Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Behandeling en evaluatie van menselijke primaire prostaat Organoid cultuur

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/59051
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Departments of Urology, Physiology, and Biophysics, University of Illinois at Chicago, 3University of Illinois Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een protocol om begeleiden van menselijke primaire prostaat organoid behandeling dan eindpunten om te beoordelen fenotype suggereren. Zaaien, cultuur onderhoud, herstel van matrix gel, worden morfologische kwantificering, insluiten en segmenteren, FFPE segmenteren, geheel-mount kleuring en toepassing van commerciële tests beschreven.

Abstract

Dit witboek beschrijft een gedetailleerd protocol voor driedimensionale (3D) kweken, behandeling en evaluatie van menselijke primaire prostaat organoids. Het proces omvat zaaien van epitheliale cellen dunbevolkte in een 3D matrix gel op een 96-Wells-microplate met media wijzigingen in het cultiveren van expansie in organoids. Morfologie wordt vervolgens beoordeeld door geheel-well vastleggen van beelden van de z-stack. Compressie van z-stacks creëert één in-focus afbeelding waaruit organoids worden gemeten om te kwantificeren van een aantal uitgangen, met inbegrip van cirkelvormigheid, ronding en oppervlak. DNA, RNA en eiwitten kunnen worden verzameld van organoids hersteld van de matrix-gel. Cel bevolking van belang kunnen worden geëvalueerd door organoid dissociatie en stroom cytometry. Formaline-fixatie-paraffine-insluiting (FFPE) gevolgd door segmenteren is gebruikt voor de histologische beoordeling en antilichaam kleuring. Geheel-mount immunefluorescentie kleuring behoudt organoid morfologie en waarneming van eiwit lokalisatie in organoids in situvergemakkelijkt. Commerciële testen, die traditioneel worden gebruikt voor 2D enkelgelaagde cellen kunnen worden gewijzigd voor 3D organoids. De technieken in dit protocol bieden samen worden gebruikt, een robuuste gereedschapskist om te kwantificeren van de groei van de prostaat organoid, morfologische kenmerken en expressie van differentiatie markers.

Introduction

Organoids zijn een waardevol instrument om organogenese en ziekte te studeren. Zij bieden een goedkoper alternatief voor dierlijke modellen en patiënt afkomstige organoids evolueren als een strategie voor gepersonaliseerde geneeskunde1,2,3. Dit systeem van driedimensionale (3D) cultuur gaat zaaien stam of voorlopercellen cellen (geoogst van weefsel of geïnduceerde pluripotente stamcellen) in een gel van (matrix gel)4van de componenten van de extracellulaire matrix. De cellen vermenigvuldigen en onderscheid maken, resulterend in organotypic structuren die de cellulaire hiërarchie en de morfologie van het orgaan van de functionele eenheid van belang recapituleren. Organoids zijn geteeld met behulp van cellen die afkomstig zijn uit een verscheidenheid van organen, met inbegrip van de speekselklieren, maag, darm, lever, prostaat, longkanker en hersenen4. Hoewel er talrijke protocollen beschrijven van stappen om de prostaat organoids5,6, is het uitdagend om te vinden van voldoende gedetailleerde methoden over hoe om kwantitatieve eindpunten van organoids. Dit document bevat een overzicht van methoden ontwikkeld voor menselijke primaire prostaat cellen en details van een aantal voorgestelde eindpunten te beoordelen van de fenotypen van organoid. Deze technieken werden geoptimaliseerd voor prostaat organoids en voor andere 3D celculturen kunnen gelden.

Prostaat organoid culturen hebben onlangs naar voren gekomen als een waardevolle in vitro model die mist van de beperkingen van enkelgelaagde culturen met vereeuwigd cellijnen gevestigde. Goedaardige prostaat epitheel en prostaatkanker is uitdagend model in vitro met behulp van vereeuwigd cellijnen. Het aantal goedaardige cellijnen is beperkt, en alle hebben ondergaan transformatie met oncogenen7. Primaire prostaat epitheliale cellen in monolayers niet onderscheiden in luminal cellen en gebrek aan androgeen receptoren8. De meerderheid van de cellijnen van prostaatkanker hebben geen functionele androgeen receptoren, een belangrijke bemiddelaar van het begin staat van de ziekte, en ontbreken belangrijke genetische veranderingen die zijn gevonden in patiënt tumoren9. Prostaat organoid culturen kunnen gemakkelijk worden gekweekt uit goedaardige epitheel en waardevol bij het bestuderen van de eigenschappen van de cel van de stam, voorlopercellen, differentiatie en effecten van experimentele veranderingen in de communicatie4,5. Prostaatkanker organoids kunnen worden gekweekt als onderdeel van een precisienadering geneeskunde Modeling patiënt ziekte en reactie op therapieën10.

Dit protocol is samengesteld uit bestaande protocollen die gebruikmaken van verschillende celtypes, maar het hier is geoptimaliseerd voor gebruik in menselijke primaire prostaat cellen. Het complimenten protocollen tekenruimte Zagers, Clevers en Shen5,6 , die groei, passaging, helder-veld imaging, cryopreservatie en RNA en DNA isolatie van prostaat muis en menselijke organoids beschrijven. Het geheel-koppelingsprotocol is van Mahé et al. gewijzigd 11, die gastro-intestinale epitheliale organoids gebruikt en beschrijft levende imaging en bevroren en paraffine insluiten. Borten et al. 12 beschreven de analyse van borst, dubbelpunt en colorectale kanker organoid morfologie van helder-veld beeldvorming. Bovendien, Richards et al. 13 gebruikt een methode voor de morfologische beoordeling van prostaat organoids. Ten slotte, Hu et al. 14 beschreven een methode voor het daaraan vastzittende prostaat organoids aan een dia kamer overnachten vóór de immunefluorescentie kleuring om afzonderlijke cellen en dispersie van bollen voor stroom cytometry analyse te observeren.

Het doel van dit protocol is om aan te tonen in voldoende detail deze technisch uitdagende methoden als één protocol, met inbegrip van cel zaaien; media en matrix gel onderhoud; verzameling cellen voor stroom cytometry; RNA, DNA en eiwit extractie; beoordeling van de morfologische van helder-veld z-stack analyse; insluiten, verwerking en segmenteren voor histologisch kleuring; en geheel-montage voor immunofluorescentie of fluorescente sonde testen. De biologische relevantie en de interpretatie van deze verschillende eindpunten zal verschillen tussen proefopzet en antilichamen gebruikt voor analyse. Door gebruik van dit protocol, moeten de gebruikers willen opzetten van een experiment met een toolkit van eindpunten voelen.

Menselijke cellen voor primaire epitheliale prostaat (PrE) werden opgericht in het lab door het protocol beschreven door Peehl15,16 en gehandhaafd om een beperkt aantal passages (maximaal vier) als eerder beschreven17, maar ze zijn ook verkrijgbaar via commerciële leveranciers. Hepatocyte serumvrij media gebaseerde6, KSFM gebaseerde13en R-spondin 1-geconditioneerd5 media zijn alle gepubliceerde als organoids met succes hebben geproduceerd. KSFM gebaseerde vereist het minste aantal additieven, dus het wordt hier beschreven.

Protocol

Het volgende protocol was geoptimaliseerd door het gebruik van menselijke primaire prostaat epitheliale cellen geoogst uit weefsel van de patiënt aan de Universiteit van Illinois in Chicago ziekenhuis. Alle menselijke weefsels gebruikte voor deze experimenten werden verworven via een institutionele Review Board-goedgekeurde protocol en/of vrijstelling aan de Universiteit van Illinois te Chicago. Hoewel de kweekomstandigheden afhankelijk van het celtype van belang variëren zal, kunnen de eindpunten worden toegepast op organoids van andere weefsels.

1. het zaaien van epitheliale cellen in de Matrix Gel en het veranderen van de Media

  1. Verzamelen van de benodigde materialen: menselijke primaire prostaat epitheliale cellen (PrE), matrix gel op ijs, 96-Wells microplate, Keratinocyt serumvrij media (KSFM) op het ijs, houtskool gestripte foetale runderserum (FBS) en dihydrotestosteron (DHT).
  2. KSFM gebaseerde organoid media te bereiden door het combineren van 47.5 mL KSFM met 2,5 mL houtskool gestripte FBS en dihydrotestosteron (DHT) op een eindconcentratie van 10 nM DHT, dan reserve op ijs.
  3. De cellen van de plaat in een 3D matrix in een cel cultuur kap met behulp van steriele techniek.
    1. Zachtjes mix koude KSFM gebaseerde organoid media met ijskoude matrix gel op het verkrijgen van een matrix van 50% gel mengsel door langzaam op en neer pipetteren, het vermijden van bubbels.
      Opmerking: Matrix gel moet worden ontdooid 's nachts bij 4 ° C en op ijs waar mogelijk gehouden. Het stolt snel bij kamertemperatuur (RT).
    2. Natte vooraf een pipet tip in koude media en overdracht 40 – 50 μl van 50% matrix gel op de bodem van elk putje te worden gebruikt op een 96-wells-plaat. De bodem van de put te vormen een basislaag jas.
      Opmerking: Niet volledig aan de tweede halte op Pipetteer afzien, aangezien dit tot bubbels leiden kan.
    3. Plaats de 96-wells-plaat in 37 ° C incubator voor 30-45 min te stollen de basislaag.
      Opmerking: Niet epitheliale cellen op de basislaag plaat totdat het is gestold, of cellen kunnen vallen door de matrix op de bodem van de plaat en groeien als een enkelgelaagde.
    4. Meng de epitheliale cellen gesuspendeerd in KSFM gebaseerde organoid media met matrix gel om een eindconcentratie van 100 – 1000 cellen/100 μl en 33% matrix gel. De epitheliale cellen van de plaat bovenop basis lagen met 100 μl van 33% matrix gel/cel mengsel per putje.
      Opmerking: Eerdere experimenten hebben aangetoond dat het zaaien van epitheliale cellen ook dichtbevolkte in 3D de grootte van organoid groei, terwijl ook dun zaaien in zeer lage opbrengst13 resulteren kanzal beperken. Het is belangrijk voor het optimaliseren van de seeding van de voorwaarden voor het celtype van belang, gebaseerd op de organoid van de patiënt-specifieke vorming efficiëntie.
  4. Plaats van de 96-wells-plaat in een incubator 37 ° C gedurende 30-45 minuten om de gel van de matrix te stollen, en vervolgens zachtjes 100 μl van KSFM gebaseerde organoid media boven aan cellen toevoegen door pipetteren langzaam tegen de rand van de put.
  5. De media elke 2-3 dagen wijzigen. Pipetteren tegen de zijkant van de put met ruimte tussen de media en matrix gel, verwijder voorzichtig 50 μl van media en het vervangen met 50 μl van nieuwe media.
    Opmerking: Voor een langetermijnkweek, de matrix gel moet worden veranderd elke 2-3 weken. Als de matrix gel cultuur unstable worden weergegeven doorschijnend rimpels onder de Microscoop, dan is de matrix gel heeft afgebroken en moet worden vervangen.

2. verzameling van Organoids uit Matrix Gel

Opmerking: Verzameling van organoids is nodig voor matrix gel wijzigingen, passaging of eindpunten van extractie van RNA, DNA-extractie, eiwit extractie en stroom cytometry.

  1. Warme neutrale protease en Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) in een waterbad 37 ° C.
  2. Verwijder voorzichtig zonder het verstoren van de matrix gel media uit putten.
  3. Op een ~ 1 ~ 200 μL van neutrale protease toevoegen aan elk putje: 2 verhouding van matrix gel: neutraal protease en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
  4. Mechanisch distantiëren de matrix gel: neutraal protease mengsel door pipetteren omhoog en omlaag.
  5. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
  6. Het mengsel van de gel-cel neutrale protease-matrix overbrengen in een microcentrifuge buis- of kegelvormig buis, afhankelijk van het volume. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3-5 min naar pellet cellen.
    Opmerking: Als er geen cel pellet verschijnt, de matrix gel kan niet volledig worden losgekoppeld en kan worden gevisualiseerd als een doorschijnend fase aan de onderkant van de buis van het supernatans dat roze onderscheiden. De bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen op een verhouding van 1:2 neutraler protease aan matrijs de gel pellet, Incubeer gedurende een ander 20-40 minuten bij 37 ° C en herhaal centrifugeren op 300 x g.
  7. Wanneer een organoid pellet wordt verworven, verwijder de bovendrijvende substantie. Doorgaan met passaging (zie stap 2.7.1), lysis van de organoid voor de extractie van RNA, DNA of eiwit (zie stap 2.7.2), verwerking enkel cellen door stroom cytometry, en eencellige sequentiebepaling (zie stap 2.7.3).
    1. Voor langetermijnkweek, zachtjes resuspendeer intact organoids in 33% vers matrix gel en plaat als volgt beschreven in stap 1.1-1.5. Een keer wassen met 5 mL HBSS te distantiëren van organoids en replate als afzonderlijke cellen, resuspendeer de pellet in 1 mL warme cel-dissociatie enzymen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 à 15 minuten, en opnieuw plaat in de vers matrix gel na stappen 1.1-1.5.
    2. Resuspendeer de pellet organoid in een passende lysis-buffermengsel voor extractie van RNA, DNA-extractie of eiwit extractie, zoals vermeld in de Tabel van de materialen en van de fabrikant protocol volgen.
    3. Resuspendeer organoids in 1 mL warme cel-dissociatie enzymen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 à 15 minuten te distantiëren van de organoids in afzonderlijke cellen. Een keer wassen met 5 mL HBSS en ga verder met het protocol voor stroom cytometry5 of eencellige sequencing18.
      Opmerking: Om te distantiëren in afzonderlijke cellen in lage concentraties van matrix gel, de neutrale protease kan niet nodig, en cel-dissociatie enzymen kunnen rechtstreeks worden toegepast op de put na stap 2.2.

3. geheel-well Beeldacquisitie en analyse van de Organoid morfologie

  1. Verwerven van geheel-well z-stack beelden met behulp van een doorvallend licht omgekeerde Microscoop met een gemotoriseerde X / Y scannen fase (werkstroom geïllustreerd in figuur 1A).
    1. Beginnen gericht omhoog totdat de eerste organoid wordt aangetroffen, die in het midden van de put te wijten aan de meniscus van de basislaag worden zal met het focal standpunt aangepast aan de bodem van de put. Stel de onderkant z-plane op deze positie.
    2. Blijven richten omhoog totdat de laatste organoid is in beeld, die in de periferie van de put worden zal. Stel de hoogste z-plane op deze positie.
      Opmerking: Na het instellen van de boven- en onderkant van de z-stack, zorg ervoor dat deze standpunten de organoids binnen alle resterende putjes vangen en pas desgewenst aan de bovenkant/onderkant. Dit zorgt voor het z-bereik dat moet worden gebruikt voor een enkele scan waarin elke organoid binnen elk putje.
    3. 15 – 35 z-vliegtuigen per putje, met behulp van een groter getal voor grotere resolutie vastleggen. De hele goed beeld vastleggen, samenvoegen en verzamelen kwadranten of subsecties indien nodig.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen om meerdere z-vliegtuigen in tegenstelling tot een honkslag z-plane, zoals geïllustreerd in figuur 1B waarin organoids onscherp worden bij het vastleggen van slechts één z-plane.
    4. Z-stapel afbeeldingen voor downstream analyse opslaan.
  2. Analyseren van beelden met behulp van beeld software met vrije tekenmogelijkheden.
    1. Open één afbeelding z-plane instellen vanuit stap 3.1.4.
    2. Indien nodig, de foto's genomen op elke individuele z-plane in één geheel-well afbeelding tegel. De nieuwe afbeelding als een afzonderlijk bestand opslaan. Herhaal dit proces voor elke z-plane verworven.
    3. Open de afbeelding geheel-well voor elke z-plane uit een enkele bron met beeld software en maken een uitgebreide diepte van gebied (EOF) beeld van de stack van z-vliegtuigen.
      Opmerking: Dit type afbeelding selecteert de beste focus regio van elke z-vliegtuig naar het maken van een enkel beeld in-focus van de put.
    4. Stel de schaal van de pixel van de software aan de bar van de schaal van de afbeelding die wordt gemeten.
    5. Met behulp van het gereedschap Vrije vorm tekenen van de afbeelding software, traceren de omtrek van elke organoid in de put.
    6. De meting statistieken voor overgetrokken organoid planimetrische weergave van de afbeelding software verkrijgen.
      Opmerking: Aanbevolen parameters zijn gebied, cirkelvormigheid en maximale/minimale radius-verhouding. Representatieve resultaten ter illustratie van de toepassing van deze statistieken worden weergegeven in Figuur 1 c. Gebied is berekend op basis van de veelhoek gedefinieerd door de organoid de omtrek. Cirkelvormigheid is de verhouding van de ruimte van de organoid aan de oppervlakte van een cirkel met een diameter gelijk de organoid de maximale ferret, waarbij 0 is minder circulaire en 1 meer circulaire. Maximale/minimale radius-ratio is de verhouding tussen de maximumstraal en de minimumboogstraal voor de getraceerde organoid.
      Cirkelvormigheid =Equation 1
      RADIUS-verhouding =Equation 2

4. formaline fixatie en paraffine inbedding van Organoids voor histologisch eindpunten

  1. Bereiden van insluiten leveringen: HBSS, 2% agar-oplossing, histologisch markering kleurstof, histologie gel, Pipetteer tip schimmel, tape, plunjer uit een 1 cc insuline spuit, ice pack, cassettes, 10% neutraal gebufferde formaline (NBF), potlood en 75% histologisch graad ethanol (EtOH).
    1. Twee microcentrifuge-buizen van 2% agar-oplossing te bereiden. Incubeer in een waterbad of op een warmte blok bij 100-110 ° C te handhaven agar in vloeibare vorm. Voeg 1-2 druppels histologische markering kleurstof aan één van de 2% agar-oplossingen, die zal het duiden van de bovenkant van de agar sluit en helpen bij het handhaven van oriëntatie tijdens het insluiten. Meng goed.
    2. Warm de histologie gel in een water-bad of warmte blok bij 55-65 ° C.
    3. Maak met een 1000 μL pipet tip mallen door te snijden een klein deel van het uiteinde van de pipet om een cilinder die in het bezit van ~ 50 μl. Maak een tweede, bredere schimmel die rond de eerste mal past.
    4. Maak een koud blok door verpakking van een pak ijs met tape (klevende kant naar boven) en mallen aan de tape vast te houden.
    5. Maak een plunjer doordat de zuiger van een 1 cc insuline spuit.
  2. De organoids insluiten in een histologie gel plug voor verwerking, volgen de workflow die is afgebeeld in figuur 2A.
    1. Distantiëren van de matrix-gel- and -pellet organoids door het volgen van de stappen 2.1-2.7.
    2. De organoid pellet een keer met 1 mL HBSS en opnieuw pellet wassen door spinnen gedurende 3-5 min. 300 x g en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
    3. Resuspendeer de pellet organoid in 30 – 50 μl van vloeibare histologie gel. Meng zachtjes door pipetteren langzaam op en neer. Breng de histologie gel/organoid mengsel in een mal op het koude blok en laat het specimen afkoelen en stollen in een stekker.
    4. Gebruik een zuiger te duwen de stekker uit de kleine schimmel en in de grotere mal. Pipetteer duidelijk 2% agar rond de stekker te vullen van de grotere schimmel.
    5. Pipetteer histologische kleurstof getinte 2% agar bovenop de stekker ter aanduiding van de bovenkant van het monster.
    6. Eenmaal afgekoeld, kunt een plunjer Breng de stekker in een cassette histologie. De cassette met behulp van een potlood en plaats de cassette in 10% label NBF voor fixatie 's nachts.
    7. Overzetten van de cassette van 10% naar 70% histologisch graad EtOH NBF.
  3. Proces de histologie gel sluit met behulp van een vooraf ingestelde biopsie-protocol op een processor, indien beschikbaar. Als voorinstelling niet beschikbaar is, voer de volgende sequentie en lengtes: 70% EtOH voor 6 min, 70% EtOH voor 10 min 80% EtOH voor 10 min, 95% EtOH 2 keer voor 10 min, 100% EtOH 3 keer voor 10 min, xyleen 3 keer voor 15 min , en paraffine 3 keer voor 15 min. die afwijkt van de aanbevolen volgorde verwerken kan leiden tot gescheurde organoids (figuur 3A).
  4. Embed de histologie gel stekker met het gekleurde gedeelte naar boven, aangezien hierdoor de verkleurd gedeelte met de organoids te worden gesegmenteerd in eerste.
  5. Sectie de histologie FFPE gel blokken:
    1. Verzamelen van noodzakelijke levering: FFPE histologie gel blokken, histologie pen, weefsel float waterbad, ijsemmer met ijs, microtome, microtome messen, werkstation, positief geladen Microscoop dia's en laboratorium oven te embedding.
    2. Opvulling waterbad tot zeer volledige en ingesteld op 40 ° C, dan vooraf warm laboratorium oven tot 45-50 ° C.
    3. Bereiden van een ijsemmer, dan vullen met ijs en voeg water tot een ijswater drijfmest. Chill de blokken op ijs totdat zij zeer koud zijn.
      Opmerking: Blokken kunnen worden ingesteld in de ijskast voor tot 1 dag, maar als 's nachts verliet de blokken zullen worden gehydrateerd en zal moeten worden verwerkt.
    4. Een blok invoegen microtoom cassette klem, toevoegen van het blad aan de meshouder en ontgrendelen van de vergrendeling beschermende maatregelen op de machine.
    5. Beginnen door te korten op het gezicht van het blok van de paraffine (geconfronteerd af) bij een dikte van 10 µm. Zodra een sectie dat de plug gebied bevat blijkt, stop trimmen, vergrendelen van de microtoom rotor en overbrengen van het blok weer terug op het ijs om te relaxen. Als meerdere blokken worden gesegmenteerd, face-off elke blokkeren voordat u naar stap 4.5.6.
    6. Het blad naar een nieuwe, ongebruikte gedeelte en het blok ook terug overzetten naar de klem. Ontgrendelen van de machine en trimmen op 5 μm per sectie beginnen.
      Opmerking: 5 μm wordt aanbevolen voor de beste resultaten, maar 3 – 10 μm is eveneens aanvaardbaar.
    7. Met pincet, de sectie overbrengen in het waterbad van 40 ° C en laat de sectie te spreiden. Overdracht van de sectie op een dia door dompelen verticaal in het water.
      Opmerking: Dompelen in een hoek kunnen luchtbellen uit de bodem van het bad overbrengen in de sectie en vervorming van het monster veroorzaken.
    8. Visualiseer het gedeelte onder de Microscoop (figuur 2BC).
      Opmerking: Als een organoid aanwezig is, wordt deze weergegeven vergelijkbaar met de rode pijl in figuur 2B. Bubbels (figuur 2B, blauwe pijl) vergelijkbaar met organoids kunnen verschijnen en zijn gemakkelijker te onderscheiden op een vers-dia, zoals droge organoids doorschijnend (figuur 2C verschijnen). Als geen organoids presenteren, sectie verder in het blok.
  6. Wanneer dia's met organoids hebben verkregen, cirkel het gebied rond de sectie op de achterkant van de dia met een pen van histologie en bak 's nachts bij 45-50 ° C.
  7. Verzamelen van dia's en gaat u verder met H & E (zie stap 4.9.1), immunohistochemische (zie stap 4.9.2), of immunefluorescentie kleuring (zie stap 5).
    Opmerking: Representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 3B.
    1. Voor het uitvoeren van de H & E kleuring, een kit verkrijgen in de materialen lijst en volg de instructies van de fabrikant.
    2. Standaardinteracties immunohistochemische kleuring, een kit en primair antilichaam te verkrijgen van de lijst van de materialen en volg de instructies van de fabrikant.

5. immunefluorescentie kleuring van FFPE en verdeelde Organoids

  1. Verzamelen van leveringen: gebakken dia uit stap 4, xyleen, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, gedeïoniseerd water (DI H2O), coplin potten, 1 x antigeen herwinning oplossing (Natriumcitraat buffer of EDTA-Tris buffer), fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 5% normaal paard serum () NHS) met 0,1% niet-Ionische detergent in PBS, 1% bovien serumalbumine (BSA) met de niet-Ionische detergent 0,3% in PBS, kleuring rek, kleuring schotel, kamer, hydrofobe barrière pen, vochtigheid kamer, 1 ° en 2 ° antilichamen van belang, en counterstains van decloaking belang.
  2. Deparaffinize en hydrateren van de dia's door dompelen in coplins gevuld met de volgende oplossingen: xyleen (3 dips, 5 minuten elk), 100% EtOH (2 dips, 3 minuten elk), 95% EtOH (2 dips, 3 minuten elk), 70% EtOH (2 dips, 3 min elke) en DI H2O (2 dips 3 minuten elk).
  3. Vul de kleuring schotel met de oplossing van de gegevensherwinning van antigeen en pre warmte decloaking kamer tot 100 ° C.
  4. Het uitvoeren van antigeen ophalen door dia's in de voorverwarmde kleuring schotel onder te dompelen en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 100 ° C. Zodra de cyclus voltooid is, kunt u de decloaking kamer zitten voor 20 min voordat het deksel te openen.
  5. Zodra de dia schotel heeft gekoeld aan RT, zet de kleuring schotel onder stromend DI H2O te spoelen van de dia's gedurende 5 minuten.
  6. De dia's te verwijderen van de kleuring schotel, tekent een cirkel rond het monster met een hydrofobe barrière-pen, en leggen de dia op de kamer vochtigheid.
  7. Blokkeren van een niet-specifieke antilichaam kleuring door 5% NHS met 0,1% niet-Ionische detergent in PBS op de hydrofobe cirkel rond het monster toe te passen (ongeveer 30 μL nodig is ter dekking van het monster).
  8. Wash dia's in coplins gevuld met PBS 3 keer voor elke 5 min.
  9. Toevoegen van de 1° antilichamen (Tabel of Materials) verdund in 1% BSA met 0,3% niet-ionogene wasmiddel in PBS naar de hydrofobe cirkel rond het monster (ongeveer 30 μL moet betrekking hebben op de sectie), vervolgens Incubeer gedurende 1 h op RT of 's nachts bij 4 ° C in de kamer vochtigheid.
  10. Het wassen van de dia's in coplins gevuld met PBS 3 keer voor elke 5 min.
  11. Toevoegen van het antilichaam van de 2° verdund in 1% BSA met 0,3% niet-ionogene wasmiddel in PBS naar de hydrofobe cirkel rond het monster (ongeveer 30 μL zal bestrijken het gebied), vervolgens Incubeer gedurende 1 h bij RT in vochtigheid kamer.
  12. Het wassen van de dia's in coplin gevuld met PBS 3 keer voor elke 5 min.
  13. DAPI, verdund tot de specificaties van de fabrikant, in 1% BSA met 0,3% niet-ionogene wasmiddel in PBS naar de hydrofobe cirkel rond het monster, voeg dan Incubeer gedurende 2 – 5 min op RT in het donker (30 μL).
  14. Het wassen van de dia's in coplins gevuld met PBS 3 keer voor elke 5 min.
  15. De dia's met antifade montage media en dekglaasje aan mount en visualiseren van de resultaten onder een microscoop.

6. geheel-montage van Organoids voor immunefluorescentie kleuring

  1. Verzamelen van leveringen: kamer dia of confocal schotel, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), kleefpoeders, 50 mM NH4Cl in PBS, 0,1% niet-ionogene wasmiddel in PBS, 5% NHS met 0,1% niet-Ionische detergent in PBS, 1% BSA met 0,3% niet-Ionische detergent in PBS, 1 ° en 2 ° antilichamen van belang, en counterstains van belang.
  2. Verwijder voorzichtig zoveel media mogelijk zonder het verstoren van de organoid cultuur door pipetteren tegen de zijkant van goed, verlaten ruimte tussen media en matrix gel.
  3. Met behulp van een bijgesneden, vooraf nat met media of PBS, 1.000 μL pipet tip, één druppel (25-50 μl) van matrix gel waarin de organoid(s) van belang opstellen en afzien op het midden van een kamer dia goed of confocal schotel.
    Opmerking: 33% matrix gel is niet een vaste stof. Het is een gelatine-achtige vloeistof die verwerkt vergelijkbaar met een Jello die niet volledig ingesteld. Een tip van de bijgesneden Pipetteer met een grote opening zal breken tijdens overdrachten organoids verhinderen.
  4. Als organoids in de bovenliggende cultuur blijven, vervangt u media met warme KSFM gebaseerde media.
  5. Gecombineerd met het blote oog of ontleden toepassingsgebied, de overtollige media en matrix gel van de dia van de kamer met een boete-tip Pipet (10-200 μl).
    Opmerking: Het is optioneel voorbehandeling van de dia van de kamer met een hechting reagens.
  6. Plaat een gelijk volume matrix gel in een lege putje van de kamer dia als een optioneel besturingselement te observeren autofluorescence van overgebleven matrix.
  7. Plaats de kamer dia in een incubator 37 ° C gedurende 30-45 minuten ter bevordering van de organoid om te voldoen aan het glas en verlies van monsters tijdens wassen stappen te voorkomen.
  8. Pipetteren langzaam te voorkomen van onthechting van de dia, organoids met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen op RT terwijl het zachtjes te schudden.
  9. Verwijder de 1 x PBS en correctie met 200 μL van 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten op RT terwijl het zachtjes te schudden. Controleer of de matrix gel wordt duidelijk na deze stap weergegeven.
    Opmerking: Methanol of formaline fixatie zijn ook mogelijk. Fixatie methode moet worden geoptimaliseerd voor specifieke antilichamen, zoals bepaalde fixatie methoden wel dwarslijn de antigenen van belang of quench TL-labeling-proteïnen van belang.
  10. Verwijder de fixeer en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden.
    Opmerking: De lengte van de stappen wassen moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van de grootte van de organoid. Vijf minuten is voldoende uitgangspunt, maar de stap wassen kan zo nodig worden verlengd.
  11. Doven autofluorescence met 200 μL van 50 mM NH4Cl in 1 x PBS voor 30 min op RT terwijl het zachtjes te schudden.
    Opmerking: Deze stap zal autofluorescence uit puin in het lumen van de organoid en fluorescerende eiwit expressie (zoals GFP), die van de proefopzet inhouden kan doven. Het moet worden opgenomen als het gewenst is te gebruiken van een fluorophore in de 488 kanaal, maar kan worden overgeslagen als wilde behouden GFP signaal.
  12. Verwijder NH4Cl en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden.
  13. Permeabilize organoids in 200 μL van 0,1% niet-ionogene wasmiddel-100 in 1 x PBS voor 30 min op RT terwijl het zachtjes te schudden.
  14. Verwijder de 0,1% niet-ionogene wasmiddel-100 in 1 x PBS en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden.
  15. Blok met 5% NHS met 200 μL van 0,1% niet-ionogene detergens X-100 op PBS en incubeer gedurende 60 minuten op RT terwijl het zachtjes te schudden.
  16. Verwijder de buffer met blokkerend en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden.
  17. Verdun het 1° antilichaam in 1% BSA met 0,3% Triton X-100 in 1 x PBS en aan 200 μL van de kamer dia toevoegen en incubeer gedurende 1 tot 3 dagen bij 4 ° C.
  18. Verwijderen van het 1° antilichaam en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden.
  19. Verdun het 2° antilichaam in 1% BSA met 0,3% Triton X-100 in 1 x PBS en aan 200 μL van de kamer dia toevoegen en incubeer gedurende 1 tot 3 dagen bij 4 ° C in het donker.
    Opmerking: De duur van incubatie tijd moet worden geoptimaliseerd voor de grootte van de organoid en antilichaam. Sommigen zullen vereisen meer tijd om door te dringen door middel van de organoid. Antilichaam concentratie zal ook moeten worden geoptimaliseerd. In het algemeen, 2 x de concentratie gebruikt voor FFPE secties is geschikt voor 1° antilichamen en dezelfde concentratie voor FFPE secties is geschikt voor 2° antilichamen.
  20. Verwijderen van het 2° antilichaam en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden.
  21. Counterstain de actine met phalloidin en de kern met DAPI of Hoescht, volgens de aanbevelingen van de fabrikant in 1% BSA met 0,3% verdund Triton-X in 1 x PBS. 200 μl aan kamer dia toevoegen en Incubeer bij RT gedurende 40 min. in het donker.
  22. Monteren in 200 μL van vers 1 x PBS of montage media en beeld onmiddellijk (fluorescentie moet worden bewaard tot maximaal 5 dagen, zo niet meer). Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 3 c.
    Opmerking: Natriumazide kan worden toegevoegd aan de monsters om verontreiniging te voorkomen als confocal imaging niet beschikbaar is. Het toevoegen van een clearing-agent kan verbeteren imaging.

7. geheel-montage van Organoids voor testen en fluorescerende sondes

Opmerking: Er zijn verkrijgbare testen en fluorescente sondes/kleurstoffen (voorbeelden zijn opgenomen op de lijst van de materialen) voor gebruik op geheel gemonteerde organoids te observeren van een verscheidenheid van nuttige eindpunten19geamendeerd. Het volgende protocol is voor de fluorescently-gelabelde EdU proliferatie kit, maar elke kit kan worden aangepast voor gebruik met een steekproef geheel gemonteerd.

  1. Zorgvuldig verwijderen van 50 μl van media en vervangen door 50 μl van 20 μM 2 x EdU-werkoplossing door pipetteren tegen de zijkant van goed, verlaten ruimte tussen media en matrix gel.
  2. Incubeer bij 4 ° C gedurende 1-3 dagen (de gewenste tijdsduur voor EdU inbouw moet worden geoptimaliseerd voor celtype van keuze).
  3. Stappen 6.2 – 6.8 overdracht van de organoids van belang op een kamer dia of confocal schotel.
  4. PBS verwijderen en monteren met 200 μL van 3,7% paraformaldehyde gedurende 30 minuten op RT terwijl het zachtjes te schudden. Zorgen dat de matrix gel na deze stap duidelijk weergegeven.
  5. Verwijder de fixeer en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden. Verwijder van PBS en voeg 200 μL van 0,5% niet-ionogene wasmiddel-100 in 1 x PBS voor 30 min op RT terwijl het zachtjes te schudden.
  6. Bereiden een 1 x TL reactie cocktail volgens specificaties van de fabrikant.
  7. Verwijderen van 0,5% niet-ionogene wasmiddel-100 en tweemaal met 200 μL van 3% BSA in 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden.
  8. Voeg reactie cocktail en incubeer gedurende 30 min op RT in het donker.
  9. Verwijder de fluorescerende reactie cocktail en wassen met 200 μL van 3% BSA in 1 x PBS voor 5 min terwijl het zachtjes te schudden. Counterstain en mount door na stappen 6.21-6.22 (figuur 3D).

Representative Results

Na succesvolle cultuur van menselijke primaire prostaat organoids, kunnen morfologie en differentiatie worden beoordeeld met behulp van FFPE, helder-veld beeldanalyse en geheel-mount kleuring technieken.

Het proces van helder-veld Fotolader wordt geïllustreerd in figuur 1A. Organoids zijn gegroeid in een 3D matrix en verspreid over verschillende focal vlakken. Om te observeren organoids in focus over vele vliegtuigen, wordt voorgesteld om het EOF image (figuur 1B, rechts) gebruiken in plaats van een enkel z-vliegtuig (figuur 1B, links). In het lab, organoids gegroeid onder verschillende experimentele omstandigheden kan leiden tot veranderingen in de morfologie. Met behulp van gebied, cirkelvormigheid (gedefinieerd door hoe vergelijkbaar de organoid tot een cirkel is) en max/min straal (maatregel van lengte) gebruikers geven een indicatie van organoid grootte en vorm en bieden een kwantificeerbare uitlezing van morfologie. Om te benadrukken het nut van deze maatregelen, worden representatieve beelden van organoids met soortgelijk gebied maar verschillende morfologie weergegeven in Figuur 1 c, waarin een lange organoid worden minder circulaire en hebben een grotere maximale/minimale verhouding dan een bolvormig organoid.

Het insluiten van organoids voor histologie is een nuttig eindpunt te observeren van het interieur van de monsters en zorgen dat necrose is niet aanwezig in de kern van een organoid. Een workflow voor dit proces en de resultaten van de vertegenwoordiger van de monsters van het Onbevlekt, verdeelde onder een heldere-veld Microscoop vindt u in figuur 2AB, C. Figuur 3A geeft een onjuist afgehandelde organoid (links) vergeleken met goed overhandigde organoids in figuur 3A (rechts) en figuur 3B. Om te bepalen van de differentiatie-en statuswaarden van het monster, is het raadzaam om te kijken naar basale cel markeringen (cytokeratin 5 en p63)8 samen met de luminal cel markeringen (cytokeratin 8)8. Het is dan ook om vlek organoids desgewenst in situ, geheel-mount kleuring is een handig alternatief, en deze representatieve resultaten vindt u in Figuur 3 cD.

Figure 1
Figuur 1: beoordeling van de morfologie van organoids in 3D cultuur. (A) foto-collectie en compressie workflow voor menselijke primaire prostaat organoids overgenomen door een doorvallend licht omgekeerd Microscoop met een gemotoriseerde X / Y fase en metgezel scansoftware. (B) representatieve beelden van een enkele z-stack (links) vs. een EOF afbeelding (rechts) van een geheel-well steekproef van menselijke primaire prostaat organoids, waaruit blijkt dat meer organoids in focus wanneer meerdere z-stacks zijn gecombineerd tot een enkele geprojecteerde beeld (schaal bar = 1000 µm). (C) representatieve beelden voor gebied, cirkelvormigheid en max/min verhouding van morfologisch ongelijke menselijke primaire prostaat organoids hebben hetzelfde gebied (schaal bar = 200 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Organoid insluiten workflow en vertegenwoordiger resultaten segmenteren. (A) menselijke primaire prostaat organoid werkstroom te embedding. (B) representatieve afbeelding van een dia van het Onbevlekt, verse met menselijke primaire prostaat organoids onder een heldere veld Microscoop beeltenis agar (groene pijl), histologie gel (zwarte pijl), bel (blauwe pijl), organoids (rode pijlen) (schaal bar = 1000 µ m). (C) onbevlekt vers gesneden dia (links) vs. organoids (rode pijlen) verschijnt onbevlekt droge dia (rechts), doorschijnend ostand (schaal bar = 500 µm) en zijn moeilijker te onderscheiden onder een heldere-veld Microscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: histologische kleuring op verdeelde en geheel gemonteerde organoids. (A) H & E kleuring van een gebroken mens primaire prostaat organoid van verkeerde behandeling (agressieve pipetteren, verkeerde verwerking protocol, links) naast een goed behandeld organoid (rechts) (schaal bar = 100 µm). (B) menselijke prostaat, primaire organoid, die al formaline-vaste, paraffine-ingebedde, gesegmenteerd, en gekleurd met basale cytokeratin 5 of luminal cytokeratin 8 (boven) of basale p63 en luminal cytokeratin 8 (onder) en beeld met confocal microscoop ( schaal bar = 100 µm). (C) een geheel gemonteerde menselijke primaire prostaat organoid gekleurd met basale cytokeratin 5 of luminal cytokeratin 8 en counterstained met phalloidin en DAPI, beeld met confocal microscoop (schaal bar = 100 µm). (D) een geheel gemonteerde menselijke primaire prostaat cel organoid gekleurd met fluorescently label EdU en teller gekleurd met Hoescht, beeld met confocal microscoop (schaal bar = 500 µm) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Organotypic cultuur is een spannende nieuwe methode voor Recapitulerend weefsel met het gemak van een in vitro -omgeving. Op dit moment groeien labs organoids van vele types van weefsels voor verschillende eindpunten. De methoden die worden beschreven in dit document nuttig eindpunten samenvatten en markeer nieuwe technieken volledig karakteriseren 3D primaire prostaat celculturen.

Er zijn een verscheidenheid van media recepten voor het cultiveren van menselijke primaire prostaat cel organoids5,6,13. Terwijl alle levensvatbare en vergelijkbare resultaten bereiken, KSFM gebaseerde media13 gebruikt minimale additieven zodat het wordt beschreven hier. Bovendien zijn papers gepubliceerd met behulp van meerdere concentraties voor matrix gel, van 10% tot 75% tot cultuur prostaat organoids5,6,13. Omdat de matrix gel is een duur reagens, en 33% matrix gel is aangetoond dat voldoende is om te cultiveren van lange termijn (2-3 weken), levensvatbare, unclumped organoids13, dit is de aanbevolen concentratie. Matrix gel kan echter variëren in eiwitconcentratie tussen de lotnummers, zodat hiermee rekening moet worden gehouden wanneer plating. Het is ook aanbevolen voor de aankoop van matrix gel in bulk voor gebruik in meerdere experimenten om inconsistentie tussen veel. Andere laboratoria hebben verschillende formaten voor de plating matrix gel, zoals druppeltjes in plaats van een 96-wells-plaat goed5coating gepubliceerd. Beide methoden vormen levensvatbare organoids, maar de indeling hier beschreven voorziet in cellen worden meer dun, vergulde waarvan is aangetoond dat het bevorderen van de bekendheid van de cellen groter organoids13. Echter moet plating dichtheid worden geoptimaliseerd op basis van patiënt-specifieke vorming efficiëntie. Matrix gel is beschikbaar in vele formaten waaronder groeifactor verminderde, fenol rood-vrije, hoge concentratie, enz. Groeifactor-verminderd wordt aanbevolen voor kweekomstandigheden gedefinieerd en fenol rood-vrije wordt aanbevolen bij het werken met cellen die uitdrukking geven aan GFP of in experimenten waarbij z-stack Fotolader. Het is essentieel dat elke matrix gel plating stappen worden uitgevoerd met ijskoude reagentia, zoals matrix gel snel bij kamertemperatuur stolt.

Organoids geteeld onder verschillende experimentele behandelingen kan resulteren in wijzigingen aan vorm, zodat helder-veld imaging veel gebruikt wordt om te studeren waargenomen morfologische fenotypen. Niettemin, opname en kwantificering van gebied of vorm is een uitdaging om twee redenen: 1) selectie bias tijdens Fotolader en 2) het toepassen van een tweedimensionale parameter zoals gebied op een driedimensionale monster. Een strategie van Fotolader is opnemen van een willekeurig veld en meten van een vooraf bepaald aantal organoids op dat gebied, kan maar dit vooroordeel tijdens de selectie kunt maken, en alle organoids in het geselecteerde veld niet in focus. Geheel-well imaging geoptimaliseerd voor de indeling van de 96-Wells microplate elimineert deze bemonstering bias door het verzamelen van de bevolking van de hele organoid van belang. Echter, afhankelijk van de doelstellingen van de Microscoop op hand wellicht meerdere velden worden verzameld en betegeld met het oog op de afbeelding van een geheel-well. Sommige laboratoria hebben meten gebied van een enkele z-plane12beschreven, maar om vast te leggen van alle organoids in focus, wordt u geadviseerd te verzamelen en stapelen van meerdere vlakken in een enkele EOF-afbeelding13. In sommige gevallen een meniscus in de matrix gel kan vignettering in de afbeelding en achtergrond correctie methoden mogelijk moeten worden toegepast met behulp van de software van de analyse van de afbeelding. Exacte volume is idealiter de geschiktste meting voor de grootte van de organoid; Dit is echter moeilijk precies te verkrijgen, zelfs met meerdere plaatjes-z-stack. Andere nuttige morfologische dimensies, zoals cirkelvormigheid en maximale/minimale verhouding, kunnen gemakkelijk worden berekend op basis van alle organoids in een geheel-well EOF afbeelding. Samen, deze methoden overwinnen sampling bias uitdagingen en inschakelen van de meting van 2D parameters van 3D-objecten in een 3D-ruimte.

Formaline fixatie en paraffine inbedding van organoids is een gemeenschappelijke werkwijze te halen haematoxyline en eosine (H & E), immunohistochemische (IHC) en immunefluorescentie (IF) kleuring voor visualisatie en analyse6,11, 20. echter een publicaties die deze techniek beschreven gebrek aan uitgebreide gegevens over het insluiten proces. Bovendien kan vinden van organoids binnen het blok van paraffine worden uitdagende. Enkele labs vlek vooraf organoids met trypan blauwe voorafgaand aan insluiten om te helpen bij locatie tijdens het segmenteren van11. De hier beschreven methode omvat het gebruik van een histologische kleurstof voor oriëntatie van de gelplug van de organoid/histologie tijdens te embedding ter bevordering van de efficiëntie van het segmenteren. H & E dia's vergemakkelijken onderzoek van necrose en textuur van de nucleaire proliferatie, en dus moet het een verplichte eindpunt voor organoid cultuur om ervoor te zorgen dat de cellen gezond in heel het gebied zijn. Een sterkte van organoid cultuur is dat monsters bestaan uit een heterogene mengsel van cellen die beter in vivo patiënten weefsel lijken. In de prostaat, bijvoorbeeld, zijn zowel de luminal als de basale cellen aanwezig in de prostaat organoids5, terwijl cellen gekweekt in 2D ontbreken luminal differentiatie8. Om te beoordelen organoid differentiatie, is het aanbevolen dat onderzoekers basale markeringen zoals CK5 en p63 en luminal markeringen zoals androgeen receptoren en CK88 beoordelen. Elke andere experimentele proteïnen van belang kunnen ook worden bestudeerd met behulp van deze kleuring technieken.

Hoewel FFPE secties toestaan visualisatie van de cellen die woonachtig zijn in de innerlijke compartiment via histologische methoden (H & E, als, IHC), beelden zijn beperkt tot het Kruis secties, en organoid vorm kan worden veranderd door het insluiten proces. Geheel-mount kleuring kan een organoid worden gekleurd en waargenomen in situ, behoud van morfologische fenotypes en beelden van eiwit localisatie toe te staan. Geheel-montage is een hulpmiddel gebruikt om het geheel-weefsel of geheel-dier monsters, zoals de zebravis of muis embryo, vlekken en is gemakkelijk aan te passen voor organoids. De hier beschreven techniek werd vanaf de procedure gewijzigd door Mahéet al. 11, die gegevens van de initiële groei en de cultuur van gastro-intestinale organoids rechtstreeks op de dia van een kamer voor de kleuring en fixatie van de volledige hoofd-cultuur vereist. De hier geschetste methode omvat de overdracht van een enkele organoid (of organoids) van belang in een kamer dia ten tijde van de kleuring. Hierdoor is de selectie van individuele organoids in een lopende experiment zonder fixatie van de bovenliggende cultuur p.a. geheel-mount. Bij het uitvoeren van geheel-mount kleuring, het is noodzakelijk voor het optimaliseren van de permeabilization en de incubatietijd voor primaire en secundaire antilichamen om penetratie tijdens het specimen (overal van één of meer dagen wordt aanbevolen). Zodra het beeld via confocale microscopie, kunnen 3D renderings worden geproduceerd om te schakelen van visualisatie en lokalisatie van een specifieke proteïne en bereken het aantal positief gekleurde cellen aanwezig in een monster. Stroom cytometry is een nuttig eindpunt te kwantificeren populaties van basale, luminal, of5,14van de cellen van de stam. Om dit te doen, worden cellen hersteld van de matrix-gel en zachtjes los gezien voor de kleuring. Gebruikers moeten passende markeringen voor scheiding op basis van de huidige literatuur zorgvuldig selecteren. Voor menselijke primaire prostaat epitheliale cellen zijn CD26 en CD49f geschikt luminal en basale markers, respectievelijk5,21.

Kortom gegevens dit protocol menselijke primaire prostaat organoid groei, collectie, en experimentele eindpunten. Van de nota, kan de montage techniek beschreven worden toegepast op een verscheidenheid van andere tests die normaal werkzaam zijn voor 2D cellen, zoals fluorescente sonde gebaseerde experimenten kijken proliferatie19, apoptosis en subcellular organel vlekken. Bovendien, kan de collectie en dissociatie hier beschreven methode worden gebruikt ter voorbereiding van eencellige RNA sequencing18. Collectief, hieruit blijkt dat de mogelijkheid voor een verscheidenheid van roman, hifi-eindpunten die onderzoekers kunnen optimaliseren en verkennen in de toekomst.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken de leden van de UIC Biorespository, Dr. Klara Valyi-Nagy, en Alex Susma, evenals de Urologen, Drs. Michael Abern, Daniel Moreira en Simone Crivallero, voor versoepeling van de weefsel aanwinst voor de primaire celculturen. Wij danken de UIC-urologie-patiënten voor het doneren van hun weefsel voor onderzoek. Dit werk werd gefinancierd, gedeeltelijk door het departement van defensie prostaat kanker onderzoek programma gezondheid verschillen idee Award PC121923 (Nonn) en het UIC-Center for Clinical en vertaling wetenschapsonderwijs Pre-doctoral voor (klinisch en translationeel wetenschappers PECTS) programma (McCray en Richards) en door de National Institutes of Health National Cancer Institute, Grant nummers U54CA202995, U54CA202997 en U54CA203000, bekend als de Chicago gezondheid "equity" Collaborative (Nonn en Richards). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health of het ministerie van defensie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells of interest
Keratinocyte-SFM (KSFM) ThermoFisher Scientific 17005042
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) ThermoFisher Scientific 12676029
5α-Dihydrotestosterone (DHT) Sigma-Aldrich D-073-1ML
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Matrigel (matrix gel) Corning Various Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application
Ice Bucket
Cell Culture Hood
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical ThermoFisher Scientific 05-408-130, 339650
Centrifuge
Dispase (neutral protease) STEMCELL Technologies 7923 neutral protease
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025076
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018 suggested RNA extraction solution
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900 suggested protein extraction solution
DNAzol ThermoFisher Scientific 10503027 suggested DNA extraction solution
Organoids
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Brightfield microscope with camera capabilities ex. ‎EVOS FL Auto Imaging System
Photo analysis software ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler
Graphing software ex. Graphpad, Excel, etc
Organoids
Ice pack
Masking tape
Pipette tips (1000 μL)
Razor blade
Dispase STEMCELL Technologies 7923
Agarose Sigma-Aldrich A9045
HistoGel (histology-gel) ThermoFisher Scientific HG-4000-012
Pencil
"Plunger" from 1 cc insulin syringe
Tissue Casette Thomas Scientific 1202D72
Container to hold fixative
10% neutral buffered formalin (NBF) Sigma-Aldrich HT501128
Histology pen, xylene and EtOH-resistant Sigma-Aldrich Z648191-12EA STATMARK pen
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 For fixation and graded dilutions during processing
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water
Paraffin Leica various
Tissue processor
Embedding workstation
Economy Tissue Float Bath Daigger EF4575E XH-1001
Microtome
Microtome blades Ted Pella 27243
Positively charged microscope slides Thomas Scientific 1158B91
Laboratory Oven ThermoFisher Scientific PR305225G
Hematoxylin and Eosin Stain Kit Vector Laboratories H-3502 Suggested H&E staining kit
ABC Peroxidase Standard Staining Kit ThermoFisher Scientific 32020 Suggested immunohistochemistry staining kit
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) Cell Signaling Technology 5153S Suggested primary antibody for IHC
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 dilutions should be performed using deinoized water
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water (DI H2O)
Antigen retrieval solution Sigma-Aldrich, Abcam C9999, ab93684
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Coplin Fisher Scientific 19-4
Staining rack IHC World M905-12DGY
Staining dish IHC World M900-12B
Decloaking chamber Biocare Medical DC2012
Humidity chamber Thomas Scientific 1219D68
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Microscope cover glass Globe Scientific 1414-10
Anti-fade mounting media ThermoFisher Scientific S36972
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240 optional adherent reagent
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023
4% paraformaldehye (PFA) Biotium 22023 other fixatives such as methanol or formalin can be used
50mM NH4Cl sigma-Aldrich 254134
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum (NHS) thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin (BSA) sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Counterstain (phalloidin) thermoFisher Scientific A22287
Sodium azide sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Visikol HISTO-M Visikol various optional clearing agent
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Cell assay of interest Various Various Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)
Organoids
Ice bucket
Cell culture hood
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical
Microcentrifuge
Dispase STEMCELL Technologies 7923
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175079
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap Fisher Scientific 08-771-23
Cytokeratin 5 Antibody - FITC Millipore Sigma FCMAB291F Suggested flow antibody
Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 Abcam ab210139 Suggested flow antibody
CD49f - Alexafluor 647 BioLegend 313609 Suggested flow antibody
CD26 - PE BioLegend 320576 Suggested flow antibody
Flow cytometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
  2. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  3. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
  4. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  7. Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2. The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).
  8. Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue. Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).
  9. Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1. The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).
  10. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
  11. Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).
  12. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).
  13. Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids. iScience. , in press (2018).
  14. Hu, W. -Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
  15. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
  16. Peehl, D. M. Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro. Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).
  17. Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).
  18. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  19. Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. Whole-mount Enteroid Proliferation Staining. Bio-Protocol. 6 (12), (2016).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).

Tags

Bioengineering kwestie 143 Organoid eindpunt 3D quanification beeldanalyse FFPE geheel-mount morfologie prostaat mens immunofluorescentie
Behandeling en evaluatie van menselijke primaire prostaat Organoid cultuur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCray, T., Richards, Z., Marsili,… More

McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. J. Vis. Exp. (143), e59051, doi:10.3791/59051 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter