Summary
Här introducerades protokollet tillåter karakterisering av den målsökande lungkapacitet av primära humana lymfocyter under Invivo inflammatoriska tillstånd. Pulmonell infiltration av adoptively överförda mänskliga immunceller i en musmodell av allergisk inflammation kan avbildas och kvantifieras av ljus ark fluorescensmikroskopi av kemiskt clearade lungvävnad.
Abstract
Överväldigande vävnadsansamling av starkt aktiverade immuncellerna representerar ett kännetecken för olika kroniska inflammatoriska sjukdomar och framträtt som ett attraktivt terapeutiska mål i kliniska hanteringen av drabbade patienter. För att ytterligare optimera strategier som syftar till terapeutiska reglering av patologiskt obalanserad vävnad infiltration av pro-inflammatoriska immunceller, blir det särskilt viktigt att uppnå förbättrade insikter till sjukdom - och organ-specifika perifera lymfocyter homing egenskaper. Här beskrivs experimentella protokollet tillåter för att övervaka lung ackumulering av fluorescently märkta och adoptively överförda humana lymfocyter i samband med papain Exponeringsinducerad inflammation. Till skillnad från in vitro-standardanalyser som ofta används för analys av immunceller migration och Kemotaxis, nu introducerade Invivo inställningen tar konto lung-specifika aspekter av vävnad organisation och påverkan av komplexet inflammatoriska scenario som äger rum i den levande murina organismen. Dessutom tredimensionella tvärsnittsdata ljus ark fluorescens mikroskopbilder ger inte bara kvantitativa uppgifter om infiltrera immunceller, men också skildrar mönstret av immunceller lokalisering inom inflammerad lungan. Sammantaget kan vi införa en innovativ teknik för högt värde för immunologisk forskning i fältet av kroniska inflammatoriska lungsjukdomar, som lätt kan tillämpas genom att följa protokollet angivna steg för steg.
Introduction
Klassiska inflammatoriska sjukdomar i lungorna, såsom allergisk astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), är väl känt att drivas av en ökad rekrytering av aktiverade lymfocyter in i pulmonell vävnad1,2. Lymfocyter-släppt cytokiner (t.ex., IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ och TNF-α) ytterligare främja chemotaxis av medfödd och adaptiv immunceller, inducerar fibrotiska luftvägarna remodeling eller direkt skada på lungan parenkymet2. Hittills har är de underliggande mekanismerna som ansvarar för patologisk ansamling av lymfocyter i lungvävnaden ännu inte helt förstått. I analogi till vävnad-selektiva T cell imprinting beskrivs för tarmen och huden homing, pulmonell dendritiska celler (DCs) är självklart kunna prime perifera T-celler för förmånliga lunginfiltration, åtminstone delvis via induktion av CCR4 uttryck på den ytan av lymfocyter3. Förutom CCR4 kännetecknas luftvägarna-infiltrera T-celler också av ett särskilt ökat uttryck av chemokine receptorer CCR5 och CXCR3 jämfört med T-celler i perifert blod1,4,5. Övergripande, befintliga data är konsekventa med begreppet att lungan homing av T-lymfocyter fysiologiska eller inflammatoriska villkor omfattar ett antal olika chemokine receptorer och deras respektive ligander och därmed beror ytterst på en nära kontrollerade samarbete mellan medfödd och adaptiv immunceller1. Särskilt under den inledande fasen av patogen eller allergen exponering svarar celler av det medfödda immunsystemet TLR stimulering eller IgE-medierad cross-linking av omedelbar frigivning av olika chemoattractants, som LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 och PGD21,6,7. Som ett paradexempel, samspelet mellan PGD2 och korrektiv receptorn CRTh2 är kända för att vara av särskild betydelse för chemotaxis av Th2-celler och således synts så lovande terapeutiskt mål i kliniska hanteringen av astma. Faktiskt, patienter med måttlig astma visade en förbättring av symtom och en betydande ökning av forcerad exspiratorisk volym under en sekund (FEV1) efter behandling med selektiva CRTh2 antagonist jämfört med placebo gruppen8 ,9. I en mer avancerad tillstånd av den inflammatoriska reaktionen är redan rekryterade T celler att ytterligare förstärka pulmonell lymfocyter ackumulering via frisättningen av IL-4 och IL-13 som potenta stimuli för pulmonell DCs. Därefter uppreglera dessa myeloisk-derived medfödda celler uttryck för CCL17 och CCL22 i en STAT6-beroende sätt1,10,11. Trots komplexiteten i det beskrivna scenariot försvårar fortfarande en fullständig förståelse av T-cell lung homing, erbjuder det en uppsjö av molekylära mål för en potentiellt optimerad terapeutisk kontroll av inflammatoriska eller allergiska sjukdomar. Därför finns det ett akut behov av innovativa experimentella metoder, som har möjlighet att ytterligare fördjupa och komplettera vår kunskap inom T cell Kemotaxis och lung homing.
På grund av att lungorna homing av lymfocyter i kroppen påverkas av flera cellulära och humorala fysiska parametrar1, är de flesta av de befintliga experimentella metoderna inte kunna modellera hela komplexiteten i denna immunologiska process. Istället, fokusera många standardprotokoll för analys av lung homing selektivt på en särskild aspekt som är inblandade i kaskaden av lymfocyter attraktion, vidhäftning, migrering och lagring. Förutom en rent beskrivande bestämning av mRNA eller protein uttrycksmönstret av integriner och chemokine receptorer på perifera eller lung-infiltrera lymfocyter och kompletterande mätning av respektive chemokine nivåer i blod, bronkoalveolär lavage (BAL) eller pulmonell vävnad12,13,14,15, väletablerade in vitro rapportör cell kultur analyser tillåta en funktionell karakterisering av lymfocyter vidhäftning eller chemotaxisna vid definierade försöksbetingelser16,17,18. I princip övervaka statiska in vitro-vidhäftning analyser bindande kapacitet av odlade lymfocyter till en endothelial enskiktslager eller objektglas bestruket med rekombinant endothelial adhesionsmolekyler (t.ex. MAdCAM-1, VCAM-1), medan standard in vitro- chemotaxis analyser används vanligtvis för att kvantifiera lymfocyter förmåga att migrera längs en chemokine övertoning i en transwell system19. Båda in vitro-inställningarna aktivera en kontrollerad justering och modulering av experimentella förhållanden, men å andra sidan saknar viktiga variabler känd som kritiskt inverkan på Invivo Kemotaxis och vidhäftning av lymfocyter. Huvudsakligen, statisk cell kultur analyser bortse från påverkan av skjuvning krafter orsakade av den permanenta blod flöde19 och försumma potentiellt den omgivande immunologiska miljö och samverkande icke-lymfocyter immunceller, engagemang båda finns i en levande organism. För att övervinna dessa begränsningar, tolkning av resultat som förvärvats i statiska in vitro-chemotaxisna eller följsamhet analyser behöver ytterligare validering i dynamiska vidhäftning experiment under flöde villkor20,21 och i i vivo modeller av inflammatoriska orgel patologi19. Ja, viktiga slutsatser om regleringen av T-cell lung homing inflammatorisk eller allergisk villkor kunde dras från djurstudier analysera genetiskt modified möss i definierade modeller av olika lungsjukdomar3, 22 , 23. kvantitativ jämförelse av lung infiltrera lymfocyter mellan vildtyp möss och möss med en brist för en specifik gen av intresse utgör ett väletablerat och i stort sett används verktyg för att definiera effekterna av särskilda cellulär vägar eller receptorer på sjukdomen-driven mönster av T-cell distribution. I kontrast till innan diskuteras in vitro rapportör cell kultur analyser, saknar en studiedesign baserad på klassisk djurmodeller dock förmågan att analysera och övervaka primära humant T-celler som direkt härrör från blod eller BAL av patienter som lider en inflammatorisk lungsjukdom sjukdom. Alltså, det är fortfarande utmanande att funktionellt verifiera om ett diagnostiskt angivna lungsjukdom är kunna avtryck mänskligt lymfocyter för förmånliga lung tropism och hur långt kliniska parametrar kan påverka på detta scenario. Nyligen infördes ett mycket elegant Invivo synsätt i samband med inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), som kunde övervinna de flesta av dessa begränsningar och öppnat nya vägar för avancerade translationella studier på intestinal lymfocyter homing24 . Dra nytta av protokoll för lösningsmedelsbaserade vävnad clearing följt av tvärsnittsdata ljus ark fluorescensmikroskopi som ett kraftfullt imaging verktyg, var det möjligt att visualisera infiltration och distribution av adoptively överförda mänskliga T celler i tarmen colitic nedsatt immunförsvar möss24. I synnerhet denna experimentella inställning genomfört två viktigaste innovationer: (1) primär mänsklig immunceller kan analyseras på experimentellt fastställda Invivo villkor; (2) ett ganska stort område av sjuka organ (ca 1,5 x 1,5 cm) kan avbildas i högupplöst kvalitet, följt av 3D-rekonstruktion. Dessutom etablerat flera färska studier framgångsrikt användningen av lösningsmedel-baserade vävnad clearing och ljus ark fluorescensmikroskopi som viktiga verktyg för avancerad lungcancer imaging25,26. Utnyttja detta tekniska framsteg i pulmonell immunologi, antagit vi nu systemet för analys av lung homing.
Här presenteras protokollet ger en stegvis introduktion hur att rena och fluorescently etikett primära humant T-celler för överföring till möss med inducerad Exponeringsinducerad inflammation och, dessutom i detalj beskriver den efterföljande processen av ljus-ark fluorescens mikroskopbilder, inklusive orgel förberedelse och bildbehandling. Sammantaget hoppas vi kunna stödja framtida translationella studier av inflammatoriska eller allergiska lungsjukdomar genom att införa en sofistikerad, men ändå genomförbar, experimentell modell för övervakning av mänskligt lymfocyter lung homing på förhållandena in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experiment med djur utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av de berörda lokala myndigheterna i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Möss inkvarterades särskilda villkor patogenfria. Insamling av humanblod godkändes av den lokala etiska kommittén och den institutionella Granskningsnämnden av universitetet i Erlangen-Nürnberg. Varje patient gav skriftligt informerat samtycke.
1. framkalla allergisk lunginflammation hos möss
Obs: Som beskrivits i tidigare studier27, följande experimentella procedur gör att framkalla allergiska luftvägsinflammationer hos möss och följaktligen utlöser ansamling av medfödd och adaptiv immuna celler i BAL. Protokollet beskrivs har fastställts i C57BL/6J möss, men antagandet att andra standard inavlade stammar bör vara möjligt.
Se figur 1för en sammanfattning av Invivo experimentella förfarandet .
-
Söva möss av intraperitoneal injektion av Ketamin/xylazin.
Obs: bara använda C57BL/6J möss äldre än 6 veckor och med en kroppsvikt på minst 16 g.- Förbereda Ketamin/xylazin lösning i PBS (12 mg/mL Ketamin; 1,6 mg/mL xylazin) och fastställa exakta kroppsvikten av möss.
- Injicera den första musen med 8 µL/g kroppsvikt av Ketamin/xylazin lösning intraperitonealt och bekräfta djup anestesi via avsaknad av tass nypa reflexen innan du fortsätter till steg 1.3.
- Nymalen bereda 5 mg/mL papain i PBS. Långsamt Pipettera 10 µL (50 µg) papain lösning i näsborren. Noggrant övervaka musen tills uppvaknande.
- Upprepa steg 1.1 och 1.2 för alla möss som ingår i experimentet. Utför steg 1.1 – 1.3 på tre dagar.
2. rena och Fluorescently etikett humant perifert blod CD4+ T-celler
Obs: Bearbeta celler under sterila förhållanden.
-
Samla in 18 mL fullt mänskligt blod från en perifer ven. Utföra Ficoll-Hypaque gradient centrifugering för att markera del av perifera mononukleära blodceller (PBMC).
Obs: Insamling och analys av primära humant material måste godkännas av de lokala etiska myndigheterna. Endast en person med en adekvat medicinsk examen är tillåtet att samla blod från en perifer ven.- Samla in blod i etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA)-som innehåller monovettes (1,6 mg EDTA/mL blod) för att undvika koagulering.
Tillval: Använda lättcellsskikt blod, en biprodukt av blodgivning berikad i leukocyter, i stället för komplett venöst blod. - Överföra blod i en konisk 50 mL tub och späd 1:2 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt försiktigt 10 mL Ficoll-medium (densitet 1.077 g/mL) som ett bottenlager under utspädda blodet. Centrifugera provet (800 x g i 15 min i rumstemperatur utan broms).
- Försiktigt bort röret från centrifugen och överför PBMC-innehållande interphasen till en ny konisk 50 mL tub. Kassera den övre och nedre lagret. Fyll PBMC-innehållande röret med PBS och centrifugera (300 x g under 10 minuter vid 4 ° C). Ta bort supernatanten.
Obs: Alternativt, om nödvändigt, utföra Lys av återstående erytrocyter. Tillsätt försiktigt ammonium-klorid-kalium (AVS) lyseringsbuffert (155 mM ammoniumklorid, 19 mM kalium väte karbonat och 0,68 mM EDTA, pH 7,27) 3 mL återsuspenderade cellpelleten och vortex provet. Skaka rören för 3 min. Ta bort den ACP lyseringsbuffert, tillsätt 40 mL PBS och centrifugera (300 x g under 10 minuter vid 4 ° C). Kassera supernatanten.
- Samla in blod i etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA)-som innehåller monovettes (1,6 mg EDTA/mL blod) för att undvika koagulering.
-
Rena CD4+ T celler via CD4 Mikrokulor.
Obs: I allmänhet finns det flera distributörer av magnetiska Mikrokulor för rening av mänskliga CD4+ celler, vilket bör resultera i jämförbara nivåer av cell renhet. Produktvalet bör baseras på individuella preferenser. Följande steg i protokollet (2.2.2–2.2.7) justeras till en definierad CD4 microbead produkt och respektive Separationskolonner ytterligare anges i Tabell för material. Vissa ändringar i protokollet kan krävas i fall att en alternativ CD4 microbead produkt är markerad.- Återsuspendera pelleten PBMC i minst 80 µL PBS med 0,5% fetalt bovint serum (FBS) och 2 mM EDTA (PBS/FBS/EDTA-buffert) per 107 PBMC. Använd en start befolkning på ca 30 x 106 PBMC för att slut upp med ca 3 x 106 till 6 x 106 renat mänskliga CD4+ T celler.
- Tillsätt 20 µL av CD4 Mikrokulor per 107 PBMC, blanda försiktigt och Inkubera under 20 minuter vid 4 ° C. Fyll röret med PBS/FBS/EDTA-buffert (kyls ned till 4 ° C) och centrifugera (300 x g under 10 minuter vid 4 ° C). Ta bort supernatanten.
- Placera en separation-kolumn i ett magnetfält. Skölj kolonnen med 3 mL PBS/FBS/EDTA-buffert. Återsuspendera cellpelleten i 500 µL av PBS/FBS/EDTA-buffert (kyls ned till 4 ° C) och överföra cellsuspension på kolumnen sköljda separation placeras i ett magnetfält.
- Skölj kolumnen separation tre gånger med 3 mL PBS/FBS/EDTA-buffert (kyls ned till 4 ° C) och kassera utflödet.
- Ta bort kolumnen separation från magnetfältet och placera det i en 15 mL tub. Eluera CD4+ cell fraktionen i 5 mL PBS/FBS/EDTA-buffert med hjälp av kolven.
- Fyll röret med PBS och centrifugera (300 x g under 10 minuter vid 4 ° C). Ta bort supernatanten. Upprepa detta tvätt två gånger.
- Bestäm antalet gav celler genom en standardmetod för val (t.ex. Neubauer avdelningen).
-
Etikett CD4+ T celler med ett fluorescerande cell spridning färgämne.
- Återsuspendera CD4+ T celler i PBS (upp till 107 celler/mL; Använd inte mindre än 500 µL av PBS).
- Förbereda en 6 µM lösning av ett rött ljus-retbara cellproliferation färga (se Tabell för material) i PBS (pre värmas till rumstemperatur). Blanda denna lösning 1:2 med den innan förberett cellsuspension och vortex grundligt (3 µM slutlig koncentration).
- Inkubera i 10 minuter vid 37 ° C (skyddade från ljus). Lägg därefter till fem volymer av RPMI medium innehållande 10% FBS och inkubera i 5 min på is (skyddade från ljus).
- Tvätta märkt celler tre gånger i RPMI medium innehållande 10% FBS (Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C). Återsuspendera märkta celler i PBS, lagra på is och ljuskänsligt fram till användning.
Obs: Långvarig lagring av celler (> 60 min) kan inverka negativt på cellöverlevnad.
Tillval: Bestämma renheten av CD4+ cell bråkdel och effekten av förfarandet för märkning av flödescytometri. Återsuspendera 0,5 x 106 till 1 x 106 CD4+ celler i 100 µL buffert (1% FBS, 2 mM EDTA i PBS) och lägga till en anti-humana CD4 antikropp tillsammans med ett fluorescerande färgämne val. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C. Tillsätt 1 mL buffert och centrifugera (300 x g under 10 minuter vid 4 ° C). Kassera supernatanten. Fortsätt med flödescytometrisk flödesmätning av provet (representativa resultat avbildas i figur 1B, C).
3. adoptively överföra mänskliga CD4+ T Cells in Papain-exponerade mottagare Mmice
Obs: Se figur 1A en sammanfattning av de Invivo utfört experimentella. Utföra cell överföring en dag efter den sista intranasal administreringen av papain.
- Justera upphävandet av fluorescently märkt mänskliga CD4+ T celler (steg 2.3.4) till en koncentration av 1 x 107 celler/mL i PBS. Fyll 100 µL cellsuspension i en 1 mL/30 G-spruta.
- Noggrant placera första papain-exponerade C57BL/6J musen (steg 1.1 – 1.3) i en fasthållningsanordning för svans ven injektion. Använd den förberedda sprutan (steg 3.1) att punktera venen svans och långsamt Injicera 100 µL cellsuspension med 1 x 106 märkt mänskliga CD4+ celler. Inte omedelbart dra ut nålen efter injektionen, men vänta i ytterligare 5 sekunder för att förhindra utsläpp av cellsuspensionen.
- Släpp musen från fasthållningsanordningen enheten och fortsätt med nästa djuret. Hålla minst en papain-exponerade djur, som inte genomgår överföring med fluorescently märkta celler att fungera som negativ kontroll för ljus ark fluorescensmikroskopi.
4. Förbered lungvävnad för ljus ark fluorescensmikroskopi
Obs: Följande steg utförs 3 h efter överföring av fluorescently märkt mänskliga celler (steg 3,2). De beskrivna experimentella rutiner inklusive skörd av lungvävnad, anpassades fixering och lösningsmedelsbaserade vävnad clearing från för närvarande beskrivs protokoll24,28.
- Offra musen av koldioxid (C02) inandning.
-
BEGJUTA lungan på plats med PBS som innehåller 5 mM EDTA.
- Öppna bröstkorgen via skära längs bröstbenet att exponera hjärtat. Punktuell höger kammare med en 21 G kanyl ansluten till en kateter.
- Öppna den vänstra ventrikeln genom att skära och därmed låta blod och perfusion vätskan att avsluta. Långsamt BEGJUTA lungan med 20 mL iskallt PBS som innehåller 5 mM EDTA via katetern.
- För att kunna utföra jordbaserad fixering av lungan, ta inte bort katetern från höger kammare. Långsamt BEGJUTA lungan med 2 mL iskallt 4% paraformaldehyd (PFA) löst i PBS. Ta bort katetern och kanylen.
Obs: PFA-baserade jordbaserad fixering av lungvävnad representerar en väl etablerad teknik för att förbereda murina lungvävnad efterföljande Mikroskopisk analys29,30.
Varning: PFA är giftigt och måste hanteras under en huv med omsorg. -
Fyll lungorna med 0,75% agaros jordbaserad.
- Förbereda 0,75% agaros i PBS och hålla fast vid 50 ° C i en thermo-shaker fram till användning. Ta bort de saliv-körtlarna av musen, skär den sternohyoid muskler och exponera luftstrupen genom att skjuta en pincett under.
- Punktera exponerade luftstrupen med en 30 G nål och ersätta det med en trubbig 30 G kateter att förhindra ytterligare skador av luftstrupen resulterar i oönskat läckage av agaros. Försegla korsningen mellan infogade katetern och luftstrupen med en nålförare.
Tillval: Kombinera här beskrivs förfarandet med BAL samling att analysera infiltrerade mänskliga celler i BAL som nyligen beskrivs i detalj31 (se figur 2E för representativa resultat). - Noggrant fylla luftvägarna med 0,75% agaros (kyls ner till kroppstemperatur) via katetern tills fullständig unfoldingen av lungan; vänta tills fullständig solidifiering Agarens. Ta bort katetern och noggrant skörda lungan i ett mörklagt 2 mL rör fyllda med 4% PFA.
- För ytterligare fixering Inkubera provet i 4% PFA löst i PBS för 2 h vid 4 ° C under kontinuerlig rotation (31 rpm).
- Torkar ut vävnad av därefter ruvning provet under kontinuerlig rotation (31 rpm) vid 4 ° C i 50% etanol (pH 9), 70% etanol (pH 9) och 100% etanol; varje steg i minst 4 h. I slutet, utföra en andra inkubation i fräsch 100% etanol i 4 h.
- Utföra lösningsmedelsbaserade clearing av vävnad använder ethyl cinnamate (ECi). Därför överföra provet till ECi. Inkubera över natten i rumstemperatur (under ständig rotation) tills vävnaden visas genomskinliga (se figur 1D för representativa bilder).
Obs: Proverna förvaras i ECi i rumstemperatur (skyddade från ljus) är stabil under flera veckor till månader.
5. utför ljus ark fluorescensmikroskopi Wwhole murint Lung lober
Obs: Se Tabell för material för detaljer om mikroskopet ljus ark fluorescens och motsvarande programvara, som bygger på följande steg. Jämförbara system från andra tillverkare, men kan användas också med utvecklarspecifika ändringar av följande protokoll. Innan du börjar, bekanta dig med Mikroskop-specifika bruksanvisningen och följ instruktionerna teknisk av den ansvariga personen på plats.
-
Ställa in mikroskopet ljus ark.
- Slå på mikroskopet ljus ark och öppna motsvarande bildbehandlingsprogram på datorn. Fyll provkammaren med filtrerade ECi (100 µm filter) och placera den i dess position mellan laserstrålar.
- Använd en liten droppe av organiska lösningsmedel-stabil lim för att hålla lungorna att provhållaren. För att hålla krävs genomträngningsdjupet av ljus-arken så liten som möjligt, ange lunglob upprätt. Placera provhållaren i dess kammare.
- Ange brytningsindex för målet till 3.5 när ECI-dokument som clearing reagens.
-
Justera inställningarna på mikroskopet ljus-ark för att upptäcka mänskliga celler i samband med hela orgeln.
- Välj krävs lasrar (filter för mätning > Aktivera kryssrutorna för krävs lasrar) och välj lämplig stödnivåer i programvaran control (laser växellådsstyrning > använda skjutreglaget för att ange laser intensitet > tillämpa). Använda en magnetisering våglängd av 488 nm (525/50 filter) att upptäcka autofluorescent lungvävnad och 640 nm (680/30 filter) att väcka mänskliga celler märkta med en fluorophore avger i det röda spektrumet.
- Fokusera på prov upphetsad på 488 nm och anpassa fokus via verktyget 'kromatiska korrigeringen' av våglängden excitation av 640 nm (Använd skjutreglaget för att ange kromatiska korrigeringen > tillämpa).
- Välja en lämplig zoomfaktor; Använd en låg förstoring-översikt (t.ex. 6,3 x) att bestämma den totala fördelningen av märkta celler inom lungvävnad och förstorade bilder (t.ex. 32 x) för detaljerad lokalisering.
- Välj blad bredd enhetligt belysa hela orgeln eller ett specifikt avsnitt av intresse (optik > Använd reglaget för att ange blad bredd, vanligtvis mellan 20 – 40%). Definiera den ark numeriska bländaröppningen (NA) med högre NA skapa skarpare bilder (optik > Ställ ark NA hjälp skjutreglaget; för en murin lunglob expanderat till dess fysiologiska storlek en NA 0,025% kan ofta användas).
- Välj antalet ljus-ark som ska användas under 'avancerad mätningsinställningar'. Vid dubbelriktad belysning, koppla vänster och höger ljus-ark för att skapa en likartad upplysta bild (Avancerade > sammanfoga lightsheets > Välj blandningsläge > Använd reglagen för att definiera överlappning mellan båda ljus-ark).
Obs: Det rekommenderas att dra nytta av dubbelriktad belysning av provet med tre ljus-ark varje.
Tillval: För att ytterligare öka bildkvalitet, använda åtgärden dynamisk fokus. Detta tillåter för att flytta fokus i x-riktningen under bild förvärv. - Definiera start- och slutpositioner av z-stacken mätas och ange stegstorlek till 5 µm (xyz-tabell Z > avsöka).
Obs: Start- och slutpositioner av en z-stack är beroende av storlek och placering av lunglob inom provkammaren. Ca 300 till 800 z-stackar förvärvas dock oftast för en enda lunglob (5 µm stegstorlek). - Spara filer med hjälp av 'Spara inställningar' och starta mätningen för att fånga bilder. Efter efterbehandling datainsamling, ren ECi-förorenade provhållare och kammare under rinnande vatten.
Obs: Använd samma inställningar för bild flera lung lober som ska jämföras efteråt.
6. efter bild bearbetning och kvantifiering av Lung-ackumulerat mänskliga celler
Obs: Se Tabell för material för detaljer på efter imaging programvara för 3D-analys, som bygger på följande steg. Alternativ efter imaging mjukvaror kan dock användas också.
- Ladda den första bilden i en z-stack (Aktivera knappen överstiga, filen > Öppna > Välj bild) för att initiera öppnandet av alla andra bilder av den valda z-stacken och deras automatisk 3D rekonstruktion.
- För att säkerställa korrekt visning av x, y och z-dimensioner, kontrollera voxel storlekar och justera dem om det behövs (Redigera > Bildegenskaper > Ange voxel storlek manuellt). För voxel storlek z, ange den valda steg-storleken mellan två bilder (här 5 µm).
- Visa varje kanal i en distinkt färg (Redigera > Visa justering av bildskärmens). Klicka på varje kanal en efter den andra att definiera en färg val (i figur 2A, B, C, D autofluorescens signalen visas i grått och märkt mänskliga CD4+ celler i rött).
- Justera intensitet, svärta och kontrast för varje kanal (Redigera > Visa justering av bildskärmens) använder trianglar i kanal barer eller att ange exakta siffror i kanalinställningarna. För justering av intensitet, använda den rätvinklig triangeln. För svart nivåjustering, använda vänster triangeln och för kontrastjustering av, använder den mellersta triangeln.
Obs: Använd lungan härrör från kontroll musen utan överföring (steg 3.3) att skilja mellan specifika mänsklig cell-derived signaler och ospecifikt bakgrund. -
För att kvantifiera märkta celler inom pulmonell vävnaden använda 'Lägg till nya fläckar' i verktygsfältet och välj 'hoppa över automatisk skapa, redigera manuellt' för manuell cell inventering.
Obs: alternativt använda cellen automatisk inventering verktyg under 'fläckar'. Manuell räknar tillåter dock för att skilja mellan specifika och ospecifika signaler mer exakt.- För att jämföra ansamling av mänskliga celler i olika prover, definiera en lung kub med en specifik volym med verktyget 3D-skärning (Redigera > beskära 3D) (här 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
- Att räkna ackumulerade celler Välj kanalen 640 nm och definiera en 'radie skala' 10 µm. Klicka på 'Redigera', kontrollera 'Välj' i menyn pekaren och markera varje cell med en prick via Skift-klicka med vänster musknapp. Hitta det totala antalet räknade celler visas i statistiken.
Obs: Det rekommenderas starkt att räkna flera kuber per lunglob (här fem) att säkerställa resultatens tillförlitlighet och kompensera för forskare-beroende urval av de inventerade lungvolymen (kvantifiering strategi och representativa resultat skildras i Figur 2D).
- Ta en bild med hjälp av verktyget ”ögonblicksbild” eller ta en video med verktyget ”animation”. Spara justerat .ims-filerna (filen > Exportera).
Obs: För representativa ändamål, Visa eller dölja ramen genom att markera eller avmarkera ramen i verktygsfältet. Dessutom Visa bilder antingen som maximal intensitet projektion (MIP) (Verktygsfält > volym > läge > Kontrollera MIP) eller använda den 'yta mode' (Verktygsfält > Lägg till nya ytor). Den 'yta mode' måste aktiveras separat för varje kanal för att belysa vävnad arkitektur och/eller cellen organ (representativa bilder visas i figur 2C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Presenterade protokollet beskriver en experimentell musmodell, som möjliggör övervakning och kvantifiera ansamling av adoptively överförda humana T-lymfocyter i lungan via ljus ark fluorescensmikroskopi. Figur 1 A föreskrivs en schematisk översikt över hur Invivo av experimentella schemat. För att garantera tillförlitliga resultat, är det av väsentlig betydelse för att säkerställa en god kvalitet av den isolerade och fluorescently märkt mänskliga CD4+ T celler, som därefter överföras till möss. Som olikt avbildade i figur 1B, C, ovan beskrivna förfarandet för microbead-baserade cell anrikning och efterföljande fluorescens-märkning vanligtvis resulterar i en flöde cytometrically bestäms CD4+ T cell renhet > 95% och framgångsrika fluorescens-märkning av alla CD4+ T celler. Kvalitet och penetration djupet av ljus ark fluorescensmikroskopi är kritiskt beroende av en lämplig grad av vävnad röjning. Som framgår i figur 1D, var här tillämpad protokollet för ECi-baserade vävnad clearing kunna garantera en hög nivå av orgel öppenhet, som anger en lyckad brytningsindex matchande. Slutligen demonstreras en representativ övergripande resultat av beskrivs experimentella protokollet i form av fullständigt bearbetad ljus ark fluorescence mikroskopi bilder i figur 2B, C, D och i Kompletterande Video. Autofluorescent signalen (visas i grått) ger ett användbart verktyg för imaging anatomiska strukturen av lungan. Röd signal representerar lungan ackumulerade mänskliga CD4+ T celler. Kvantifiering av ljus ark fluorescence mikroskopi imaging tillåter att bestämma totalt antal lung ackumulerade mänskliga CD4+ T cells per definierade av inflammerad lungvävnad. En strategi för kvantifiering av mänsklig cell infiltration illustreras i figur 2E. (Valfritt) flöde flödescytometrisk detektion av fluorescently märkt celler i BAL av mottagarens möss, som avbildas i figur 2F, kan användas som en kompletterande teknik för att bekräfta lyckad vävnad migration av adoptively överförda CD4+ T celler. Preferensen av överförda human T-celler för selektiv ackumulering i inflammerad lungvävnad här beskrivs experimentella inställning var dessutom ytterligare stöds av faktumen att mänskliga CD4+ T celler kunde inte hämtas i tarmslemhinnan mottagarens djur som skildras i figur 2B (höger panel).
Figur 1 : Schematisk översikt över arbetsflödet för Invivo experimentella. (A) allergisk lunginflammation förmåddes i C57BL/6J möss vid inandning av papain (50 µg/mus) på tre dagar (d0, d1 och d2). Nästa dag (d3), nymalen isolerade och fluorescently märkt mänskliga CD4+ T celler överfördes adoptively till möss via svans ven injektion. Efter ytterligare tre timmar offrades möss, följt av jordbaserad perfusion och fixering av lungorna. Slutligen, lungorna var explanterad och ytterligare analyseras ex vivo av ljus ark fluorescensmikroskopi. Alternativt kan BAL samlas innan lung explantation att utföra utvidgas ex vivo analyser av framgångsrikt extravasering och migrerade mänskliga celler. (B) representativa histogrammet bekräftar renheten av den isolerade CD4+ T cell bråkdel som bestäms av flödescytometri. Celler som färgas av en anti-humana CD4 antikropp eller isotypen kontroll visas i svart och grått, respektive. (C) representativa histogrammet bekräftar effekten av fluorescens-märkning av mänskliga CD4+ celler före överföring. (D) representativa bilder av en perfunderade murina lunglob före och efter röjning med ECi. FI, fluorescensintensiteten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativ analys av pulmonell ansamling av mänskliga CD4+ celler i samband med lunginflammation Invivo. Humana CD4+ celler isolerades från perifert blod med täthet lutning centrifugering följt av en magnetisk microbead-baserade reningssteg. Humana CD4+ celler var märkt med ett rött ljus-retbara cell spridning färgämne och injiceras intravenöst i papain-exponerade C57BL/6J möss. Efter tre timmar offrades möss för att samla in och analysera ytterligare lungvävnad via ljus ark fluorescensmikroskopi. (A) representativa översikt över en 3D rekonstruktion av murina, papain-exponerade lungvävnad (grå) tre timmar efter intravenös injektion av märkt mänskliga CD4+ celler (röd) som registrerats av ljus ark fluorescence mikroskopi. (B) lungvävnad mottagarens musklick tre timmar efter cell överföring visas som översikt eller hög förstoring segment (till vänster). Hämtad mänskliga CD4+ celler kan visualiseras som röda signaler och var antingen avbildas i överlagring med autofluorescens signalen av lungvävnad eller som kanal bild. För att bekräfta specificiteten av upptäckta signalen, serveras kontroll lungvävnad utan intravenös cell överföring som negativ kontroll (mellersta panelen). I motsats till lungvävnad, ingen märkt mänskliga CD4+ celler (röd) kunde detekteras i ileum samma mottagare musen (höger panel). (C) Post bildbehandling tillåter analys av enstaka skivor av lungvävnad samt generation av 3D rekonstruktioner av segmentet hela organ att kan antingen representeras som maximal intensitet projektion (MIP) eller i ytläge. Representativa bilder skildras. (D) kvantifiering strategin illustreras exemplarily i samma lunga som redan avbildas i figur 2A. Definierade kuberna för segmentet analyserade lung valdes ut och antalet humana CD4+ celler (röd) kvantifierades för varje kub. Resultaten av en senare utförd kvantifiering (händelser/813 µm x 813 µm x 1,000 µm kub) indikeras som medelvärde ± SEM. (E) som ett ytterligare alternativ, flöde flödescytometrisk detektion av fluorescently märkt humant T-celler i BAL av mottagarens djur kan vara utförs för att bekräfta lyckad vävnad migration av ackumulerade mänskliga CD4+ T celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Video: Representativa videosekvensen visar ackumulerade mänskliga CD4+ celler inom murina lungvävnad. 3D rekonstruktion av murina lung visning ackumulerade mänskliga CD4+ celler (röd) inom ramen av pulmonell vävnad (grå) tre timmar efter intravenös injektion i svansen venen. Bilder visas som MIP i början och i surface-läge i slutet. Bilder var förvärvat via ljus ark fluorescensmikroskopi och bearbetas av efter imaging programvara för 3D-analys. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här beskrivna experimentella inställningen ger möjlighet att övervaka den målsökande lungkapacitet av primära mänskliga immunceller under Invivo inflammatoriska tillstånd och därmed relevant komplement klassiskt utförs in vitro-vidhäftning och chemotaxisna analyser. För att ta in i konto specifikt anatomiska organ egenskaper i lungan, viktiga aspekter av immunceller homing (inklusive Kemotaxis och cell distribution inom målorganet) samt klinisk relevans och överförbarhet av förvärvade data, vi tog fördel av tre tekniska huvudfunktioner: (1) analysen av primära mänskliga celler inom en levande murina organism; (2) papain-medierad induktion av Exponeringsinducerad inflammation; och (3) ljus-ark fluorescensmikroskopi clearade lungvävnad.
Även om funktionella studier av adoptively överförde mänskliga kan immunceller inom en levande murina organism vara begränsat i vissa aspekter på grund av potentiellt relevanta inkompatibiliteter i receptor-ligand-interaktioner mellan möss och människor, det allmänna konceptet humaniserad mus modeller har fastställts framgångsrikt som ett viktigt experimentella verktyg inom translationell medicin under de senaste decennier24,32,33,34,35 . Studier i humaniserade möss jämfört med klassisk djurmodeller, och erbjuder fördelen att direkt analysera patientderiverade immunceller i ett scenario för Invivo och därigenom identifiera funktionella förändringar präglade av viss sjukdom32, 36,37. Angående relevansen av potentiella missmatchningar mellan definieras receptorer på ytan av mänskliga immunceller och deras respektive murina ligander eller vice versa, tidigare studier redan visat att mänskliga CD4+ T celler är kunna interagera effektivt med murin adhesionsmolekyler MAdCAM-1 och VCAM-1, som utgör avgörande ligander för integrin-medierad lymfocyter homing32. Följaktligen kan migration av intravaskulärt överförda mänskliga immunceller i murina gut vävnad framgångsrikt blockeras i vivo genom behandling med kliniskt används α4β7-integrin antikropp vedolizumab32. Dock även i fall att en särskild receptor-ligand-interaktion av relevans kan visa en fullständig mänskliga/murin obalans, det kommer förmodligen vara möjligt att övervinna denna begränsning av genteknik och exempelvis av transgena överuttryck av den respektive mänskliga ligand, tillväxtfaktor, cytokin eller receptor inom murina organism33,35.
Som en betydande inflytande av kronisk inflammation på lokala utsöndringen av kemokinerna, har endothelial uttrycket av adhesionsmolekyler och efterföljande ansamling av lymfocyter beskrivits i ett flertal publikationer38,39 ,40, valet av en lämplig experimentell modell av pulmonell inflammation representerade ett kritiskt steg medan upprätta ovanstående beskrivna protokollet och kan vara anpassade beroende på det kliniska sammanhanget av varje enskild studie. Den här inställningen av papain-inducerad allergisk lunginflammation representerar en väl beskrivna experimentell modell, som bygger på lokalt administrerad Cystein proteas papain förmåga att irritera luftvägarna epitel och utlösa de påföljande frisättning av alarmins27,41,42. Intressant, är oavsiktlig exposition till papain känt för att orsaka astma utveckling hos människor som väl43. Beroende av den inhalerade dosen av papain, utsatt möss Visa en ansamling av medfödd och adaptiv immunceller och förhöjda nivåer av typ 2 cytokiner i lungan27. Medan upptrappning av dosen visade sig leda till en utvidgning av luftrum (klassiska histologiska fenomen av kol) och en förstörelse av blodkärlens väggar med efterföljande blödning, gick måttlig dosering scheman tillsammans med en framstående pulmonell eosinofili och därmed härmade en viktig histologiska funktion av mänskliga astma27. Eftersom vårt syfte var att använda denna experimentella modell för att generera en inflammatorisk kontext för analys av pulmonell immunceller homing, försökte vi noggrant undvika papain-inducerad skada i blodkärlen, vilket annars kan resultera i en unphysiological extravasering av mänskliga immunsystemet celler på grund av störd endotelfunktion integritet. Därför har vi valt en mellanliggande dos av 50 µg papain per mus per dag i ovan beskrivna protokollet. Även om utvecklingen av papain-inducerad inflammation i luftvägarna uppstår även i avsaknad av B och T-lymfocyter, lung infiltrera adaptiv immunceller är kända för att påverka betydligt på jaga av sjukdom27,42. Exempelvis kunde regulatoriska T-celler identifieras som potent regulatorer av papain-inducerad luftvägarna eosinofili27. I perspektiv, ett aktivt deltagande av pulmonell lymfocyter i inflammatoriska patogenes av papain-exponerade möss ifrågasätter att ovan beskrivna protokollet kan det dessutom möjligt för att analysera den funktionella kapaciteten hos adoptively överförs och framgångsrikt lung-ackumulerat mänskliga immunceller att modulera lung patologi (t.ex. via flöde flödescytometrisk förvärv av eosinofil räknas i BAL). Dessutom kan en dessutom utförs intranasal administrering av valda sjukdom-relevanta mänskliga chemokiner strax före intravaskulär cell överföring möjliggöra för att analysera effekterna av dessa humorala medlare på lung målsökande processen för distinkta mänskliga immunceller populationer i Invivo miljö. Jämväl, kan effekten av hämmare på lung målsökande processen och därefter på inflammatorisk lungsjukdom patologi studeras.
En särskild fördel med det här introducerade experimentella förfarandet är exakt spårning och lokalisering av lung infiltrera mänskliga immunceller av high-end imaging kvaliteten på ljuset ark fluorescensmikroskopi. Nyligen genomförda studier visat redan att tekniken med ljus ark fluorescensmikroskopi representerar ett värdefullt experimentella verktyg för analys av intestinal immunceller homing i translationell IBD och kunna övervinna de huvudsakliga begränsningarna av konventionella immunofluorescens Mikroskopi och flöde flödescytometri24,32. Medan analyser baserade på konventionella mikroskopi är vanligtvis begränsad till en mycket liten och eventuellt inte representativt område av den orgel och flöde flödescytometri tar inte hänsyn till aspekten av vävnad organisation alls, ljus ark fluorescensmikroskopi av kemiskt clearade vävnad tillåter en ökad penetration djup utan större förlust av upplösning och därmed en 3D rekonstruktion av ganska stor orgel sektioner (upp till 1,5 cm x 1,5 cm)24,28,44. Säker, beroende kvalitet och giltigheten av förvärvade 3D rekonstruktioner kritiskt av vävnad clearance. Här beskrivs i inställningen ingår vi ett något antagna versionen av nyligen publicerade protokollet för ECi-baserade vävnad clearing44. Jämfört med andra väletablerade strategier för lösningsmedelsbaserade vävnad clearing26,kombinerar45,46, ECi-baserade protokollet de fördelarna med utmärkt clearing boenden, låg toxicitet av använda reagenser och en måttlig tid krav44. Som standard ljus ark fluorescensmikroskopi förmåga att lösa finaste vävnad strukturer som alveolära kapillärer är fortfarande begränsad även under optimala clearing villkor28, det skulle på något sätt vara svårt att tillförlitligt skilja mellan intravaskulära och redan extravasering immunceller. Införande av ett ytterligare standard fluorescens-baserade blodkärl färgning i de här beskrivna protokollet skulle troligen inte kunna helt övervinna denna begränsning. Således, studier med särskild inriktning på uppförandet av immunceller inom pulmonell mikrocirkulationen eller deras diapedesis kanske företrädesvis beakta ett nyligen publicerade och mycket elegant protokoll för intravital lung imaging baserat på 2-photon mikroskopi47. I denna experimentella inställning, en bröstkorg fönster var implanteras i sövda och ventilerade möss, genom vilken stabiliserad lungan kan övervakas av en resonant-scanning 2-foton mikroskopi modul, tillåter högupplösta imaging i hela den andningscykeln vid bevarade ventilation och perfusion47,48. Denna teknik har tillämpats framgångsrikt i olika studier och kunde visualisera exempelvis intrapulmonell trombocytantal biogenes och lung ingången av cirkulerande tumör celler49,50. Emellertid, förutom kravet på sofistikerade instrumentala utrustning (t.ex. mus ventilationssystem) och behovet av omfattande invasiva manipulationer i levande djur (implantation av bröstkorg fönster och intravital mikroskopi), den största begränsningen denna levande lungan är mikroskopi system trånga z-axis penetration. Av utförda lung surface imaging tillåter endast analysera den yttre 100 µm subpleural lunga vävnad47,48. Beroende på det vetenskapliga sammanhanget, det kan vara en värdefull möjlighet att genomföra 2-foton mikroskopi av explanterad lungorna som ett ytterligare förfarande i ovan beskrivna protokollet. Analysera samma lungan först av 2-foton mikroskopi och efteråt av ljus ark fluorescensmikroskopi kan representera en strategi för att få en kvantitativ översikt över distribution och lokalisering av mänskliga immunceller inom den murina lung ( ljus-ark fluorescensmikroskopi) och, på samma gång, få mer detaljerad insikt i cellular eller mikrovaskulära processer (2-foton mikroskopi). Faktiskt, 2-foton mikroskopi av murina luftrör bladsticklingar representerar ett etablerat imaging verktyg för att analysera immunceller beteende i samband med experimentellt inducerad lung inflammation51,52. Istället för att visualisera små pulmonella kapillärer, kan framgångsrika extravasering och lunga vävnad infiltrationen av de överförda human T-cellerna i våra experimentell modell också bevisas genom att upptäcka fluorescently märkt mänskliga celler i BAL av mottagaren djur via flödescytometri som exemplarily avbildas i figur 2E. I allmänhet, företräder analyser av cellulära BAL facket en väletablerad metod för att karakterisera pulmonell immunceller inflödet i samband med inflammatoriska luftvägssjukdomar31. Slutligen en annan flöde flödescytometrisk strategi för att kvantifiera extravaseringen av adoptively överförda immunceller inom lungvävnad beskrevs av Galkina et al. (2005)53 och skulle potentiellt kunna kombineras med protokollet här beskrivs. I studien av Galkina et al., överförde en intravenös injektion av en fluorescens-konjugerad anti-CD8 antikropp strax innan resektion av lungan resulterade i en exklusiv och fullständig märkning av innan CD8+ T celler i lungan vaskulära facket, medan redan extravasering CD8+ T celler inom det lung interstitium förblev ofärgade. Efterföljande analyser av Invivo märkt pulmonell immunceller var utförda flöde cytometrically efter ex vivo matsmältningen av lunga vävnad53. Naturligtvis, innebär processen för vävnad matsmältning att anatomiska separationen mellan intra- och extravaskulär lung fack upphävs och, således, finns det en allmän risk för falsk-positiv märkning av interstitiell immunceller på grund av antikropp läckage mellan båda fack. Denna risk kan endast minimeras genom att utföra vävnad matsmältningen i närvaro av mättar mängder omärkt antikropp53 eller eventuellt genom att ersätta flöde flödescytometrisk analys av ljus ark fluorescensmikroskopi, vilket gör det möjligt att helt undvika förstörelsen av vävnadsstrukturen.
I Sammanfattning, här infört kombination av Invivo homing av fluorescently märkt primära immunceller och efterföljande ljus ark fluorescensmikroskopi är tillförlitligt identifiera, kvantifiera och lokalisera lung ackumulerade mänskliga immunceller i en experimentell musmodell av pulmonell inflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.F. Neurath har tjänstgjort som rådgivare för Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda och Boehringer. Återstående författarna att inte lämna någon konflikt.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt finansiering av DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 och TRR 241. Den optisk Imaging Centre Erlangen (OICE) och i särskilt Ralf Palmisano, Philipp Tripal och Tina Fraaß (projektet Z2 av de DFG CRC 1181) är erkända för teknisk expertsupport för ljus ark fluorescens mikroskopbilder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
| AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
| Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
| Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
| Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
| CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
| Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
| Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
| Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
| FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
| Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
| Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
| ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
| Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
| LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
| Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
| 30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
| Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
| Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
| LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) | anprotec | AC-AF-0018 | |
| Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
| PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
| PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
| Syringe 1 mL | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
| Syringe 5 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
| Syringe 20 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
| Tube 1.5 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
| Tube 2 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
| Tube 2 mL, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
| Tube 15 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
| Tube 50 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
| Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |
References
- Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
- Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
- Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
- Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
- Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
- Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
- Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
- Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
- Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
- Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
- Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
- Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
- Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
- Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
- Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
- Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604 (2014).
- Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
- Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
- Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
- Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
- Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
- Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
- Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
- Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
- Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
- Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
- Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
- Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
- Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707 (2017).
- Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
- Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
- Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
- Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
- Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
- Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
- Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
- Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513 (2015).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
