnettet veier eller reseptorer på sykdom-drevet mønster av T celle distribusjon. Men mangler i motsetning til før diskutert i vitro celle kultur analyser, en studie design basert på klassisk dyremodeller evnen til å analysere og overvåke primær menneskelige T-celler direkte avledet fra blod eller BAL av pasienter som lider av en inflammatorisk lunge sykdom. Derfor fortsatt det utfordrende funksjonelt validere om en diagnostically angitt lungesykdom er i stand til å implementere menneskelige lymfocytter for fortrinnsrett lunge tropism og hvor langt klinisk parametere kan påvirke på dette scenariet. Nylig ble en svært elegant i vivo tilnærming introdusert i sammenheng med inflammatorisk tarm sykdommer (IBD), som klarte å overvinne de fleste av disse begrensningene og åpnes nye muligheter for avansert translational studier på intestinal lymfocytt homing24 . Dra nytte av protokoller for løsemiddelbaserte vev clearing etterfulgt av cross-sectional lys arks fluorescens mikroskopi som et kraftig tenkelig verktøy, det var mulig å visualisere infiltrasjon og distribusjon av adoptively overførte menneskelige T-celler i tarmen av colitic immunodeficient mus24. Spesielt denne eksperimentelle innstillingen gjennomført to viktigste nyvinningene: (1) primære menneskelige immunceller kan analyseres under eksperimentelt definert i vivo forhold; (2) et ganske stort område av syke orgelet (ca 1,5 cm x 1,5 cm) kan avbildes i høy oppløsningskvalitet, etterfulgt av 3D-gjenoppbygging. Dessuten opprettet flere nyere studier bruk av løsemiddelbaserte vev clearing og lys arks fluorescens mikroskopi som viktigste verktøy for avansert lunge imaging25,26. For å ha nytte av denne teknologiske fremskritt i lunge immunologi, innført vi nå systemet for analyse av lunge homing.
Her presenteres protokollen gir en trinnvis innføring hvordan å rense og fluorescently etikett primære menneskelige T celler for overføring til mus med indusert lungebetennelse og, videre beskriver i detalj senere prosessen med lys-ark fluorescens mikroskopiske bildebehandling, inkludert orgel forberedelse og bildebehandling. Total, håper vi å støtte fremtidig translational studier innen inflammatoriske eller allergisk lungesykdommer ved å innføre en sofistikert, men likevel mulig, eksperimentelle modell for overvåking menneskelige lymfocytt lunge homing på i vivo forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter som involverer dyr ble utført i henhold til protokoller godkjent av relevante lokale myndigheter i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Mus ble plassert ved bestemte patogen uten betingelser. Samlingen av menneskeblod ble godkjent av lokale etiske komiteen og institusjonelle gjennomgang styret av universitetet i Erlangen-Nuremberg. Hver pasient ga skriftlig samtykke.
1. få allergisk lungebetennelse i mus
Merk: Som beskrevet i tidligere studier27, eksperimentelle fremgangsmåten kan indusere allergisk airway betennelse i mus og derfor utløser akkumulering av medfødte og adaptive immunceller i BAL. Beskrevet protokollen er etablert i C57BL/6J mus, men adopsjon til andre standard innavlet stammer bør være mulig.
Se figur 1A et sammendrag av den i vivo eksperimentelle prosedyren.
-
Bedøve mus ved intraperitoneal injeksjon av ketamin/xylazine.
Merk: bare bruker C57BL/6J-mus som er eldre enn 6 uker og med en kroppsvekt på minst 16 g.- Forberede ketamin/xylazine løsning i PBS (12 mg/mL Ketamin, 1.6 mg/mL xylazine), og fastslå nøyaktig kroppsvekten mus.
- Injisere første musen med 8 µL/g kroppsvekt ketamin/xylazine løsning intraperitoneally og Bekreft dyp anestesi via fravær av det pote knipe refleks før du fortsetter til trinn 1.3.
- Fersk forberede 5 mg/mL papain i PBS. Sakte Pipetter 10 µL (50 µg) papain løsningen i neseboret. Nøye overvåke musen til oppvåkning.
- Gjenta trinn 1.1 og 1.2 for alle mus med i eksperimentet. Utfør trinn 1,1-1,3 på tre dager.
2. rense og Fluorescently etiketten menneskelige perifert blod CD4+ T celler
Merk: Behandle celler under sterile forhold.
-
Samle 18 mL full menneskelig blod fra en ekstern blodåre. Utføre Ficoll-Hypaque gradient sentrifugering for å velge delen av perifert blod mononukleære celler (PBMC).
Merk: Innsamling og analyse av primære menneskelige materiale må godkjennes av lokale etiske myndigheter. Bare en person med en tilstrekkelig medisinsk kvalifisering er tillatt å samle blod fra en ekstern blodåre.- Samle blod ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA)-som inneholder monovettes (1.6 mg EDTA/mL blod) for å unngå koagulering.
Tilleggsutstyr: Bruk buffy pels blod, et biprodukt av blodgivning anriket på leukocytter, i stedet for fullstendig venøst blod. - Overføre blod til en konisk 50 mL tube og fortynne 1:2 i fosfat bufret saltvann (PBS). Forsiktig legge 10 mL av Ficoll-middels (tetthet 1.077 g/mL) som en nederste laget under utvannet blod. Sentrifuge prøven (800 x g i 15 min ved romtemperatur uten brems).
- Nøye fjerne røret fra sentrifuge og overføre PBMC inneholder interphase til en ny konisk 50 mL tube. Kast den øverste og nederste laget. Fyll PBMC inneholder røret med PBS og sentrifuger (300 x g i 10 min på 4 ° C). Fjerne nedbryting.
Merk: Frivillig, eventuelt utføre lysis av gjenværende erytrocytter. Forsiktig legge 3 mL ammonium klor kalium (ACP) lyseringsbuffer (155 mM salmiakk, 19 mM kalium hydrogen karbonat og 0.68 mM EDTA, pH 7.27) til resuspended celle pellets og vortex prøven. Riste rør for 3 min. Hvis du vil fjerne lyseringsbuffer ACP, Legg 40 mL PBS og sentrifuger (300 x g i 10 min på 4 ° C). Kast nedbryting.
- Samle blod ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA)-som inneholder monovettes (1.6 mg EDTA/mL blod) for å unngå koagulering.
-
Rense CD4+ T celler via CD4 microbeads.
Merk: Generelt, er det flere distributører av magnetiske microbeads for rensing av menneskelig CD4+ celler, som skal resultere i sammenlignbare nivåer av cellen renhet. Produkt valg bør være basert på personlige preferanser. Følgende protokollen (2.2.2–2.2.7) blir justert til et definert CD4 microbead produkt og respektive separasjon kolonner som ytterligere indikert i Tabellen for materiale. Noen endringer av protokollen kan være nødvendig i tilfelle at det er merket av for et alternativ CD4 microbead produkt.- Resuspend PBMC pellets i minimum 80 µL PBS med 0,5% fosterets bovin serum (FBS) og 2 mM EDTA (PBS/FBS/EDTA-buffer) per 107 PBMC. Bruk en start befolkning på ca 30 x 106 PBMC for å ende opp med ca 3 x 106 til 6 x 106 renset menneskelige CD4+ T celler.
- Legge til 20 µL av CD4 microbeads per 107 PBMC, bland forsiktig og ruge etter 20 min på 4 ° C. Fylle røret med PBS/FBS/EDTA-buffer (kjøles ned 4 ° C) og sentrifuger (300 x g i 10 min på 4 ° C). Fjerne nedbryting.
- Plass en separasjon-kolonne i et magnetfelt. Skyll kolonnen med 3 mL PBS/FBS/EDTA-buffer. Resuspend celle pellet i 500 µL PBS/FBS/EDTA-bufferen (kjøles ned 4 ° C) og overføre celle suspensjon på kolonnen skylles separasjon plassert i et magnetfelt.
- Skyll kolonnen separasjon tre ganger med 3 mL PBS/FBS/EDTA-buffer (kjøles ned 4 ° C) og kast avløpsvann.
- Fjern kolonnen separasjon fra det magnetiske feltet og legg den i en 15 mL tube. Elute av CD4+ celle fraksjon i 5 mL PBS/FBS/EDTA-bufferen ved hjelp av stempelet.
- Fyll røret med PBS og sentrifuger (300 x g i 10 min på 4 ° C). Fjerne nedbryting. Repeter dette vaskemaskin to ganger.
- Bestemme antall gitt celler ved en standardmetode for valg (f.eks Neubauer kammer).
-
Etiketten CD4+ T celler med et fluorescerende celle spredning fargestoff.
- Resuspend CD4+ T celler i PBS (opptil 107 celler/mL, bruker ikke mindre enn 500 µL av PBS).
- Forberede en 6 µM løsning av et rødt lys-nervøs celle spredning fargestoff (se Tabell for materiale) i PBS (pre oppvarmet til romtemperatur). Bland denne løsning 1:2 med den før forberedt celle suspensjon og vortex grundig (3 µM siste konsentrasjon).
- Inkuber i 10 min på 37 ° C (beskyttet fra lys). Etterpå legge fem mengder RPMI medium som inneholder 10% FBS og Inkuber i 5 min på is (beskyttet fra lys).
- Vask merket cellene tre ganger i RPMI medium som inneholder 10% FBS (sentrifuge på 300 x g for 10 min på 4 ° C). Resuspend merket celler i PBS, lagre på is og beskytte mot lys før bruk.
Merk: Langvarig lagring av celler (> 60 min) kan ha en negativ innvirkning på celle overlevelse.
Tilleggsutstyr: Bestemme renheten av CD4+ celle brøk og effekten av merking prosedyren av flowcytometri. Resuspend 0.5 x 106 til 1 x 106 CD4+ celler i 100 µL bufferen (1% FBS, 2 mM EDTA i PBS) og legge til en anti-CD4 antistoff kombinert med et fluorescerende fargestoff valgfrihet. Inkuber i 30 min på 4 ° C. Legg 1 mL buffer og sentrifuger (300 x g i 10 min på 4 ° C). Kast nedbryting. Fortsette med cytometric måling av prøven (representant resultatet er avbildet i figur 1B, C).
3. adoptively overføre menneskelige CD4+ T celler i Papain-eksponerte mottakerens Mmice
Merk: Se figur 1A et sammendrag av i vivo utført eksperimentelle prosedyren. Utføre celle overføring dagen etter siste intranasal administrasjonen av papain.
- Justere suspensjon av fluorescently merket menneskelige CD4+ T celler (trinn 2.3.4) til en konsentrasjon av 1 x 107 celler/mL i PBS. Fylle 100 µL av cellen suspensjon i en 1 mL/30 G-sprøyte.
- Forsiktig plassere den første papain-eksponerte C57BL/6J mus (trinn 1,1-1,3) til en tilbakeholdenhet enhet for hale blodåre injeksjon. Bruke forberedt sprøyten (trinn 3.1) å punktere hale venen og sakte injisere 100 µL av cellen suspensjon som inneholder 1 x 106 merket menneskelige CD4+ celler. Ikke umiddelbart dra ut pinnen etter injeksjon, men vente i ytterligere 5 sekunder for å hindre utslipp av cellen suspensjon.
- Slipp museknappen fra tilbakeholdenhet enheten og fortsette med neste dyret. Holde minst ett papain-eksponerte dyr, som gjennomgår overføring fluorescently merket cellene som negativ kontroll for lys arks fluorescens mikroskopi.
4. forberede lungevev lys arks fluorescens mikroskopi
Merk: Følgende utføres 3t etter overføring av fluorescently merket menneskelige celler (trinn 3.2). Den beskrevne eksperimentelle prosedyrer inkludert høsting av lungevev, var fiksering og løsemiddelbaserte vev fjerne tilpasset fra som beskrives protokoller24,28.
- Ofre musen for karbondioksid (C02) innånding.
-
Perfuse lunge i situ med PBS inneholder 5 mM EDTA.
- Åpne thorax via kutte langs sternum å avsløre hjertet. Vises punctate høyre ventrikkel med en 21 G kanyle koblet til et kateter.
- Åpne venstre ventrikkel ved å klippe og dermed la blod og perfusjon væske ut. Sakte perfuse lunge med 20 mL iskald PBS inneholder 5 mM EDTA via kateter.
- For å utføre i situ fiksering av lunge, må du ikke fjerne kateter fra høyre ventrikkel. Sakte perfuse lunge med 2 mL iskald 4% paraformaldehyde (PFA) løst i PBS. Fjern kateter og kanyle.
Merk: PFA-basert i situ fiksering av lungevev representerer en veletablert teknikk for å forberede murine lungevev påfølgende mikroskopisk analyse29,30.
Forsiktig: PFA er giftig og må håndteres under hette med forsiktighet. -
Fylle lungene med 0,75% agarose på stedet.
- Forberede 0,75% agarose i PBS og holde den fast ved 50 ° C i en thermo-shaker før bruk. Fjerne spyttkjertler museklikk, kuttet sternohyoidus muskelen og utsette luftrøret ved å skyve en tang under.
- Avbryte eksponert luftrøret med en 30 G nål og erstatte den med en stump 30 G kateter for å hindre ytterligere skade av trachea resulterer i uønskede lekkasje av agarose. Forsegle krysset mellom den innsatte kateter og luftrøret bruker en nål holder.
Tilleggsutstyr: Kombiner Her beskrives fremgangsmåten med BAL samling analysere infiltrere menneskelige celler i BAL som nylig beskrevet i detalj31 (se figur 2E representant resultater). - Omhyggelig fylle luftveiene med 0,75% agarose (avkjølt til kroppstemperatur) via kateter til fullstendig unfolding av lunge; Vent til fullstendig herding av agarose. Fjern kateter og nøye innhøsting lunge i et mørkt 2 mL rør fylt med 4% PFA.
- For ekstra fiksering ruge eksemplet i 4% PFA løst i PBS for 2t 4 ° c under kontinuerlig rotasjon (31 rpm).
- Tørke vev av senere rugende prøven under kontinuerlig rotasjon (31 rpm) på 4 ° C i 50% etanol (pH 9), 70% etanol (pH 9) og 100% etanol; hvert trinn minst 4 h. På slutten, kan du utføre en andre inkubasjon i frisk 100% etanol 4 h.
- Utføre løsemiddelbaserte clearing av vevet bruker ethyl cinnamate (ECi). Derfor overføre prøven til ECi. Ruge over natten i romtemperatur (under konstant rotasjon) til vevet vises gjennomsiktig (se figur 1D for representant bilder).
Merk: Prøver lagret i ECi ved romtemperatur (beskyttet fra lys) er stabile over flere uker til måneder.
5. utføre lys arks fluorescens mikroskopi av Wwhole murint lunge Lobes
Merk: Se Tabellen for materiale for detaljer om lys arks fluorescens mikroskopet og tilhørende programvare, som er basert på følgende. Sammenlignbare systemer fra andre produsenter, men kan brukes også med utvikler-spesifikke endringer av følgende protokollen. Før du starter, bli kjent med mikroskop-spesifikke bruksanvisningen og følg de tekniske instruksjonene av ansvarlig person på området.
-
Sette opp lys arks mikroskopet.
- Slå på lyset arks mikroskopet og åpne de tilhørende bildebehandlingsprogramvare på datamaskinen. Fyll utvalget kammeret med filtrerte ECi (100 µm filter) og plasserer den i sin posisjon mellom laserstråler.
- Bruk en liten dråpe organisk løsemiddel-stabil lim til å holde lungene for eksempel innehaveren. For å holde den nødvendige gjennomtrenging dyp på lys-arkene så liten som mulig, angi lunge lobe oppreist. Deretter plass prøven holderen i sitt kammer.
- Angi brytningsindeks av målet til 3.5 ved ECi som fjerne reagens.
-
Juster innstillingene i lys arks mikroskopet å oppdage menneskelige celler i sammenheng med hele orgel.
- Velg nødvendig lasere (filter for måling > aktivere boksene nødvendig lasere) og velg riktig intensitet i Kontrollprogramvaren (laser overføring kontroll > Bruk glidebryteren til å angi laser intensitet > bruke). Bruke en eksitasjon bølgelengden til 488 nm (525/50 filter) å oppdage autofluorescent lungevev og 640 nm (680/30 filter) å opphisse menneskelige celler merket med en fluorophore som slipper ut i rød spekteret.
- Fokuser på prøven spent på 488 nm og tilpasse fokus via verktøyet "kromatisk korreksjon" på eksitasjon bølgelengde på 640 nm (bruke glidebryteren til å stille kromatiske korreksjon > bruke).
- Velg en passende zoomfaktor; Bruk en lav forstørrelse oversikt (f.eks 6.3 x) til fordelingen samlede merket celleområde i lungevev og forstørret bilder (f.eks 32 x) for detaljert lokalisering.
- Velg et ark bredde jevnt Klargjørende hele organ eller en bestemt del av interesse (optikk > Bruk glidebryteren til å angi ark bredde, vanligvis mellom 20-40%). Definere ark numeriske blenderåpning (NA) med høyere NA lage skarpere bilder (optikk > Bruk glidebryteren til å angi ark NA, for en murine lunge flik utvidet fysiologiske størrelse en NA 0.025% ofte brukes).
- Velg antall lys-ark brukes under "Avansert måling innstillinger". Ved toveis belysning, flette venstre og høyre lys-ark for å lage en homogenously opplyst bilde (Avansert > flette lightsheets > Velg blanding modus > bruk glidebryterne til å definere overlapping mellom arkene lys-).
Merk: Det anbefales å utnytte toveis belysning av prøven med tre lys-ark hver.
Tilleggsutstyr: For å ytterligere øke bildekvaliteten, kan du bruke dynamisk fokus operasjonen. Kan flytte fokuset i x-retningen under bildeopptak. - Definer start- og sluttposisjonen i z-stabelen målt og angi trinn til 5 µm (xyz tabell Z > skanneområde).
Merk: Start- og sluttposisjonen av en z-stabel, avhenger av størrelsen og plasseringen av lunge lobe innenfor eksempel kammeret. Imidlertid er om 300 til 800 z-stabler vanligvis ervervet for en enkelt lunge flik (5 µm trinn størrelse). - Lagre filer ved hjelp av innstillinger for automatisk lagring og start måling for å ta bilder. Etter endt datainnsamling, rengjør ECi forurenset eksempel holderen og kammer under rennende vann.
Merk: Bruke de samme innstillingene for bilde flere lunge fliker som skal sammenlignes etterpå.
6. etter image bearbeiding og kvantifisering av lunge-akkumulert menneskelige celler
Merk: Se Tabellen for materiale for detaljer på etter bildebehandling programvare for 3D analyse, som er basert på følgende. Alternativ stolpe-tenkelig programvare kan imidlertid brukes også.
- Laste det første bildet i en z-stabel (aktivere knappen Overgå, fil > Åpne > Velg bilde) for å starte åpning av alle andre bilder av valgte z-stakken og deres automatisk 3D rekonstruksjon.
- For å sikre riktig visning av x, y og z dimensjoner, sjekk voxel størrelser og justere dem om nødvendig (Rediger > image egenskaper > Angi voxel størrelse manuelt). Voxel størrelsen på z, angi den valgte trinnet størrelsen mellom to bilder (her 5 µm).
- Vise hver kanal i en distinkt farge (Rediger > Vis skjerm justering). Klikk på hver kanal en etter en å definere en fargen ( figur 2A, B, C, D autofluorescence signalet vises i grått og merket menneskelige CD4+ celler i rødt).
- Justere intensiteten, svart nivå og kontrast for hver kanal (Rediger > Vis skjerm justering) ved hjelp av trekantene i kanalen barer eller skrive inn nøyaktige tall i kanalene innstillingene. Intensitet justering, bruke rettvinklet trekant. Svart nivå justering, Bruk venstre trekanten og kontrast justering, bruke den midtre trekanten.
Merk: Bruk lungene avledet fra kontroll musen uten celle transfer (trinn 3.3) til å skille mellom bestemte menneskelige celle-avledet signaler og uspesifikke bakgrunn. -
For å kvantifisere merket celler i lunge vev bruk "Legg nye flekker" på verktøylinjen og velg "hoppe automatisk oppretting, redigere manuelt" for manuell celle opptelling.
Merk: også bruke automatisk cellen telling verktøy under "spots". Men lar manuelle telle for å skille mellom bestemte og uspesifikke signaler mer presist.- For å sammenligne akkumulering av menneskelige celler over forskjellige prøver, definere en lunge kube med et bestemt volum bruker 3D skjærende verktøy (Rediger > beskjære 3D) (her 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
- Telle akkumulert celler Velg 640 nm kanalen og definere en radius skala på 10 µm. Klikk på "Rediger", sjekk "Velg" pekeren menyen og merke hver celle med en prikk via Skift-klikk med venstre museknapp. Finn det totale antallet telte celler vises i statistikken.
Merk: Det anbefales å telle flere kuber per lunge lobe (her fem) å sikre at resultatene og kompensere for forsker-avhengige utvalg av telt lungevolumet (kvantifisering strategi og representant resultatene vises i Finne 2D).
- Ta et bilde ved hjelp av verktøyet "øyeblikksbilde" og/eller ta en video med verktøyet "animasjon". Lagre justert filer som .ims-filer (Fil > Eksporter).
Merk: Til representative formål, vise eller skjule rammen ved å merke av eller fjerne rammen i verktøylinjen. I tillegg vise bilder som maksimal intensitet projeksjon (MIP) (verktøylinjen > volum > modus > Sjekk MIP) eller bruke 'overflate modus' (verktøylinjen > Legg nye overflater). 'Overflate modus' har å bli aktivert separat for hver kanal å markere vev arkitektur og/eller cellen legemer (representant bilder er vist i figur 2C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Presentert protokollen beskriver en eksperimentell musemodell, hvilke innrømmer overvåking og kvantifisere akkumulering av adoptively overførte menneskelige T-lymfocytter i lungene via lys arks fluorescens mikroskopi. Figur 1 A gir en skjematisk oversikt i vivo trinnene av eksperimentelle planen. For å garantere pålitelige resultater, det er av vesentlig betydning å sikre god kvalitet av den isolerte og fluorescently merket menneskelige CD4+ T celler, som etterpå vil bli overført til mus. Som representatively avbildet i figur 1B, C, ovenfor beskrevet prosedyren for microbead-basert celle berikelse og påfølgende fluorescens-merking vanligvis resulterer i en flyt cytometrically bestemt CD4+ T celle renhet > 95% og vellykket fluorescens-merking av alle CD4+ T celler. Kvalitet og penetrasjon dybden av lys arks fluorescens mikroskopi er kritisk avhengig av en passende karakter av vev clearing. Som vist i figur 1D, kunne her brukte protokollen for ECi-baserte vev fjerne garantere høy orgel åpenhet, som indikerer en vellykket brytningsindeks tilsvarende. Endelig er en representant samlede resultatet av beskrevet eksperimentelle protokollen i form av fullstendig behandlet lys arks fluorescens mikroskopi bilder vist i figur 2B, C, D og Supplerende Video. Autofluorescent signalet (vises i grått) gir et nyttig verktøy for imaging anatomiske strukturen i lungene. Røde signalet representerer lungene akkumulert menneskelige CD4+ T celler. Kvantifisering av lys arks fluorescens mikroskopi imaging kan bestemme totalt antall lunge akkumulert menneskelige CD4+ T celler per definert område av betent lungevev. En strategi for kvantifisering av human celle infiltrasjon er illustrert i figur 2E. (Valgfritt) flyt cytometric påvisning av fluorescently merket celler i BAL mottaker mus, som vist i figur 2F, kan brukes som en ekstra teknikk for å bekrefte vellykket vev migrering av adoptively overført CD4+ T celler. Videre preferanse for overførte menneskelige T celler for selektiv akkumulering i betente lungevev i her beskrevet eksperimentelle innstillingen var videre støttet av faktum at menneskelige CD4+ T celler kan ikke hentes i tarmen mottaker dyr som avbildet i figur 2B (høyre panel).
Figur 1 : Skjematisk oversikt over i vivo eksperimentelle arbeidsflyten. (A) allergisk lungebetennelse ble indusert i C57BL/6J mus ved inhalasjon av papain (50 µg/mus) på tre påfølgende dager (d0, d1 og d2). Den neste dagen (d3), fersk isolert og fluorescently merket menneskelige CD4+ T celler ble adoptively overført til mus via hale blodåre injeksjon. Etter en annen tre timer, ble mus ofret, etterfulgt av i situ perfusjon og fiksering av lungene. Endelig var lungene explanted og videre analysert ex vivo av lys arks fluorescens mikroskopi. BAL kan eventuelt samles før lunge explantation utføre utvidet ex vivo analyser av vellykket extravasated og overførte menneskelige celler. (B) representant histogrammet bekrefter renheten av de isolerte CD4+ T celle brøkdel som bestemmes av flowcytometri. Celler farget av en anti-CD4 antistoff eller isotype kontroll vises i svart og grå, henholdsvis. (C) representant histogrammet bekrefter effekten av fluorescens-merkingen av menneskelig CD4+ celler før adopsjon overføring. (D) representant bilder av en parfyme murine lunge flik før og etter avregning med ECi. FI fluorescens intensitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant analyse av lunge akkumulering av menneskelig CD4+ celler i sammenheng med lunge-betennelse i vivo. Menneskelige CD4+ celler ble isolert fra perifert blod bruker tetthet gradert sentrifugering etterfulgt av et magnetisk microbead-baserte rensing skritt. Menneskelige CD4+ celler ble merket bruker et rødt lys-nervøs celle spredning fargestoff og injiseres intravenøst papain-eksponerte C57BL/6J mus. Etter tre timer, ble mus ofret for å samle og analysere lungevev via lys arks fluorescens mikroskopi. (A) representant oversikt over en 3D rekonstruksjon av murine, papain-utsatt lungevev (grå) tre timer etter intravenøs injeksjon av merket menneskelige CD4+ celler (rød) som er registrert av lys arks fluorescens mikroskopi. (B) lungevev mottaker museklikk tre timer etter celle overføring vises som oversikt eller forstørring segment (venstre panel). Hentet menneskelige CD4+ celler kan visualiseres som røde signaler og var enten avbildet i overlegg med autofluorescence signalet av lungevev eller som én kanal. For å bekrefte spesifisitet av oppdaget, var kontrollen lungevev uten intravenøs celle transfer negative Kontrollpanel (midten). I motsetning til lungevev, ingen merket menneskelige CD4+ celler (rød) ble oppdaget i ileum av samme mottaker musen (høyre panel). (C) innlegget bildebehandling tillater analyse av enkelt skiver av lungevev samt generasjon 3D rekonstruksjoner av hele organ segmentet at kan enten vises som maksimal intensitet projeksjon (MIP) eller i overflaten modus. Representant bilder er avbildet. (D) kvantifisering strategi er illustrert exemplarily i samme lungene som allerede avbildet i figur 2A. Definerte kubene på analysert lunge segmentet ble valgt og antall menneskelig CD4+ celler (rød) ble kvantifisert for hver kube. Resultatene av en senere utført kvantifisering (arrangementer/813 µm x 813 µm x 1,000 µm kube) er angitt som gjennomsnittlig ± SEM. (E) som i tillegg flyt cytometric oppdagelsen av fluorescently merket menneskelige T-celler i BAL mottaker dyr kan være for å bekrefte vellykket vev migrering av akkumulert menneskelige CD4+ T celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Video: Representant videosekvensen viser akkumulert menneskelige CD4+ celler i murine lungevev. 3D rekonstruksjon av murine lunge viser akkumulert menneskelige CD4+ celler (rød) innenfor rammen av lunge vev (grå) tre timer etter intravenøs injeksjon i halen venen. Bilder vises som MIP i begynnelsen og i overflaten til slutt. Bilder ble ervervet via lys arks fluorescens mikroskopi og behandlet av etter bildebehandling programvare for 3D Analyser. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives eksperimentelle innstillingen gir mulighet til å overvåke homing lungekapasitet av primære menneskelige immunceller under i vivo inflammatoriske tilstander og dermed relevantly utfyller klassisk utført i vitro vedheft og chemotaxis analyser. Ta i kontoen bestemte anatomiske orgel kjennetegner lungene, viktige aspekter av immun celle homing (inkludert chemotaxis og celle distribusjon i målet orgel) samt kliniske relevans og overdragelse av ervervet data, vi tok nytte av tre tekniske viktige funksjoner: (1) analyse av primære menneskelige celler innenfor en levende murine organisme; (2) papain-mediert induksjon av lungebetennelse; og (3) lys arks fluorescens mikroskopi av ryddet lungevev.
Selv om funksjonelle studier av adoptively overført menneskelige kan immunceller i en levende murine organisme være begrenset i deler på grunn av potensielt relevant inkompatibilitet i reseptor-ligand-interaksjoner mellom mus og menn, det generelle begrepet humanized musen modeller er etablert som et viktig eksperimentelle verktøy innen translasjonsforskning medisin i løpet av de siste tiår24,32,33,34,35 . Sammenlignet med klassisk dyremodeller, tilbyr studier i humanized mus fordelen direkte analysere pasient-avledede immunceller i en i vivo scenario, og dermed å identifisere funksjonelle endringer preget av sykdommen32, 36,37. Angående relevansen av mulige uoverensstemmelser mellom definert reseptorer på overflaten av menneskelig immunceller og deres respektive murine ligander eller omvendt, tidligere studier allerede angitt som menneskelig CD4+ T celler er i stand til å samhandle effektivt med murine vedheft molekyler MAdCAM-1 og VCAM-1, som representerer avgjørende ligander integrin-mediert lymfocytt homing32. Følgelig blokkeres overføringen av intravascularly overførte menneskelige immunceller i murine tarmen tissue vellykket i vivo av behandling med klinisk brukte α4β7 integrin antistoff vedolizumab32. Men selv i tilfelle at en bestemt reseptor-ligand-interaksjon relevans kan vise en fullstendig menneske/murint konflikt, det vil antagelig være mulig å overkomme denne begrensningen av genteknologi og for eksempel av transgene overuttrykte i respektive menneskelige ligand, vekstfaktor, cytokin eller reseptor i murine organisme33,35.
Som en betydelig innflytelse av kronisk betennelse på lokale utskillelsen av chemokines, har endothelial uttrykk for vedheft molekyler og påfølgende akkumulering av lymfocytter blitt beskrevet i mange publikasjoner38,39 ,40, valg av riktig eksperimentell modell av lungebetennelse representert en kritisk trinn mens etablerer ovennevnte beskrevet protokollen og kan være tilpasset avhengig av klinisk sammenheng med hver enkelt studie. Her valgt innstilling av papain-indusert allergisk lungebetennelse representerer en godt beskrevet eksperimentell modell, som er basert på kapasiteten til lokalt administrert cystein protease papain å irritere luftveier epitel og utløse de senere utgave av alarmins27,41,42. Interessant, er utilsiktet exposition til papain kjent for å forårsake astma utvikling hos mennesker som godt43. Avhengig av inhalert dose papain, eksponert mus viser en opphopning av medfødte og adaptive immunceller og forhøyede nivåer av type 2 cytokiner i lunge27. Mens dose opptrapping viste seg resultatet i en utvidelse av airspaces (klassisk histologiske fenomen av COPD) og en ødeleggelse av blod fartøy vegger med påfølgende blødning, gikk moderat dosering tidsplaner sammen med en fremtredende lunge eosinophilia og dermed etterlignet en viktig histologiske funksjon menneskelige astma27. Vårt formål var å bruke denne eksperimentell modell for å generere en inflammatorisk kontekst for analyse av lunge immun celle homing, prøvde vi nøye å unngå papain forårsaket skader på blodkar, noe som ellers et resultat i en unphysiological bloduttredelse av menneskelig immunceller på grunn av forstyrret endothelial integritet. Derfor valgte vi en mellomliggende dose av 50 µg av papain per musen per dag i ovenfor beskrevet protokollen. Selv om utviklingen av papain-indusert airway betennelse oppstår også i fravær av B og T-lymfocytter, lunge infiltrere adaptive immunceller er kjent til betydelig innvirkning på løpet av sykdom27,42. For eksempel, kan regulatoriske T celler bli identifisert som potent regulatorer papain-indusert airway eosinophilia27. I perspektiv, aktivt engasjement av lunge lymfocytter i inflammatorisk patogenesen papain-eksponerte mus impliserer at ovenfor beskrevet protokollen kan i tillegg aktivere analysere den funksjonelle kapasiteten til adoptively overført og lykkes lunge-samlet menneskelige immunceller modulerer lunge patologi (f.eks via flyt cytometric oppkjøpet av eosinophilic teller i BAL). Videre kan en i tillegg utføres intranasal administrasjon av valgte sykdom relevante menneskelige chemokines like før intravascular celle overføring kunne analysere virkningen av disse humoral meglere på lunge homing prosessen med forskjellige mennesker immun celle populasjoner i i vivo omgivelser. Likeledes, effekten av hemmere på lunge homing prosessen og, senere, på inflammatorisk lunge patologi kan studeres.
En spesiell fordel her introduserte eksperimentelle prosedyren er presis sporing og lokalisering av lunge infiltrere menneskelige immunceller av avansert tenkelig kvaliteten på lyset arks fluorescens mikroskopi. Nyere studier vist allerede at teknikken av lys arks fluorescens mikroskopi representerer et verdifullt eksperimentelle verktøy for analyse av intestinal immun celle homing inn IBD translasjonsforskning og kan overvinne viktigste begrensningene til konvensjonelle immunofluorescence mikroskopi og flyt cytometri24,32. Mens analyser basert på konvensjonelle mikroskopi er vanligvis begrenset til en veldig liten og potensielt ikke representative område av orgel og flyt cytometri tar ikke hensyn aspekt av vev organisasjon, lys arks fluorescens mikroskopi av kjemisk ryddet vev lar en økt gjennomtrenging dyp uten store tap av oppløsning og dermed muliggjør en 3D rekonstruksjon av ganske stort orgel deler (opp til 1,5 cm x 1,5 cm)24,28,44. For at kvaliteten og gyldigheten av ervervet 3D rekonstruksjoner til kritisk avhengig ytelsen vev klaring. Her beskrives innstillingen inkludert vi en litt vedtatt versjon av den nylig publiserte protokollen for ECi-baserte vev fjerne44. Sammenlignet med andre godt etablert strategier for løsemiddelbaserte vev fjerne26,kombinerer45,46, ECi-baserte protokollen fordelene med utmerket clearing egenskaper, lav toksisitet av brukte reagenser og en moderat gang kravet44. Som standard lys arks fluorescens mikroskopi løse fineste vev strukturer som alveolar kapillærene er fortsatt begrenset selv under optimale fjerne betingelser28, kan liksom det vanskelig å skille pålitelig mellom intravascular og allerede extravasated immunceller. Inkludering av en ekstra standard fluorescens-baserte blodkar flekker i her beskrevet protokollen være sannsynligvis ikke i stand til fullt overvinne denne begrensningen. Dermed kan studier med særlig fokus på oppførselen til immunceller i lunge mikrosirkulasjonen eller deres diapedesis fortrinnsvis ta hensyn til en nylig publisert og svært elegant protokoll for intravital lunge imaging basert på 2-fotonet mikroskopi47. I denne eksperimentelle innstillingen, et thorax vindu ble implantert i bedøvet og ventilert mus, som stabilisert lungene kan overvåkes av en resonant-skanning 2-fotonet mikroskopi modul, slik at høy-resolution tenkelig gjennom den åndedretts syklus på bevarte ventilasjon og perfusjon47,48. Denne teknikken har vært anvendt i ulike studier og klarte å visualisere eksempelvis intrapulmonary Platederivert biogenesis og lunge inngangen sirkulerende tumor celler49,50. Men foruten kravet til avansert instrumental utstyr (f.eks mus ventilasjonssystem) og behov for omfattende invasiv manipulasjoner i levende dyr (implantasjon i thorax vinduet og intravital mikroskopi), den viktigste begrensningen Dette live lunge er mikroskopi systemet begrenset z penetrasjon. Utført lunge overflaten avbilding tillater bare analysere den ytre 100 µm subpleural lunge vev47,48. Avhengig av den vitenskapelige sammenhengen, det kan være en verdifull mulighet til å implementere 2-fotonet mikroskopi i explanted lungene som en ekstra prosedyre i ovenfor beskrevet protokollen. Analysere samme lungene først ved 2-fotonet mikroskopi og etterpå lys arks fluorescens mikroskopi kan representere en strategi for å få en kvantitativ oversikt over distribusjon og lokalisering av menneskelig immunceller i murine lunge ( lys arks fluorescens mikroskopi) og samtidig, få mer innsikt i mobilnettet eller mikrovaskulær prosesser (2-fotonet mikroskopi). Faktisk representerer 2-fotonet mikroskopi av murine tracheal explants et etablert avbildningsverktøy for å analysere immun celle oppførsel i konteksten av eksperimentelt indusert lunge betennelse51,52. I stedet for å visualisere små lunge kapillærene, kan vellykket bloduttredelse og lunge vev infiltrasjon av de overførte menneskelige T-cellene i eksperimentell modellen også være bevist av oppdager fluorescently merket menneskelige celler i BAL mottakeren dyr via flowcytometri som exemplarily avbildet i figur 2E. Generelt, representerer analyser av mobilnettet BAL kupé en etablert metode for å karakterisere lunge immun celle tilstrømningen i sammenheng med inflammatorisk luftveissykdommer31. Endelig en annen flyt cytometric strategi for kvantifisere bloduttredelse av adoptively overførte immunceller i lungevev ble beskrevet av Galkina et al. (2005)53 og kan potensielt bli kombinert med her beskrevet protokollen. I studien av Galkina et al., en enkelt intravenøs injeksjon av en fluorescens-konjugerte anti-CD8 antistoff kort tid før resection av lunge resulterte i en eksklusiv og fullstendig merking av før overført CD8+ T celler i lungene vaskulære kammer, mens allerede extravasated CD8+ T celler i lunge interstitium forble unstained kvinne. Etterfølgende analyser av i vivo merket lunge immunceller var utført flyt cytometrically etter ex vivo fordøyelsen av lunge vev53. Selvfølgelig, betyr vev fordøyelsen at anatomiske separasjon mellom intra- og ekstravaskulær overvåking av lunge kupeen er avskaffet, og dermed er det en generell risiko for falske positive merking av interstitiell immunceller på grunn av antistoff lekkasje mellom begge deler. Denne risikoen kan bare reduseres ved å utføre vev fordøyelsen i nærvær av Mette mengder umerkede antistoff53 eller muligens ved å erstatte flyt cytometric analyse av lys arks fluorescens mikroskopi, som gjør det mulig å helt unngå ødeleggelse av vevet struktur.
Oppsummert her innført kombinasjon av i vivo homing av fluorescently merket primære immunceller og påfølgende lys arks fluorescens mikroskopi er pålitelig identifisere, kvantifisere og lokalisere lunge akkumulert menneskelige immunceller i en eksperimentell musemodell av lungebetennelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MF Neurath har fungert som en rådgiver for Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda og Boehringer. Gjenværende forfatterne avslører ikke konflikt.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner takknemlig støtte av DFG samarbeidende forskning sentre SFB 1181 og TRR 241. Optisk tenkelig sentrum Erlangen (OICE) og i bestemt Ralf Palmisano, Philipp Tripal og Tina Fraaß (Project Z2 av DFG CRC 1181) er anerkjent ekspert kundestøtte for lys arks fluorescens mikroskopiske bildebehandling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
| AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
| Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
| Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
| Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
| CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
| Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
| Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
| Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
| FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
| Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
| Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
| ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
| Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
| LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
| Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
| 30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
| Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
| Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
| LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) | anprotec | AC-AF-0018 | |
| Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
| PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
| PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
| Syringe 1 mL | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
| Syringe 5 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
| Syringe 20 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
| Tube 1.5 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
| Tube 2 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
| Tube 2 mL, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
| Tube 15 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
| Tube 50 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
| Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |
References
- Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
- Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
- Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
- Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
- Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
- Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
- Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
- Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
- Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
- Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
- Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
- Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
- Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
- Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
- Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
- Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604 (2014).
- Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
- Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
- Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
- Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
- Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
- Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
- Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
- Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
- Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
- Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
- Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
- Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
- Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707 (2017).
- Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
- Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
- Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
- Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
- Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
- Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
- Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
- Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513 (2015).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
