Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Manutention et évaluation de la Culture humaine Organoïde la Prostate primaire

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/59051
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Departments of Urology, Physiology, and Biophysics, University of Illinois at Chicago, 3University of Illinois Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à guider la manipulation humaine primaire organoïde la prostate puis indiquent les points de terminaison pour évaluer le phénotype. Semis, entretien de la culture, recouvrement de gel de matrice, quantification morphologique, enrobage et sectionnement, FFIP sectionnement, entier-montez coloration et application d’essais commerciaux sont décrites.

Abstract

Cet article décrit un protocole détaillé pour en trois dimensions (3D) culture, manutention et évaluation des humains primaires organoïdes la prostate. Le processus implique l’ensemencement des cellules épithéliales faiblement dans un gel de la matrice 3D sur une microplaque 96 puits avec milieu change de cultiver l’expansion dans organoïdes. Morphologie est ensuite évaluée par puits toute capture d’images de z-pile. Compression de z-cheminées crée une seule image de mise au point d'où organoïdes sont mesurés afin de quantifier les diverses sorties, y compris la circularité, rondeur et la surface. ADN, d’ARN et protéine peuvent être collectées d’organoïdes extraite le gel de la matrice. Les populations de cellules d’intérêt peuvent être évaluées par une dissociation organoïde et cytométrie en flux. Formol-fixation-paraffine-embedding (FFIP) suivie de la section est utilisée pour l’évaluation histologique et anticorps. Entier-Montez la souillure immunofluorescente préserve la morphologie organoïde et facilite l’observation de la localisation de la protéine dans organoïdes in situ. Des essais commerciaux qui sont traditionnellement utilisées pour les cellules de la monocouche 2D peuvent être modifiés pour organoïdes 3D. Utilisés ensemble, les techniques dans ce protocole fournissent une boîte à outils robuste afin de quantifier la prostate organoïde croissance, les caractéristiques morphologiques et l’expression des marqueurs de différenciation.

Introduction

Organoïdes constituent un outil précieux pour étudier l’organogénèse et la maladie. Ils fournissent une alternative moins chère à des modèles animaux, et dérivé de patient organoïdes évoluent comme une stratégie pour la médecine personnalisée1,2,3. Ce système en trois dimensions (3D) culture consiste à ensemencer les cellules souches ou progénitrices (récoltées dans les tissus ou induite par les cellules souches pluripotentes) dans un gel des composants de la matrice extracellulaire (gel de matrice)4. Les cellules prolifèrent et se différencient, résultant en des structures organotypique qui récapitulent la hiérarchie cellulaire et la morphologie de l’organe de l’unité fonctionnelle de l’intérêt. Organoïdes ont été cultivés à l’aide de cellules provenant d’une variété d’organes, y compris les glandes salivaires, estomac, intestin, foie, prostate, poumon et cerveau4. Bien qu’il existe de nombreux protocoles décrivant les étapes pour mettre en place la prostate organoïdes5,6, il est difficile de trouver des méthodes suffisamment détaillées sur la façon d’obtenir des points de terminaison quantitatives d’organoïdes. Cet article résume les méthodes mises au point pour les cellules de la prostate humains primaires et détaille une série de points de terminaison suggérés d’évaluer les phénotypes organoïde. Ces techniques ont été optimisées pour la prostate organoïdes et peuvent s’appliquer à d’autres cultures cellulaires 3D.

La prostate organoïde cultures ont récemment émergé comme un modèle précieux in vitro qui n’a pas les limitations de l’utilisation des cultures monocouches établi de lignées cellulaires immortalisées. L’épithélium de la prostate et le cancer de la prostate est un défi au modèle in vitro à l’aide de lignées cellulaires immortalisées. Le nombre de lignées cellulaires bénignes est limité, et tous ont subi la transformation avec oncogènes7. Cellules épithéliales de la prostate primaires en monocouches de ne pas se différencier en cellules luminales et n’ont pas de récepteurs aux androgènes8. La majorité des lignées cellulaires de cancer de la prostate n’ont pas de récepteurs aux androgènes fonctionnelle, un médiateur important d’état précoce de la maladie et manque de changements génétiques clés qui ont été retrouvés dans les tumeurs de patients9. La prostate organoïde cultures peuvent être cultivées facilement de l’épithélium bénigne et sont utiles dans l’étude des propriétés de cellules souches, cellules progénitrices, différenciation et les effets des changements expérimentaux dans le microenvironnement4,5. Organoïdes cancer de la prostate peut être cultivé dans le cadre d’une approche de la médecine de précision à la modélisation des maladie patiente et réponse aux thérapies10.

Ce protocole a été compilé à partir des protocoles existants qui utilisent divers types de cellules, mais elle a été ici optimisée pour une utilisation dans les cellules de la prostate primaires humaines. Il complimente protocoles décrits par Soltani, Clevers et Shen5,6 qui décrivent la croissance, passage, imagerie champ lumineux, cryoconservation et isolement ARN et l’ADN de souris la prostate et de l’organoïdes humaine. Le protocole entier-montez est modifié de Mahé et al. 11, qui ont utilisé organoïdes épithéliales gastro-intestinaux et décrit vivre d’imagerie et congelés et enrobage de paraffine. Borten et al. 12 décrit l’analyse du cancer du sein, du côlon et la morphologie organoïde cancer colorectal de lumineux-zone d’imagerie. En outre, Richards et al. 13 une méthode utilisée pour l’évaluation morphologique de la prostate organoïdes. Enfin, Hu et al. 14 décrit une méthode de prostate adhérente organoïdes à une diapositive de chambre pour la nuit avant l’immunofluorescence pour observer les cellules individuelles et dispersion des sphères pour analyse en cytométrie en flux.

Le but du présent protocole est de démontrer de manière suffisamment détaillée ces méthodes techniquement difficiles comme un protocole, y compris l’ensemencement de cellule ; médias et matrice gel entretien ; collection de cellules pour la cytométrie en flux ; ARN, ADN et extraction de la protéine ; évaluation morphologique de l’analyse de lumineux-zone z-pile ; incorporation, traitement et profilés pour coloration histologique ; et tout le montage pour immunofluorescence essais sonde fluorescente. La pertinence biologique et l’interprétation de ces divers paramètres variera entre expérimental et les anticorps utilisés pour l’analyse. Par l’utilisation du présent protocole, les utilisateurs doivent se sentir prêts à mettre en place une expérience avec une boîte à outils des points de terminaison.

Primaire la prostate (GER) des cellules épithéliales humaines furent établies en laboratoire par le protocole décrit par Peehl15,16 et maintenus à un nombre limité de passages (jusqu'à quatre) comme décrit précédemment17, mais ils sont aussi disponibles auprès de fournisseurs commerciaux. Hépatocytes sans sérum axée sur les médias6et axée sur les KSFM13R-spondin 1-conditionné5 médias sont tous publiés comme avoir réalisé avec succès organoïdes. Axée sur la KSFM exige le plus petit nombre d’additifs, donc elle est décrite ici.

Protocol

Le protocole suivant a été optimisé en utilisant humains cellules épithéliales de la prostate primaires, récoltées dans les tissus du patient à l’Université de l’Illinois à l’hôpital de Chicago. Tous les tissus humains utilisés pour ces expériences ont été acquises via l’Institutional Review Board-a approuvé le protocole et/ou dispense à l’Université de l’Illinois à Chicago. Alors que les conditions de culture varient selon le type de cellule d’intérêt, les points de terminaison peuvent servir à organoïdes des autres tissus.

1. ensemencement des cellules épithéliales dans la matrice Gel et évolution des médias

  1. Recueillir les matériaux nécessaires : primaire la prostate cellules épithéliales humaines (GER), gel de matrice sur la glace, microplaque 96 puits, kératinocytes milieux sans sérum (KSFM) sur la glace, du charbon de bois dépouillé sérum fœtal (SVF) et la dihydrotestostérone (DHT).
  2. Préparer les milieux organoïde axée sur les KSFM en combinant 47,5 mL de KSFM avec 2,5 mL de charbon FBS dénudées et de la dihydrotestostérone (DHT) à une concentration finale de 10 nM DHT, puis réserve sur la glace.
  3. Cellules de la plaque dans une matrice 3D sous une hotte de culture cellulaire en utilisant une technique stérile.
    1. Doucement mélange froid organoïde axée sur la KSFM des médias avec gel glacé matrice pour obtenir une matrice de 50 % de mélange de gel lentement pipetage de haut en bas, en évitant les bulles.
      Remarque : Gel de la matrice devrait être décongelé toute la nuit à 4 ° C et gardé sur glace lorsque cela est possible. Elle se solidifie rapidement à température ambiante (RT).
    2. Pré mouillage un embout de la pipette dans les médias froids et transférer 40 – 50 μL de matrice de 50 % de gel sur la partie inférieure de chaque puits pour être utilisé sur une plaque à 96 puits. Recouvrir le fond du puits pour former une couche de base.
      Remarque : Dispensent pas pleinement à la deuxième étape sur la pipette graduée, car cela peut créer des bulles.
    3. Placer la plaque à 96 puits dans l’incubateur de 37 ° C pendant 30 à 45 min solidifier la couche de base.
      Remarque : Plaque pas de cellules épithéliales sur la couche de base jusqu'à ce qu’il se solidifie, ou cellules peuvent tomber à travers la matrice sur la partie inférieure de la plaque et se développer comme une monocouche.
    4. Mélanger des cellules épithéliales suspendus dans les médias organoïde axée sur les KSFM avec le gel de la matrice pour obtenir une concentration finale de 100 – 1 000 cellules/100 μL et gel de matrice de 33 %. Cellules épithéliales de la plaque sur le dessus de couches de base à l’aide de 100 μL de mélange de 33 % matrice gel/cellules / puits.
      Remarque : Les expériences antérieures ont démontré que la semis trop dense en 3D, les cellules épithéliales limitera la taille de croissance organoïde, tandis que les semis trop faiblement peuvent entraîner la très faible rendement,13. Il est important d’optimiser les conditions de semis pour le type de cellule d’intérêt, basé sur l’efficacité de la formation spécifique au patient organoïde.
  4. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 à 45 min permettre le gel de la matrice se solidifier, puis doucement ajouter 100 μL de médias organoïde axée sur les KSFM sur le dessus de cellules en pipettant également lentement contre le bord du puits.
  5. Modifier les médias tous les 2 – 3 jours. Pipetage contre la paroi du puits avec un espace entre le médias et matrice gel, retirez soigneusement 50 μL de médias et remplacer par 50 μL de supports neufs.
    Remarque : Pour une culture à long terme, le gel de la matrice doit être changé toutes les 2 – 3 semaines. Si la culture de gel de matrice apparaît instable et affiche des rides translucides sous le microscope, puis le gel de la matrice est en panne et doit être remplacé.

2. collection d’Organoïdes de matrice Gel

NOTE : Collecte d’organoïdes est nécessaire pour la matrice gel de changements, de passage ou de points de terminaison de l’extraction de l’ARN, l’extraction d’ADN, extraction de protéine et cytométrie en flux.

  1. Protéase neutre chaud et Hanks balanced solution saline (HBSS) dans un bain-marie à 37 ° C.
  2. Enlevez soigneusement média puits sans perturber le gel de la matrice.
  3. Ajouter ~ 200 μL de protéase neutre dans chaque puits à un ~ 1:2 ratio de protéase de matrice gel : neutre et incuber pendant 20 min à 37 ° C.
  4. Mécaniquement de dissocier le mélange de protéase matrice gel : neutre par pipetage de haut en bas.
  5. Incuber pendant 20 min à 37 ° C.
  6. Transvaser le mélange de gel électrolyte de matrice protéase neutre dans un tube de microcentrifuge ou tube à fond conique, en fonction du volume. Centrifuger à 300 g pendant 3 – 5 min granuler des cellules.
    Remarque : Si aucun culot cellulaire n’apparaît, le gel de la matrice ne peut-être pas être complètement dissocié et peut être visualisé comme une phase translucide au fond du tube distinct du surnageant rose. Retirez le surnageant et ajouter protéase plus neutre à un ratio de 1:2 à matrice le culot de gel, incuber pendant 20 à 40 min à 37 ° C et répéter la centrifugation à 300 x g.
  7. Lorsqu’un pellet organoïde est acquis, éliminer le surnageant. Poursuivez le passage (voir étape 2.7.1), organoïde lyse pour l’extraction de l’ARN, ADN ou protéines (voir étape 2.7.2), unique de traitement des cellules par cytométrie en flux et le séquençage des unicellulaires (voir étape 2.7.3).
    1. Pour les cultures à long terme, doucement resuspendre organoïdes intact dans 33 % frais de matrice gel et plaque en suivant les étapes décrites dans les étapes 1.1 – 1,5. Pour dissocier des organoïdes et replate comme des cellules individuelles, resuspendre le culot dans 1 mL d’enzymes chaud-la dissociation cellulaire et incuber à 37 ° C pendant 10 à 15 min, laver une fois avec 5 mL de HBSS et re-plaque dans le gel frais matrice suivant étapes 1.1 – 1,5.
    2. Resuspendre le culot d’organoïde dans un tampon de lyse approprié pour l’extraction de l’ARN, l’extraction d’ADN ou l’extraction de protéines telles qu’énumérées dans le Tableau des matériaux et suivre le protocole du fabricant.
    3. Resuspendre organoïdes dans 1 mL d’enzymes chaud-la dissociation cellulaire et incuber à 37 ° C pendant 10 à 15 min à se dissocier de l’organoïdes en cellules individuelles. Laver une fois avec 5 mL de HBSS et aller de l’avant avec le protocole pour écoulement cytometry5 ou unicellulaires séquençage18.
      Remarque : Pour dissocier dans des cellules individuelles à de faibles concentrations de gel de la matrice, la protéase neutre peut-être ne pas être nécessaires, et enzymes de dissociation cellulaire peuvent être appliquées directement dans le puits après l’étape 2.2.

3. ensemble-bien Image Acquisition et analyse de la morphologie Organoïde

  1. Acquérir des images de tout puits z-pile à l’aide d’un microscope inversé lumière transmis avec un motorisé X / Y analyse la scène (workflow illustré dans la Figure 1 a).
    1. La position focale réglée au fond du puits, commencez à mise au point vers le haut jusqu'à ce que le premier organoïde est rencontrée, qui sera au centre du puits à cause du ménisque de la couche de base. Définir le plan z bas à cette position.
    2. Poursuivre la mise au point vers le haut jusqu'à ce que le dernier organoïde est mise au point, qui sera dans la périphérie du puits. Définir le plan z supérieur à cette position.
      Remarque : Après avoir réglé le haut et le bas de la pile-z, s’assurer que ces positions capturent l’organoïdes dans tous les puits restants et ajustez le haut/bas, selon vos besoins. Cela permet pour la gamme z à utiliser pour un seul balayage qui inclut chaque organoïde dans chaque puits.
    3. Capturer les 15 – 35 z-plans / puits, en utilisant un plus grand nombre pour une plus grande résolution. Capturer l’image bien ensemble, fusionner et recueillir les quadrants ou paragraphes si nécessaire.
      Remarque : Il est recommandé de prendre plusieurs avions-z par opposition à un seul plan z, comme l’illustre l' Figure 1 b , dans lequel organoïdes sont hors de discussion lors de la capture d’un seul plan z.
    4. Enregistrer des images de z-pile pour analyse en aval.
  2. Analyser les images à l’aide de logiciel d’images avec des possibilités de dessin libres.
    1. Ouvrez une seule image de z-plane définie à l’étape 3.1.4.
    2. Si nécessaire, les images prises à chaque plan z individuel dans une seule image puits ensemble de tuiles. Enregistrez la nouvelle image dans un fichier séparé. Répétez cette procédure pour chaque plan z acquis.
    3. À l’aide du logiciel image, ouvrez l’image de tout puits pour chaque plan z provenant d’un puits unique et créer une profondeur de champ (Fed) image étendue de la pile de z-planes.
      NOTE : Ce type d’image choisira la meilleure région de mise au point de chaque plan z pour créer une seule image de mise au point du puits.
    4. Définir l’échelle du pixel du logiciel au Barreau de l’échelle de l’image qui est mesurée.
    5. À l’aide de l’outil forme libre et dessin du logiciel image, trace le périmètre de chaque organoïde dans le puits.
    6. Obtenir la métrique de mesure de périmètres organoïde tracées par le logiciel d’image.
      Remarque : Les paramètres recommandés sont zone, circularité et rapport rayon maximale/minimale. Résultats représentatifs qui illustrent l’application de ces mesures sont indiquées dans la Figure 1. Zone est calculé à partir du polygone défini par le périmètre de l’organoïde. La circularité est le rapport entre la zone de l’organoïde à l’aire d’un cercle avec furet maximale un diamètre l’organoïde d’equal, où 0 est moins circulaires et 1 plus circulaire. Maxi/mini rayon ratio est le rapport entre le rayon maximum et le rayon minimal de l’organoïde tracée.
      Circularité =Equation 1
      Rapport rayon =Equation 2

4. paraffine et Fixation au formol incorporation d’Organoïdes pour les paramètres histologiques

  1. Préparer les fournitures encastrement : HBSS, solution d’agar de 2 %, colorant histologique marquage, gel d’histologie, de pipettes moule d’embout, ruban, piston d’une seringue à insuline de 1 cc, banquise, cassettes, 10 % de formol tamponné neutre (FBN), un crayon et 75 % grade histologique d’éthanol (EtOH).
    1. Préparer deux tubes de microcentrifuge de solution d’agar de 2 %. Incuber dans un bain-marie ou dans un bloc chauffant à 100-110 ° C pour maintenir la gélose sous forme liquide. Ajouter 1 à 2 gouttes de histologique marquant le colorant à l’une des solutions de 2 % d’agar, qui signifiera la partie supérieure de la gélose Branchez et aident au maintien de l’orientation au cours de l’incorporation. Bien mélanger.
    2. Chauffer le gel de l’histologie dans un bloc de baignoire ou de la chaleur de l’eau à 55-65 ° C.
    3. À l’aide d’une pointe de pipette 1000 μL, créer des moules en découpant une petite section de l’embout de la pipette pour faire un cylindre qui contient environ 50 μL. Créer un moule ensuite, plus large qui s’adapte autour du premier moule.
    4. Créez un bloc froid en encapsulant un sac de glace avec du ruban adhésif (adhésif vers le haut) et en respectant les moules sur la bande.
    5. Créer un plongeur en retirant le piston d’une seringue à insuline de 1 cc.
  2. Incorporer l’organoïdes dans une prise de gel d’histologie pour traitement, suivant le flux de travail représenté dans la Figure 2 a.
    1. Dissocier le gel de la matrice et pellet organoïdes en suivant les étapes 2.1 – 2,7.
    2. Laver le culot organoïde une fois avec 1 mL de HBSS et re-granulés en filature pendant 3 à 5 min à 300 x g et en supprimant le surnageant.
    3. Resuspendre le culot d’organoïde dans 30 à 50 μL de gel liquide histologie. Mélanger doucement en pipettant également monter et descendre lentement. Transférer le mélange de gel/organoïde histologie dans un moule sur le bloc froid et laisser l’échantillon de refroidir et se solidifier dans un bouchon.
    4. Utiliser un piston pour pousser le bouchon sur le petit moule et dans le plus grand moule. Pipetter clair 2 % d’agar autour du bouchon pour remplir le moule plus grand.
    5. Pipette histologique teinté de colorant 2 % d’agar sur le dessus du bouchon pour désigner la partie supérieure de l’échantillon.
    6. Une fois refroidie, utiliser un piston pour transférer la fiche dans une cassette de l’histologie. Étiquetez la cassette à l’aide d’une cassette de crayon et place dans 10 % NBF pour la fixation du jour au lendemain.
    7. Transférer la cassette de 10 % NBF au grade histologique 70 % EtOH.
  3. Processus le gel histologie fiche utilisant un protocole de biopsie réglée sur un processeur, si elles sont disponibles. Si le paramètre prédéfini n’est pas disponible, saisir la séquence et les longueurs suivantes : 70 % EtOH pendant 6 min, 70 % EtOH pour 10 min, 80 % EtOH pendant 10 min, 95 % EtOH 2 fois pendant 10 min, 100 % EtOH 3 fois pendant 10 min, xylène 3 fois pendant 15 min , et en paraffine 3 fois pendant 15 min. s’écartant de la recommandée séquence de traitement peut entraîner la rupture organoïdes (Figure 3 a).
  4. Incorporer la prise de gel d’histologie avec la partie colorée vers le haut, ce qui permettra à la partie décolorée qui contient l’organoïdes à être sectionné en premier.
  5. Article l’histologie FFIP gel blocs :
    1. Matériel nécessaire : histologie FFIP gel stylo histologie, bain d’eau flotteur tissu, blocs, seau à glace avec glace, microtome, lames microtome, incorporation de poste de travail, chargés positivement les lames de microscope et four de laboratoire.
    2. Bain d’eau de remplissage jusqu'à ce que très complet et réglé à 40 ° C, puis four de laboratoire préchauffez à 45 – 50 ° C.
    3. Préparer un seau à glace, puis remplir de glace et ajouter de l’eau pour créer une suspension d’eau glacée. Faites refroidir les blocs de glace jusqu'à ce qu’ils sont très froids.
      NOTE : Blocs peuvent être définies sur la glace pour jusqu'à 1 jour, mais si laissé toute la nuit, les blocs vont devenir hydratés et devront être retraitées.
    4. Insérer un bloc de serrage de cassette microtome, s’ajoute la lame du porte-couteau et débloquer toutes mesures conservatoires de verrouillage sur l’ordinateur.
    5. Commencer par couper le visage du bloc de paraffine (face) sur une épaisseur de 10 µm. Une fois une section émerge qui contient la zone de prise, arrêter de parage, bloquer le rotor microtome et transférer le bloc sur la glace pour refroidir. Si plusieurs blocs doivent être sectionnées, face à face chaque bloc avant de passer à l’étape 4.5.6.
    6. Déplacez la lame à une portion de neuf, inutilisée et transférer le bloc à la pince. Débloquer la machine et commencer à tailler à 5 μm par section.
      Remarque : 5 μm est recommandé pour de meilleurs résultats, mais 3 – 10 μm est également acceptable.
    7. À l’aide de pinces à épiler, transférer la section dans le bain d’eau de 40 ° C et laisser la section d’étaler. Transférer la section sur une lame en plongeant verticalement dans l’eau.
      NOTE : Trempage dans un angle peut transférer les bulles du fond de la baignoire à la section et entraîner une distorsion de l’échantillon.
    8. Visualiser la section sous microscope (Figure 2 bC).
      Remarque : Si un organoïde présents, il sera identique à la flèche rouge dans la Figure 2 b. Bulles (Figure 2 b, flèche bleue) peuvent apparaître semblables à organoïdes et sont plus faciles à discerner dans une diapositive-frais que secs organoïdes apparaissent translucide (Figure 2). Si aucun organoïdes ne sont présents, section plus loin dans le bloc.
  6. Lorsque les diapositives contenant organoïdes ont été acquis, entourez la zone autour de la section sur le dos de la lame avec un stylo de l’histologie et les cuire au four durant la nuit à 45 – 50 ° C.
  7. Recueillir des diapositives et de procéder à la H & E (voir l’étape 4.9.1), immunohistochimiques (voir étape 4.9.2), ou par immunofluorescence souillant (voir étape 5).
    NOTE : Résultats représentatifs sont montrées dans la Figure 3 b.
    1. Pour effectuer des H & E coloration, obtenir un kit de la liste du matériel et suivez les indications du fabricant.
    2. Pour effectuer le marquage immunohistochimique, obtenir un kit et un anticorps primaire dans la liste de matériaux et suivre les indications du fabricant.

5. immunofluorescence de FFIP et sectionnés Organoïdes

  1. Matériel : au four slide de l’étape 4, xylène, 100 % EtOH, 95 % EtOH, 70 % EtOH, eau désionisée (DI H2O), coplin jars, 1 x antigène retrieval solution (tampon citrate de sodium ou tampon Tris-EDTA), tamponnée au phosphate solution saline (PBS), 5 % cheval normal sérum ( NHS) avec un détergent non ionique 0,1 % dans du PBS, 1 % sérum d’albumine bovine (BSA) avec un détergent non ionique 0,3 % dans du PBS, rack de coloration, coloration plat, révèler chambre, stylo barrière hydrophobe, chambre humide, 1 ° et anticorps 2 ° d’intérêt et de recouvrement des intérêt.
  2. Déparaffiner et réhydrater les diapositives en plongeant dans les coplins remplis avec les solutions suivantes : xylène (3 trempettes, 5 min chacun), 100 % EtOH (2 trempettes, 3 min chacun), 95 % EtOH (2 trempettes, 3 min), 70 % EtOH (2 trempettes, 3 min) et DI H2O (2 trempettes 3 min chacun).
  3. Remplir le plat coloration avec la solution de l’antigène et la chambre de préchauffage révèler à 100 ° C.
  4. Effectuer la recherche d’antigène en immergeant les lames dans le plat de coloration préchauffé et incuber pendant 5 à 10 min à 100 ° C. Une fois le cycle terminé, laisser la chambre decloaking siéger pendant 20 min avant d’ouvrir le couvercle.
  5. Une fois que le plat de la lame est refroidie jusqu'à la RT, posez le plat coloration courante DI H2O à rincer les lames pendant 5 min.
  6. Supprimer les diapositives de la coloration plat, tracer un cercle autour de l’échantillon avec un stylo de barrière hydrophobe et poser la lame sur la chambre de l’humidité.
  7. Bloquer n’importe quel anticorps non-spécifiques coloration en appliquant le NHS de 5 % avec un détergent non ionique 0,1 % dans du PBS au cercle hydrophobe autour de l’échantillon (environ 30 μL est nécessaire pour couvrir l’échantillon).
  8. Diapositives de lavage de coplins remplis de PBS 3 fois pendant 5 min chaque.
  9. Ajouter les anticorps 1° (Table des matières) dilués à 1 % de BSA avec 0,3 % de détergent non ionique dans du PBS au cercle hydrophobe autour de l’échantillon (environ 30 μL devrait couvrir la section), puis incuber pendant 1 heure à ta ou toute la nuit à 4 ° C en chambre humide.
  10. Laver les diapositives dans coplins rempli de PBS 3 fois pendant 5 min chaque.
  11. Ajouter l’anticorps 2° dilué à 1 % de BSA avec 0,3 % de détergent non ionique dans du PBS au cercle hydrophobe autour de l’échantillon (environ 30 μL couvrira la surface), puis incuber pendant 1 heure à ta en chambre humide.
  12. Laver les diapositives dans coplin rempli de PBS 3 fois pendant 5 min chaque.
  13. Ajouter DAPI, dilué selon les spécifications du fabricant, dans 1 % BSA avec 0,3 % de détergent non ionique dans du PBS au cercle hydrophobe autour de l’échantillon, puis incuber pendant 2 à 5 min à ta dans l’obscurité (30 μL).
  14. Laver les diapositives dans coplins rempli de PBS 3 fois pendant 5 min chaque.
  15. Monter les lames avec des supports de montage antifade et lamelle, puis visualiser les résultats sous un microscope.

6. montage ensemble d’Organoïdes pour immunofluorescence

  1. Matériel : diapositive de chambre ou plat confocale, tampon phosphate salin (PBS), fixateur, 50 mM NH4Cl dans du PBS, 0,1 % de détergent non ionique dans du PBS, NHS de 5 % avec un détergent non ionique 0,1 % dans du PBS, 1 % de BSA avec 0,3 % de détergent non ionique anticorps PBS, 1 ° et 2 ° d’intérêt et colorants d’intérêt.
  2. Retirez soigneusement autant médias possible sans perturber la culture organoïde en pipettant également contre la paroi du puits, laissant l’espace entre les médias et la matrice gel.
  3. En utilisant un parés, pré mouillage avec les médias ou PBS, 1 000 de pipette μL, dresser une goutte (25 – 50 μL) de gel de matrice qui contient l’organoid(s) d’intérêt et répartir au milieu d’un plat bien ou confocale du chambre de diapositive.
    Remarque : 33 % matrice gel n’est pas un solide. C’est un liquide gélatineux qui gère semblable à une gelée qui n’a pas été défini entièrement. Un embout de la pipette taillée avec une large ouverture empêchera organoïdes de rupture pendant les transferts.
  4. Si les organoïdes restent dans la culture parente, remplacez médias médias KSFM chaud.
  5. Avec l’oeil nu ou de dissection, aspirez le gel excès de médias et de la matrice de la diapositive de chambre avec une pipette de fine pointe (10 – 200 μL).
    Remarque : Il est facultatif d’un prétraitement de la diapositive de chambre avec un réactif d’adhérence.
  6. Plaque d’un volume égal de matrice gel dans un puits vide de la diapositive de la chambre comme un contrôle facultatif d’observer l’autofluorescence des reste matrice.
  7. Placez la chambre dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 à 45 min promouvoir l’organoïde pour adhérer à la vitre et éviter toute perte d’échantillons au cours des étapes de lavage.
  8. Pipetage lentement pour éviter de détachement de diapositive, laver organoïdes avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min à ta tout en secouant doucement.
  9. Enlever le 1 x PBS et fix avec 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min à ta tout en secouant doucement. Veiller à ce que le gel de la matrice apparaît clairement après cette étape.
    Remarque : La fixation méthanol ou formol sont également possibles. Méthode de fixation doit être optimisée pour des anticorps spécifiques, comme certaines méthodes de fixation peuvent relier les antigènes d’intérêt ou étancher fluorescentes-étiquetage-protéines d’intérêt.
  10. Retirez le fixateur et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement.
    Remarque : La longueur des étapes de lavage doit être optimisée selon la taille d’organoïde. Cinq minutes est un point de départ suffisant, mais l’étape de lavage peut être prolongée si nécessaire.
  11. Étancher autofluorescence avec 200 μL de 50 mM NH4Cl dans du PBS 1 x pendant 30 min à ta tout en secouant doucement.
    Remarque : Cette étape va étancher autofluorescence des débris dans le lumen de l’organoïde et d’expression de la protéine fluorescente (tels que GFP) qui peut-être présenter de plan expérimental. Il devrait être inclus s’il est nécessaire d’utiliser un fluorophore dans le chenal 488 mais peut être ignorée si vous le souhaitez afin de préserver le signal de la GFP.
  12. Enlevez NH4Cl et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement.
  13. Permeabilize organoïdes dans 200 μl de 0,1 % de détergent non ionique-100 dans du PBS 1 x pendant 30 min à ta tout en secouant doucement.
  14. Enlever le détergent non ionique 0,1 %-100 en 1 x PBS et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement.
  15. Bloquer avec 5 % NHS avec 200 μL de 0,1 % de détergent non ionique X-100 dans du PBS et incuber pendant 60 min à ta tout en secouant doucement.
  16. Retirer le tampon de blocage et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement.
  17. Diluer l’anticorps 1° 1 % BSA avec 0,3 % Triton X-100 dans du PBS 1 x et ajouter 200 μl de la diapositive de la chambre, puis incuber pendant 1 à 3 jours à 4 ° C.
  18. Éliminer les anticorps de la 1° et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement.
  19. Diluer l’anticorps 2° 1 % BSA avec 0,3 % Triton X-100 dans du PBS 1 x et ajouter 200 μl de la diapositive de la chambre, puis incuber pendant 1 à 3 jours à 4 ° C dans l’obscurité.
    Remarque : La longueur du temps d’incubation doit être optimisée pour les anticorps et organoïde taille. Certains exigeront plus de temps pour traverser l’organoïde. Concentration en anticorps devront également être optimisé. En général, 2 x la concentration utilisée pour les sections de la FFPE est appropriée pour les anticorps de la 1° et la même concentration pour les sections de la FFPE est appropriée pour les anticorps 2°.
  20. Éliminer les anticorps de la 2° et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement.
  21. Contre-coloration l’actine avec la phalloïdine et le noyau avec DAPI ou Hoescht, dilué selon les recommandations du fabricant BSA 1 % 0,3 % Triton-X dans du PBS 1 x. Ajouter 200 μL à glissière de la chambre, puis incuber à RT pendant 40 min dans le noir.
  22. Mont de 200 μL de frais 1 x PBS ou supports de montage et image immédiatement (fluorescence devrait être conservé pendant 5 jours, si ce n’est pas plus). Résultats représentatifs sont présentés dans la Figure 3.
    NOTE : Azide de Sodium peut être ajouté aux échantillons pour prévenir la contamination si l’imagerie confocale n’est pas facilement disponible. Ajout d’un agent de compensation peut améliorer l’imagerie.

7. montage ensemble d’Organoïdes pour des essais et des sondes fluorescentes

Remarque : Il existe des tests disponibles dans le commerce et les sondes/colorants fluorescents (exemples figurent sur la liste du matériel) amendable utilisables sur montés ensemble organoïdes d’observer une variété de points de terminaison utile19. Le protocole suivant est pour le kit de prolifération EdU fluorescent marqué, mais n’importe quel kit peut être modifié pour être utilisé avec un échantillon montés ensemble.

  1. Soigneusement retirer 50 μL de médias et le remplacer par 50 μL de 20 μM 2 x EdU solution de travail en pipettant également contre la paroi du puits, laissant l’espace entre les médias et la matrice gel.
  2. Incuber à 4 ° C pendant 1 à 3 jours (la durée désirée pour l’incorporation de l’EdU doit être optimisée pour le type de cellule de choix).
  3. Suivez les étapes de 6,2 à 6,8 pour transférer les organoïdes d’intérêt sur une diapositive de chambre ou plat confocale.
  4. Retirer les PBS et fixer avec 200 μL de paraformaldéhyde de 3,7 % pendant 30 min à ta tout en secouant doucement. Faire en sorte que la matrice gel semble clair après cette étape.
  5. Retirez le fixateur et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement. Supprimez les PBS et 200 μl de 0,5 % de détergent non ionique-100 dans 1 x PBS pendant 30 min à ta tout en secouant doucement.
  6. Préparer un 1 x fluorescente réaction cocktail selon les spécifications du fabricant.
  7. Retirez 0,5 % de détergent non ionique-100 et laver deux fois avec 200 μl de 3 % de BSA dans du PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement.
  8. Ajouter réaction cocktail et incuber 30 min à ta dans l’obscurité.
  9. Supprimer la réaction fluorescente cocktail et laver une fois avec 200 μl de 3 % de BSA dans du PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement. Contre-colorant et monter en suivant les étapes 6.21 – 6.22 (Figure 3D).

Representative Results

Sur culture réussie des humains primaires organoïdes la prostate, la morphologie et la différenciation peuvent être évaluées à l’aide d’analyse d’images lumineuses-champ et FFIP et entier-montent des techniques de coloration.

Le processus de capture d’image de lumineux-zone est illustré dans la Figure 1 a. Organoïdes sont cultivés dans une matrice 3D et dispersés sur différents plans focaux. Pour observer l’organoïdes mise au point à travers de nombreux avions, il est suggéré d’utiliser une image d’EDF (Figure 1 b, droite) au lieu d’un seul plan z (Figure 1 b, à gauche). Dans le laboratoire, organoïdes cultivé dans des conditions expérimentales différentes peut entraîner des changements dans la morphologie. À l’aide de la zone, de circularité (défini par l’organoïde comment semblable est à un cercle) et de rayon max/min (mesure de longueur) donner aux utilisateurs une indication de la forme et taille organoïde et fournir une lecture quantifiable de morphologie. Pour souligner l’utilité de ces mesures, images représentatives d’organoïdes avec une zone similaire mais différente morphologie sont indiquées dans la Figure 1, dans lequel une longue organoïde sera moins circulaires et ont un rapport plus élevé de maximale/minimale qu’un sphérique organoïde.

L’incorporation d’organoïdes pour histologie est un point de terminaison utile d’observer l’intérieur des échantillons et de veiller à ce que la nécrose n’est pas présente dans le noyau d’un organoïde. Un "workflow" pour ce processus et les résultats représentatifs des échantillons incolores, sectionnées sous un microscope lumineux-zone sont fournis dans la Figure 2 aB, C. Figure 3 a montre un organoïde manipulés sans précaution (à gauche) par rapport à correctement remis organoïdes dans la Figure 3 a (à droite) et la Figure 3 b. Pour déterminer l’état de différenciation de l’échantillon, il est recommandé de regarder de marqueurs (cytokératine 5 et p63) carcinome Baso-cellulaire8 ainsi que de cellules luminales marqueurs (cytokératine 8)8. Si on désire colorer organoïdes in situ, entier-Montez la coloration est une alternative pratique, et ces résultats représentatifs sont fournis dans la Figure 3D.

Figure 1
Figure 1 : évaluation de la morphologie des organoïdes dans la culture 3D. (A) flux de collecte et la compression d’images pour humains primaires organoïdes la prostate acquis par une lumière transmise microscope avec un motorisé inversé X / Y, stade et compagnon logiciel de numérisation. (B) les images représentatives d’une seule pile-z (gauche) vs. une image de l’EDF (à droite) d’un échantillon de tout puits d’humain organoïdes primaire de la prostate, montrant que plus organoïdes sont en discussion lorsque z-piles multiples sont combinées en une seule image projetée (barre d’échelle = 1000 µm). (C) des images représentatives rapport surface, circularité et max/min : morphologiquement dissemblables humains primaires organoïdes la prostate qui ont la même zone (barre d’échelle = 200 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Organoïde intégration de flux de travail et représentant de la section résultats. (A) humaine organoïde la prostate primaire intégrant des flux de travail. (B) une image représentative d’une diapositive non colorée, fraîche contenant des humains primaires organoïdes la prostate sous un microscope lumineux zone représentant agar (flèche verte), gel de l’histologie (flèche noire), bulle (flèche bleue), organoids (flèches rouges) (section Echelle = 1000 µ m). (C) non souillées enregistré diapositive fraîchement coupées (à gauche) vs. diapositive sec sans coloration (à droite), organoids (flèches rouges) apparaissent translucides une fois sec (section Echelle = 500 µm) et sont plus difficiles à discerner au microscope lumineux-zone. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : coloration histologique sur organoïdes sectionnés et montés ensemble. (A) une coloration H & E d’un cassé organoïde la prostate humaine de primaire de mauvaise manipulation (pipetage agressif, protocole de mauvais traitement, gauche) à côté d’un organoïde bien gérée (à droite) (section Echelle = 100 µm). (B) humaine organoïde la prostate primaire qui ont été fixés au formol, paraffine, sectionnées et tachée de basale cytokératine 5 ou Luminale cytokératine 8 (en haut) ou basale p63 et luminal cytokératine 8 (en bas) et imagés avec (microscope confocal Echelle = 100 µm). (C) un organoïde la prostate primaire humain montés ensemble tachée de basale cytokératine 5 ou Luminale cytokératine 8 et eosine phalloïdine et DAPI, photographié au microscope confocal (barre d’échelle = 100 µm). (D) un organoïde montés ensemble humain cellules prostatiques primaires coloré avec fluorescent étiqueté EdU et compteur tachée de Hoescht, photographié au microscope confocal (barre d’échelle = 500 µm) s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La culture Organotypique est une méthode nouvelle excitante pour récapitulant les tissus avec la commodité d’un milieu in vitro . Actuellement, les laboratoires poussent organoïdes de nombreux types de tissus pour divers paramètres. Les méthodes décrites dans le présent document résument les points de terminaison utiles et mettre en évidence de nouvelles techniques pour caractériser complètement les cultures de cellules de la prostate primaire 3D.

Il existe une variété de recettes de médias pour cultiver des cellules de la prostate humain primaire organoïdes5,6,13. Alors que tous obtenir des résultats viables et comparables, médias KSFM13 utilise additifs minimales donc il est décrit ici. En outre, les articles ont été publiés à l’aide de plusieurs concentrations pour le gel de matrice, de 10 à 75 % à la culture la prostate organoïdes5,6,13. Parce que la matrice gel est un réactif coûteux, et 33 % gel de matrice s’est avéré être suffisant pour cultiver à long terme (2-3 semaines), viable, unclumped organoïdes13, il s’agit de la concentration recommandée. Cependant, gel de matrice peut varier dans la concentration de protéines entre les numéros de lot, donc cela devrait tenir compte lors de l’ensemencement. Il est également recommandé d’acheter le gel de matrice en vrac pour utilisation à travers de multiples expériences visant à réduire l’incohérence entre les lots. D’autres laboratoires ont publié différents formats pour placage gel de matrice, tels que les gouttelettes au lieu d’une plaque à 96 puits puits5de revêtement. Ces deux méthodes font organoïdes viable, mais le format décrit ici permet d’être plaqué de plus faible densité, des cellules qui a été établi pour promouvoir l’expansion des cellules dans le plus grand organoïdes13. Cependant, la densité de placage doit être optimisé basé sur l’efficacité de la formation spécifique au patient. Matrice gel est disponible en plusieurs formats, y compris le facteur de croissance réduite, sans rouge de phénol et haute concentration, etc.. Réduit de facteur de croissance est recommandé pour définir les conditions de culture et exempt de rouge de phénol est recommandé lorsque vous travaillez avec des cellules exprimant la GFP ou dans les expériences impliquant la capture d’image z-pile. Il est essentiel que des mesures de placage matrice gel être réalisée avec des réactifs glacées, comme le gel de la matrice se solidifie rapidement à température ambiante.

Organoïdes cultivées sous différents traitements expérimentaux peut entraîner des changements à la forme, donc imagerie champ lumineux est largement utilisé pour l’étude des phénotypes morphologiques observées. Néanmoins, d’enregistrement et de quantifier les zone ou la forme sont un défi pour deux raisons : biais de sélection 1) au cours de la capture d’image et 2) appliquer un paramètre deux dimensions tels que la zone à un échantillon en trois dimensions. Une stratégie de capture d’image consiste à enregistrer un champ aléatoire et mesurer un nombre prédéterminé d’organoïdes dans ce domaine, mais cela peut créer des biais lors de la sélection, et tous les organoids dans le champ sélectionné peut ne pas être mise au point. Imagerie ensemble-bien optimisé pour le format microplaque 96 puits élimine ce biais d’échantillonnage en recueillant la population entière organoïde d’intérêt. Toutefois, selon les objectifs de microscope sur la main, plusieurs champs peuvent doivent être recueillis et carrelage afin d’obtenir une image d’ensemble-puits. Certains laboratoires ont décrit la zone de mesurage d’un seul plan z12, mais pour capturer tous les organoids en bref, il est recommandé de collecter et d’empiler des plans multiples dans un seul EDF-image13. Dans certains cas, un ménisque dans le gel de la matrice peut causer le vignettage dans l’image, et méthodes de correction de fond peuvent doivent être appliquées à l’aide de logiciels d’analyse image. Volume exact est idéalement la mesure plus appropriée pour organoïde grandeur ; Cependant, c’est difficile d’obtenir avec précision, même avec plusieurs images de z-pile. Autres dimensions morphologiques utiles, telles que la circularité et la proportion maximale/minimale, peuvent se calculer facilement de tous les organoïdes dans une image d’EDF bien ensemble. Ensemble, ces méthodes surmonter d’échantillonnage défis biais et permettent de mesurer des paramètres 2D à partir des objets 3D dans un espace 3D.

Fixation de formol et enrobage de paraffine d’organoïdes est une méthode commune pour obtenir l’hématoxyline et éosine (H & E), immunohistochimie (IHC) et immunofluorescence (IF) pour la visualisation et l’analyse6,11, 20. Toutefois, les publications qui ont décrit cette technique pas détaillés sur le processus d’incorporation. En outre, il peut être difficile de localiser des organoïdes dans le bloc de paraffine. Certains laboratoires pré détachant organoïdes avec trypan bleu avant l’incorporation à l’aide en situation au cours de la section11. La méthode décrite ici incorpore l’utilisation d’un colorant histologique pour l’orientation de la gelplug organoïde/histologie au cours de l’incorporation à promouvoir l’efficacité de sectionnement. H & E de diapositives facilitent l’examen de la nécrose, texture nucléaire et la prolifération, et il devrait donc être un point de terminaison obligatoire pour organoïde culture pour s’assurer que les cellules sont en bonne santés tout au long de la sphère. Une force de la culture organoïde est que les échantillons sont constitués d’un mélange hétérogène de cellules qui ressemblent à des tissus du patient en vivo mieux. Dans la prostate, par exemple, les cellules basales et luminaux sont présents dans la prostate organoïdes5, alors que les cellules cultivées en 2D manque de différenciation Luminale8. Afin d’évaluer la différenciation organoïde, il est recommandé que les chercheurs évaluent basales marqueurs tels que CK5 et p63 et luminaux tels que les récepteurs aux androgènes et CK88. Aucune autre protéine expérimentale d’intérêt peut également être étudiés à l’aide de ces techniques de coloration.

Bien que FFIP sections permettent la visualisation des cellules résidant dans les compartiment interne via histologique méthodes (H & E, IF, IHC), images se limitent aux sections droites et organoïde forme peut-être être modifié par le processus d’incorporation. Entier-Montez la souillure permet un organoïde être colorés et observés in situ, préservant les phénotypes morphologiques et permettant des images de la localisation de la protéine. Ensemble-montage est un outil utilisé pour souiller des spécimens ensemble des tissus ou des animaux entiers, tels que l’embryon de poisson zèbre ou la souris et est facile à adapter pour organoïdes. La technique décrite ici a été modifiée par la procédure de Mahéet al. 11, qui détaille la croissance initiale et la culture d’organoïdes gastro-intestinal directement sur une lame de chambre pour la coloration et nécessite la fixation de la culture de l’ensemble parent. La méthode décrite ici implique le transfert d’organoïde unique (ou organoids) d’intérêt sur une lame de la chambre au moment de la coloration. Cela permet la sélection des organoïdes individuelles pour l’analyse des entiers dans une expérimentation en cours sans fixation de la culture parente. Lorsque vous effectuez entier-Montez la souillure, il est nécessaire d’optimiser le temps d’incubation pour des anticorps primaires et secondaires assurer une pénétration dans l’ensemble de l’échantillon et la perméabilisation (n’importe où depuis un jour ou plus est recommandé). Une fois l’image par microscopie confocale, rendus 3D peuvent être produits pour permettre la visualisation et la localisation d’une protéine spécifique et calculer le nombre de cellules colorées positivement présents dans un échantillon. Cytométrie en flux est un paramètre utile pour quantifier les populations de basale, luminal, ou cellules souches5,14. Pour ce faire, les cellules sont récupérés depuis le gel de la matrice et doucement dissociées pour la coloration. Utilisateurs doivent sélectionner avec soin les marqueurs appropriées pour séparation basée sur la littérature actuelle. Pour primaire la prostate cellules épithéliales humaines, CD26 et CD49f sont adaptés luminales et basales des marqueurs, respectivement de5,21.

En résumé, ce protocole en détail la croissance humaine organoïde la prostate primaire, collection et paramètres expérimentaux. À noter, la technique de montage décrite peut être appliquée à une variété d’autres dosages qui sont normalement utilisés pour les cellules 2D, telles que fluorescents basée sur l’analyse des expériences en regardant19de la prolifération, apoptose et organites subcellulaires taches. En outre, la méthode de collecte et de dissociation décrite ici pourrait être utilisée en vue de la cellule unique RNA séquençage18. Collectivement, cela démontre la possibilité pour une variété de roman, les points de terminaison haute fidélité que les chercheurs peuvent optimiser et explorer à l’avenir.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions les membres de l’UIC Biorespository, Dr. Klara Nadine-Nagy et Alex Susma, ainsi que les urologues, les Drs Michael Abern, Daniel Moreira et Simone Crivallero, pour la facilitation de l’acquisition de tissu pour les cultures de cellules primaires. Nous remercions les patients d’urologie de l’UIC pour le don de leur tissu à la recherche. Ce travail a été financé, en partie, par le ministère de la défense Prostate Cancer recherche programme santé disparités idée prix PC121923 (Nonn) et le centre de l’UIC pour clinique et traduction Science Pre-doctoral Education pour les cliniques et translationnelles scientifiques ( PECTS) programme (McCray et Richards) et par du National Institutes of Health National Cancer Institute, Grant numéros U54CA202995, U54CA202997 et U54CA203000, connu comme le Chicago Health Equity Collaborative (Nonn et Richards). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health ou le ministère de la défense.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells of interest
Keratinocyte-SFM (KSFM) ThermoFisher Scientific 17005042
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) ThermoFisher Scientific 12676029
5α-Dihydrotestosterone (DHT) Sigma-Aldrich D-073-1ML
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Matrigel (matrix gel) Corning Various Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application
Ice Bucket
Cell Culture Hood
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical ThermoFisher Scientific 05-408-130, 339650
Centrifuge
Dispase (neutral protease) STEMCELL Technologies 7923 neutral protease
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025076
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018 suggested RNA extraction solution
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900 suggested protein extraction solution
DNAzol ThermoFisher Scientific 10503027 suggested DNA extraction solution
Organoids
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Brightfield microscope with camera capabilities ex. ‎EVOS FL Auto Imaging System
Photo analysis software ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler
Graphing software ex. Graphpad, Excel, etc
Organoids
Ice pack
Masking tape
Pipette tips (1000 μL)
Razor blade
Dispase STEMCELL Technologies 7923
Agarose Sigma-Aldrich A9045
HistoGel (histology-gel) ThermoFisher Scientific HG-4000-012
Pencil
"Plunger" from 1 cc insulin syringe
Tissue Casette Thomas Scientific 1202D72
Container to hold fixative
10% neutral buffered formalin (NBF) Sigma-Aldrich HT501128
Histology pen, xylene and EtOH-resistant Sigma-Aldrich Z648191-12EA STATMARK pen
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 For fixation and graded dilutions during processing
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water
Paraffin Leica various
Tissue processor
Embedding workstation
Economy Tissue Float Bath Daigger EF4575E XH-1001
Microtome
Microtome blades Ted Pella 27243
Positively charged microscope slides Thomas Scientific 1158B91
Laboratory Oven ThermoFisher Scientific PR305225G
Hematoxylin and Eosin Stain Kit Vector Laboratories H-3502 Suggested H&E staining kit
ABC Peroxidase Standard Staining Kit ThermoFisher Scientific 32020 Suggested immunohistochemistry staining kit
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) Cell Signaling Technology 5153S Suggested primary antibody for IHC
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 dilutions should be performed using deinoized water
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water (DI H2O)
Antigen retrieval solution Sigma-Aldrich, Abcam C9999, ab93684
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Coplin Fisher Scientific 19-4
Staining rack IHC World M905-12DGY
Staining dish IHC World M900-12B
Decloaking chamber Biocare Medical DC2012
Humidity chamber Thomas Scientific 1219D68
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Microscope cover glass Globe Scientific 1414-10
Anti-fade mounting media ThermoFisher Scientific S36972
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240 optional adherent reagent
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023
4% paraformaldehye (PFA) Biotium 22023 other fixatives such as methanol or formalin can be used
50mM NH4Cl sigma-Aldrich 254134
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum (NHS) thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin (BSA) sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Counterstain (phalloidin) thermoFisher Scientific A22287
Sodium azide sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Visikol HISTO-M Visikol various optional clearing agent
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Cell assay of interest Various Various Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)
Organoids
Ice bucket
Cell culture hood
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical
Microcentrifuge
Dispase STEMCELL Technologies 7923
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175079
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap Fisher Scientific 08-771-23
Cytokeratin 5 Antibody - FITC Millipore Sigma FCMAB291F Suggested flow antibody
Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 Abcam ab210139 Suggested flow antibody
CD49f - Alexafluor 647 BioLegend 313609 Suggested flow antibody
CD26 - PE BioLegend 320576 Suggested flow antibody
Flow cytometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
  2. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  3. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
  4. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  7. Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2. The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).
  8. Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue. Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).
  9. Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1. The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).
  10. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
  11. Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).
  12. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).
  13. Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids. iScience. , in press (2018).
  14. Hu, W. -Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
  15. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
  16. Peehl, D. M. Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro. Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).
  17. Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).
  18. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  19. Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. Whole-mount Enteroid Proliferation Staining. Bio-Protocol. 6 (12), (2016).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).

Tags

Bio-ingénierie numéro 143 Organoïde point de terminaison 3D quanification analyse d’image FFIP entier-montent la morphologie la prostate homme immunofluorescence
Manutention et évaluation de la Culture humaine Organoïde la Prostate primaire
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCray, T., Richards, Z., Marsili,… More

McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. J. Vis. Exp. (143), e59051, doi:10.3791/59051 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter