Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

مقايسة محتوى عالية لرصد امبا مستقبلات الاتجار

Published: January 28, 2019 doi: 10.3791/59048
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Neuroscience Institute, Georgia State University
* These authors contributed equally

Summary

يمكن أن يكون التضمين استثارة الخلايا العصبية من خلال عملية ديناميكية إندو-والرقابة إيونوتروبيك ضادات مستقبلات الغلوتامات. الموصوفة هنا مقايسة موجوداً، وارتفاع محتوى للتحديد الكمي لتجمعات السكان مستقبلات السطحية والداخلية.

Abstract

بوستسينابتيك الاتجار مستقبلات من سطح الخلية وآلية هامة لتعدل الخلايا العصبية التي قدرتها على الاستجابة للمحفزات المختلفة. المستقبلات (امبا) حمض α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic، والمسؤولة عن انتقال متشابك ضادات سريع في الخلايا العصبية، يتجر بهم من السطح بوستسينابتيك بشكل حيوي تغيير استثارة الخلايا العصبية. امبا مستقبلات الاتجار ضروري اللدونة متشابك، ويمكن أن تتعطل في الأمراض العصبية. ومع ذلك، تجاهل النهج السائد للتحديد الكمي للاتجار مستقبلات مستقبلات أكمله برك، هي مفرطة الوقت-وكثيفة العمالة، أو يحتمل أن تعطيل آليات الاتجار بالبشر العادي وتعقيد ولذلك تفسير البيانات الناتجة عن ذلك. نقدم مقايسة عالية المحتوى للتحديد الكمي للسكان مستقبلات امبا السطحية والداخلية على حد سواء في الخلايا العصبية هيبوكامبال الابتدائي مثقف استخدام إيمونولابيلينج نيون مزدوج وماسح ضوئي القريبة من الأشعة تحت الحمراء فلورسنت 96-جيدا ميكروسكوبية. سطح كثافة مستقبلات مع تقليل المواد عينة هذا النهج ويسهل الفرز السريع من استيعاب الجزء الأكبر. ومع ذلك، لدينا أسلوب قد قيودا في الحصول على قرار خلية واحدة أو إجراء تصوير الخلايا الحية. وأخيراً، أن هذا البروتوكول قد تكون قابلة للمستقبلات وأنواع الخلايا المختلفة، وقدمت التعديلات المناسبة والتحسين الأخرى.

Introduction

حجم وديناميات الزمانية لاستثارة الخلايا العصبية يعتمد إلى حد كبير على توافر وتكوين السكان مستقبلات السطحية التي ترانسدوسي الإشارات الكهروكيميائية. حين تركيب مستقبلات جديدة (أو مفارز مستقبلات) عموما عملية قوة مكلفة وطويلة الأمد نسبيا، مجموعة من الأجهزة الخلوية مخصصة إندو-والرقابة من المستقبلات الموجودة توفر وسيلة لإدخالهم بسرعة وإزالة من الغشاء1. ولذلك، بالإضافة إلى تنظيم مستقبلات النسخي ومتعدية الجنسيات، الاتجار مستقبلات بوسترانسلاشونال هو المغير هامة لاستثارة الخلايا العصبية.

ويعتقد اللدونة متشابك، أو قوة تغيير الاتصالات بين الخلايا العصبية مع التجربة، لتشكل أساسا للتعلم والذاكرة2،3. تقوية وإضعاف نقاط الاشتباك العصبي مع مرور الوقت، ووصف التقوية الطويلة الأجل (الكمونية) والاكتئاب الطويل الأجل (المحدودة)، على التوالي، يمكن أن يكون التضمين من خلال الاتجار بمستقبلات حمض α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (امبا) 4 , 5-مستقبلات امبا هيتيروتيتراميرس تتألف من أربع وحدات فرعية (GluA1-4)، والتوسط في أغلبية ضادات سرعة انتقال متشابك في الدماغ6. وهكذا، استثارة الخلايا العصبية في جزء كبير منه دالة لكمية امبا مستقبلات على سطح بوستسينابتيك المتاحة لتنشيط بواسطة الغلوتامات. المحدودة ويرتبط عادة مع زيادة في امبا مستقبلات الالتقام، بينما LTP يرتبط أساسا بزيادة الرقابة مستقبلات امبا. يتطلب التعبير السطحي بوستسينابتيك امبا مستقبلات تسليم اندوسومال للبروتينات اكسوسيتوتيك، حيث يحدث الانصهار مع غشاء البلازما ثم في طريقة تعتمد على الكالسيوم7،،من89، 10 , 11 , 12 , 13 , 14-وتوجد أيضا مجموعة من الآليات التي تنظم نشاط تعتمد امبا مستقبلات الالتقام. واحد الأمثلة على ذلك عن طريق الجينات المبكر الفوري Arc/Arg3.1 (Arc). من بين مهام أخرى15، يعرف القوس التوسط مستقبلات الغلوتامات ميتابوتروبيك (مجلور)-تعتمد المحدودة عن طريق تعزيز امبا مستقبلات الالتقام من خلال شركائها الملزمة، التي تشمل البروتينات اندوسيتيك AP-2، اندوفيلين-3 ودينامين-2 16 , 17 , 18 , 19، في كلاثرين المغلفة حفر20،21. مستقبلات امبا المدخلة يمكن أما إعادة تدويرها مرة أخرى إلى غشاء البلازما أو المخصصة لتدهور22،23.

الأهم من ذلك، يساهم تشكيل وحدة فرعية من مستقبلات امبا ديناميات الاتجار24. أهمية رئيسية هو المجال ج-محطة داخل الخلايا من الوحدات الفرعية، حيث تحدث غالبية التعديلات بوستترانسلاشونال والتفاعلات المتصلة بالاتجار البروتين. GluA1 و GluA4 التي تحتوي على وحدة فرعية امبا المستقبلات خاصة عرضه للاتجار بهم إلى سطح الخلية خلال الكمونية، جزئيا بسبب وجود على يغاندس بدز، تسلسل الأحماض الأمينية ~ 90 التي تروج للأغشية رسو عبر التفاعل مع مختلف بدز المجال التي تحتوي على بروتينات25،26. من ناحية أخرى، تميل امبا المستقبلات المحتوية على GluA2 والتي تفتقر إلى GluA1 أو GluA4 إلى يهرب مؤثرا ولكن تتراكم إينتراسيلولارلي مع النشاط متشابك27. مفارز GluA2 الخضوع للحمض النووي الريبي التحرير التي، بالإضافة إلى تعزيز الاحتفاظ في هيولى28، يجعل المسام قناة كتيمة إلى29من الكالسيوم، كذلك تورط وحدة فرعية محددة الاتجار كوسيط رئيسي للخلايا العصبية التوازن واللدونه. من المثير للاهتمام، قد تبين توقف تدهور القوس ubiquitin-تعتمد على زيادة GluA1 الالتقام وزيادة التعبير السطحي GluA2 التي تحتوي على وحدة فرعية امبا مستقبلات بعد تحريض من مجلور--المحدودة مع انتقائية المجموعة الأولى مؤثر مجلور (ق)--3، 5-ديهيدروكسيفينيلجليسيني (دهبج)، مما يشير إلى أنه ما زال يمكن تعلمه بشأن الآليات ودور وحدة فرعية محددة امبا مستقبلات الاتجار30.

أساليب لمراقبة التغيرات في سطح التعبير عن مستقبلات غالباً ما تكون مرهقة، وتستغرق وقتاً طويلاً، أو إدخال غير ضرورية يفند. فحوصات على أساس البيوتين نهج منتشرة ومتوفرة تجارياً. انجذاب تطهير مستقبلات سطحية بيوتينيلاتيد يمثل أحد الأمثلة، إلا أن ضرورة إجراء التفريد يتطلب كمية كبيرة من مواد العينة ويمكن أن تجعل فحص عدة علاجات باهظة طويلة 31من العملية. ملحقات لهذا التحليل، حيث يتم تنفيذ متعددة النقاط الزمنية لوضع العلامات وإيمونوبريسيبيتيشنز لقياس التدهور التدريجي لإشارة أولية، وبالمثل الإهمال الإضافة جديدة – أو المعاد تدويرها – مستقبلات الخلية السطحية وإلا تؤدي إلى تفاقم الوقت والاحتياجات من المواد.

نهوج أخرى الاستفادة من بنيات تشيميريك أو إضافة علامات مضيئة لمراقبة الاتجار مستقبلات32، وفي بعض الأحيان استخدام لايف الخلية التصوير،من3334. في حين يحتمل أن تكون قوية، هذه التصاميم يمكن أن تؤثر على أنماط الاتجار العادي من مستقبلات سبب طفرات أو تغيرات دراماتيكية في الوزن الجزيئي وعرض في هذه البروتينات. استخدام الأصباغ التي تسمية المقصورات سوبسيلولار باستهداف الأس الهيدروجيني المنخفض34،35 هي غير محددة، وجعل التمييز بين الأقسام المختلفة داخل الخلايا الهامة لمستقبلات الاتجار غير المشروع (على سبيل المثال. ليسوسوميس و proteasomes) صعبة. وأخيراً، استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] تصور كولوكاليزاتيون مستقبلات مع علامات المرتبطة بالاتجار بالأشخاص والتدهور، مثل البروتينات اندوسومال أو كلاثرين، بينما يحتمل أن توفر الترجمة محددة مع نظرة ثاقبة مفيدة القرار سوبسيلولار، والوقت، وكثيفة العمالة، ومكلفة بسبب ضرورة تحليل منفردة كل خلية، والاشتراط [كنفوكل] أو مجهرية فائقة القرار.

هنا، علينا أن نظهر مقايسة الاتجار مستقبلات عالية المحتوى متوافق مع ثقافة العصبية الأولية الاستعدادات30. تسميات هذا الأسلوب بشكل منفصل في تجمعات مستقبلات سطحية وداخل الخلية من الخلايا العصبية الثابتة، مما يتيح عرض البيانات كنسبة من سطح طبيعية أو كثافة مستقبلات المدخلة إلى الكثافة الإجمالية لأن المستقبلات. طبيعة المحتوى العالي من هذا الأسلوب مثالية لفحص عدة علاجات و/أو الأنماط الجينية في فترة زمنية قصيرة، وتتطلب خبرة حضانة استزراع وجسم الخلية القياسية فقط.

بإيجاز، الخلايا العصبية الأولية هي تزرع في معيار 96-جيدا ميكروبلاتيس وثم تعامل وفق ما تمليه التصميم التجريبي والمحتضنة مع الأجسام المضادة الأولية وغسلها وثابتة. ثم هي المحتضنة الخلايا مع جسم ثانوية لتسمية المستقبلات السطحية، تليها خطوة أخرى من التثبيت. بيرميبيليزيشن ثم يحدث وجسم ثانوية ثانية تستخدم لتسمية برك مستقبلات داخلية. وأخيراً، يتم تصويرها الخلايا استخدام ماسح ضوئي ميكروسكوبية فلورسنت الأشعة تحت حمراء لقياس كثافة السكان مستقبلات كل متكامل. ويلخص الشكل 1 لدينا مقايسة محتوى عالية بالمقارنة مع الإنزيم بيوتينيليشن تقليدية.

في حين عرضت البروتوكول هنا هو الأمثل ومحددة لمستقبلات امبا الاتجار في الثقافات العصبية هيبوكامبال الأولية، هذا الإجراء يمكن، من الناحية النظرية، الموسعة وتكييفها لمستقبلات مختلفة في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ولاية جورجيا.

1-إعداد الخلايا العصبية هيبوكامبال الأولية (في هود الاندفاق الصفحي)

  1. عزل الخلايا العصبية هيبوكامبال الابتدائي من يوم الولادة الجنس المختلط (ف) 0-1 الفئران كما تم وصفه سابقا36.
  2. صفيحة من الخلايا العصبية في 96-جيدا بولي-د-يسين المغلفة ميكروبلاتيس في كثافة 2 × 104 خلايا كل بئر.
  3. تعد وسائل الإعلام لتغذية الخلايا العصبية بإضافة 10 مل 50 س B-27، 5 مل 100 × الجلوتامين، ميليلتر 242 من 10 ملغ/مل 5-مخفضات-2 '--ديوكسيوريديني (فودر) و 10 ميليلتر من 10 ملغ/مل مع الجنتامايسين إلى 485 مل وسائط العصبية (انظر الجدول للمواد).
  4. تغذية الخلايا العصبية كما تم وصفه سابقا36 بإزالة نصف (100 ميليلتر) من القائمة من قبل وسائل الإعلام (المشار إليها كوسائل الإعلام المكيفة، التي تحتوي على المكونات التي تدعم بقاء الخلايا العصبية) من كل بئر واستبدال مع 100 ميليلتر من 37 درجة مئوية بريوارميد وسائل الإعلام في الخطوة 1، 3 إعداد كل 3-4 أيام. قم بتخزين الوسائط مكيفة من كل تغذية في 4˚C لخطوة 2، 3.

2-قياس مستقبلات امبا الاتجار في الاستجابة إلى دهبج (في هود الاندفاق الصفحي)

  1. في اليوم في المختبر (DIV) 14، إعداد حل أسهم 500 ميليلتر من تيدرودوتاكسين (ت) بتركيز 2 مم باستخدام خلية ثقافة المياه الصف.
    تنبيه: ت عصبي. التعامل معها بعناية وتجنب ملامسة الجلد.
  2. استخدام ماصة متعددة القنوات، إزالة 100 ميليلتر من كل بئر الميكروسكوبية 96-جيدا من الخلايا العصبية وتجمع وسائط الإعلام.
  3. إضافة 2 ميليلتر من حل ت الأسهم إلى 1 مل من وسائط الإعلام مكيفة المجمعة من الخطوة 2.2 لإنشاء حل ت 4 ميكرومتر. إذا لم يكن هناك تجميع ما يكفي من وسائل الإعلام المكيفة، ثم استخدام بعض الوسائط المخزنة مكيفة من "الخطوة 1، 4".
  4. علاج الخلايا العصبية مع 100 ميليلتر/جيدا من حل ت 4 ميكرومتر من الخطوة 2، 3. مكان الميكروسكوبية في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية ح 4.
  5. إرفاق زجاج معقمة باستور "الماصة؛" لخط شفط وإرفاق حد 200 ميليلتر ماصة معقمة بتلميح الماصة. قم بإزالة الوسائط من كل كذلك بعناية. تجنب لمس أسفل الميكروسكوبية حيث توجد الخلايا العصبية.
  6. إضافة 200 ميليلتر من الوسائط العصبية في درجة حرارة الغرفة لكل بئر.
  7. احتضان الميكروسكوبية في درجة حرارة الغرفة 15 دقيقة حضانة في 5% CO2 هو المفضل ولكن ليس من الضروري.

3-إيمونولابيلينج (في هود الاندفاق الصفحي)

  1. إعداد إضعاف 1:150 جسم GluA1 المضادة أو مكافحة GluA2 في الوسائط العصبية.
  2. قم بإزالة الوسائط العصبية بإضافتها في "الخطوة 2، 6". إضافة 50 ميليلتر من الحلول الأجسام المضادة GluA1 المضادة أو مكافحة GluA2 لآبار المقابلة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح ربط جسم. إضافة 50 ميليلتر من الوسائط العصبية إلى جسم الثانوية فقط مراقبة الآبار.
  3. إزالة جسم الحلول بإضافتها في الخطوة 3، 2. أغسل الميكروسكوبية 3 مرات مع 100 درجة حرارة الغرفة ميليلتر/بئر الوسائط العصبية لإزالة أي أجسام غير منضم.
  4. جعل حل أسهم 50 مم من دهبج في الوسائط العصبية أو خلية ثقافة الصف المياه. دوامة الحل بإيجاز حل دهبج الكامل. إعداد هذا الحل الطازجة في اليوم نفسه من التجربة. تجنب استخدام الحلول القديمة أو المذابة.
  5. تمييع الحل الأسهم في الوسائط العصبية إلى 1: 500 لجعل حل 100 ميكرومتر.
  6. قم بإزالة الوسائط الموجودة من كل بئر. إضافة 100 ميليلتر/بئر الحل الأسهم دهبج 100 ميكرون من 3.5 خطوة. احتضان الميكروسكوبية في الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 لمدة 10 دقائق.
  7. إزالة الحل دهبج بإضافتها في الخطوة 3، 6 وإضافة الوسائط العصبية ميليلتر/بئر 100. كرر هذه الخطوة مرة أخرى. مكان الميكروسكوبية في الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 لمدة 5 دقائق.
  8. إضافة السكروز لجعل الحل السكروز paraformaldehyde/4% 4% في برنامج تلفزيوني في اليوم نفسه من التجربة. تجنب استخدام الحلول القديمة أو المذابة. قم بإزالة الوسائط بإضافتها في الخطوة 3، 7. إضافة من محلول السكروز paraformaldehyde/4% 4% 100 ميليلتر/جيدا. كرر الخطوات من 3.6-3.8 لكل نقطة الوقت الإضافي. بمجرد اكتمال، احتضان الميكروسكوبية عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    تنبيه: التعامل مع الأرصدة بارافورمالدهيد في غطاء دخان.
  9. إزالة مثبت من الخطوة 3.8 واضافه 100 ميليلتر/جيدا من البرد x DPBS 1.
  10. إزالة دببس. إضافة 150 ميليلتر/بئر حجب المخزن المؤقت (صيغة جاهزة للاستخدام في تبس، أرجع إلى الجدول للمواد) واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 90 دقيقة بدلاً من ذلك، تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

4-وضع العلامات المستقبلات السطحية

  1. إعداد إضعاف 1:1500 680RD الماعز الماوس المضادة IgG جسم الثانوية في المخزن المؤقت لحظر.
  2. إزالة المخزن المؤقت حظر من الخطوة 3، 10. إضافة 50 ميليلتر/بئر الحل جسم الثانوية واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 60 دقيقة تبقى الميكروسكوبية محمية من الضوء بمجرد إضافة الأجسام المضادة الثانوية. تأكد من الاستمرار في حماية الصفيحة من الضوء خلال إينكوبيشنز اللاحقة.
  3. إزالة الحل من الخطوة 4، 2. إضافة 100 ميليلتر/بئر TBS (50 مم تريس-HCl، 150 مم كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 7.6) واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 كرر هذه الخطوة 4 مرات إضافية.
  4. إزالة TBS من الخطوة 4، 3. إضافة من السكروز paraformaldehyde/4% 4% 100 ميليلتر/جيدا في برنامج تلفزيوني واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  5. إزالة الحل من الخطوة 4، 4. إضافة 100 ميليلتر/بئر TBS واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 تكرار هذه الخطوة 2 مرات إضافية.

5-وضع العلامات السكان مستقبلات المدخلة

  1. إعداد تبس تحتوي على صابونين 0.2%. دوامة الحل بإيجاز بالكامل حل مسحوق صابونين. تصفية الحل باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرون لإزالة أي الجزيئات التي يمكن أن تسبب السيارات-الأسفار.
  2. إضافة 150 ميليلتر تبس تحتوي على صابونين 0.2% واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  3. إزالة الحل صابونين من الخطوة 5، 2 وإضافة 150 ميليلتر/كذلك حظر في المخزن المؤقت. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.
  4. إعداد إضعاف 1:1500 800CW حمار الماوس المضادة مفتش الثانوي جسم في المخزن المؤقت لحظر.
  5. إزالة المخزن المؤقت حظر من الخطوة 5، 3 وإضافة 50 ميليلتر/بئر الحل جسم الثانوية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
  6. إضافة 100 ميليلتر/بئر TBS واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 تكرار هذه الخطوة 4 مرات إضافية.

6-التصوير والتحليل

  1. صورة ميكروسكوبية 96-جيدا باستخدام ليزر الأشعة تحت حمراء التصوير النظام وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تعيين دقة المسح الضوئي إلى 84 ميكرومتر، ونوعية المسح الضوئي إلى المتوسطة والتركيز تعويض وفقا لارتفاع الميكروسكوبية 96-كذلك تستخدم قاعدة. انقر فوق ← زر القائمة "الصورة استوديو" تصدير ← صورة "الوسائط الرقمية" ← تصدير الصور بدقة 300 نقطة في البوصة، في تنسيق TIFF.
  2. تحميل صورة ي "فيجي" في https://imagej.net/Fiji/Downloads
  3. فتح الصورة في الصورة ي "فيجي". تقسيم قنوات الألوان بالنقر على القائمة "صورة"
    لون ← تقسيم القنوات.
  4. فتح إدارة العائد على الاستثمار من "تحليل" ← "أدوات". حدد المربع "تسميات" في إدارة العائد على الاستثمار لتسمية الدوائر مع أرقام.
  5. باللون الأحمر قناة (680 نانومتر مستقبلات سطح حوض السباحة)، حدد المنطقة من الفائدة (العائد على الاستثمار) عن طريق تحديد أداة الدائرة ورسم دائرة يناسب دقة البئر الأولى. اضغط Ctrl + T.
  6. اسحب الدائرة إلى التالي جيدا واضغط Ctrl + T. تكرار حتى يتم حلق جميع الآبار.
  7. من إدارة العائد على الاستثمار، انقر فوق "إجراء". حدد القيم التي تظهر ونسخها إلى جدول بيانات.
  8. انقر فوق قناة الأخضر (800 نانومتر مستقبلات داخلية حوض السباحة) وثم تبديل رويس مختارة من الخطوة 6، 6 بالصورة. من إدارة العائد على الاستثمار، انقر فوق "إجراء". حدد القيم التي تظهر ونسخها إلى جدول بيانات.
  9. حساب القيم متوسط كثافة المتكاملة من الثانوية فقط التحكم في الآبار. طرح قيم الكثافة المتكاملة لكل بئر تجريبية من قيم الكثافة السيطرة المتكاملة فقط الثانوي متوسط لتجمع مستقبلات سطحية. كرر هذه الخطوة لتجمع مستقبلات داخلية.
  10. حساب التغيرات في التعبير مستقبلات السطحية باستخدام Rs/Rt، حيث تمثل Rs المتكاملة كثافة المستقبلات السطحية وارتي يمثل كثافة المستقبلات السطحية متكامل + كثافة المتكاملة مستقبلات داخلية.

Representative Results

القوس/Arg3.1 يسرع امبا مستقبلات الالتقام من خلال التفاعل مع AP-2، اندوفيلين-3 ودينامين-216،18 بعد التنشيط مجلور37. في قوس تدق في الماوس (أرككر)، وهي تحور ليسينيس 268 و 269 في البروتين القوس إلى ارجينين، الذي يتداخل مع أوبيكويتيناتيون القوس. وهذا يعوق دوران بروتوزوم-تعتمد على القوس ويطيل عمرها النصفي في الخلايا العصبية21،30. في هذه التجربة، تم بحث استمرار القوس في تنظيم الاتجار بمستقبلات امبا استخدام محتوى عالي امبا مستقبلات الإنزيم الاتجار بالبشر. وعولج الخلايا العصبية مع مانع قناة نا+ ت، مما يحول دون إمكانات العمل ويقلل من قوس مستويات38، تليها دهبج، الذي يدفع القوس الترجمة و37،أوبيكويتينيشن39. السطح وبرك المدخلة من GluA1-(الشكل 2A) وقيست مفارز مستقبلات امبا (الشكل 3A) المحتوية على GluA2 في 5 و 15 دقيقة بعد تبييض دهبج. تستخدم هذه التجربة خاصة replicates التقنية الثلاثة من 3 التجارب المستقلة. أركر الخلايا العصبية أظهرت زيادة الالتقام GluA1 عندما تعامل مع دهبج مقارنة بوزن الخلايا العصبية، هو تأثير الذي لم يكن ينظر إليه عندما كانت تعامل الخلايا العصبية مع ت فقط (الشكل 2). التعبير السطحي من مفارز GluA2 ارتفع عند نقطة زمنية قصيرة مقارنة بوزن الخلايا العصبية (الشكل 3B)، تشير إلى إمكانية استبدال وحدة فرعية30. وعولج بعض الآبار مع الأجسام المضادة الثانوية فقط لعنصر التحكم للأسفار الخلفية الناجمة عن الربط غير محدد.

Figure 1
رقم 1: مقارنة بين مستقبلات امبا المحتوى السامي المقايسة الاتجار للانزيم بيوتينيليشن مستقبلات. تحليل الاتجار عالية المحتوى يستهلك أقل من الوقت والموارد مقارنة بمقايسة بيوتينيليشن القياسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: السكان السطحية والداخلية لمفارز مستقبلات GluA1 امبا في الخلايا العصبية هيبوكامبال WT وأركر- (أ) سطح (sGluA1) والمدخلة (iGluA1) التي تحتوي على GluA1 امبا مستقبلات مفارز في الخلايا العصبية هيبوكامبال WT وأركر في 5 و 15 دقيقة بعد تبييض دهبج. مقارنة WT، أركر الخلايا العصبية قد انخفاضا آخر في المحتوية على sGluA1 امبا مستقبلات تجمع 5 و 15 دقيقة بعد تبييض دهبج. (ب) الرسم البياني يمثل fluorescence السطحية تطبيع لشدة مجموع الأسفار. وأجريت مقارنات إحصائية استخدام ANOVA أحادي اتجاه، اختبارات t المزدوجة ومزاوج للطالب. p ≤ 0.05؛ n = 3 replicates التقنية من 3 التجارب المستقلة. وتمثل القيم يعني ± sem. لقد تم تعديل هذا الرقم من الجدار، م. ج. وآخرون 201830. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: السكان السطحية والداخلية لمفارز مستقبلات GluA2 امبا في الخلايا العصبية هيبوكامبال WT وأركر- (أ) نفس الحالة التجريبية الرقم 2. مقارنة WT، قد أركر الخلايا العصبية زيادة في تجمع مستقبلات امبا المحتوية على sGluA2 5 دقائق بعد تبييض دهبج. (ب) الرسم البياني يمثل fluorescence السطحية تطبيع لشدة مجموع الأسفار. وأجريت مقارنات إحصائية استخدام أحادي الاتجاه ANOVA، اختبارات t المزدوجة ومزاوج للطالب. p ≤ 0.05؛ n = 3 replicates التقنية من 3 التجارب المستقلة. وتمثل القيم يعني ± sem. لقد تم تعديل هذا الرقم من الجدار، م. ج. وآخرون 201830. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

مستقبلات امبا هي النوع فرعي مستقبلات غلوتامات إيونوتروبيك التي جزء لا يتجزأ لوظائف الخلايا العصبية التي تشمل تشكيل المشبك المشبك واﻻستقرار اللدونة متشابك. اضطراب مستقبلات امبا مرتبط ب اضطرابات عصبية متعددة24 وتعتبر المخدرات جاذبية أهداف40. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات أن واحدة من علامات المبكرة من مرض الزهايمر (AD) هو فقدان المشبك وخفض مستويات مستقبلات امبا متشابك41،42. الفضول، وإضافة ليغومرات اميلويد-ß يضعف التعبير مستقبلات المحتوية على GluA1 امبا السطحية في نهايات43. علاوة على ذلك، مركز epilepticus أسفل-ينظم مرناً GluA2 والبروتين في الخلايا العصبية هيبوكامبال السابقة على وفاة44. في التصلب العضلي الجانبي (المرض)، وأمراض البروتين (ماساتشوستس-43) "القطران الحمض النووي" ملزم، شذوذ جزيئية خاصة بالمرض، وقد تم مرتبطة بالكفاءة GluA2 Q/R الموقع-الجيش الملكي النيبالي تحرير45.

عالية--محتوى امبا مستقبلات الإنزيم الاتجار يوفر وسيلة فعالة لقياس التغيرات الأكبر في مستقبلات ملفات تعريف الاتجار بالبشر ضمن شبكة الخلايا العصبية استجابة لعوامل مختلفة، تستهلك أقل بكثير من الوقت والمواد من الأساليب البديلة. ميكروسكوبية 96-بئر واحدة توفر الآبار العديدة تشغيل تقنية متعددة وإنشاء نسخ متماثلة وعناصر تحكم للظروف التجريبية المختلفة في نفس اللوحة. كثافة منخفضة والطلاء 2 × 104 خلايا/جيدا بالنسبة إلى كثافة الخلايا/بئر 5 × 105 يقلل كثيرا من عدد الحيوانات والمواد المطلوبة لكل تجربة (الشكل 1). الماسح الضوئي الأشعة تحت الحمراء يمكن الصورة يصل إلى ستة 96-بئر ميكروبلاتيس في وقت واحد. يمكن أيضا تعديل المقايسة إلى ميكروسكوبية جيدا 38446، الذي يصبح على وجه التحديد قيمة إذا تم تشغيل الفحص عينات الثمينة التي يصعب الحصول عليها أو غالية الثمن للثقافة (العينات البشرية مثلاً والخلايا الجذعية المستحثة pluripotent). يمكن إكمال التحليل الكامل وحللت في نفس اليوم، مما يوفر وقتاً ثمينا (الشكل 1).

لإتمام ناجحة وفعالة المقايسة، تحتاج بعض النقاط التي سينظر فيها. أولاً، من المهم إعداد الحل دهبج في نفس اليوم لعلاج العصبية. لا إعادة استخدام أو تجميد الأرصدة دهبج. كما ينبغي الطازجة السكروز paraformaldehyde/4% 4 ٪ في حل برنامج تلفزيوني في اليوم نفسه من التجربة. وثانيا، آبار مراقبة تعامل مع ت فقط أو مركبة مطلوبة لضمان محددة لمعالجة آثار لاحظ. كما أن من المهم أن تشمل الآبار تعامل مع الأجسام المضادة الثانوية فقط لعنصر التحكم للأسفار الخلفية التي تنتجها ملزمة غير محددة. علما أن الخطوة الثانية التثبيت (تبييض التالية من الأجسام المضادة الثانوية) هي المفتاح للحد من تأثيرات خلفية جسم الثانوي وتحقيق وسمها فعال من مفارز مستقبلات.

حلول توفيقية والقيود، كما هو الحال مع أي أسلوب، موجودة. هذا التحليل لا يوفر القرار خلية واحدة (أو سوبسيلولار)، ولا يسمح بتتبع في الوقت الحقيقي من مستقبلات الاتجار مثل أخرى أساليب32،،من3335. بالإضافة إلى ذلك، يجب اتخاذ الرعاية المناسبة خلال الخطوة بيرميبيليزيشن من الخلايا العصبية، هذا الأسلوب سوف تكون حساسة لتسرب العناصر داخل الخلايا في حالة الإفراط بيرميبيليزيشن.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر الين زخاري للمساعدة التقنية. هذا العمل كان تدعمه "مؤسسة وايت هول" (منحة عام 2017-05-35) و "كليون جيم Arrington البحوث بدء برنامج منح" (تلاعب-93) A.M.M. ماج و D.W.Y. على حد سواء حظيت بزمالة 2CI "نيوروجينوميكس جامعة الدولة في جورجيا".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal EMD Millipore Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 ThermoFisher Scientific Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15
(RS)-3,5-DHPG Tocris Bio-Techne Cat#0342
Tetrodotoxin Citrate (TTX) Tocris Bio-Techne Cat#1069
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich Cat#P7280-5X5MG
Saponin ACROS Organics Cat# 419231000
B-27 Supplement (50x), Serum Free Gibco Cat#17504044
Glutamax Supplement Gibco Cat#35050061
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) Sigma-Aldrich Cat#F0503
Gentamycin (10 mg/mL) Gibco Cat#15710064
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified Electron Microscopy Sciences Cat#19210
Sucrose (EP/BP/NF) FisherScientific Cat#S2500GM
Odyssey Blocking Buffer (TBS) Li-COR Cat#927-50003 Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol
Cell Culture Grade Water HyClone Cat#SH30529.02
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco Cat#14190250
Neurobasal Medium, minus phenol red Gibco Cat#12348017 Referred to as "neuronal Media" in the protocol
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile Corning Cat#431219
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates Corning Cat#3603
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070
FIJI (Fiji is Just ImageJ) NIH http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285
Odyssey CLx imaging system Li-COR Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kennedy, M. J., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 29, 325-362 (2006).
  2. Hebb, D. O. The organization of behavior; a neuropsychological theory. , Wiley. (1949).
  3. Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B. 369 (1633), 20130288 (2014).
  4. Collingridge, G. L., Isaac, J. T., Wang, Y. T. Receptor trafficking and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 5 (12), 952-962 (2004).
  5. Newpher, T. M., Ehlers, M. D. Glutamate receptor dynamics in dendritic microdomains. Neuron. 58 (4), 472-497 (2008).
  6. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
  7. Correia, S. S., et al. Motor protein-dependent transport of AMPA receptors into spines during long-term potentiation. Nature Neuroscience. 11 (4), 457-466 (2008).
  8. Wang, Z., et al. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135 (3), 535-548 (2008).
  9. Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 defines a domain for activity-dependent exocytosis in dendritic spines. Cell. 141 (3), 524-535 (2010).
  10. Hussain, S., Davanger, S. Postsynaptic VAMP/Synaptobrevin Facilitates Differential Vesicle Trafficking. of GluA1 and GluA2 AMPA Receptor Subunits. PLoS One. 10 (10), 0140868 (2015).
  11. Wu, D., et al. Postsynaptic synaptotagmins mediate AMPA receptor exocytosis during LTP. Nature. 544 (7650), 316-321 (2017).
  12. Jurado, S., et al. LTP requires a unique postsynaptic SNARE fusion machinery. Neuron. 77 (3), 542-558 (2013).
  13. Arendt, K. L., et al. Calcineurin mediates homeostatic synaptic plasticity by regulating retinoic acid synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), E5744-E5752 (2015).
  14. Ahmad, M., et al. Postsynaptic complexin controls AMPA receptor exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
  15. Bramham, C. R., Worley, P. F., Moore, M. J., Guzowski, J. F. The immediate early gene arc/arg3.1: regulation, mechanisms, and function. The Journal of Neuroscience. 28 (46), 11760-11767 (2008).
  16. Chowdhury, S., et al. Arc/Arg3.1 interacts with the endocytic machinery to regulate AMPA receptor trafficking. Neuron. 52 (3), 445-459 (2006).
  17. Waung, M. W., Huber, K. M. Protein translation in synaptic plasticity: mGluR-LTD, Fragile X. Current Opinion in Neurobiology. 19 (3), 319-326 (2009).
  18. Wall, M. J., Correa, S. A. L. The mechanistic link between Arc/Arg3.1 expression and AMPA receptor endocytosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 77, 17-24 (2018).
  19. DaSilva, L. L., et al. Activity-Regulated Cytoskeleton-Associated Protein Controls AMPAR Endocytosis through a Direct Interaction with Clathrin-Adaptor Protein. eNeuro. 2 (3), (2016).
  20. Carroll, R. C., et al. Dynamin-dependent endocytosis of ionotropic glutamate receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (24), 14112-14117 (1999).
  21. Mabb, A. M., et al. Triad3A regulates synaptic strength by ubiquitination of Arc. Neuron. 82 (6), 1299-1316 (2014).
  22. Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28 (2), 511-525 (2000).
  23. Petrini, E. M., et al. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation. Neuron. 63 (1), 92-105 (2009).
  24. Henley, J. M., Wilkinson, K. A. Synaptic AMPA receptor composition in development, plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 17 (6), 337-350 (2016).
  25. Hayashi, Y., et al. Driving AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII: requirement for GluR1 and PDZ domain interaction. Science. 287 (5461), 2262-2267 (2000).
  26. Sheng, N., et al. LTP requires postsynaptic PDZ-domain interactions with glutamate receptor/auxiliary protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), 3948-3953 (2018).
  27. Lee, S. H., Simonetta, A., Sheng, M. Subunit rules governing the sorting of internalized AMPA receptors in hippocampal neurons. Neuron. 43 (2), 221-236 (2004).
  28. Greger, I. H., Khatri, L., Kong, X., Ziff, E. B. AMPA receptor tetramerization is mediated by Q/R editing. Neuron. 40 (4), 763-774 (2003).
  29. Sommer, B., Kohler, M., Sprengel, R., Seeburg, P. H. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels. Cell. 67 (1), 11-19 (1991).
  30. Wall, M. J., et al. The Temporal Dynamics of Arc Expression Regulate Cognitive Flexibility. Neuron. 98 (6), 1124-1132 (2018).
  31. Mammen, A. L., Huganir, R. L., O'Brien, R. J. Redistribution and stabilization of cell surface glutamate receptors during synapse formation. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7351-7358 (1997).
  32. Shi, S. H., et al. Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. Science. 284 (5421), 1811-1816 (1999).
  33. Zhang, Y., Cudmore, R. H., Lin, D. T., Linden, D. J., Huganir, R. L. Visualization of NMDA receptor-dependent AMPA receptor synaptic plasticity in vivo. Nature Neuroscience. 18 (3), 402-407 (2015).
  34. Hayashi, A., Asanuma, D., Kamiya, M., Urano, Y., Okabe, S. High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: Visualization of AMPA-type glutamate receptor endocytosis in living neurons. Neuropharmacology. 100, 66-75 (2016).
  35. Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends in Neuroscience. 27 (5), 257-261 (2004).
  36. Correa, S. A., Muller, J., Collingridge, G. L., Marrion, N. V. Rapid endocytosis provides restricted somatic expression of a K+ channel in central neurons. Journal of Cell Science. 122, 4186-4194 (2009).
  37. Waung, M. W., Pfeiffer, B. E., Nosyreva, E. D., Ronesi, J. A., Huber, K. M. Rapid translation of Arc/Arg3.1 selectively mediates mGluR-dependent LTD through persistent increases in AMPAR endocytosis rate. Neuron. 59 (1), 84-97 (2008).
  38. Shepherd, J. D., et al. Arc/Arg3.1 mediates homeostatic synaptic scaling of AMPA receptors. Neuron. 52 (3), 475-484 (2006).
  39. Klein, M. E., Castillo, P. E., Jordan, B. A. Coordination between Translation and Degradation Regulates Inducibility of mGluR-LTD. Cell Reports. , (2015).
  40. Chang, P. K., Verbich, D., McKinney, R. A. AMPA receptors as drug targets in neurological disease--advantages, caveats, and future outlook. European Journal of Neuroscience. 35 (12), 1908-1916 (2012).
  41. Hsieh, H., et al. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss. Neuron. 52 (5), 831-843 (2006).
  42. DeKosky, S. T., Scheff, S. W. Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer's disease: correlation with cognitive severity. Annals of Neurology. 27 (5), 457-464 (1990).
  43. Gu, Z., Liu, W., Yan, Z. {beta}-Amyloid impairs AMPA receptor trafficking and function by reducing Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II synaptic distribution. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10639-10649 (2009).
  44. Grooms, S. Y., Opitz, T., Bennett, M. V., Zukin, R. S. Status epilepticus decreases glutamate receptor 2 mRNA and protein expression in hippocampal pyramidal cells before neuronal death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (7), 3631-3636 (2000).
  45. Yamashita, T., Kwak, S. The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Brain Research. 1584, 28-38 (2014).
  46. Huang, H. S., et al. Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons. Nature. 481 (7380), 185-189 (2011).

Tags

علم الأعصاب، 143 قضية، الاتجار، امبا، مستقبلات، المشبك، اللدونة، استيعاب، الالتقام، والرقابة، قوس، غلوتامات
مقايسة محتوى عالية لرصد امبا مستقبلات الاتجار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb,… More

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter