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Neuroscience

एक उच्च AMPA रिसेप्टर तस्करी की निगरानी के लिए सामग्री परख

doi: 10.3791/59048 Published: January 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

इंडो की एक गतिशील प्रक्रिया के माध्यम से संग्राहक किया जा सकता है-और उत्तेजक ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की exocytosis । यहां वर्णित एक सुलभ, उच्च सतह और आंतरिक रिसेप्टर जनसंख्या पूल को बढ़ाता है के लिए सामग्री परख है ।

Abstract

Postsynaptic के नलए और सेल की सतह से रिसेप्टर्स की एक महत्वपूर्ण व्यवस्था है जिसके द्वारा न्यूरॉन्स विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए उनकी जवाबदेही का नियमन करते हैं । α-अमीनो-3-hydroxy-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA) रिसेप्टर्स, जो न्यूरॉन्स में तेजी से उत्तेजक synaptic संचरण के लिए जिम्मेदार हैं, के लिए और postsynaptic सतह से गतिशील रूप से न्यूरॉन्स को बदलने के लिए तस्करी कर रहे हैं उत्तेजित । AMPA रिसेप्टर ्े synaptic प्लास्टिक के लिए जरूरी है और न्यूरोलॉजिकल बीमारी में खलल डाल सकता है । हालांकि, रिसेप्टर तस्करी की अनदेखी पूरे रिसेप्टर पूल को बढ़ाता के लिए प्रचलित दृष्टिकोण, पीढ़ी समय कर रहे हैं और श्रम-गहन, या संभावित सामान्य तस्करी तंत्र को बाधित और इसलिए परिणामस्वरूप डेटा की व्याख्या जटिल. हम एक उच्च दोनों सतह और आंतरिक AMPA रिसेप्टर की आबादी में ठहराव के लिए सामग्री परख वर्तमान में दोहरी फ्लोरोसेंट immunolabeling और एक के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट ९६-अच्छी तरह से microplate स्कैनर का उपयोग कर संस्कृतिपूर्ण प्राथमिक हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस । यह दृष्टिकोण थोक आंतरिक और सतह रिसेप्टर घनत्व की तेजी से जांच की सुविधा जबकि नमूना सामग्री को कम करने. हालांकि, हमारे विधि एकल सेल संकल्प प्राप्त करने या लाइव सेल इमेजिंग का आयोजन करने में सीमाएं हैं । अंत में, इस प्रोटोकॉल अंय रिसेप्टर्स और विभिंन प्रकार के सेल के लिए उत्तरदाई हो सकता है, उचित समायोजन और अनुकूलन प्रदान की है ।

Introduction

परिमाण और ंयूरॉन उत्तेजितता के लौकिक गतिशीलता काफी हद तक की उपलब्धता और सतह रिसेप्टर आबादी है जो transduce विद्युत संकेतों की संरचना पर निर्भर है । जबकि नए रिसेप्टर्स के संश्लेषण (या रिसेप्टर उपइकाईओं) आम तौर पर एक ऊर्जावान महंगा और अपेक्षाकृत लंबी प्रक्रिया है, सेलुलर मशीनरी के एक मेजबान इंडो करने के लिए समर्पित-और मौजूदा रिसेप्टर्स की exocytosis उनके तेजी से प्रविष्टि के लिए एक साधन प्रदान और झिल्ली1से और हटाने के लिए । इसलिए, रिसेप्टर्स के transcriptional और शोधों के नियमन के अलावा, posttranslational रिसेप्टर की तस्करी न्यूरॉनी उत्तेजित करने का एक महत्वपूर्ण मॉडुलन है.

Synaptic प्लास्टिक, या अनुभव के साथ ंयूरॉंस के बीच कनेक्शन की बदलती ताकत, सीखने और स्मृति2,3के आधार के रूप में सोचा है । समय के साथ synapses के मजबूत और कमजोर, दीर्घकालिक potentiation (LTP) और दीर्घकालिक अवसाद (लिमिटेड), क्रमशः, α-अमीनो-3-hydroxy-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA) रिसेप्टर्स की तस्करी के माध्यम से संग्राहक जा सकता है 4 , 5. AMPA रिसेप्टर्स चार उपइकाईयों (GluA1-4) से बना heterotetramers हैं, और मस्तिष्क6में तेजी से उत्तेजक synaptic संचरण के बहुमत मध्यस्थता. इस प्रकार, न्यूरॉन उत्तेजित करने के लिए ग्लूटामेट द्वारा सक्रिय किया जा करने के लिए उपलब्ध postsynaptic सतह पर AMPA रिसेप्टर्स की मात्रा का एक समारोह में बड़े हिस्से में है । लिमिटेड सामांयतः AMPA रिसेप्टर endocytosis में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि LTP मुख्य रूप से AMPA रिसेप्टर exocytosis में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है. AMPA रिसेप्टर्स की Postsynaptic सतह अभिव्यक्ति exocytotic प्रोटीन के लिए endosomal वितरण की आवश्यकता है, जहां प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूजन तो एक कैल्शियम निर्भर तरीके से होता है7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. वहां भी तंत्र है कि गतिविधि पर निर्भर AMPA रिसेप्टर endocytosis को विनियमित के एक मेजबान मौजूद हैं । इस का एक उदाहरण तत्काल जल्दी जीन चाप के माध्यम से है/arg 3.1 (चाप) । अन्य15कार्यों के अलावा, चाप metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर मध्यस्थता करने के लिए जाना जाता है (mGluR)-निर्भर लिमिटेड अपने बाध्यकारी भागीदारों के माध्यम से AMPA रिसेप्टर endocytosis को बढ़ावा देने, जो endocytic प्रोटीन एपी-2, endophilin-3, और dynamin-2 शामिल 16 , 17 , 18 , 19, clathrin-लेपित गड्ढ़े20,21पर । आंतरिक AMPA रिसेप्टर्स या तो क्षरण के लिए प्लाज्मा झिल्ली या निर्धारित को वापस पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है22,23.

महत्वपूर्ण बात, AMPA रिसेप्टर्स की उपइकाई संरचना उनके तस्करी गतिशीलता24के लिए योगदान देता है. प्रमुख प्रासंगिकता के intracellular सी-टर्मिनल डोमेन उपइकाईयों की है, जहां posttranslational संशोधनों और तस्करी से संबंधित प्रोटीन बातचीत के बहुमत होते हैं । GluA1 और GluA4 उपइकाई-AMPA रिसेप्टर्स युक्त विशेष रूप से LTP के दौरान सेल की सतह के लिए अवैध तस्करी किया जा रहा है, उनके PDZ लाइगैंडों की उपस्थिति के कारण भाग में, ~ ९० एमिनो एसिड दृश्यों कि विभिन्न PDZ के साथ बातचीत के माध्यम से झिल्ली एंकरिंग को बढ़ावा देने के डोमेन-प्रोटीन युक्त25,26. दूसरी ओर, AMPA रिसेप्टर्स युक्त GluA2 और कमी GluA1 या GluA4 के लिए constitutively तस्करी हो जाते हैं, लेकिन intracellularly27गतिविधि के साथ जमा synaptic. GluA2 उपयूनिटों से गुजरना आरएनए संपादन जो, endoplasmic जालिका28में प्रतिधारण को बढ़ावा देने के अलावा,29कैल्शियम के लिए चैनल ताकना अभेद्य renders, आगे के एक प्रमुख मध्यस्थ के रूप में उपइकाई विशेष तस्करी फंसाने ंयूरॉन homeostasis और प्लास्टिक । दिलचस्प है, ubiquitin निर्भर चाप गिरावट के विघटन GluA1 endocytosis बढ़ाने के लिए और GluA2 उपइकाई की सतह अभिव्यक्ति-AMPA रिसेप्टर्स युक्त mGluR की प्रेरण के बाद चयनात्मक समूह मैं mGluR एगोनिस्ट के साथ लिमिटेड में वृद्धि दिखाया गया है ()-3, 5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG), यह दर्शाता है कि बहुत रहता है तंत्र और उपइकाई की भूमिका के बारे में सीखा है विशिष्ट AMPA रिसेप्टर30तस्करी ।

रिसेप्टर्स की सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन देख के लिए तरीके अक्सर बोझिल हैं, समय लेने वाली, या अनावश्यक निराधार परिचय । बायोटिन आधारित परख एक व्यापक और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दृष्टिकोण हैं । biotinylated सतह रिसेप्टर्स के अपनत्व शुद्धि एक ऐसा उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन ट्रो प्रदर्शन की आवश्यकता नमूना सामग्री की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है और कई उपचार की स्क्रीनिंग प्रदान कर सकते हैं एक नकारात्मक स्तर तक लंबा प्रक्रिया३१. इस परख के एक्सटेंशन, जहां लेबलिंग और immunoprecipitations के कई समय अंक के लिए एक प्रारंभिक संकेत के क्रमिक क्षरण मात्रा का प्रदर्शन कर रहे हैं, इसी तरह की उपेक्षा के अलावा नए या पुनर्नवीनीकरण-रिसेप्टर्स सेल सतह के लिए और केवल ख़राब समय और सामग्री आवश्यकताओं ।

अंय दृष्टिकोण chimeric का निर्माण या फ्लोरोसेंट टैग के अलावा का उपयोग करने के लिए रिसेप्टर तस्करी३२का पालन करना, कभी-लाइव सेल इमेजिंग३३,३४का उपयोग कर । जबकि संभावित शक्तिशाली, इन डिजाइनों में उत्परिवर्तनों या आणविक वजन इन प्रोटीन में शुरू में नाटकीय परिवर्तन के कारण रिसेप्टर्स के सामांय तस्करी पैटर्न को प्रभावित कर सकते हैं । रंजक है कि कम पीएच३४,३५ लक्ष्यीकरण द्वारा सेलुलर डिब्बों लेबल का उपयोग गैर विशिष्ट है और अलग intracellular रिसेप्टर की तस्करी के लिए महत्वपूर्ण डिब्बों के बीच भेद करना (जैसे lysosomes आणि proteasomes) वाटतो. अंत में, फोकल माइक्रोस्कोपी के उपयोग की तस्करी और गिरावट के साथ जुड़े मार्करों के साथ रिसेप्टर्स की colocalization कल्पना करने के लिए, ऐसे endosomal प्रोटीन या clathrin के रूप में, जबकि संभावित साथ विशिष्ट स्थानीयकरण में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान सेलुलर संकल्प, समय, श्रम गहन, और व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक कोशिका का विश्लेषण और फोकल या सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता की आवश्यकता के कारण महंगा है ।

यहां, हम एक उच्च सामग्री रिसेप्टर तस्करी परख है कि प्राथमिक न्यूरॉन्स संस्कृति की तैयारी30के साथ संगत है प्रदर्शन । इस विधि अलग सतह और स्थिर ंयूरॉंस की intracellular रिसेप्टर पूल लेबल, सामान्यीकृत सतह या कि रिसेप्टर के लिए समग्र घनत्व के लिए आंतरिक रिसेप्टर घनत्व के अनुपात के रूप में डेटा की प्रस्तुति को सक्षम करने से. इस विधि के उच्च सामग्री प्रकृति एक कम समय सीमा में कई उपचार और/या पादी स्क्रीनिंग के लिए आदर्श है, और केवल मानक सेल संवर्धन और एंटीबॉडी मशीन विशेषज्ञता की आवश्यकता है ।

संक्षेप में, प्राथमिक ंयूरॉंस मानक ९६ में हो-अच्छी तरह से microplates और फिर प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा तय के रूप में इलाज, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन, धोया, और तय की । कोशिकाओं तो एक माध्यमिक एंटीबॉडी सतह रिसेप्टर्स लेबल, एक और निर्धारण कदम के बाद के साथ मशीन हैं । Permeabilization तब होता है और एक दूसरे द्वितीयक एंटीबॉडी आंतरिक रिसेप्टर पूल लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है । अंत में, कोशिकाओं को एक अवरक्त फ्लोरोसेंट microplate स्कैनर का उपयोग करने के लिए प्रत्येक रिसेप्टर जनसंख्या के एकीकृत घनत्व मात्रा imaged रहे हैं । चित्रा 1 एक पारंपरिक biotinylation परख की तुलना में हमारे उच्च सामग्री परख संक्षेप ।

जबकि प्रोटोकॉल यहां की पेशकश की प्राथमिक हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन संस्कृतियों में AMPA रिसेप्टर तस्करी के लिए अनुकूलित और विशिष्ट है, इस प्रक्रिया, सिद्धांत में, बढ़ाया जा सकता है और सेल प्रकार की एक किस्म में विभिंन रिसेप्टर्स के लिए अनुकूलित ।

Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा जॉर्जिया राज्य विश्वविद्यालय में अनुमोदित किया गया है ।

1. प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स (लामिना फ्लो हूड में) की तैयारी

  1. मिश्रित सेक्स जन्मोत्तर दिवस (पी) 0-1 चूहों से प्राथमिक हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस को अलग के रूप में पहले से वर्णित३६
  2. प्लेट न्यूरॉन्स में ९६-अच्छी तरह से पाली-डी-lysine लेपित microplates के घनत्व पर 2 x 104 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से.
  3. 50x बी-27 के 10 मिलीलीटर जोड़कर न्यूरॉन्स खिलाने के लिए मीडिया तैयार, 5 मिलीलीटर की 100x Glutamine, २४२ µ एल के 10 मिलीग्राम/एमएल 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) और 10 µ के एल 10 मिलीग्राम/एमएल गेन्तमयसीं से ४८५ मिलीलीटर के लिए ंयूरॉन मीडिया ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  4. फ़ीड ंयूरॉंस पूर्व के आधे (१०० µ एल) से पहले के रूप में वर्णित३६ मौजूदा मीडिया (वातानुकूलित मीडिया, जो घटक है कि न्यूरॉन अस्तित्व का समर्थन शामिल है के रूप में संदर्भित) से एक अच्छी तरह से और ३७ के १०० µ एल की जगह हर 3-4 दिन १.३ चरण में तैयार । २.३ चरण के लिए 4 ˚ C पर प्रत्येक खिला से वातानुकूलित मीडिया की दुकान ।

2. मापने AMPA रिसेप्टर DHPG के जवाब में तस्करी (लामिना फ्लो हूड में)

  1. इन विट्रो (DIV) 14 में दिन में, Tetrodotoxin के एक ५०० µ एल शेयर समाधान तैयार (TTX) 2 मिमी की एकाग्रता में सेल संस्कृति ग्रेड पानी का उपयोग कर ।
    सावधानी: TTX एक neurotoxin है । सावधानी से संभालें और त्वचा के साथ संपर्क से बचें ।
  2. एक मल्टी चैनल पिपेट का प्रयोग, ९६ के प्रत्येक अच्छी तरह से १०० µ एल निकालें-न्यूरॉन्स और पूल मीडिया की खैर microplate.
  3. TTX के 4 µ m समाधान बनाने के लिए २.२ चरण से pooled वातानुकूलित मीडिया के 1 मिलीलीटर के लिए TTX स्टॉक समाधान के 2 µ l जोड़ें । यदि नहीं है पर्याप्त pooled कंडीशन्ड मीडिया, फिर का उपयोग कुछ संग्रहीत वातानुकूलित मीडिया से चरण १.४ ।
  4. उपचार न्यूरॉन्स के साथ १०० µ l/4 µ मीटर के समाधान से TTX के चरण २.३. 4 एच के लिए ३७ ° c में एक 5% सह2 मशीन में microplate प्लेस ।
  5. एक सक्शन लाइन के लिए एक बाँझ कांच पाश्चर पिपेट संलग्न और पिपेट की नोक करने के लिए एक बाँझ २०० µ एल पिपेट अंत संलग्न. मीडिया को एक अच्छी तरह से ध्यान से निकालें । microplate जहां ंयूरॉंस स्थित है के नीचे छूने से बचें ।
  6. एक अच्छी तरह से कमरे के तापमान न्यूरॉन्स मीडिया के २०० µ एल जोड़ें.
  7. 5% सह2 में 15 मिनट की मशीन के लिए कमरे के तापमान पर microplate मशीन पसंद है लेकिन आवश्यक नहीं है ।

3. Immunolabelling (लामिना फ्लो हूड में)

  1. एंटी-GluA1 या एंटी-GluA2 एंटीबॉडी के एक 1:150 कमजोर पड़ने को न्यूरॉन मीडिया में तैयार करें.
  2. न्यूरॉन मीडिया निकालें चरण २.६ में जोड़ा गया है । विरोधी GluA1 या विरोधी के ५० µ एल जोड़ें GluA2 एंटीबॉडी समाधान इसी कुओं के लिए 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एंटीबॉडी बाध्यकारी अनुमति देते हैं । माध्यमिक एंटीबॉडी केवल कुओं को नियंत्रित करने के लिए ंयूरॉन मीडिया के ५० µ एल जोड़ें ।
  3. चरण ३.२ में जोड़े गए एंटीबॉडी समाधान निकालें । धो microplate 3 बार के साथ १०० µ एल/अच्छी तरह से कमरे के तापमान न्यूरॉन मीडिया किसी भी असीम एंटीबॉडी को दूर करने के लिए.
  4. DHPG के एक ५० mM स्टॉक समाधान में न्यूरॉन मीडिया या सेल संस्कृति ग्रेड पानी बनाओ । भंवर संक्षेप में पूरी तरह से DHPG भंग करने के लिए समाधान । प्रयोग के उसी दिन इस समाधान को ताजा तैयार करें । पुराने या गल चुके समाधानों के उपयोग से बचें ।
  5. 1:500 के लिए एक १०० µ मीटर समाधान बनाने के लिए न्यूरॉन मीडिया में स्टॉक समाधान पतला.
  6. मौजूदा मीडिया को प्रत्येक कुआं से निकालें । जोड़ें १०० µ १०० µ मीटर DHPG स्टॉक समाधान के चरण ३.५ से/ मशीन में ३७ ° c में 5% CO2 में 10 मिनट के लिए microplate मशीन ।
  7. DHPG समाधान निकालें चरण ३.६ में जोड़ा गया और जोड़ें १०० µ l/अच्छी तरह से न्यूरॉन मीडिया. इस चरण को एक और बार दोहराएं । मशीन में 5% सह2 में ३७ ° c में microplate प्लेस 5 मिनट के लिए ।
  8. प्रयोग के उसी दिन पंजाबियों में 4% paraformaldehyde/4% सुक्रोज समाधान बनाने के लिए सुक्रोज जोड़ें । पुराने या गल चुके समाधानों के उपयोग से बचें । चरण ३.७ में जोड़े गए मीडिया निकालें । Add १०० µ l/4% paraformaldehyde/4% सुक्रोज समाधान । दोहराएं चरण ३.६ – ३.८ प्रत्येक अतिरिक्त समय-बिंदु के लिए । एक बार पूरा, 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर microplate मशीन ।
    सावधानी: एक धुएं डाकू में paraformaldehyde स्टॉक संभाल ।
  9. चरण ३.८ से निर्धारण निकालें और कोल्ड 1x DPBS के १०० µ l/
  10. निकाल DPBS. जोड़ें १५० µ एल/खैर बफर अवरुद्ध (टीबीएस में एक तैयार करने के लिए उपयोग के निर्माण, सामग्री की तालिकाको देखें) और ९० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में मशीन ।

4. लेबलिंग भूतल रिसेप्टर्स

  1. 680RD बकरी विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी के एक 1:1500 कमजोर पड़ने बफर अवरुद्ध में तैयार करते हैं ।
  2. ३.१० चरण से ब्लॉकिंग बफ़र निकालें । जोड़ें ५० µ द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान और ६० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन की अच्छी तरह से । द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ रहे हैं एक बार प्रकाश से संरक्षित microplate रखें. बाद की गर्मी के दौरान प्रकाश से microplate की रक्षा करने के लिए जारी रखने के लिए सुनिश्चित करें ।
  3. समाधान से चरण ४.२ निकालें । जोड़ें १०० µ l/well टीबीएस (५० mm Tris-HCl, १५० mm NaCl, पीएच ७.६) और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । इस चरण को 4 अतिरिक्त बार दोहराएं ।
  4. चरण ४.३ से टीबीएस निकालें । Add १०० µ l/4% paraformaldehyde/4% पंजाब में सुक्रोज और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  5. ४.४ चरण से समाधान निकालें । Add १०० µ l/अच्छी तरह से टीबीएस और कमरे के तापमान पर मशीन 5 मिनट के लिए दोहराएं इस चरण 2 अतिरिक्त बार दोहराएँ ।

5. आंतरिक रिसेप्टर जनसंख्या लेबलिंग

  1. ०.२% saponin युक्त टीबीएस तैयार करें । भंवर saponin पाउडर पूरी तरह से भंग करने के लिए संक्षेप में समाधान । स्वत:-प्रतिदीप्ति कारण हो सकता है किसी भी कणों को निकालने के लिए एक ०.२ µm फ़िल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर करें ।
  2. जोड़ें १५० µ एल टीबीएस ०.२% युक्त saponin और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  3. निकालें saponin समाधान से चरण ५.२ और जोड़ें १५० µ l/अच्छी तरह से अवरुद्ध बफ़र । ९० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  4. 800CW गधे विरोधी माउस के 1:1500 कमजोर पड़ने बफर अवरुद्ध में आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार करते हैं ।
  5. चरण ५.३ से ब्लॉकिंग बफ़र निकालें, और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के ५० µ l/well जोड़ें । ६० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  6. Add १०० µ l/अच्छी तरह से टीबीएस और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी इस चरण 4 अतिरिक्त बार दोहराएँ ।

6. इमेजिंग और विश्लेषण

  1. छवि ९६-अच्छी तरह से microplate एक अवरक्त लेजर इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर निर्माता के निर्देशों के अनुसार । स्कैन रिज़ॉल्यूशन ८४ µm करने के लिए सेट करें, मध्यम करने के लिए स्कैन गुणवत्ता और फोकस ऑफ़सेट ९६-well microplate उपयोग की आधार ऊँचाई के अनुसार । "छवि स्टूडियो" मेनू बटन → निर्यात → डिजिटल मीडिया के लिए छवि → ३०० dpi के एक संकल्प पर निर्यात छवियों TIFF प्रारूप में पर क्लिक करें ।
  2. डाउनलोड छवि जंमू https://imagej.net/Fiji/Downloads में "फिजी"
  3. छवि जंमू में खुला छवि "फिजी" । "छवि" मेनू पर क्लिक करके विभाजित रंग चैनल
    रंग → विभाजन चैनल ।
  4. "विश्लेषण" → "उपकरण" से रॉय प्रबंधक खोलें । नंबर के साथ हलकों लेबल करने के लिए रॉय प्रबंधक में बॉक्स "लेबल" की जाँच करें.
  5. लाल चैनल (६८० एनएम सतह रिसेप्टर पूल) में, सर्कल उपकरण का चयन करके ब्याज के क्षेत्र (रॉय) का चयन करें और एक चक्र है कि सही ढंग से पहली अच्छी तरह से फिट बैठता है ड्राइंग । ctrl + T दबाएं ।
  6. वृत्त को अगली अच्छी तरह खींचें और सभी कुओं को घेरे जाने तक ctrl + T दोहराएँ दबाएँ.
  7. रॉय प्रबंधक से, "माप" पर क्लिक करें. प्रकट होने वाले मानों का चयन करें और उंहें किसी स्प्रेडशीट पर प्रतिलिपि बनाएं ।
  8. ग्रीन चैनल पर क्लिक करें (८०० एनएम आंतरिक रिसेप्टर पूल) और फिर छवि के लिए ६.६ कदम से चयनित ROIs स्थानांतरित । रॉय प्रबंधक से, "माप" पर क्लिक करें. प्रकट होने वाले मानों का चयन करें और उंहें किसी स्प्रेडशीट पर प्रतिलिपि बनाएं ।
  9. माध्यमिक केवल नियंत्रण कुओं से औसत एकीकृत घनत्व मूल्यों की गणना । प्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह से औसत माध्यमिक केवल सतह रिसेप्टर पूल के लिए एकीकृत घनत्व मूल्यों को नियंत्रित करने के लिए एकीकृत घनत्व मूल्यों घटाना । आंतरिक रिसेप्टर पूल के लिए इस चरण को दोहराएँ ।
  10. की सतह रिसेप्टर अभिव्यक्ति में परिवर्तन की गणना rs/का उपयोग कर, जहां आरएस की सतह रिसेप्टर्स के एकीकृत घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है और आरटी सतह रिसेप्टर्स के एकीकृत घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है + के एकीकृत घनत्व आंतरिक रिसेप्टर्स ।

Representative Results

आर्क/arg 3.1 AMPA रिसेप्टर endocytosis के साथ बातचीत के माध्यम से तेजी लाने एपी-2, endophilin-3 और dynamin-216,18 निम्नलिखित mGluR सक्रियण३७. आर्क में दस्तक में माउस (ArcKR), lysines २६८ और २६९ चाप प्रोटीन में arginine, जो चाप ubiquitination के साथ हस्तक्षेप के लिए रूपांतरित हो रहे हैं । इस बिगड़ा proteasome चाप के आश्रित कारोबार और ंयूरॉंस में अपने आधे जीवन को लंबे समय तक21,30। इस प्रयोग में, AMPA रिसेप्टर तस्करी को विनियमित करने में चाप के हठ उच्च सामग्री AMPA रिसेप्टर तस्करी परख का उपयोग कर जांच की थी । न्यूरॉन्स ना के साथ इलाज किया गया था+ चैनल अवरोधक TTX, जो कार्रवाई क्षमता को रोकता है और arc स्तर३८, DHPG द्वारा पीछा कम कर देता है, जो चाप अनुवाद और ubiquitination३७,३९लाती है. दोनों सतह और GluA1 के आंतरिक पूल-(चित्रा 2a) और GluA2 युक्त (चित्रा 3ए) AMPA रिसेप्टर उपइकाइयों 5 और 15 मिनट में DHPG वॉशआउट के बाद मापा गया । इस विशेष प्रयोग 3 स्वतंत्र प्रयोगों से तीन तकनीकी प्रतिकृति इस्तेमाल किया । ArcKR न्यूरॉन्स दिखाया GluA1 endocytosis जब DHPG के साथ इलाज किया WT न्यूरॉन्स की तुलना में, एक प्रभाव है कि नहीं देखा गया था जब न्यूरॉन्स केवल TTX (चित्रा बी) के साथ इलाज कर रहे थे. GluA2 उपइकाइयों की सतह अभिव्यक्ति काफी कम समय अंक पर WT ंयूरॉंस की तुलना में बढ़ गया था (चित्र बी), एक संभावित इकाई प्रतिस्थापन30का संकेत है । कुछ कुओं माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ केवल पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए नियंत्रण के लिए विशिष्ट बाध्यकारी के कारण इलाज किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: रिसेप्टर biotinylation परख करने के लिए AMPA रिसेप्टर उच्च सामग्री तस्करी परख की तुलना. उच्च सामग्री की तस्करी परख मानक biotinylation परख की तुलना में कम समय और संसाधनों का उपभोग करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सतह और WT और ArcKR हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस में GluA1 AMPA रिसेप्टर उपइकाईयों की आंतरिक आबादी । (A) सतह (sGluA1) और आंतरिक (iGluA1) GluA1-युक्त AMPA रिसेप्टर उपइकाईयों में WT और ArcKR हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में 5 और 15 मिनट के बाद DHPG वॉशआउट. WT की तुलना में, ArcKR न्यूरॉन्स DHPG वॉशआउट के बाद sGluA1-युक्त AMPA रिसेप्टर पूल 5 और 15 मिनट में एक और कमी है. () ग्राफ सतह प्रतिदीप्ति कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए सामान्यीकृत का प्रतिनिधित्व करता है । सांख्यिकीय तुलना किया गया एक तरह से ANOVA का उपयोग कर, युग्मित और छात्र टी एक ख़राब परीक्षण । *p ≤ ०.०५; 3 स्वतंत्र प्रयोगों से एन = 3 तकनीकी प्रतिकृति. मूल्यों का प्रतिनिधित्व ± SEM मतलब है । यह आंकड़ा वॉल, एम जे एट अल २०१८30से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सतह और WT और ArcKR हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस में GluA2 AMPA रिसेप्टर उपइकाईयों की आंतरिक आबादी । () चित्रा 2के रूप में एक ही प्रायोगिक शर्त । WT की तुलना में, ArcKR न्यूरॉन्स DHPG वॉशआउट के बाद sGluA2-युक्त AMPA रिसेप्टर पूल 5 मिनट में वृद्धि हुई है. () ग्राफ सतह प्रतिदीप्ति कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए सामान्यीकृत का प्रतिनिधित्व करता है । सांख्यिकीय तुलना किया गया एक तरह से ANOVA का उपयोग कर, युग्मित और छात्रों के टी एक ख़राब परीक्षण । *p ≤ ०.०५; 3 स्वतंत्र प्रयोगों से एन = 3 तकनीकी प्रतिकृति. मूल्यों का प्रतिनिधित्व ± SEM मतलब है । यह आंकड़ा वॉल, एम जे एट अल २०१८30से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

AMPA रिसेप्टर्स एक ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर उपप्रकार है कि ंयूरॉन कार्यों जो synapse गठन, synapse स्थिरता, और synaptic प्लास्टिक शामिल हैं के लिए अभिंन अंग है । AMPA रिसेप्टर व्यवधान कई स्नायविक विकारों24 से जुड़ा हुआ है और आकर्षक दवा लक्ष्य४०माना जाता है । उदाहरण के लिए, अध्ययनों से पता चला है कि अल्जाइमर रोग (AD) के जल्द से एक लक्षण synapse हानि और कम synaptic AMPA रिसेप्टर स्तर४१,४२है । साज़िश, Amyloid के अलावा-ß oligomers ख़राब सतह GluA1-synapses४३पर AMPA रिसेप्टर अभिव्यक्ति युक्त । इसके अलावा, स्थिति एपिलेप्टिकस नीचे-विनियमित GluA2 mRNA और हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस में प्रोटीन उनकी मौत४४पूर्ववर्ती । पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS) में, राल डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (तेदेपा-४३) विकृति, एक ALS विशिष्ट आणविक विषमता, अक्षम GluA2 क्ष/आर साइट-आरएनए संपादन४५से जोड़ा गया है ।

उच्च सामग्री AMPA रिसेप्टर तस्करी परख विभिंन कारकों के जवाब में एक ंयूरॉंस नेटवर्क के भीतर रिसेप्टर तस्करी प्रोफाइल में थोक परिवर्तन को मापने के लिए एक प्रभावी साधन प्रदान करता है, खपत बहुत कम समय और वैकल्पिक तरीकों से सामग्री । एक एकल ९६-अच्छी तरह से microplate एक ही थाली में विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए कई तकनीकी प्रतिकृति और नियंत्रण चलाने के लिए कई कुओं प्रदान करता है. कम चढ़ाना घनत्व के 2 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से घनत्व 5 x 105 कोशिकाओं के सापेक्ष/काफी मात्रा में पशुओं और प्रत्येक प्रयोग (चित्रा 1) के लिए आवश्यक सामग्री की संख्या कम कर देता है । अवरक्त स्कैनर ६ ९६ अप करने के लिए छवि एक समय में अच्छी तरह से microplates कर सकते हैं । परख भी एक ३८४ के लिए संशोधित किया जा सकता है-अच्छी तरह से microplate४६, जो विशेष रूप से मूल्यवान अगर परख कीमती नमूने है कि प्राप्त करने के लिए मुश्किल है या संस्कृति को महंगा कर रहे है पर चला जाता है (जैसे मानव नमूने और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल) हो जाता है । पूरे परख पूरा किया जा सकता है और एक ही दिन है, जो बहुमूल्य समय बचाता है पर विश्लेषण (चित्रा 1) ।

सफल और कुशल परख के पूरा होने के लिए, कुछ बिंदुओं पर विचार करने की आवश्यकता है । सबसे पहले, यह ंयूरॉन उपचार के एक ही दिन पर DHPG समाधान तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है । पुनः प्रयोग या DHPG स्टॉक फ्रीज नहीं है । 4% paraformaldehyde/पंजाब के समाधान में सुक्रोज को भी प्रयोग के उसी दिन ताजा कर दिया जाना चाहिए । दूसरा, नियंत्रण कुओं TTX केवल या वाहन के साथ इलाज सुनिश्चित करने के लिए कि प्रभाव मनाया उपचार के लिए विशिष्ट है की आवश्यकता है । यह भी केवल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी द्वारा उत्पादित पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए नियंत्रण के लिए कुओं का इलाज शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है । ध्यान दें कि दूसरा निर्धारण कदम (माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद वॉशआउट) माध्यमिक एंटीबॉडी पृष्ठभूमि प्रभाव को कम करने और रिसेप्टर उपइकाईयों के प्रभावी लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.

समझौता और सीमाएं, किसी भी विधि के रूप में मौजूद हैं । इस परख एकल सेल (या सेलुलर) संकल्प प्रदान नहीं करता है और वास्तविक समय अंय तरीकों३२,३३,३५की तरह रिसेप्टर तस्करी की ट्रैकिंग के लिए अनुमति नहीं है । इसके अतिरिक्त, न्यूरॉन्स के permeabilization कदम के दौरान उचित देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि यह विधि ओवर-permeabilization के मामले में intracellular घटकों के लीक होने के प्रति संवेदनशील होगी.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए जाकारी एलन धंयवाद । यह काम व्हाइटहॉल फाउंडेशन (ग्रांट 2017-05-35) और Cleon सी. Arrington अनुसंधान दीक्षा अनुदान कार्यक्रम (रिग-९३) के लिए A.M.M. M.A.G. और D.W.Y. दोनों एक जॉर्जिया राज्य विश्वविद्यालय Neurogenomics 2CI फैलोशिप द्वारा समर्थित थे द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal EMD Millipore Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 ThermoFisher Scientific Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15
(RS)-3,5-DHPG Tocris Bio-Techne Cat#0342
Tetrodotoxin Citrate (TTX) Tocris Bio-Techne Cat#1069
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich Cat#P7280-5X5MG
Saponin ACROS Organics Cat# 419231000
B-27 Supplement (50x), Serum Free Gibco Cat#17504044
Glutamax Supplement Gibco Cat#35050061
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) Sigma-Aldrich Cat#F0503
Gentamycin (10 mg/mL) Gibco Cat#15710064
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified Electron Microscopy Sciences Cat#19210
Sucrose (EP/BP/NF) FisherScientific Cat#S2500GM
Odyssey Blocking Buffer (TBS) Li-COR Cat#927-50003 Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol
Cell Culture Grade Water HyClone Cat#SH30529.02
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco Cat#14190250
Neurobasal Medium, minus phenol red Gibco Cat#12348017 Referred to as "neuronal Media" in the protocol
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile Corning Cat#431219
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates Corning Cat#3603
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070
FIJI (Fiji is Just ImageJ) NIH http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285
Odyssey CLx imaging system Li-COR Biosciences

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एक उच्च AMPA रिसेप्टर तस्करी की निगरानी के लिए सामग्री परख
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Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).More

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).

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