Summary
ここでは、人間プライマリ前立腺における処理をガイドし、表現型を評価するためにエンドポイントを提案するプロトコルを提案する.播種、文化の維持、マトリックス ゲルからの回復形態の定量化、埋め込み断面、FFPE 切片、全取り付ける染色と商業アッセイの適用を示します。
Abstract
本稿では、三次元 (3 D) の培養、処理、および人間のプライマリ前立腺オルガノイドの評価のための詳しいプロトコルについて説明します。プロセスは、まばら organoids 進出を育成するメディアの変更と 96 ウェル マイクロ プレート上に 3 D マトリックス ゲルにおける上皮細胞の播種を行います。形態を全体もキャプチャ画像を z スタックの評価します。Z スタック圧縮 organoids 様々 な出力、真円度、真円度、エリアなどを定量化する測定から単一の焦点でイメージを作成します。DNA、RNA および蛋白質は、マトリックス ゲルから回収オルガノイドから収集できます。興味の細胞集団における解離によって評価され、フローサイトメトリーします。ホルマリン固定・ パラフィン-埋め込み (FFPE) 断面に続いては、組織学的評価および抗体の汚損のため使用されます。ホール マウント免疫蛍光染色における形態を維持し、オルガノイドの in situにおけるタンパク質局在の観察が容易になります。3 D オルガノイドの 2次元単層細胞に伝統的に使用される商業のアッセイを変更できます。一緒に使用すると、このプロトコルの技術は前立腺における成長、形態学上の特性、および分化マーカーの発現を定量化する堅牢なツールボックスを提供します。
Introduction
Organoids、器官形成と疾患を検討する貴重なツールです。彼らは動物モデルに安価な代替手段を提供、患者由来 organoids が個人化された薬1,2,3の戦略として進化しています。この三次元 (3 D) 培養システムを含む細胞外マトリックス成分 (マトリックス ゲル)4のゲルに幹または前駆細胞 (組織から収穫または誘導多能性幹細胞) を播種します。細胞増殖し、の興味の機能単位の器官の形態と細胞階層を要約脊髄構造で区別する.さまざまな臓器、唾液腺、胃、腸、肝臓、前立腺、肺、脳の4を含む由来細胞を用いたオルガノイドを栽培されています。前立腺 organoids5,6を確立する手順を説明する多数のプロトコルが organoids から定量的なエンドポイントを実現する方法について詳細な方法を見つけることに挑戦です。本稿はひと前立腺細胞の開発方法をまとめたもの、シリーズにおける表現型を評価するために提案されたエンドポイントの詳細。これらのテクニックは、前立腺 organoids 用に最適化され、3 D の細胞の他の文化に適用される場合があります。
前立腺における文化は、不死化細胞株を用いた単層培養の制限に欠けている貴重な生体外モデルとして最近浮上しています。良性前立腺上皮、前立腺癌モデルの in vitro不死化細胞株を使用するは困難です。良性の細胞の数は限られているとすべては遺伝子7変換を受けています。単分子膜における一次前立腺上皮細胞は管腔細胞に分化しないし、アンドロゲン受容体8を欠いています。機能的なアンドロゲン受容体、初期の病気の状態や患者の腫瘍9で発見されている不足キー遺伝的変更の重要なメディエーターである前立腺癌細胞株の大半を持っていません。前立腺における文化は良性の上皮から簡単に育てることができる、茎セルのプロパティ、前駆細胞、分化および微小環境4、5の実験的変化の影響の研究に貴重です。患者の疾患や治療10への応答のモデリング精度医学アプローチの一環として前立腺癌オルガノイドを栽培できます。
このプロトコルは、さまざまなセルの種類を使用して、既存のプロトコルからコンパイルされていますが、それはここでひと前立腺細胞での使用に最適化されています。トムソーヤ、Clevers、シェン、説明したプロトコルをほめる5,6成長、継、明視野イメージング、凍結、および前立腺マウスと人間オルガノイドの RNA と DNA の分離を記述します。Mahéらから全体マウント プロトコルを変更します。11、消化管上皮オルガノイドを使用してについて説明しますライブ イメージングと冷凍とパラフィンを埋め込みます。Bortenら12は、胸、コロン、および明るいフィールド画像から大腸癌における形態の分析を説明します。また、リチャーズら。13は、前立腺オルガノイドの形態学的評価法を使用しました。最後に、胡主席ら14は、チェンバー スライドする organoids 一晩単一細胞およびフローサイトメトリー解析のための球のばらつきを観察する蛍光抗体染色前に付着した前立腺のメソッドを説明します。
このプロトコルの目的細胞播種; を含む、1 つのプロトコルとして十分詳細にこれらの技術的に挑戦的な方法を示すことです。メディアと行列のゲルのメンテナンス;フローサイトメトリー用セルのコレクションRNA、DNA および蛋白質の抽出;明るいフィールド z スタック分析の形態学的評価埋め込み処理と組織染色; の断面蛍光抗体法や蛍光プローブの全体マウントを試金します。生物学的関連性とこれらのさまざまなエンドポイントの解釈は、実験的なデザインと分析に使用する抗体の間で異なります。このプロトコルを活用すると、ユーザーは、エンドポイントのツールキットを使った実験を設定する準備ができて感じるはずです。
ひと前立腺上皮 (PrE) 細胞、ラボで Peehl15,16によって記述され、前述の17通路 (最大 4 つ) の限られた数に維持のプロトコルによって設立されたが、また商用ベンダーから利用できます。肝細胞無血清メディア ベース6、KSFM ベース13、および R spondin 1 エアコン5メディアは、organoids 制作正常に発行されます。KSFM ベースで、添加物の少ないが必要とするは、ここに記述されますので。
Protocol
次のプロトコルは、イリノイ大学シカゴの病院で患者のティッシュから収穫される人間の一次前立腺上皮細胞を使用して最適化されていました。これらの実験に使用されるすべての人間組織は買収による治験審査委員会承認プロトコルやイリノイ大学シカゴ校免除だった一方、培養条件は、目的のセルの種類によって異なりますが、エンドポイントはオルガノイドの他の組織に適用できます。
1. マトリックス ゲルとメディアを変更する上皮細胞の播種
- 必要な材料を集める: ひと前立腺上皮細胞 (PrE)、氷上、96 ウェル マイクロ プレート、氷上では、血清無料メディア ケラチノ サイト (KSFM) 行列ゲル炭剥かれたウシ胎児血清 (FBS)、ジヒドロテストステロン (DHT) です。
- 氷の上 10 nM、DHT、予備の最終的な集中に木炭除去 FBS とジヒドロテストステロン (DHT) の 2.5 ml 47.5 KSFM mL を組み合わせることにより KSFM ベースにおけるメディアを準備します。
- 生殖不能の技術を使用して細胞文化フードの 3 D マトリックス プレート セル。
- ゆっくりミックス冷たい冷たいマトリックス ゲル 50% 行列の取得と KSFM ベースにおけるメディア ゲル混合によるゆっくりとピペッティングを上下、泡を回避します。
注: マトリックス ゲルが 4 ° C で一晩解凍し、可能な限り氷で保たれます。それは室温 (RT) で迅速に固化します。 - 前 50% 行列の μ L のゲルの 96 ウェル プレートで使用される各井戸の底に冷たいメディアと転送 40-50 のピペット チップを濡れています。ベース層を形成する井戸の底をコートします。
注: 完全に分配しないピペットで目のストップをこれは泡を作成することができます。 - ベース層を固めるための 30-45 分の 37 ° C の定温器に 96 ウェル プレートを配置します。
注: を行う基本レイヤーの上に上皮細胞をプレートないまでそれが凝固した、またはセルが行列をプレートの底に落ちるし、単層として成長します。 - 上皮細胞 KSFM ベースにおけるメディア 100-1,000 セル/100 μ L の最終的な集中を達成するためにマトリックス ゲルと 33% 行列ゲル懸をミックスします。プレート 33% 行列の 100 μ L を使用して基本レイヤーの上に上皮細胞ゲル/セルあたりよく混合物。
注: 前の実験は、3 D でも密集上皮細胞を播種のサイズを制限における成長が、非常に低い利回り13もまばらとなるシードを示しています。患者固有の器官毛細生成効率に基づく興味のセル型の播種条件を最適化することが重要です。
- ゆっくりミックス冷たい冷たいマトリックス ゲル 50% 行列の取得と KSFM ベースにおけるメディア ゲル混合によるゆっくりとピペッティングを上下、泡を回避します。
- 固化、マトリックス ゲルを許可する 30-45 分の 37 ° C の定温器の 96 ウェル プレートを配置し、そっと井戸の端にゆっくりとピペッティングにより細胞の上に KSFM ベースにおけるメディアの 100 μ L を追加します。
- 2-3 日ごとにメディアを変更します。井戸の側に対してピペッティング メディアと行列ゲル間のスペース慎重にメディアの 50 μ L を削除し、新鮮なメディアの 50 μ L に置き換えます。
注: 長期培養のマトリックス ゲルの 2-3 週間ごとに変更する必要があります。ゲル培養不安定表示され顕微鏡下で半透明のしわ場合、行列ゲル壊れているし、交換する必要があります。
2. 行列のゲルからオルガノイドのコレクション
注: オルガノイドのコレクションは、マトリックス ゲル変更や継 RNA の抽出、DNA 抽出、タンパク質の抽出とフローサイトメトリーのエンドポイントの必要です。
- 温かみのある中性プロテアーゼ、ハンクスは平衡塩類溶液 (HBSS) 37 ° C の水浴中です。
- 井戸から行列ゲルを中断させることがなくメディアを慎重に取り外します。
- 〜 1 に中性プロテアーゼ 〜 200 μ L を各ウェルに追加: 2 比行列ゲル: 中性プロテアーゼの 37 ° C で 20 分間インキュベートし、
- 機械的に上下にピペッティングによるマトリックス ゲル: 中性プロテアーゼ混合物を切り離します。
- 37 ° C で 20 分間インキュベートします。
- 微量遠心チューブや量に応じての円錐管に中性プロテアーゼ マトリックスのゲル-セルの混合物を転送します。細胞ペレットに 3-5 分間、300 × gで遠心分離機します。
注: 細胞ペレットは表示されません、マトリックス ゲルが完全に分離できない場合があり、ピンクの上澄みから個別の管の下部に半透明相として視覚化することができます。上澄みを除去し 1:2 の比率でより中立的なプロテアーゼをゲル ペレットのマトリックスに追加、37 ° C で別の 20-40 分間インキュベートし、300 × gで遠心分離を繰り返します。 - Organoid ペレットを取得したときは、上澄みを除去します。継 (ステップ 2.7.1 を参照)、タンパク質や DNA、RNA の抽出における換散を続行 (2.7.2 のステップを参照)、処理単一細胞フローサイトメトリー、および単一セルの配列 (ステップ 2.7.3 を参照)。
- 長期培養の優しく 1.1-1.5 の手順で説明されている手順に従うことによって 33% 新鮮なマトリックス ゲルとプレートにそのままオルガノイドを再懸濁します。オルガノイドを切り離して考えると単一セルとして replate、暖かい細胞解離酵素の 1 mL にペレットを再懸濁します、10-15 分の 37 ° C で孵化させなさい、HBSS、5 mL で 1 回洗浄し、再次の手順 1.1-1.5 新鮮なマトリックス ゲル板します。
- 材料の表に記載されている RNA の抽出、DNA 抽出、または蛋白質の抽出のための適切な換散バッファー内におけるペレットを再懸濁します、製造元のプロトコルに従います。
- 暖かい細胞解離酵素の 1 つの mL でオルガノイドを再懸濁します、単一セル、オルガノイドを分離するに 10-15 分の 37 ° C で孵化させなさい。HBSS の 5 mL で 1 回洗浄し、流れ cytometry5または単一セル配列18プロトコルに進みます。
注: マトリックス ゲルの低濃度で単一のセルに分離する中性プロテアーゼが不要となるし、細胞解離酵素は、2.2 のステップの後、井戸に直接適用できます。
3. 全体も画像の取得と Organoid 形態の解析
- 電動を用いた透過光倒立顕微鏡全体ウェル z スタック画像 X ・ Y ステージ (ワークフロー図 1 aに示されている) をスキャンします。
- 井戸の底に調整焦点位置、最初 organoid が発生ベース層からメニスカスによる井戸の中心になるまで上方を中心に開始します。この位置にある下の z 平面を設定します。
- 井戸の周囲になるフォーカスが最後 organoid まで上方を中心に継続します。この位置で一番上の z 平面を設定します。
注: z スタックの上下を設定した後、これらの位置とすべての残りウエル内でオルガノイドをキャプチャ上/下を必要に応じて調整を確認します。各ウェル内のすべての器官毛細を含む単一のスキャンに使用される z 範囲が可能になります。 - まあ、大きい数を使用してより高い解像度のあたり 15-35 z 平面をキャプチャします。よくイメージ全体を取り込んでマージ必要な場合の作業領域やサブセクションを収集します。
注:図 1 bのみ 1 つの z 平面をキャプチャするとき organoids が焦点から外れているように単一ではなく複数の z 平面 z 平面を取ることをお勧めします。 - 下流解析のため z スタック画像を保存します。
- フリー フォームの描画機能を備えたイメージ ソフトウェアを使用して画像を分析します。
- 3.1.4 の手順から設定 1 つの z 平面画像を開きます。
- 必要な場合、全体も 1 つのイメージにそれぞれの個々 の z 平面で撮影した画像を並べて表示します。新しいイメージを別のファイルとして保存します。各 z 平面の取得のためには、このプロセスを繰り返します。
- イメージ ソフトウェアを使用すると、単一の井戸からすべての z 平面全体もイメージを開き、z 平面のスタックからフィールド (EDF) の画像の奥行きを拡張を作成します。
注: このタイプのイメージは井戸の単一焦点でイメージを作成する各の z 平面の最高のフォーカス領域を選択します。 - ソフトウェアのピクセル スケールを測定されているイメージのスケール バーに設定します。
- 画像ソフトのフリー フォームの描画ツールを使用して、すべて organoid 井戸の中の境界をトレースします。
- 画像ソフトからトレースにおける境界の測定指標を取得します。
注: 推奨されるパラメーターは、エリア、真円度、最大/最小半径比。これらの指標のアプリケーションを示す代表的な結果は、図 1のとおりです。Organoid の境界によって定義される多角形の面積が計算されます。真円度は、直径イコール、organoid の最大フェレット、0 が少ない循環あり、1 はより円形で円の面積に organoid の領域の比率です。最大/最小半径比は、トレースにおけるの最小半径と最大半径の比率です。
真円度 =
半径比 =
4. ホルマリン固定・ パラフィン組織学的エンドポイント オルガノイドの埋め込み
- 埋め込みの供給の準備: HBSS、2% 寒天培地溶液、組織学的マーキング染料、組織学のゲル、ピペット チップ型、テープ、プランジャー 1 cc インスリン注射器と氷のパック、カセット、10% 中性緩衝ホルマリン (NBF)、鉛筆、および 75% の組織学的グレードのエタノール (エタノール)。
- 2% 寒天液の 2 つの遠心管を準備します。水浴や液状の寒天培地を維持するために 100 ~ 110 ° C で熱ブロックを孵化させなさい。組織の 1-2 滴、寒天培地の上部を示す 2% 寒天のソリューションの 1 つに色素をマーキング プラグし、埋め込み時にオリエンテーションを維持する上で支援追加します。よく混ぜます。
- 55-65 ° C で水バスまたは熱ブロック組織ゲルをウォーム アップします。
- 1000 μ L ピペット チップを使用して、~ 50 μ L を保持するシリンダー ピペット チップの小さなセクションを切り出して金型を作成します。最初に金型周りに適合する第二より広い金型を作成します。
- テープ (粘着面を上) に氷パックをラップし、テープにカビの付着によりコールド ブロックを作成します。
- 1 cc インスリン注射器のプランジャーを外してプランジャーを作成します。
- 図 2Aに示されているワークフローを次の処理のための組織学ゲル プラグに、オルガノイドを埋め込みます。
- マトリックス ゲルを切り離して、に従って手順 2.1-2.7 オルガノイドのペレットします。
- 300 x gで 3-5 分間回転し、上清を取除くことによって HBSS と再ペレットの 1 mL で一度 organoid ペレットを洗浄します。
- 再液体組織ゲルの 30-50 μ l organoid ペレットを中断します。上下にゆっくりとピペッティングで優しく混ぜます。コールド ブロックの鋳型に組織ゲル/organoid 液を移し、冷却し、プラグに固める標本を許可します。
- 小さなカビと大きな金型にプラグをプッシュするのにには、プランジャーを使用します。大きな金型に合わせてプラグの周りのピペット クリアの 2% 寒天培。
- サンプルの上部を示すためにプラグの上に組織の色素着色 2% 寒天をピペットします。
- いったん冷却、組織カセットにプラグインを転送するのにプランジャーを使用します。10% に鉛筆と場所のカセットを使用してカセットのラベル NBF 一晩固定用。
- 10% からカセットを転送、NBF 異型 70 %etoh を。
- プロセス組織ゲルは、利用可能な場合、プロセッサであらかじめ設定生検プロトコルを使用してを差し込みます。プリセットを使用できない場合は、次の順序と長さを入力: 70 %6 分、70% エタノール エタノール 10 分、80% エタノール 10 分、95% エタノール 2 時間 10 分、10 分、15 分の 3 回キシレン 100% EtOH 3 回、3 回 15 分のパラフィンを推奨される逸脱と破裂 organoids (図 3 a) は、シーケンスを処理できます。
- これが最初に断面にオルガノイドを含む変色部分を許容する組織ゲル プラグを上向き、色付きの部分に埋め込みます。
- FFPE 組織ゲルのブロックのセクション:
- 必要な物資を収集: FFPE 組織ゲルのブロック、組織学ペン、組織フロート水浴、氷、ミクロトーム、ワークステーション、顕微鏡スライド、および実験室のオーブンを正荷電の埋め込みのミクロトーム刃と氷のバケツ。
- 塗りつぶし温泉まで非常に完全、40 ° C に設定、前暖かい所オーブンで 45-50 ° c
- 氷のバケツを準備し、氷でいっぱい、氷-水スラリーを作成するために水を追加します。氷のブロックを冷やすまでは非常に寒い。
注: 1 日の氷のブロックを設定できますが、一晩放置、ブロック、水和し再処理する必要があります。 - ミクロトーム ユニバーサルカセットク ランプにブロックを挿入ナイフ ホルダーにブレードを追加して、任意ロック対策マシン上のロックを解除します。
- 10 μ m の厚みで (対決) パラフィン ブロックの顔をトリミングすることによって開始します。セクションはプラグ部を含む出現、一度トリミングを停止、ミクロトーム、ローターをロックし、寒さに氷の上に戻ってブロックを転送します。いくつかのブロックを切断する場合は、それぞれの対決は 4.5.6 のステップに移動する前にブロックします。
- 新しい未使用の部分をブレードに移動し、ブロックをクランプに転送します。マシンのロックを解除し、セクションごとの 5 μ m でトリミングを開始します。
注: 最良の結果を得るには、5 μ m をお勧めしますが、3-10 μ m も可能です。 - ピンセットを使用して、40 ° C の水浴にセクションを転送し、セクションを広げるようにします。スライドにセクションを転送するには、垂直に水の中に浸漬します。
注: 角度で浸漬し、セクションにお風呂の底から気泡を転送できます、サンプルの歪みが発生します。 - 顕微鏡 (図 2 b, C) の下でセクションを視覚化します。
注: 場合、organoid 存在が図 2B の赤い矢印のように表示されます。泡 (図 2 b, 青い矢印) オルガノイドのように表示することができ、乾燥 organoids 半透明 (図 2) が表示されます、新鮮なスライドで識別し易い。Organoids しない場合を提示、さらにブロックにセクション。
- 組織学ペンと 45-50 ° C で一晩焼くオルガノイドを含むスライドが取得されたとき円のスライドの背面にセクション周辺
- スライドを収集し、H & E に進みます (4.9.1 のステップを参照)、免疫組織化学的 (4.9.2 のステップを参照)、または免疫蛍光染色 (手順 5. を参照)。
注:図 3Bの代表的な結果が表示されます。- H & E 染色を実行するには、材料のリストからキットを入手して製造元の仕様に従ってください。
- 免疫組織化学染色を材料リストからキットと一次抗体を取得して製造元の仕様に従ってください。
5. FFPE の蛍光抗体染色と断面 Organoids
- 収集用品: ステップ 4 から焼かれたスライド、キシレン、100% エタノール、95% エタノール、70% エタノール、脱イオン水 (ディ H2O) coplin jar、抗原検索ソリューション (ナトリウム クエン酸バッファーまたは EDTA Tris バッファー)、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、5% 通常の馬血清 (x 1NHS) PBS、PBS、ラックを染色、染色皿、商工会議所、疎水性障壁ペン、湿度チャンバー、1 ° 2 ° 抗体興味の counterstains のクロークの解除に非イオン性洗剤で 0.3% 1% ウシ血清アルブミン (BSA) で 0.1% 非イオン性洗剤で関心します。
- Deparaffinize し、coplins 以下のソリューションでいっぱいに浸漬によってスライドを水分補給: キシレン (3 ディップ、5 分)、100% エタノール (2 ディップ、3 分ごと)、95% エタノール (2 ディップ、3 分)、70 %etoh (2 ディップ、3 分ごと)、・ ディ ・ H2O (2 ディップ、各 3 分)。
- 抗原検索ソリューションと 100 ° C に予熱のクロークの解除商工会議所で染色の皿を満たし
- 事前に加熱された染色皿にスライドを浸すことによって抗原検索を実行し、100 ° C で 5-10 分の間孵化させなさいサイクルが完了すると、蓋を開ける前に 20 分間座って decloaking 商工会議所を許可します。
- スライドの皿は、RT に冷却して、一度は、流水・ ディ ・ H2O 5 分用のスライドを洗浄する染色皿を置きます。
- 染色のお皿からスライドを削除、疎水性障壁ペンでサンプルの周りに円を描くし、湿度チャンバーのスライドを置きます。
- 染色疎水性サンプル一円に PBS で非イオン性洗剤で 0.1% 5 %nhs を適用することによって、非特異抗体をブロック (約 30 μ L のサンプルをカバーするため必要です)。
- Coplins の洗浄のスライドは、PBS 3 回各 5 分でいっぱい。
- 疎水性サンプル一円に PBS で 0.3% 非イオン性洗剤で 1 %bsa で希釈 1 ° 抗体 (資材表) を追加 (約 30 μ L はセクションをカバーする必要があります)、1 時間常温または一晩で 4 ° C 湿度チャンバー、孵化させなさい。
- Coplins PBS 3 回各 5 分でいっぱいにスライドを洗います。
- 疎水性サンプル一円に PBS で 0.3% 非イオン性洗剤で 1 %bsa で希釈 2 ° 抗体を追加 (約 30 μ L の領域をカバーする)、湿度チャンバーで RT で 1 時間インキュベートし。
- Coplin PBS 3 回各 5 分でいっぱいにスライドを洗います。
- DAPI、疎水性サンプル、一円に PBS で 0.3% 非イオン性洗剤で 1 %bsa の製造元の仕様に希釈を追加し、暗い (30 μ L) で RT で 2-5 分の間孵化させなさい。
- Coplins PBS 3 回各 5 分でいっぱいにスライドを洗います。
- Antifade マウント メディアと観察のスライドをマウントし、顕微鏡下で結果を可視化します。
6. 全体取り付けオルガノイドの免疫蛍光染色
- 収集用品: チェンバー スライドまたは共焦点皿、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、定着性、50 mM NH4PBS PBS pbs は、PBS、1 °、2 ° 抗体の非イオン性洗剤で 0.3% 1 %bsa 非イオン性洗剤で 0.1% 5 %nhs で 0.1% 非イオン性洗剤で Cl興味と関心の counterstains。
- まあ、メディアと行列のゲルの間スペースを残しての側に対してピペッティングによる培養、中断することがなく可能な限りとして多くのメディアを慎重に取り外します。
- 使用済みメディアまたは PBS、ウェット トリミング、1,000 μ L ピペット チップは関心の organoid(s) を含むマトリックス ゲルの一滴 (25-50 μ L) を描画し、チャンバー スライドもや共焦点皿の真ん中に分配します。
注: 33% 行列ゲルは固体ではありません。それはゼラチン状流体であり、処理が完全に設定いないゼリーのようです。大きな開口部とトリミングされたピペット チップ転送中に速報 organoids できなくなります。 - オルガノイドの親カルチャのまま、暖かい KSFM ベースのメディアとメディアを交換してください。
- 肉眼や切り裂くスコープ、- ファインチップ ピペット (10-200 μ L) とチェンバー スライドから過剰なメディアと行列のゲルを吸引します。
注: それは付着性試薬によるチェンバー スライドを前処理するオプションです。 - 残りの行列の蛍光を観察するオプションのコントロールとしてチェンバー スライドの空井戸に行列ゲルの等量をプレートします。
- ガラスに付着し、洗浄手順の中にサンプルの損失を防ぐ organoid を促進するために 30-45 分の 37 ° C の定温器にチェンバー スライドを配置します。
- 軽く振りながら常温を 5 分の 1 × PBS の 200 μ l/オルガノイドを洗う、スライドからの剥離を防ぐためにゆっくりとピペッティング。
- 1 × PBS と優しく揺れながら常温 30 分 4% パラホルムアルデヒドの 200 μ L と修正を削除します。マトリックス ゲルがこのステップの後明確な表示されることを確認します。
注: メタノール、ホルマリンの固定も可能です。固定する方法は、特定の固定方法、クロスリンク可能性があります興味の抗原または興味の蛍光標識蛋白質を消す特異抗体の最適化必要があります。 - 固定を外し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗います。
注: 洗浄手順の長さは organoid サイズに応じて最適化する必要があります。5 分は十分な開始ポイントが、必要に応じて、洗浄工程を長くことができます。 - 軽く振りながら 50 mM NH4RT で 30 分の 1 × PBS で Cl の 200 μ L と蛍光を癒します。
注: この手順は、organoid の内腔の残骸から、実験的なデザインから生じる (GFP) などの蛍光蛋白質の表現からの自家蛍光を癒やします。それは 488 のチャネルで、蛍光体を使用する必要が、GFP の信号を維持するために必要な場合にスキップすることができる場合は、含まれているはずです。 - NH4Cl を外し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗います。
- 軽く振りながら 0.1% 非イオン性洗剤 100 RT で 30 分の 1 × PBS での 200 μ l オルガノイドを permeabilize します。
- 軽く振りながら 1 × PBS と 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗浄で 0.1% 非イオン性洗剤 100 を削除します。
- 200 μ L の PBS で 0.1% 非イオン性洗剤 X-100 と 5 %nhs とブロックし、優しく揺れながら室温で 60 分間インキュベートします。
- ブロック バッファーを削除し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗ってください。
- 0.3% と 1 %bsa で 1 ° 抗体を希釈 1 × PBS でトリトン X-100 チェンバー スライドの 200 μ L を追加し、4 ° C で 1-3 日間インキュベート
- 1 ° 抗体を外し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗います。
- 0.3% と 1 %bsa の 2 ° 抗体を希釈 1 × PBS でトリトン X-100 チェンバー スライドの 200 μ L を追加し、暗闇の中で 4 ° C で 1-3 日間インキュベートします。
注: インキュベーション時間の長さは、organoid サイズと抗体を最適化する必要があります。いくつかは、organoid 貫通するより多くの時間を必要があります。抗体濃度を最適化する必要があります。一般に、2 x FFPE のセクションの使用濃度は 1 ° 抗体に適した、FFPE セクションの同じ濃度に適した 2 ° 抗体。 - 2 ° 抗体を外し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗います。
- ファロイジンをアクチンと DAPI や Hoescht、0.3% と 1 %bsa の製造元の推奨事項に従って希釈と核の対比染色 1 × PBS でトリトン X。チェンバー スライドに 200 μ L を追加し、RT で暗闇の中で 40 分間インキュベートします。
- 新鮮な 1 × PBS またはメディアをマウントの 200 μ l マウントし、すぐにイメージ (より長くないなら最大 5 日間の蛍光が保存する必要があります)。代表的な結果を図 3に示します。
注: アジ化ナトリウムは、共焦点レーザー顕微鏡が容易に利用可能でない場合、汚染を防ぐためにサンプルを追加できます。クリア エージェントを追加すると、画像が向上します。
7 試金および蛍光プローブのオルガノイドの全体取付
注: があります市販の試金および蛍光プローブ/染料 (例は材料のリストに含まれています) 全体載 organoids 様々 な有用なエンドポイント19を観察するために使用するため除去。次のプロトコルはエドゥ増殖の蛍光標識キットの全体マウントのサンプルで使用するためのキットを変更ことができます。
- 慎重にメディアの 50 μ L を削除し、メディアと行列ゲル間のスペースを残して、井戸の側に対してピペッティングによる作業教育ソリューション x 20 μ M 2 の 50 μ L で置き換えます。
- 1-3 日 (エドゥの混入のための時間の希望の長さを選択したセル型用に最適化する必要があります)、4 ° C で孵化させなさい。
- 6.2-6.8 チェンバー スライドや共焦点料理に関心のオルガノイドを転送するための手順に従います。
- PBS を取り外し、常温 30 分 3.7% パラホルムアルデヒドの 200 μ L を軽く振りながら。マトリックスは、このステップの後はゲルは明瞭であります。
- 固定を外し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗います。PBS を削除し、軽く振りながら RT で 30 分の 1 × PBS で 0.5% 非イオン性洗剤 100 の 200 μ L を追加します。
- 蛍光反応の製造元の仕様に従ってカクテル × 1 を準備します。
- 0.5% 非イオン性洗剤 100 を外し、軽く振りながら 5 分 1 × PBS で 3 %bsa の 200 μ L で 2 回洗います。
- 反応のカクテルを追加し、暗闇の中で室温で 30 分間インキュベートします。
- 5 分の 1 × PBS で優しく揺れながらカクテルと 3 %bsa の 200 μ L で一度洗って蛍光反応を削除します。対比染色とに従ってマウント手順 6.21-6.22 (図 3 D)。
Representative Results
人間プライマリ前立腺オルガノイド培養に成功、時に、明視野画像解析と FFPE と全取り付ける染色技術を使用すると、形態と差別化を評価できます。
図 1 aに明視野イメージ キャプチャのプロセスを示します。Organoids が 3 D マトリックスで成長し、異なった焦点面に 。多くの面でフォーカス オルガノイドを観察するには、は、(図 1 b、左) 1 つの z 平面の代わりに EDF 画像 (図 1 b右) を使用することをお勧めします。演習では、形態変化 organoids 異なる実験条件下で栽培した可能性があります。領域を使用して、循環 (円、どのように似て、organoid で定義) と最大/最小半径 (長さの単位) organoid サイズと形状の指示をユーザーに与えるし、形態の定量化可能な読み出しを提供します。図 1、長い organoid が小さい円形になるし、球面よりも大きく最大値/最小値比を持っているのこれらの措置の有用性を強調するため同じような区域が異なる形態オルガノイドの代表的な画像が表示されます。organoid。
組織学のためオルガノイドの埋め込みは、サンプルの内部を観察し、壊死組織が、organoid のコア内に存在しないことを確認する便利なエンドポイントです。このプロセスと明視野顕微鏡断面無染色試料の代表の結果のためのワークフローは、図 2 a、B、Cで提供されます。図 3 aは、不適切 organoid (左) と比較して正しく渡した (右)図 3Aおよび図 3 bでオルガノイドを示しています。サンプルの分化状態を調べるを基底細胞のマーカー (サイトケラチン 5 および p63)8管腔細胞マーカー (サイトケラチン 8)8と一緒に見ることをお勧めします。オルガノイドを染色する必要がある場合はその場で、全取り付ける染色は便利な代替手段とこれらの代表的な結果は、図 3、d.で提供されます。
図 1: 3 D 培養オルガノイドの形態評価。(A)透過光によって取得した人間のプライマリ前立腺オルガノイドのイメージ コレクションと圧縮ワークフロー反転電動顕微鏡 X ・ Y ステージとコンパニオン ソフトウェアをスキャンします。(B)単一 z スタック (左)対の代表的なイメージ。複数 z スタックは、単一の投影イメージに組み込まれるより organoids がフォーカスされていることを示す人間のプライマリ前立腺オルガノイドの全体もサンプルの (右) EDF 画像 (スケールバー = 1000 μ m)。(C)同じ領域のある形態学的に異種の人間プライマリ前立腺オルガノイドのエリア、真円度、最大値/最小値の比の代表的画像 (スケールバー = 200 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ワークフローと代表の結果を断面に埋め込む Organoid。(A)人間プライマリ前立腺におけるワークフローを埋め込みます。(B)寒天培地 (緑の矢印)、組織ゲル (黒矢印)、バブル (青い矢印)、organoids (赤矢印) を描いた明るいフィールド顕微鏡下で人間のプライマリ前立腺オルガノイドを含む無染色、新鮮なスライドの代表的な画像 (スケールバー = 1000 μm). (C)新鮮なカット スライド (左)対を無染色します。無染色のドライ スライド (右)、organoids (赤い矢印) は乾燥すると半透明表示される (スケール バー = 500 μ m)、明るいフィールド顕微鏡下で識別するは難しい。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 断面と全体載オルガノイドの組織染色します。(A) H & E 染色よく処理されます organoid (右) の横にある (積極的なピペッティング、不適切な処理プロトコル、左) で壊れた人間プライマリ前立腺 organoid (スケールバー = 100 μ m)。(B)ホルマリン固定、パラフィン包埋されている人間のプライマリ前立腺 organoid 断面、および 8 (上) または基底 p63 と内腔サイトケラチン 8 (下) 基底サイトケラチン 5 や内腔のサイトケラチン染色し、共焦点顕微鏡 (イメージスケールバー = 100 μ m)。(C) 、全体に取り付けられた人間プライマリ前立腺における基底サイトケラチン 5 または内腔サイトケラチン 8 とステンド グラスし、ファロイジンと共焦点顕微鏡を用いたイメージング DAPI counterstained (スケールバー = 100 μ m)。(D)蛍光染色全体載人間原発前立腺細胞器官毛細エドゥをラベルし、カウンター Hoescht、共焦点顕微鏡とイメージングで染色 (スケールバー = 500 μ m)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
培養は、体外環境の利便性と組織の概説のためのエキサイティングな新しい方法です。現在、ラボは成長 organoids 様々 なエンドポイントのためのティッシュの多くの種類からです。本稿で説明する方法は、有用なものを要約し、3 D の主な前立腺細胞培養を完全に特徴づける新しい手法を強調表示。
主な前立腺細胞オルガノイド5,6,13の育成のためのメディア レシピはたくさんあります。一方、実行可能な対等な結果を達成するすべて KSFM ベースのメディア13を使用最小限の添加物が記載されているのでここで。さらに、論文は、マトリックス ゲル、文化前立腺 organoids5,6,1375% に 10% からの複数の集中を使用して公開されています。マトリックスのゲルは、高価な試薬と 33% 行列ゲルは長期 (2-3 週間) を養うに十分であると示されているので実行可能な unclumped organoids13、推奨の濃度です。ただし、ロット番号、ので、これはアカウントに取られるべきときにめっき間の蛋白質の集中のゲルのマトリックスは異なります。また、多くの不一致を軽減する複数の実験中用一括でマトリックス ゲルを購入することをお勧めします。他のラボは、メッキ コーティング 96 ウェル プレートも5ではなく水滴などのマトリックス ゲルの異なるフォーマットを公開しています。両方の方法は実行可能なオルガノイドを形成、細胞より希薄で、メッキがここで説明されている形式により大きい organoids13に細胞の拡大を促進するために示されています。しかし、播種密度最適化してください患者固有の形成の効率に基づきます。マトリックス ゲル成長因子減少、フェノールレッド フリー、高濃度、等を含む多くのフォーマットで利用可能です。培養条件を定義し、GFP を発現する細胞または z スタック画像キャプチャを伴う実験で作業してときフェノールレッド フリーをお勧め、成長因子減少することをお勧めします。マトリックス ゲルは室温で迅速に固化、冷たい試薬とマトリックス ゲル メッキ ステップを実行することが重要です。
オルガノイドのさまざまな実験的治療法で栽培した可能性があります変更、図形に明視野イメージングを使用広く観察された形態学的表現型を研究しています。それにもかかわらず、記録領域または形状の定量化が挑戦 2 つの理由: 1) 偏り中にイメージをキャプチャし、2) 三次元サンプル エリアなどの 2 次元のパラメーターに適用します。画像キャプチャの方法の 1 つは、レコードのランダムなフィールドとそのフィールドにオルガノイドの所定の数を測定、これは選択時バイアスを作成することができます選択したフィールドすべてオルガノイドのフォーカスできない場合があります。全体もイメージングの 96 ウェル マイクロ プレート フォーマット用に最適化は、利益の全体における人口を集めることによってこのサンプリング バイアスを排除します。しかし、一方で顕微鏡対物レンズに応じて複数のフィールドは収集し全体もイメージを得るためにタイル張りの必要があります。いくつかの研究所は単一の z 平面12からの測定領域を説明しているが、フォーカスのすべてオルガノイドをキャプチャするを収集、単一 EDF 画像13に複数の平面をスタックすることは勧め。いくつかの場合、行列ゲルに半月板のイメージでケラレが発生する可能性があります、バック グラウンド補正法は、画像解析ソフトを使用して適用する必要があります。正確なボリュームは理想的に organoid サイズの最も適切な測定ただし、これは正確に得るために、複数画像を z スタックとも困難です。真円度、最大値/最小値比など、その他の有用な形態学的寸法は、全体も EDF イメージですべての organoids から簡単に算出することができます。一緒に、これらのメソッドは、サンプリング バイアス課題を克服し、3 D 空間内の 3D オブジェクトの 2D パラメーターの測定を有効にします。
ホルマリン固定・ パラフィン包埋オルガノイドのヘマトキシリンとエオシン (H & E)、(IHC)、免疫組織化学的および免疫蛍光 (IF) は、可視化と分析の6,11,の染色を取得する一般的な方法は、します。20します。 ただし、この方法を説明している出版物不足埋め込みプロセスの詳細については包括的な。また、organoids パラフィン ブロック内を検索、挑戦的なことができます。いくつかのラボは、前11の区分の間に場所で支援するために埋め込む前に青いトリパン ブルーとオルガノイドを汚します。ここで説明したメソッドには、断面の効率を促進する埋め込み中 organoid/組織 gelplug の方向の組織学的の染料の使用が組み込まれています。H & E スライド壊死、核の質および増殖の検討を容易にする、従ってそれは培養細胞の球を通して、健康を確実にするための必須のエンドポイントをする必要があります。培養の強さは、サンプルはより良い患者組織体内のような細胞の異種混合物から成ることです。前立腺でたとえば、基底部および管腔細胞は前立腺 organoids5、2 D の不足, 分化8で育った細胞中に存在。における差別化を評価するためには、CK5 など p63 基底マーカーとアンドロゲン受容体など CK88内腔マーカー研究者を評価することをお勧めします。興味の他の実験的蛋白質はまたこれらの染色技術を使用して習得します。
FFPE のセクションには、細胞内部のコンパートメントで組織学的方法 (H & E、場合、IHC) 在住の可視化ができるように、画像、断面に制限されます、organoid 図形埋め込みプロセスによって改変すること。全取り付ける染色により染色し観察場で、形態学的表現型を維持し、蛋白質のローカリゼーションの画像を許可する organoid です。全体取り付けはマウスやゼブラフィッシュ胚など、全体組織または全体の動物の標本を染色するために利用するツールをオルガノイドのために容易に適応です。ここで説明する手法は、Mahéらによってプロシージャから変更されました。11, 初期生育と染色、チェンバー スライドに直接胃腸オルガノイドの文化の詳細と全体の親カルチャの固定が必要です。ここで概説している方法には染色時にチェンバー スライドに興味の単一の器官毛細 (または organoids) の転送が含まれます。これは、親カルチャの固定せず継続的な実験の全体マウント分析個々 オルガノイドの選択できます。それは透過と試料全体で確実にするために第一次および二次抗体の孵化時間を最適化するために必要な全取り付ける染色の際、(任意の場所 1 つまたは複数の日からを推奨)。一度経由共焦点顕微鏡のイメージを作成、可視化と特定の蛋白質の局在化を有効にして積極的に染色細胞サンプルで現在の数を計算する 3 D レンダリングを作り出すことができます。フローサイトメトリーは、基底の内腔、集団を定量化する有用なエンドポイントまたは幹細胞5,14。これを行うには、セルをマトリックス ゲルから回収して優しく汚損のため解離。ユーザーは慎重に現在の文献に基づく分離の適切なマーカーを選択してください。ひと前立腺上皮細胞、CD26 と CD49f が適切な内腔と基底マーカー、それぞれ5,21。
要約すると、このプロトコル詳細人間プライマリ前立腺における成長、コレクション、および実験的エンドポイントを示します。注記のうち、説明する実装手法は様々 な 2次元細胞増殖19、アポトーシスおよび細胞内オルガネラの汚れ見て蛍光プローブを用いた実験などの通常使用されていた他のアッセイに適用できます。さらに、ここで説明したコレクションと解離のメソッドは、単一細胞 RNA シーケンス18のための準備で利用できます。まとめると、これは小説、研究者が最適化され、将来的に探索する忠実度の高いエンドポイントのさまざまな可能性を示しています。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
一次電池文化の組織取得の円滑化のための泌尿器ドクター マイケル ・ Abern、ダニエル ・ モレイラ、シモーネ ・ Crivallero と同様に、UIC Biorespository メンバー、博士クララ Valyi-ナジとアレックス Susma に感謝いたします。私たちは研究に彼らのティッシュの寄付の UIC の泌尿器疾患を感謝します。この作業によって賄われていた、一部、部門の防衛前立腺がん研究プログラム健康格差アイデア賞 PC121923 (Nonn) と UIC 臨床センター、臨床や医療科学者 (翻訳科学呼称される教育展望) プログラム (McCray とリチャーズ)、国立衛生研究所の国立癌研究所、助成番号 U54CA202995、U54CA202997、U54CA203000、によってシカゴの健康資本共同 (Nonn とリチャーズ) として知られています。内容は著者の責任と健康の国民の協会、または国防総省の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells of interest | |||
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
| Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
| 5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
| Ice Bucket | |||
| Cell Culture Hood | |||
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
| Centrifuge | |||
| Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
| DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
| Organoids | |||
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
| Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
| Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
| Organoids | |||
| Ice pack | |||
| Masking tape | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Razor blade | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
| HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Pencil | |||
| "Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
| Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
| Container to hold fixative | |||
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water | |||
| Paraffin | Leica | various | |
| Tissue processor | |||
| Embedding workstation | |||
| Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
| Microtome | |||
| Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
| Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
| Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
| ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
| Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
| FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water (DI H2O) | |||
| Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
| Staining dish | IHC World | M900-12B | |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
| Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
| 50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
| Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
| Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
| Organoids | |||
| Ice bucket | |||
| Cell culture hood | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
| Microcentrifuge | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
| Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Cytokeratin 5 Antibody - FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
| Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
| CD49f - Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
| CD26 - PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |
| Flow cytometer |
References
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