Summary
신경 흥분의 엔도-동적 과정 및 exocytosis 흥분 성의 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 통해 변조 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 표면 및 내부 수용 체 인구 풀 측정에 대 한 접근, 하이 콘텐츠 분석 결과가입니다.
Abstract
Postsynaptic 수용 체 세포 표면에서의 매매는 뉴런 다른 자극에 그들의 응답을 조절 하는 중요 한 메커니즘이입니다. Α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용 체, 신경에 빠른 흥분 성의 시 냅 스 전송에 대 한 책임은, 동적으로 변경 하는 신경 흥분에 postsynaptic 표면에서 매매 됩니다. AMPA 수용 체 매매 시 냅 스가 소성에 대 한 필수적 이며 신경 질환에서 중단 될 수 있습니다. 그러나, 널리 접근 수용 체 매매 측정에 대 한 전체 수용 체 풀, 무시는 지나치게 시간-와 노동 집약, 또는 잠재적으로 정상적인 인신매매 메커니즘을 방해 하 고 결과 데이터의 해석에 따라서 복잡 하 게. 우리는 교양된 기본 hippocampal 신경 듀얼 형광 immunolabeling와 근 적외선 형광 96 잘 microplate 스캐너를 사용 하 여 표면 및 내부 AMPA 수용 체 인구의 정량화에 대 한 하이 콘텐츠 분석 결과 제시. 이 방법은 대량 내 면의 신속한 심사를 용이 하 게 하 고 샘플 자료를 최소화 하면서 수용 체 밀도 표면. 그러나, 우리의 메서드는 단일 셀 해상도 하거나 진행 하는 라이브 셀 이미징에 제한이 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜은 다른 수용 체와 다른 세포 유형, 적절 한 조정 및 최적화를 제공 하는 의무가 있을 수 있습니다.
Introduction
크기와 신경 흥분의 시간적 역학은 가용성과 전기 화학 신호로 transduce 표면 수용 체 인구의 구성에 크게 의존 합니다. 엔도-및 exocytosis 기존 수용 체의 세포질 기계 장치의 호스트 새로운 수용 체 (또는 수용 체 소 단위)의 합성은 일반적으로 정력적으로 비용과 상대적으로 장기 과정, 반면 그들의 빠른 삽입에 대 한 수단을 제공 그리고1막 제거. 따라서, 수용 체의 transcriptional 및 변환 규칙 뿐만 아니라 신경 흥분의 중요 한 변조기입니다 posttranslational 수용 체 인신 매매.
변화 경험, 뉴런 간의 연결 강도 또는 시 냅 스가 소성, 학습 및 메모리2,3의 기본 생각 이다. 강화 및 약화 시 냅 스 시간이 지남에, 장기 potentiation (LTP)와 장기 불경기 (주식 회사), 각각, 수 수 변조 α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용 체의 인신 매매를 통해 4 , 5. AMPA 수용 체 4 개의 소 단위 (GluA1-4)의 구성 하는 heterotetramers 그리고 대부분 뇌6빠른 흥분 성의 시 냅 시스 전송의 중재. 따라서, 신경 흥분 큰 부분에 있는 postsynaptic 표면 조미료에 의해 활성화 될 수에 AMPA 수용 체의 수량의 기능입니다. LTP는 AMPA 수용 체 exocytosis의 증가와 주로 관련 된 회사 AMPA 수용 체 endocytosis의 증가와 일반적으로 연결 됩니다. AMPA 수용 체 postsynaptic 표면 표현 exocytotic 단백질, 원형질 막으로 융합 다음 칼슘 의존 방식으로7,,89, 에서 발생 하는 위치에 endosomal 배달 해야 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 거기도 존재 하는 활동-종속 AMPA 수용 체 endocytosis 규제 메커니즘의 호스트. 이것의 한 예로 즉시 이른 유전자 호/Arg3.1 (아크)를 통해 이다. 15의 다른 기능 중 아크 metabotropic 글루타민 산 염 수용 체 (mGluR) 중재에 알려져 있다-AMPA 수용 체 endocytosis endocytic 단백질 AP 2, endophilin-3, 및 dynamin-2를 포함 하는 그것의 바인딩 파트너를 통해 홍보 하 여 종속 회사 16 , 17 , 18 , 19, clathrin 입히는에20,21구 덩이. 내 면된 AMPA 수용 체 원형질 막에 다시 재활용 하거나 저하22,23배정 될 수 있습니다.
중요 한 것은, AMPA 수용 체 소 단위 구성의 밀매 역학24에 기여 한다. 주요 관련성의 소 단위의 세포내 C 터미널 도메인 posttranslational 수정 및 매매 관련 단백질 상호 작용의 대부분 발생입니다. GluA1 및 GluA4 AMPA 수용 체 소 단위를 포함 하는 특히 경향이 되 고 매매 셀 표면에 LTP, 동안에 그들의 PDZ ligands, 홍보와 함께 다양 한 PDZ 상호 작용을 통해 고정 막 ~ 90 아미노산 시퀀스의 존재로 인해 도메인에 포함 된 단백질25,26. 다른 한편으로, GluA2를 포함 하 고 GluA1 또는 GluA4 부족 AMPA 수용 체 constitutively 매매 하지만 시 냅 스 활동27와 침 축적 경향이 있습니다. GluA2 소 단위 받을 RNA 편집,28바인딩과 그물 보존 홍보 뿐만 아니라 렌더링 채널 공 칼슘29, 스며들 지 않는 더 소 단위 특정 신경의 주요 중재자 밀매 연루 항상성 그리고가 소성입니다. 흥미롭게도, 유비퀴틴-종속 아크 저하의 위하여 보였다 GluA1 endocytosis를 증가 하 고 유도 선택적으로 mGluR 주식 회사의 그룹 I mGluR 주 작동 근 후 GluA2 AMPA 수용 체 소 단위를 포함 하는 표면 표현의 증가 (S)-3, 5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG), 나타내는 많은 메커니즘 및 소 단위 특정 AMPA 수용 체 밀매30의 역할에 대해 배울 수 있다.
수용 체의 표면 표현에 변화를 관찰 하는 방법 복잡, 시간이 소모 되는 또는 불필요 한 소개 혼동 한다. Biotin 기반 분석 실험은 만연 하 고 상업적으로 사용할 수 있는 접근. 그러나 전기 이동 법 수행의 필요성 많은 양의 시료를 필요로 하 고 엄청나게 긴 여러 치료의 심사를 렌더링할 수 있습니다 biotinylated 표면 수용 체의 친 화력 정화 한 예를 나타냅니다. 31을 처리 합니다. 어디 여러 시간 포인트 라벨 및 immunoprecipitations의 척도 초기 신호의 점진적 저하를 수행,이 분석 결과의 확장 마찬가지로 새로운 추가 게을리-또는 재생-표면 및 유일한 세포에 수용 체 악화 시간 및 재료 요구 사항입니다.
다른 접근의 공상 구문 사용 또는 수용 체 밀매32관찰 형광 태그 추가, 라이브 사용 하 여 때때로 세포 이미징33,34. 동안 잠재적으로 강력 하 고, 이러한 디자인 돌연변이 또는 분자량이이 단백질에 있는 극적인 변화 수용 체의 정상적인 매매 패턴을 발생할 수 있습니다. 낮은 pH34,35 를 대상으로 레이블 subcellular 구획 일반적인 있으며, 다른 세포내 구획 예. (수용 체 밀매 리소좀에 대 한 중요 한 구별 하 게 염료의 사용 그리고 proteasomes) 어려운. 마지막으로, 마커 매매 및 저하, endosomal 단백질 등 clathrin, 잠재적으로와 특정 지역화에 유용한 통찰력을 제공 하는 동안 관련 된 수용 체의 colocalization를 시각화 하는 confocal 현미경 검사 법의 사용 subcellular 해상도, 시간, 노동 집약적인, 그리고 개별적으로 각 셀의 confocal 요구 사항 분석의 필요성으로 인해 비용이 많이 드는 또는 슈퍼 해상도 현미경.
여기,이 콘텐츠 수용 체 밀매 분석 결과 주요 신경 문화 준비30와 호환 되는 설명 합니다. 이 메서드는 별도로 정규화 된 표면 또는 그 수용 체에 대 한 전반적인 밀도를 내 면된 수용 체 밀도의 비율으로 데이터의 프레 젠 테이 션을 사용 하는 고정된 뉴런의 표면 및 세포내 수용 체 풀 라벨. 이 방법의 높은 콘텐츠 자연 여러 치료 및/또는 짧은 시간 프레임에 genotypes 심사 이상적 이며 표준 세포 배양 및 항 체 외피 전문 지식이 필요로.
간단히, 기본 신경은 표준 96-잘 microplates에서 재배와 실험 설계에 의해 규정으로 처리, 기본 항 체와 알을 품을, 세척, 그리고 고정. 세포 표면 수용 체, 뒤에 다른 정착 단계를 이차 항 체와 다음 알을 품는. Permeabilization 다음 발생 하 고 두 번째 이차 항 체 수용 체는 내부 풀을 사용 됩니다. 마지막으로, 셀 각 수용 체 인구의 통합된 밀도 측정 하는 적외선 형광 microplate 스캐너를 사용 하 여 몇 군데 있습니다. 그림 1 에 전통적인 biotinylation 분석 결과 비해 우리의 하이 콘텐츠 분석 결과 요약 되어 있습니다.
프로토콜 제공 여기 AMPA 수용 체 기본 hippocampal 신경 문화에서 인신 매매에 대 한 특정 최적화 이며,이 절차 수, 이론에서 확장 되며 다양 한 종류의 세포에 있는 다른 수용 체에 대 한 적응.
Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 조지아 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 기본 Hippocampal 신경 세포 (층 류 두건)의 준비
- 혼합된 성 산 후 하루 (P)에서 기본 hippocampal 신경 분리 0-1 마우스 앞36에서 설명한.
- 플레이트 신경 96 잘 폴 리-D-리 신에 잘 당 2 x 104 의 세포의 밀도에서 microplates 코팅.
- 50의 10 mL를 추가 하 여 신경 세포를 먹이 대 한 미디어를 준비 B-27, 글루타민 x 100의 5 mL, 10 mg/mL 5-플 루 오로-2-deoxyuridine (FUDR)의 242 µ L, 10 x 10 mg/mL Gentamycin 신경 미디어 ( 재료의 표참조)의 485 mL의 µ L.
- 피드 뉴런 앞 절반을 제거 하 여36 에서 설명한 (100 µ L)의 각 우물에서 미디어 (신경 생존을 지 원하는 성분 포함 된 바른된 미디어 라고 함) 기존 37 ° C의 100 µ L를 대체 미디어 prewarmed 1.3 단계에서 준비 3-4 일 마다. 2.3 단계에 대 한 4˚C에서 각 먹이에서 바른된 미디어를 저장 합니다.
2. 측정 AMPA 수용 체 (층 류 두건)에서 DHPG에 대 한 응답에서 인신 매매
- 하루에 체 외 (DIV) 14, 500 µ L 재고 솔루션 테트로도톡신 (TTX)의 세포 배양을 사용 하 여 2 m m의 농도에서 학년 물 준비.
주의: TTX는 neurotoxin입니다. 신중 하 게 처리 하 고 피부와의 접촉을 피하십시오. - 다중 채널 피 펫을 사용 하 여, 뉴런의 96-잘 미 판의 각 우물에서 100 µ L를 제거 하 고 미디어 풀.
- 단계 TTX의 4 µ M 솔루션을 만드는 2.2에서에서 풀링된 바른된 미디어의 1 mL에 TTX 재고 솔루션의 2 µ L를 추가 합니다. 충분히 풀링된 바른된 미디어 없는 경우 다음 단계 1.4에서 저장된 조건된 미디어의 일부를 사용 합니다.
- 2.3 단계에서 100 µ L/잘 TTX의 4 µ M 솔루션의 뉴런을 취급 합니다. 장소는 5% CO2 배양 기 37 ° C에서 4 h에 대 한에 미 판.
- 연결 메 마른 유리 파스퇴르 흡입 라인에 플라스틱 및 살 균 200 µ L 피 펫 끝은 피 펫의 끝을 연결 합니다. 각 미디어를 잘 신중 하 게 제거 합니다. 뉴런 있는 microplate의 아래쪽을 만지지 마십시오.
- 각 잘을 실 온 신경 미디어의 200 µ L를 추가 합니다.
- 15 분 5% CO2 배양 선호 하지만 필요 하지 않습니다에 대 한 실 온에서 미 판 품 어.
3. Immunolabelling (에서 층 류 두건)
- 신경 미디어에서 안티-GluA1 또는 안티-GluA2 항 체의 1:150 희석을 준비 합니다.
- 단계 2.6에서 추가 신경 미디어를 제거 합니다. 항 체 바인딩 수 있도록 실 온에서 20 분에 대 한 해당 우물에 안티-GluA1 또는 안티-GluA2 항 체 해결책의 50 µ L를 추가 합니다. 이차 항 체만 제어 웰 스에 신경 미디어의 50 µ L를 추가 합니다.
- 3.2 단계에서 추가 항 체 솔루션을 제거 합니다. 3 번 어떤 언바운드 항 체를 제거 하려면 100 µ L/잘 실내 온도 신경 미디어와 미 판 세척.
- 신경 미디어 또는 셀 문화 학년 물 DHPG의 50 m m 재고 솔루션을 확인 합니다. 소용돌이 DHPG를 완전히 분해를 간단히 솔루션. 이 솔루션 신선한 실험의 같은 날에 준비 합니다. 오래 된 또는 해 동 솔루션을 사용 하지 마십시오.
- 100 µ M 솔루션 1: 500에 신경 미디어에서 재고 솔루션을 희석.
- 각 우물에서 기존 미디어를 제거 합니다. 단계 3.5에서 100 µ L/잘 100 µ M DHPG 재고 솔루션을 추가 합니다. 10 분 동안 37 ° c 5% CO2 에서 인큐베이터에서 미 판 품 어.
- 단계 3.6에서에서 추가 DHPG 솔루션을 제거 하 고 100 µ L/잘 신경 미디어를 추가 합니다. 이 단계를 한 번 더 반복 합니다. 5 분 동안 37 ° c 5% CO2 에서 인큐베이터에서 미 판 장소.
- 실험의 같은 날에 PBS에서 4 %paraformaldehyde/4% 자당 솔루션으로 만들기 위해 자당을 추가 합니다. 오래 된 또는 해 동 솔루션을 사용 하지 마십시오. 3.7 단계에서 추가 된 미디어를 제거 합니다. 4 %paraformaldehyde/4% 자당 솔루션의 100 µ L/잘 추가 합니다. 각 추가 시간 포인트 3.6-3.8 단계를 반복 합니다. 완료 되 면, 20 분 동안 4 ° C에서 microplate에 품 어.
주의: 증기 두건에서 paraformaldehyde 주식을 처리 합니다. - 3.8 단계에서 정착 액을 제거 하 고 차가운 1 x DPBS의 100 µ L/잘 추가.
- DPBS 제거 합니다. 추가 150 µ L/잘 버퍼 (TBS에서 준비-사용 배합 재료의 표참조)를 차단 하 고 또는 90 분에 대 한 실 온에서 품 어, 4 ° c.에서 밤새 품 어
4. 라벨 표면 수용 체
- 680RD 염소 반대로 마우스 IgG 이차 항 체의 블로킹 버퍼에 1:1500 희석을 준비 합니다.
- 3.10 단계에서 차단 버퍼를 제거 합니다. 이차 항 체 솔루션의 50 µ L/잘 추가 하 고 60 분 유지 microplate 이차 항 체는 추가 빛 으로부터 보호에 대 한 실 온에서 품 어. 후속 외피 동안에 미 판 빛 으로부터 보호 하기 위해 계속 해야 합니다.
- 4.2 단계에서 솔루션을 제거 합니다. 100 µ L/잘 TBS (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6)을 추가 하 고 5 분이이 단계를 반복 4 추가적인 시간 동안 실 온에서 품 어.
- 4.3 단계에서 TBS를 제거 합니다. PBS에서 100 µ L/4 %paraformaldehyde/4% 자당의 우물을 추가 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- 4.4 단계에서 솔루션을 제거 합니다. 100 µ L/잘 TBS를 추가 하 고 5 분 반복이이 단계 2 추가 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
5. 라벨 내 면된 수용 체 인구
- 0.2% 사포닌을 포함 하는 큰 술 준비 합니다. 짧게 사포닌 분말을 완전히 분해 하 솔루션 소용돌이. 자동 형광을 일으킬 수 있는 모든 입자를 제거 하는 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
- 150 µ L 큰 술 추가 0.2% 사포닌을 포함 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- 5.2 단계에서 사포닌 솔루션을 제거 하 고 150 µ L/잘 차단 버퍼를 추가. 90 분 동안 실 온에서 품 어.
- 1:1500 희석 800CW 당나귀 반대로 마우스 IgG 이차 항 체의 블로킹 버퍼에서를 준비 합니다.
- 단계의 5.3 블로킹 버퍼를 제거 하 고 이차 항 체 솔루션의 50 µ L/잘 추가. 60 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 100 µ L/잘 TBS를 추가 하 고 5 분 반복이이 단계 4 추가 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
6. 영상 및 분석
- 제조업체의 지침에 따라 시스템 이미징 적외선 레이저를 사용 하 여 96-잘 미 판 이미지. 84 µ m, 매체 및 96-잘 미 판 사용의 기본 높이 따라 오프셋 초점 스캔 품질 스캔 해상도 설정 합니다. 클릭 "이미지 스튜디오" 메뉴 버튼 → 내보내기 → 디지털 미디어 → 수출 이미지 해상도 300 dpi, TIFF 포맷의 이미지.
- Https://imagej.net/Fiji/Downloads에서 이미지 J "피지" 다운로드
- 오픈 이미지 이미지 J "피지". "이미지" 메뉴를 클릭 하 여 색상 채널을 분하시오
색상 → 분할 채널입니다. - "분석" → "도구"에서 투자 수익 관리자를 엽니다. 숫자 동그라미를 ROI 관리자에서 "레이블" 상자를 확인 하십시오.
- 빨간색에서 채널 (680 nm 표면 수용 체 풀), 원 도구를 선택 하 고 첫 음을 정확 하 게 맞는 원 그리기 관심 영역 (ROI)을 선택 합니다. Ctrl + T를 누릅니다.
- 동그라미 다음 잘 끌어서 모든 우물 동그라미는 Ctrl + t. 반복 눌러.
- 투자 수익 관리자에서 "측정"을 클릭 합니다. 값을 표시 하 고 스프레드시트에 복사를 선택 합니다.
- 녹색 채널 (800 nm 내부 수용 체 풀)에서 클릭 한 다음 이미지에 단계 6.6에서에서 선택한 ROIs를 바꾸기. 투자 수익 관리자에서 "측정"을 클릭 합니다. 값을 표시 하 고 스프레드시트에 복사를 선택 합니다.
- 보조에서 통합된 평균 밀도 값만 웰 스 제어를 계산 합니다. 평균 보조 제어 통합 밀도 값만 표면 수용 체 풀에서 각 실험 잘 통합 된 밀도 값을 뺍니다. 내부 수용 체 풀에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- Rs/Rt, 어디 Rs 표면 수용 체의 통합된 밀도 나타내고 Rt 표면 수용 체의 통합된 밀도 +의 통합 된 밀도 사용 하 여 표면 수용 체 식의 변화를 계산 내부 수용 체입니다.
Representative Results
아크/Arg3.1 mGluR 활성화37다음 AP 2, endophilin 3, dynamin-216,18 와 상호 작용을 통해 AMPA 수용 체 endocytosis를 가속 한다. 아크 노크에서 마우스 (ArcKR), 268, 269 호 단백질에서 lysines 호 ubiquitination 방해 아르기닌에 돌연변이. 이 아크의 프로테아좀 종속 회전율을 손상 하 고 신경21,30에서 그것의 반감기를 연장. 이 실험에서 AMPA 수용 체 매매 규제에 아크의 지 속성 높은 콘텐츠 AMPA 수용 체 밀매 분석 결과 사용 하 여 시험 되었다. 신경 세포 나+ 채널 차단 TTX는 활동 전위를 억제 하 고 아크 레벨38, 유도 호 번역, ubiquitination,3739DHPG 다음 감소 치료 했다. 표면 및의 GluA1-내 면된 풀 (그림 2A)와 GluA2 포함 하는 (그림 3A) AMPA 수용 체 소 단위 DHPG 유실 후 5와 15 분에 측정 되었다. 이 특정 실험 3 독립적인 실험에서 3 개의 기술 복제 사용. ArcKR 신경 증가 GluA1 endocytosis를 DHPG WT 신경에 비해 신경만 TTX (그림 2B)로 치료 했다 때 보지는 효과로 치료 하면 보였다. GluA2 소 단위의 표면 표현 잠재적인 소 단위 교체30을 나타내는 짧은 시간 포인트 WT 뉴런 (그림 3B)에 비해 크게 증가 했다. 일부 웰 스는 일반적인 바인딩에 의해 발생 배경 형광에 대 한 제어에만 2 차 항 체로 치료 했다.
그림 1: AMPA 수용 체가 콘텐츠 밀매 분석 결과의 수용 체 biotinylation 분석 결과를 비교. 이 콘텐츠 밀매 분석 결과 적은 시간 표준 biotinylation 분석 결과에 비해 자원을 소비 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: WT 및 ArcKR hippocampal 신경에 있는 GluA1 AMPA 수용 체 소 단위의 표면 및 내부 인구. (A) 표면 (sGluA1) 하 고 내 면된 (iGluA1) GluA1-포함 된 AMPA 수용 체 소 단위 DHPG 유실 후 5와 15 분 WT 및 ArcKR hippocampal 신경에. WT에 비해, ArcKR 신경 DHPG 유실 후 sGluA1 포함 된 AMPA 수용 체 풀 5와 15 분 더 감소에 있다. (B) 그래프 표면 형광을 정규화 총 형광 강도를 나타냅니다. 통계적 비교는 일방통행 ANOVA, 짝된 짝이 없는 학생의 t 시험을 사용 하 여 실시 했다. p ≤ 0.05; n = 3 독립적인 실험에서 3 기술 복제. 값은 평균 ± SEM.을 나타냅니다. 이 그림은 벽, M. J. 그 외 여러분 201830에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: WT 및 ArcKR hippocampal 신경에 있는 GluA2 AMPA 수용 체 소 단위의 표면 및 내부 인구. (A) 그림 2와 같은 실험 조건. WT에 비해, ArcKR 신경 세포에 있는 증가 sGluA2 포함 된 AMPA 수용 체 풀 5 분 DHPG 세척 후. (B) 그래프 표면 형광을 정규화 총 형광 강도를 나타냅니다. 통계적 비교는 일방통행 ANOVA, 짝된 짝이 없는 학생의 t 시험을 사용 하 여 실시 했다. p ≤ 0.05; n = 3 독립적인 실험에서 3 기술 복제. 값은 평균 ± SEM.을 나타냅니다. 이 그림은 벽, M. J. 그 외 여러분 201830에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
AMPA 수용 체는 시 냅 스 형성, 냅 안정성, 그리고 시 냅 스가 소성을 포함 하는 신경 기능에 대 한 통합는 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체 하위. AMPA 수용 체 장애 여러 신경 성 질환24 에 연결 하 고 매력적인 약물 목표40을 간주 됩니다. 예를 들어 연구 Alzheimer의 질병 (광고)의 초기 징후 중 하나 냅 손실 이며 시 냅 스 AMPA 수용 체 레벨41,42감소 나타났습니다. 글, 아 밀 로이드-ß 올리고의 추가 표면 GluA1 포함 된 AMPA 수용 체 식을 시 냅 스43를 손상 한다. 또한, 상태 epilepticus 다운-조절 GluA2 mRNA와 단백질 hippocampal 신경 그들의 죽음44앞에. 루 경화 증 (ALS), 타르 DNA 묶는 단백질 (TDP-43) 병 리, ALS 관련 분자 이상, 있다 된 비효율적인 연결 된 GluA2 Q/R 사이트-RNA 편집45.
이 콘텐츠 AMPA 수용 체 밀매 분석 결과 훨씬 적은 시간과 다른 방법 보다는 재료를 사용 하는 다양 한 요인에 대 한 응답에서 신경 네트워크 내에서 수용 체 밀매 프로필에 대량 변화를 측정 하기 위한 효과적인 수단을 제공 합니다. 단일 96 잘 microplate 수많은 우물을 실행 하는 여러 복제 기술과 같은 접시에 다른 실험 조건에 대 한 제어를 제공 합니다. 5 x 105 셀/잘 밀도 기준으로 셀/잘 2 x 104 의 낮은 도금 밀도 크게 동물 및 (그림 1) 각 실험에 필요한 자료의 수를 줄입니다. 적외선 스캐너는 한 번에 최대 6 개의 96 잘 microplates를 이미지 수 있습니다. 분석 결과는 384-잘 microplate46, 분석 결과 귀중 한 샘플을 얻기 어려운 또는 비싼 문화 (예: 인간의 샘플 및 유도 만능 줄기 세포)에서 실행 되는 경우에 특히 귀중 한 되를 수정할 수 있습니다. 전체 분석 결과 완료 하 고 귀중 한 시간 (그림 1)는 같은 날에 분석 될 수 있습니다.
분석 결과의 성공적이 고 효율적인 완성 하기 위해 몇 가지 포인트 간주 해야 합니다. 첫째, 그것은 신경 치료의 같은 날에 DHPG 솔루션을 준비 하는 것이 중요입니다. 재사용 하거나 DHPG 주식을 고정 하지 마십시오. 4 %paraformaldehyde/4% 자당 PBS 솔루션에도 여야 한다 신선한 실험의 같은 날에. 둘째, 제어 웰 스 TTX로만 치료 또는 차량 효과 관찰 치료에 되도록 필요 합니다. 그것은 또한 일반적인 바인딩에 의해 생산 배경 형광에 대 한 제어에만 2 차 항 체로 치료 하는 웰 스를 포함 하는 중요 한. 참고 두 번째 정착 단계 (다음 희미하게 이차 항 체의) 이차 항 체 배경 효과 줄이고 수용 체 소 단위의 효과적인 라벨 달성의 열쇠입니다.
타협 및 한계를 어떤 방법으로 존재 합니다. 이 분석 결과 단일 셀 (또는 subcellular) 해상도 제공 하지 않습니다 그리고 다른 방법32,,3335처럼 매매 하는 수용 체의 실시간 추적을 허용 하지 않습니다. 또한, 적절 한 해야 합니다 주의 뉴런의 permeabilization 단계 동안이 방법-permeabilization의 경우 세포내 구성 요소의 유출에 민감한 될 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
기술 지원에 감사 재커리 알 렌 하 고. 이 작품은 Whitehall 재단 (그랜트 2017-05-35)에 의해 지원 되 고 클 C. 해 링 턴 연구 개시 그랜트 프로그램 (장비-93) A.M.M M.A.G. 및 D.W.Y.를 둘 다 조지아 주립 대학 Neurogenomics 2CI 친교에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal | EMD Millipore | Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732 | |
| Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 | ThermoFisher Scientific | Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03 | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15 | |
| (RS)-3,5-DHPG | Tocris Bio-Techne | Cat#0342 | |
| Tetrodotoxin Citrate (TTX) | Tocris Bio-Techne | Cat#1069 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | Cat#P7280-5X5MG | |
| Saponin | ACROS Organics | Cat# 419231000 | |
| B-27 Supplement (50x), Serum Free | Gibco | Cat#17504044 | |
| Glutamax Supplement | Gibco | Cat#35050061 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) | Sigma-Aldrich | Cat#F0503 | |
| Gentamycin (10 mg/mL) | Gibco | Cat#15710064 | |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | Electron Microscopy Sciences | Cat#19210 | |
| Sucrose (EP/BP/NF) | FisherScientific | Cat#S2500GM | |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Li-COR | Cat#927-50003 | Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | Cat#SH30529.02 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | Cat#14190250 | |
| Neurobasal Medium, minus phenol red | Gibco | Cat#12348017 | Referred to as "neuronal Media" in the protocol |
| 28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile | Corning | Cat#431219 | |
| 96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates | Corning | Cat#3603 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070 | |
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | NIH | http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285 | |
| Odyssey CLx imaging system | Li-COR Biosciences |
References
- Kennedy, M. J., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 29, 325-362 (2006).
- Hebb, D. O. The organization of behavior; a neuropsychological theory. , Wiley. (1949).
- Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B. 369 (1633), 20130288 (2014).
- Collingridge, G. L., Isaac, J. T., Wang, Y. T. Receptor trafficking and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 5 (12), 952-962 (2004).
- Newpher, T. M., Ehlers, M. D. Glutamate receptor dynamics in dendritic microdomains. Neuron. 58 (4), 472-497 (2008).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
- Correia, S. S., et al. Motor protein-dependent transport of AMPA receptors into spines during long-term potentiation. Nature Neuroscience. 11 (4), 457-466 (2008).
- Wang, Z., et al. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135 (3), 535-548 (2008).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 defines a domain for activity-dependent exocytosis in dendritic spines. Cell. 141 (3), 524-535 (2010).
- Hussain, S., Davanger, S. Postsynaptic VAMP/Synaptobrevin Facilitates Differential Vesicle Trafficking. of GluA1 and GluA2 AMPA Receptor Subunits. PLoS One. 10 (10), 0140868 (2015).
- Wu, D., et al. Postsynaptic synaptotagmins mediate AMPA receptor exocytosis during LTP. Nature. 544 (7650), 316-321 (2017).
- Jurado, S., et al. LTP requires a unique postsynaptic SNARE fusion machinery. Neuron. 77 (3), 542-558 (2013).
- Arendt, K. L., et al. Calcineurin mediates homeostatic synaptic plasticity by regulating retinoic acid synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), E5744-E5752 (2015).
- Ahmad, M., et al. Postsynaptic complexin controls AMPA receptor exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
- Bramham, C. R., Worley, P. F., Moore, M. J., Guzowski, J. F. The immediate early gene arc/arg3.1: regulation, mechanisms, and function. The Journal of Neuroscience. 28 (46), 11760-11767 (2008).
- Chowdhury, S., et al. Arc/Arg3.1 interacts with the endocytic machinery to regulate AMPA receptor trafficking. Neuron. 52 (3), 445-459 (2006).
- Waung, M. W., Huber, K. M. Protein translation in synaptic plasticity: mGluR-LTD, Fragile X. Current Opinion in Neurobiology. 19 (3), 319-326 (2009).
- Wall, M. J., Correa, S. A. L. The mechanistic link between Arc/Arg3.1 expression and AMPA receptor endocytosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 77, 17-24 (2018).
- DaSilva, L. L., et al. Activity-Regulated Cytoskeleton-Associated Protein Controls AMPAR Endocytosis through a Direct Interaction with Clathrin-Adaptor Protein. eNeuro. 2 (3), (2016).
- Carroll, R. C., et al. Dynamin-dependent endocytosis of ionotropic glutamate receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (24), 14112-14117 (1999).
- Mabb, A. M., et al. Triad3A regulates synaptic strength by ubiquitination of Arc. Neuron. 82 (6), 1299-1316 (2014).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28 (2), 511-525 (2000).
- Petrini, E. M., et al. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation. Neuron. 63 (1), 92-105 (2009).
- Henley, J. M., Wilkinson, K. A. Synaptic AMPA receptor composition in development, plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 17 (6), 337-350 (2016).
- Hayashi, Y., et al. Driving AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII: requirement for GluR1 and PDZ domain interaction. Science. 287 (5461), 2262-2267 (2000).
- Sheng, N., et al. LTP requires postsynaptic PDZ-domain interactions with glutamate receptor/auxiliary protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), 3948-3953 (2018).
- Lee, S. H., Simonetta, A., Sheng, M. Subunit rules governing the sorting of internalized AMPA receptors in hippocampal neurons. Neuron. 43 (2), 221-236 (2004).
- Greger, I. H., Khatri, L., Kong, X., Ziff, E. B. AMPA receptor tetramerization is mediated by Q/R editing. Neuron. 40 (4), 763-774 (2003).
- Sommer, B., Kohler, M., Sprengel, R., Seeburg, P. H. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels. Cell. 67 (1), 11-19 (1991).
- Wall, M. J., et al. The Temporal Dynamics of Arc Expression Regulate Cognitive Flexibility. Neuron. 98 (6), 1124-1132 (2018).
- Mammen, A. L., Huganir, R. L., O'Brien, R. J. Redistribution and stabilization of cell surface glutamate receptors during synapse formation. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7351-7358 (1997).
- Shi, S. H., et al. Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. Science. 284 (5421), 1811-1816 (1999).
- Zhang, Y., Cudmore, R. H., Lin, D. T., Linden, D. J., Huganir, R. L. Visualization of NMDA receptor-dependent AMPA receptor synaptic plasticity in vivo. Nature Neuroscience. 18 (3), 402-407 (2015).
- Hayashi, A., Asanuma, D., Kamiya, M., Urano, Y., Okabe, S. High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: Visualization of AMPA-type glutamate receptor endocytosis in living neurons. Neuropharmacology. 100, 66-75 (2016).
- Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends in Neuroscience. 27 (5), 257-261 (2004).
- Correa, S. A., Muller, J., Collingridge, G. L., Marrion, N. V. Rapid endocytosis provides restricted somatic expression of a K+ channel in central neurons. Journal of Cell Science. 122, 4186-4194 (2009).
- Waung, M. W., Pfeiffer, B. E., Nosyreva, E. D., Ronesi, J. A., Huber, K. M. Rapid translation of Arc/Arg3.1 selectively mediates mGluR-dependent LTD through persistent increases in AMPAR endocytosis rate. Neuron. 59 (1), 84-97 (2008).
- Shepherd, J. D., et al. Arc/Arg3.1 mediates homeostatic synaptic scaling of AMPA receptors. Neuron. 52 (3), 475-484 (2006).
- Klein, M. E., Castillo, P. E., Jordan, B. A. Coordination between Translation and Degradation Regulates Inducibility of mGluR-LTD. Cell Reports. , (2015).
- Chang, P. K., Verbich, D., McKinney, R. A. AMPA receptors as drug targets in neurological disease--advantages, caveats, and future outlook. European Journal of Neuroscience. 35 (12), 1908-1916 (2012).
- Hsieh, H., et al. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss. Neuron. 52 (5), 831-843 (2006).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W. Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer's disease: correlation with cognitive severity. Annals of Neurology. 27 (5), 457-464 (1990).
- Gu, Z., Liu, W., Yan, Z. {beta}-Amyloid impairs AMPA receptor trafficking and function by reducing Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II synaptic distribution. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10639-10649 (2009).
- Grooms, S. Y., Opitz, T., Bennett, M. V., Zukin, R. S. Status epilepticus decreases glutamate receptor 2 mRNA and protein expression in hippocampal pyramidal cells before neuronal death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (7), 3631-3636 (2000).
- Yamashita, T., Kwak, S. The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Brain Research. 1584, 28-38 (2014).
- Huang, H. S., et al. Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons. Nature. 481 (7380), 185-189 (2011).
