Summary
Здесь мы представляем протокол руководство человека первичной простаты органоид обработки, а затем предложить конечные точки для оценки фенотип. Посева, культура обслуживания, восстановления от матрицы геля, описаны морфологической количественной оценки, внедрения и секционирование, FFPE секционирование, целом гора окрашивание и применение коммерческих анализов.
Abstract
Этот документ описывает подробный протокол для трехмерных (3D) культивирование, обработки и оценки человека первичной простаты organoids. Процесс включает в себя заполнение клеток эпителия негусто в 3D матрицы геля на 96-луночных микропланшетов с изменениями СМИ культивировать экспансию organoids. Морфология затем оценивается в целом ну захвата z стека изображений. Сжатие z стеки создает единый образ в фокусе, из которого organoids измеряются для количественного определения различных мероприятий, включая округлости, округлость и области. ДНК, РНК и белка могут быть собраны из organoids оправился от матрицы геля. Клеточных популяций интерес может оцениваться органоид диссоциации и проточная цитометрия. Формалин фиксации парафин внедрение (FFPE) следуют секционирование используется для гистологической оценки и Пятнать антитела. Целом гора immunofluorescent окрашивание сохраняет органоид морфологии и облегчает наблюдение локализации протеина в organoids в situ. Коммерческих анализов, которые традиционно используются для 2D монослоя клеток могут быть изменены для 3D organoids. Используются вместе, методам в этом протоколе обеспечивают надежный инструментарий для количественной оценки роста простаты органоид, морфологические характеристики и выражение дифференциации маркеров.
Introduction
Organoids являются ценным инструментом для изучения Органогенез и болезни. Они обеспечивают менее дорогой альтернативой животных моделях, и пациент производные organoids развиваются как стратегия для персонализированной медицины1,2,3. Эта система трехмерного (3D) культуры включает в себя заполнение стволовых и прогениторных клеток (из ткани или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) в гель компоненты внеклеточного матрикса (матрицы геля)4. Клетки размножаются и дифференцировать, что приводит к organotypic структур, которые пилки сотовой иерархии и морфология органа интерес в функциональной единицы. Organoids с использованием клеток, происходящих из различных органов, в том числе слюнной железы, желудка, кишечника, печени, простаты, легких и мозга4были выросли. Хотя существует множество протоколов, описывающие шаги по созданию простаты organoids5,6, это сложно найти достаточно подробную методы о том, как добиться количественного конечных точек от organoids. В этом документе обобщаются методы, разработанные для человека первичных клеток простаты и подробности ряд предлагаемых конечных точек для оценки органоид фенотипов. Эти методы были оптимизированы для простаты organoids и могут применяться в других 3D клеточных культур.
Простаты органоид культур недавно появились как ценный в vitro модель, которая не имеет ограничений монослоя культур с использованием установленных увековечен клеточных линий. Доброкачественные эпителия простаты и рака простаты является сложной задачей для модели в пробирке с помощью увековечен клеточных линий. Количество линий доброкачественных клеток ограничено, и все претерпели изменения с онкогенов7. Первичный эпителиальные клетки простаты в монослои не дифференцироваться в Люминал клетки и отсутствие андрогенных рецепторов8. Большинство линий клеток рака простаты не имеют функциональные андрогенных рецепторов, посредником значительное раннее болезненное состояние, и отсутствие ключевых генетические изменения, которые были найдены в пациента опухоли9. Простаты органоид культур можно легко выращивать из доброкачественных эпителия и ценность в изучении свойств стволовых клеток, клеток-предшественников, дифференциация и экспериментальных изменений микроокружения4,5. Рак простаты organoids можно выращивать как часть подхода медицины точности для моделирования пациента заболеваний и реагирования на терапии10.
Этот протокол был составлен из существующих протоколов, которые используют различные типы клеток, но он был оптимизирован здесь для использования в человека первичных клеток простаты. Он делал комплименты протоколы, изложенные Сойерс, Clevers и Шэнь5,6 , описывающие рост, пассированый, светлые области изображения, криоконсервация и РНК и ДНК изоляции простаты мыши и человека organoids. Целом гора протокол изменяется от Маэ и др. 11, который использовал желудочно-кишечного эпителия organoids и описывает живут изображений и замороженных и парафиновые встраивание. Borten и др. 12 описал анализ груди, толстой кишки и рака прямой кишки органоид морфологии от ярко поля изображений. Кроме того, Ричардс и др. 13 используется метод морфологической оценки простаты organoids. Наконец, Ху и др. 14 описал метод придерживаясь простаты, organoids в камере слайд на ночь перед immunofluorescent окрашивание соблюдать отдельные ячейки и дисперсия сфер для анализа потока цитометрии.
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации достаточно подробно эти технически сложные методы как один протокол, включая заполнение ячейки; средства массовой информации и матрицы геля обслуживания; Коллекция ячеек для проточной цитометрии; РНК, ДНК и белка добычу; морфологическая оценка от ярко поле z стека анализа; Встраивание, обработка и секционирование для гистологической пятнать; и всего монтаж иммунофлюоресценции или флуоресцентного зонда анализов. Биологическое значение и толкование этих различных конечных точек будет варьироваться между экспериментальный дизайн и антитела, которые используются для анализа. Путем использования этого протокола пользователи должны чувствовать себя готовы создать эксперимент с инструментарий конечных точек.
Человека первичной предстательной железы клетки эпителия (PrE) были созданы в лаборатории протоколом описан Peehl15,16 и поддерживается ограниченное количество ходов (до четырех) как описано17, но они также являются имеющиеся у коммерческих поставщиков. Гепатоцит сыворотки бесплатный медиа основанный6, на основе KSFM13и R-spondin 1-кондиционером5 СМИ публикуются как успешно произведя organoids. На основе KSFM требуется наименьшее количество добавок, поэтому это описано здесь.
Protocol
Следующий протокол был оптимизирован с помощью человека первичной эпителиальных клеток простаты, заготавливаемым от пациента ткани в Университете Иллинойса в Чикаго больницы. Все человеческие ткани, используемые для этих экспериментов были приобретенных через институциональных Наблюдательный Совет утвердил протокол и/или освобождение, в университете штата Иллинойс в Чикаго. Хотя в условиях культуры будет варьироваться в зависимости от тип ячейки интереса, конечные точки может применяться к organoids других тканей.
1. посев эпителиальных клеток матрицы геля и изменение средств массовой информации
- Собрать необходимые материалы: человека первичной эпителиальных клеток простаты (PrE), матрицы геля на льду, 96-луночных микропланшетов, кератиноцитов сыворотки свободных средств массовой информации (KSFM) на льду, уголь раздели плода бычьим сывороточным (ФБС) и дигидротестостерон (ДГТ).
- Подготовьте на основе KSFM органоид СМИ, объединяя 47.5 мл KSFM с 2,5 мл уголь раздели FBS и дигидротестостерон (ДГТ) до конечной концентрации 10 Нм DHT, то резерв на льду.
- Плита клетки в 3D-матрицы в капюшоне культуры клеток с помощью стерилизации.
- Аккуратно холодной смеси, которые на основе KSFM органоид СМИ с ледяной матрицы геля для получения 50% матрицы геля смеси медленно закупорить вверх и вниз, избегая пузыри.
Примечание: Матрицы геля следует разморозить на ночь при 4 ° C и хранится на льду, когда это возможно. Он быстро затвердевает при комнатной температуре (RT). - Предварительно Намочите кончик пипетку в холодных средств массовой информации и передачи 40 – 50 мкл 50% матрицы геля на нижней части каждой скважины для использования на плиту 96-луночных. Пальто в нижней части скважины для формирования базового слоя.
Примечание: Не обойтись полностью на второй остановке на пипетку, как это может создать пузыри. - Место пластину 96-луночных в инкубатора 37 ° C за 30-45 мин закрепить базового слоя.
Примечание: Не пластины эпителиальных клеток на базовый слой до тех пор, пока она укрепила, или клетки могут падать через матрицу на нижней части пластины и расти как монослоя. - Смешайте эпителиальных клеток, приостановлено в средствах массовой информации на основе KSFM органоид с матрицы геля для достижения конечной концентрации 100 – 1000 клеток/100 мкл и 33% матрицы геля. Эпителиальные клетки пластину поверх подложки с использованием 100 мкл 33% матрицы геля/ячейка смеси в скважины.
Примечание: Предыдущие эксперименты показали, что посева эпителиальные клетки слишком плотно в 3D ограничит размер органоид роста, в то время как слишком редко посев может привести к очень низкой доходности13. Важно оптимизировать посева условия для ячейки тип интереса, основанный на эффективности формирования органоид конкретного пациента.
- Аккуратно холодной смеси, которые на основе KSFM органоид СМИ с ледяной матрицы геля для получения 50% матрицы геля смеси медленно закупорить вверх и вниз, избегая пузыри.
- Поместите 96-луночных пластину в инкубаторе 37 ° C за 30-45 мин разрешить матрицы геля закрепить, а затем осторожно добавьте 100 мкл на основе KSFM органоид СМИ на верхней части клетки, закупорить медленно против края колодца.
- Измените СМИ каждые 2-3 дня. Дозирование против стороны скважины с пространством между медиа и матрицы геля, тщательно удалить 50 мкл СМИ и заменить 50 мкл свежих средств массовой информации.
Примечание: Для долгосрочного культуры, матрицы геля необходимо изменить каждые 2 – 3 недели. Если культура матрицы геля появляется нестабильной и отображает полупрозрачные морщины под микроскопом, матрицы геля сломался и нуждается в замене.
2. сбор Organoids от матрицы геля
Примечание: Для изменения матрицы геля, пассированый или извлечение RNA, экстракции ДНК, экстракции белков и проточной цитометрии необходим сбор organoids.
- Теплых нейтральных протеаз и Hanks сбалансированного солевого раствора (HBSS) в ванну воды 37 ° C.
- Осторожно удалите СМИ из скважин без нарушения матрицы геля.
- Добавить ~ 200 мкл нейтральной протеазы в каждой скважине на ~ 1:2 соотношение матрицы геля: нейтральные протеазы и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C.
- Механически отделить смесь протеазы гель: нейтральный матрице, закупорить вверх и вниз.
- Проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C.
- Передача смеси гель клеточной нейтральных протеаз матрица microcentrifuge трубки или конические трубы, в зависимости от объема. Центрифуга на 300 x g для 3-5 мин для пеллет клетки.
Примечание: Если не ячейки Пелле, матрицы геля не может быть полностью отделена и могут быть визуализированы как полупрозрачный фазы в нижней части трубки, отличается от розового супернатант. Удалить супернатант и добавить более нейтральные протеазы в соотношении 1:2 матрицы геля Пелле, инкубировать еще 20 – 40 минут при 37 ° C и повторять центрифугирования в 300 x g. - Когда приобрел органоид Пелле, удалите супернатант. Продолжите пассированый (см. шаг 2.7.1), лизис органоид для экстракции ДНК, РНК и белков (см. шаг 2.7.2), обработка одной клетки, проточной цитометрии и одноклеточного последовательности (см. шаг 2.7.3).
- Для долгосрочной культуры нежно ресуспензируйте нетронутыми organoids в 33% свежие матрицы геля и пластины, следуя шагам, описанным в шагах 1.1-1.5. Чтобы отделить organoids и replate как отдельные клетки, Ресуспензируйте гранулы в 1 мл теплой клеток диссоциации ферментов и инкубировать при 37 ° C на 10-15 мин, мыть раз с 5 мл HBSS и повторно пластины в свежих матрицы геля, следующие шаги 1.1-1.5.
- Ресуспензируйте органоид Пелле соответствующие литического буфера для извлечение RNA, экстракции ДНК или белка добычу, перечисленных в Таблица материалов и следовать протокол изготовителя.
- Ресуспензируйте organoids в 1 мл теплой клеток диссоциации ферментов и инкубировать при 37 ° C на 10 – 15 минут, чтобы отмежеваться organoids в отдельные клетки. Мыть раз с 5 мл HBSS и продолжить с протоколом для потока цитометрии5 или одноклеточных последовательности18.
Примечание: Не присоединяться в одной клетки при низких концентрациях матрицы геля, нейтральной протеазы не могут быть необходимы, и клетки диссоциации ферментов может применяться непосредственно к хорошо после шага 2.2.
3. всего Ну изображения сбора и анализа морфологии органоид
- Получить целое ну z стек изображений с помощью передаваемого света инвертированным микроскопом с моторизованным X / Y, сканирующий столик (процесс иллюстрируется на рисунке 1A).
- С фокусом скорректирована на дно колодца переориентировавшись вверх до тех пор, пока первый органоид встречается, который будет находиться в центре скважины из-за мениска от базового слоя. Установка нижней плоскости z в этой позиции.
- Продолжать вверх до тех пор, пока последний органоид находится в фокусе, который будет находиться в периферии колодца. Установите верхней плоскости z, в этой позиции.
Примечание: После установки верхней и нижней части z стека, убедитесь, что эти позиции захватить organoids в течение всех остальных скважин и при необходимости измените сверху/снизу. Это позволяет для z диапазона для одного сканирования, которая включает в себя каждый органоид в каждой скважине. - Захват 15 – 35 z самолеты в колодец, с использованием большего числа для большего разрешения. Захватить все хорошо изображение, слияния и собирать квадрантах или подразделы, при необходимости.
Примечание: Рекомендуется взять несколько z самолеты в отличие от одного z плоскости, как показано на рис. 1B , в котором organoids не в фокусе при захвате только одной плоскости z. - Сохраните изображения z стека для анализа ниже по течению.
- Анализ изображений с помощью программного обеспечения изображений с произвольной формы функции рисования.
- Откройте одно изображение плоскости z от шага 3.1.4.
- При необходимости, плитка изображений, снятых на каждый отдельным z плоскости в одну, всего а изображение. Сохраните новое изображение как отдельный файл. Повторите этот процесс для каждого z самолет приобрел.
- С помощью изображений программное обеспечение, открыть целом ну изображение для каждой плоскости z из одной скважины и создать расширенный глубина поля (EDF) изображения из стека z-самолетов.
Примечание: Этот тип изображения будет выбрать лучший регион фокус каждой плоскости z для создания одного изображения в фокусе скважины. - Установите масштаб пиксел программного обеспечения на панель масштаб изображения, которое измеряется.
- Использование произвольной формы инструмента рисования изображения программного обеспечения, трассировки по периметру каждого органоид в колодец.
- Получите измерения метрик для отслеживаемых органоид периметров изображений программное обеспечение.
Примечание: Рекомендуемые параметры являются области, цикличность и максимального/минимального радиуса отношение. Представитель результаты, иллюстрирующие применение этих показателей показаны на рисунке 1 c. Площадь рассчитывается от многоугольник, определяемый органоид периметра. Цикличность это отношение области органоид район окружности с диаметром равным органоид максимальная хорька, где 0 меньше круговой и 1 более круговой. Максимальный/минимальный радиус коэффициент представляет собой соотношение между максимальный радиус и минимальный радиус проследить органоид.
Цикличность =
Отношение радиуса =
4. Формалин фиксации и парафин встраивание Organoids для гистологической конечных точек
- Подготовка внедрения поставок: HBSS, 2% раствор Агар, гистологические маркировки краситель, гистология гель, Пипетка оконечности плесень, ленты, поршень от 1 шприц инсулина cc, лед, кассеты, нейтральных буферизации формалина 10% (NBF), карандаш и гистологической класс 75% этанола (EtOH).
- Подготовьте две трубы microcentrifuge агар 2% раствора. Инкубируйте в водяной бане или на блок тепла на 100-110 ° C для поддержания агар в жидкой форме. Добавление 1 – 2 капли гистологических маркировки краситель для одного из 2% агар решений, которые будут обозначать в верхней части агар вилка и оказывать помощь в сохранении ориентации во время внедрения. Хорошо перемешайте.
- Теплый гель гистология в блоке Ванна или тепла воды на 55 – 65 ° C.
- С помощью кончика пипетки 1000 мкл, создания плесени путем вырезания небольшой участок кончика пипетки сделать цилиндр, который держит ~ 50 мкл. Создайте второй, более широкий плесень, которая подходит вокруг первой формы.
- Создайте блок холодное обертывание лед с лентой (липкой стороной вверх) и соблюдение формы на ленту.
- Создайте поршень, удалив поршень от 1 шприц инсулина cc.
- Внедрите organoids в гистологии гель плагин для обработки, после процесса, изображенные в рисунок 2A.
- Отделить матрицы геля и Пелле organoids следуя шаги 2.1-2.7.
- Помыть лепешка органоид раз с 1 мл раствора HBSS и повторно Пелле спиннинг в течение 3-5 мин на 300 x g и удаляя супернатант.
- Вновь приостановите органоид Пелле в 30 – 50 мкл жидкого гистология геля. Смешайте нежно закупорить вверх и вниз медленно. Передача гистология гель/органоид смесь в форму на блоке холодной и позволяют образца остыть и затвердеть в вилку.
- Используйте поршень нажать вилку из малые формы и в более крупные формы. Пипетка ясно 2% агар вокруг вилки для заполнения больших плесень.
- Пипетка гистологический краситель тонированные 2% агар поверх вилку для обозначения в верхней части образца.
- После охлаждения, используйте поршень для передачи вилку в гистологии кассету. Ярлык кассеты с помощью карандаша и место кассеты в 10% NBF для фиксации на ночь.
- Передача кассету с 10% NBF до 70% гистологические класса EtOH.
- Процесс гистология гель подключите с помощью предустановленных биопсии протокола на процессоре, если таковые имеются. Если стиль не доступен, введите следующую последовательность и длины: 70% EtOH за 6 мин., 70% EtOH за 10 мин, 80% EtOH за 10 минут, 95% EtOH 2 раза за 10 мин, 100% EtOH 3 раза по 10 мин, ксилол 3 раза за 15 мин , и парафин 3 раза за 15 мин отклоняющ от рекомендуемой последовательности обработки может привести к разрыву organoids (рис. 3A).
- Вставлять вилку гель гистологии с цветными часть вверх, как это позволит бесцветные часть, содержащая organoids для секционного в первой.
- Раздел FFPE гистология гель блоков:
- Собрать необходимые материалы: FFPE гистология гель блоков, гистология перо, ткани типа float водяной бане, ведро льда с льдом, микротом, микротомных лезвий, встраивание станцию, положительно заряженных Микроскоп слайды и лабораторные печи.
- Заливка водяной бане до очень полный и набор до 40 ° C, то предварительно теплой лабораторные печи до 45-50 ° C.
- Подготовить ведро льда, а затем заполнить со льдом и добавить воды, чтобы создать ледяной воды шлама. Расслабиться блоков на льду, до тех пор, пока они являются очень холодно.
Примечание: Блоки могут устанавливаться на льду до 1 день, но если оставить на ночь, блоки будут стать гидратированных и потребуется для повторной обработки. - Вставьте блок микротом кассетный зажим, добавить лезвие в держатель ножа и разблокировать любые защитные блокировки меры на машине.
- Начните путем обрезки лицо блоком парафина (Столкнувшись) при толщине 10 мкм. После раздела вытекает, содержащий область вилку, остановить обрезки, блокировки ротора микротома и передать блок обратно на лед для охлаждения. Если несколько блоков, чтобы быть секционного, вбрасывание каждый блок перед переходом к шагу 4.5.6.
- Переместить в новые, неиспользованные части лезвия и блок передачи обратно в держатель. Разблокировать компьютер и начать обрезки на 5 мкм в каждой секции.
Примечание: для достижения наилучших результатов рекомендуется 5 мкм, но 3 – 10 мкм также является приемлемым. - С помощью пинцета, передаче секции в ванну воды 40 ° C и позволит Секции разложить. Секция на слайд передачи вертикально погружением в воду.
Примечание: Погружения под углом можно передать Секции пузыри из нижней части ванны и искажают образца. - Визуализация раздела под микроскопом (Рисунок 2БC).
Примечание: Если органоид настоящее, он будет выглядеть красная стрелка на рисунке 2B. Пузыри (Рисунок 2Б, синяя стрелка) могут появиться аналогичные organoids и легче различить на слайде свежий, как сухой organoids появляются полупрозрачные (рис. 2 c). Если не organoids присутствуют, раздел далее в блок.
- Когда были приобретены слайдов, содержащих organoids, круг район вокруг раздела на задней части слайда с ручкой гистологии и выпекать на ночь на 45-50 ° C.
- Собирать слайды и приступить к H & E (см. шаг 4.9.1), иммуногистохимический (см. шаг 4.9.2), или immunofluorescent окрашивание (см. шаг 5).
Примечание: Представитель результаты показаны на рисунке 3B.- Для выполнения H & E окрашивание, получить набор из списка материалов и следовать в спецификациях.
- Чтобы выполнить иммуногистохимическое окрашивание, получить комплект и основное антитело из списка материалов и следовать в спецификациях.
5. immunofluorescent окрашивание FFPE и секционного Organoids
- Сбор материалов: запеченные слайд из шага 4, ксилол, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, деионизированной воды (ди H2O), coplin банки, 1 x антигена извлечения раствора (цитрат натрия буфер или буфер Tris ЭДТА), фосфат амортизированное saline (PBS), 5% нормальной лошадь сыворотки ( NHS) с 0.1% неионные моющего средства в PBS, 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) с 0,3% неионные моющего средства в PBS, окрашивание стойку, окрашивание блюдо, decloaking палаты, гидрофобный барьер перо, влажность палаты, 1 ° и 2 ° антитела интерес, и counterstains из интерес.
- Deparaffinize и увлажняет слайды путем погружения в coplins, заполнены следующие решения: Ксилол (3 DIP, 5 мин), 100% EtOH (2 провалы, 3 минуты каждый) 95% EtOH (2 провалы, 3 минуты каждый), 70% EtOH (2 провалы, 3 минуты каждый) и ди H2O (2 DIP 3 мин).
- Заполните окрашивание блюдо с антигена поиска решения и подогрейте демаскирующее камеры до 100 ° C.
- Выполнить поиска антигена, погружая слайды в разогретую посуду окрашивание и инкубировать на 5 – 10 минут при 100 ° C. После завершения цикла позволяют демаскирующее камере сидеть за 20 минут перед открытием крышки.
- Как только слайд блюдо остынет до RT, место окрашивание блюдо под струей ди H2O для полоскания слайды для 5 мин.
- Удалите слайды из окрашивание блюдо, нарисуйте круг вокруг образца с ручкой гидрофобный барьер и заложить слайд на влажность камеры.
- Блокировать любой неспецифичный антитела, окрашивание, применяя NHS 5% с 0.1% неионные моющего средства в PBS гидрофобные круг вокруг образца (около 30 мкл необходима для покрытия образца).
- Мыть слайды в coplins заполнены с PBS 3 раза за 5 мин.
- Добавьте 1° антитела (Таблица материалов) разводят в 1% БСА с 0,3% неионные моющего средства в PBS в гидрофобных круг вокруг образца (около 30 мкл должен охватывать секция), затем инкубировать 1 час на RT, или на ночь при 4 ° C в камере влажности.
- Вымойте слайды в coplins, заполнены с PBS 3 раза за 5 мин.
- Добавьте 2° антитела, разводят в 1% БСА с 0,3% неионные моющего средства в PBS в гидрофобных круг вокруг образца (около 30 мкл будет охватывать области), затем инкубировать 1 час на RT в камере влажности.
- Вымойте слайды в coplin, заполнены с PBS 3 раза за 5 мин.
- Добавить DAPI, разбавленный спецификациям производителя, в 1% БСА с 0,3% неионные моющего средства в PBS в гидрофобных круг вокруг образца, а затем проинкубируйте 2-5 мин на RT в темноте (30 мкл).
- Вымойте слайды в coplins, заполнены с PBS 3 раза за 5 мин.
- Смонтировать слайды с antifade монтажа СМИ и coverslip, а затем визуализировать результаты под микроскопом.
6. всего монтаж Organoids для Immunofluorescent окраски
- Сбор материалов: Палата слайд или конфокальный блюдо, фосфат амортизированное физиологический (PBS), фиксирующие, 50 мм NH4Cl в PBS, 0.1% неионные моющего средства в PBS, NHS 5% с 0.1% неионные моющего средства в PBS, 1% БСА с 0,3% неионные моющего средства в PBS, 1 ° и 2 ° антитела интерес, и counterstains интерес.
- Тщательно удалите столько СМИ как можно не нарушая органоид культуры, закупорить против стороны Ну, оставляя пространство между СМИ и матрицы геля.
- С помощью усеченную, предварительно смочить СМИ или PBS, 1000 мкл кончиком пипетки, составить одну каплю (25 – 50 мкл) матрицы геля, содержащего organoid(s) интерес и обойтись на середине блюдо хорошо или конфокальный слайд камеры.
Примечание: 33% матрицы геля не является прочной. Это желатиновой жидкость, которая обрабатывает похож на желе, которое не полностью. Кончик подстриженные пипетку с большим отверстием будет предотвратить organoids от разрушения во время передачи. - Если organoids остаются в родительской культуры, замените СМИ с теплой на основе KSFM СМИ.
- С невооруженным глазом или рассечения область аспирационная избыток средств массовой информации и матрицы геля из камеры слайд с штраф наконечник пипетки (10-200 мкл).
Примечание: Это является необязательным для предварительной обработки камеры слайд с присоединение реактива. - Пластина равным объемом матрицы геля в пустой колодец палата слайд как пульт управления соблюдать аутофлюоресценция оставшихся матрицы.
- Поместите камеру слайд в инкубатора 37 ° C за 30-45 мин для содействия органоид придерживаться стекла и предотвращения потери образцов во время стирки шаги.
- Дозирование медленно, для предотвращения отряд из слайдов, мыть organoids с 200 мкл ПБС втечение 5 мин на RT во время нежно тряска.
- Удаление 1 x PBS и исправить с 200 мкл параформальдегида 4% для 30 мин на RT во время нежно тряска. Убедитесь, что матрицы геля появляется ясно после этого шага.
Примечание: Метанол или формалина фиксации также возможны. Метод крепления должны быть оптимизированы для специфических антител, некоторые методы фиксации crosslink антигены интерес или утолить люминесцентные маркировки протеинов интереса. - Снимите фиксатор и мыть дважды с 200 мкл ПБС втечение 5 мин при слегка покачивая.
Примечание: Продолжительность стирки шаги должны быть оптимизированы в зависимости от размера органоид. Пять минут является достаточной отправной точкой, но стиральная шаг может быть увеличена при необходимости. - Утолите аутофлюоресценция с 200 мкл 50 мм NH4Cl в PBS 1 x 30 мин на RT во время нежно тряска.
Примечание: Этот шаг будет утолить аутофлюоресценция от мусора в просвете органоид и флуоресцентный белок выражение (например, GFP), которое может представить от экспериментального дизайна. Это должны быть включены, если это желательно использовать Флюорофор в 488 канале, но может быть пропущен при желании сохранить GFP сигнала. - Удаление NH4Cl и мыть дважды с 200 мкл ПБС втечение 5 мин во время нежно тряска.
- Разрушения organoids в 200 мкл 0,1% неионные моющего средства-100 в PBS 1 x 30 мин на RT во время нежно тряска.
- Удаляйте 0,1% неионные моющего средства-100 в 1 x PBS и мыть дважды с 200 мкл ПБС втечение 5 мин осторожно встряхивая.
- Блок с NHS 5% с 200 мкл 0,1% неионные моющего средства X-100 в PBS и проинкубируйте 60 мин на RT во время нежно тряска.
- Удалить блокирующий буфер и мыть дважды с 200 мкл ПБС втечение 5 мин при нежно тряска.
- Разбавьте антитела 1° в 1% БСА с 0,3% Тритон X-100 в однократном ПБС и добавить 200 мкл палата слайда, а затем инкубировать в течение 1-3 дней при 4 ° C.
- Удаление 1° антитела и мыть дважды с 200 мкл ПБС втечение 5 мин при слегка покачивая.
- Разбавьте антитела 2° в 1% БСА с 0,3% Тритон X-100 в однократном ПБС и добавить 200 мкл палата слайда, а затем инкубировать 1-3 дней при температуре 4 ° C в темноте.
Примечание: Длина инкубации раз должны быть оптимизированы для органоид размер и антитела. Некоторые потребует больше времени, чтобы проникнуть через органоид. Концентрация антител будет также должны быть оптимизированы. В общем 2 x концентрация для секций FFPE подходит для антител 1° и такой же концентрации для секций FFPE подходит для 2° антител. - Удалите 2° антитела и мыть дважды с 200 мкл ПБС втечение 5 мин при нежно тряска.
- Изображение актина с Фаллоидин и ядро с DAPI или Hoescht, разбавленным согласно рекомендациям изготовителя в 1% БСА с 0,3% Тритон-X в однократном ПБС. Добавить 200 мкл в камере слайд, а затем Инкубируйте на RT для 40 мин в темноте.
- Смонтировать в 200 мкл свежие 1 x PBS или монтажа СМИ и изображения немедленно (флуоресценции должны быть сохранены до 5 дней, если не больше). Представитель результаты показаны на рисунке 3 c.
Примечание: Азид натрия могут быть добавлены образцы для предотвращения загрязнения, если конфокальная томография не доступны. Добавление агента очистки может улучшить изображения.
7. всего монтаж Organoids для анализов и флуоресцентных зондов
Примечание: Есть коммерчески доступных анализов и флуоресцентных зондов/красители (примеры включены в списке материалов) исправимый для использования в целом монтируется organoids соблюдать целый ряд полезных конечных19. Следующий протокол является для дневно помечены EdU распространения комплекта, однако любой комплект может быть изменен для использования с образцом монтируется в целом.
- Тщательно удалить 50 мкл СМИ и заменить 50 мкл 20 мкм 2 x рабочего раствора Эду, закупорить против стороны Ну, оставляя пространство между СМИ и матрицы геля.
- Инкубируйте на 4 ° C для 1-3 дня (нужной длины времени для включения EdU должны быть оптимизированы для типа ячейки по выбору).
- Выполните шаги 6,2-6,8 передать organoids интерес на камере слайд или конфокальный блюдо.
- Удаление PBS и исправить с 200 мкл параформальдегида 3,7% для 30 мин на RT пока осторожно встряхивая. Убедитесь, что матрицы геля появляются ясно после этого шага.
- Снимите фиксатор и мыть дважды с 200 мкл ПБС втечение 5 мин при слегка покачивая. Удалите PBS и добавьте 200 мкл 0,5% неионные моющего средства-100 в PBS 1 x 30 мин на RT во время нежно тряска.
- Подготовьте 1 x флуоресцентные реакции коктейль согласно спецификациям производителя.
- Удаление 0,5% неионные моющего средства-100 и мыть дважды с 200 мкл 3% BSA в однократном ПБС втечение 5 мин при слегка покачивая.
- Добавление реакции коктейль и Инкубируйте 30 мин на RT в темноте.
- Удаляйте флуоресцентные реакции коктейль и мыть раз с 200 мкл 3% BSA в однократном ПБС втечение 5 мин осторожно встряхивая. Изображение и горе, следуя шаги 6.21 – 6,22 (рис. 3D).
Representative Results
После успешной культуры человека первичной простаты organoids морфология и дифференциация может быть оценена с помощью анализа светлые области изображения и FFPE и целом гора пятная методов.
Процесс захвата светлые области изображения иллюстрируется на рисунке 1A. Organoids выращиваются в матрице 3D и рассредоточены по разные фокальной плоскости. Соблюдать organoids в фокусе во многих плоскостях, предлагается использовать изображение EDF (рис. 1B, право) вместо одной плоскости z (Рисунок 1B, слева). В лаборатории organoids, выращиваемые в различных экспериментальных условиях может привести к изменениям в морфологии. С помощью области, цикличность (определяется как аналогичные органоид является круг) и Макс/мин радиус (мера длины) дать пользователям представление о органоид размер и форму и количественной индикации морфологии. Чтобы подчеркнуть полезность этих мер, представитель изображения organoids с похожей области но различной морфологии указаны в Рисунок 1 c, в котором долго органоид будет меньше круговой и соотношении больше Максимальная/минимальная чем сферической органоид.
Встраивание organoids для гистологии является полезным конечной наблюдать интерьер образцов и убедиться что некроза не присутствует в ядро органоид. Рабочий процесс для этого процесса и представительных результатов безупречная, секционного образцов под микроскопом ярко поля приведены в рисунке 2AB, C. На рисунке 3A показывает, засланный органоид (слева) по сравнению с правильно передал organoids в рисунке 3A (справа) и на рисунке 3B. Чтобы определить состояние дифференциация образца, рекомендуется смотреть на базальных клеток маркеры (Цитокератины 5 и Р63)8 вместе с Люминал ячейки маркеры (Цитокератины 8)8. Если желательно, чтобы пятно organoids в situ, всего Маунт окрашивание является удобной альтернативой, и эти представительные результаты предоставляются в рисунке 3 cD.
Рисунок 1: оценки морфологии organoids в 3D культуры. (A) изображения коллекции и сжатия рабочего процесса для человека первичной простаты organoids приобретена пропускаемого света инвертированный микроскоп с моторизованным X / Y, стадии и компаньон программное обеспечение для сканирования. (B) представитель образы одного z стека (слева) против. EDF изображение (справа) целом ну образец человека первичной простаты organoids, показаны, что больше organoids находятся в центре внимания, когда несколько z стеки объединяются в единый проецируемого изображения (шкала бар = 1000 мкм). (C) представитель изображений для области, цикличность и Макс/мин соотношение морфологически разнородных человека первичной organoids простаты, которые имеют одинаковую площадь (шкала бар = 200 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: органоид встраивание рабочего процесса и представитель секционирование результаты. (A) человека первичной простаты органоид, встраивание рабочего процесса. (B) представитель изображение безупречная, свежие слайд, содержащий человека первичной простаты organoids под микроскопом светлые области, изображающие агар (зеленая стрелка), гистология гель (черная стрелка), пузырь (синяя стрелка), organoids (красные стрелки) (шкалы бар = 1000 мкг m). (C) незапятнанное свежесрезанных слайд (слева) против. Безупречная сухой слайд (справа), organoids (красные стрелки) появляются полупрозрачные, когда сухой (шкалы бар = 500 мкм) и труднее различить под микроскопом ярко поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: гистологические окрашивания на секционного и смонтированы целом organoids. (A) H & E окрашивание сломанной человека первичной простаты органоид от неправильного (агрессивный закупорить, неправильно обработки протокола, слева) рядом с хорошо обрабатываются органоид (справа) (шкалы бар = 100 мкм). (B) человека первичной простаты органоид, которая была исправлена формалин, парафин врезанных, секционного и витражи с базальной Цитокератины 5 или Люминал Цитокератины 8 (вверху) или базальный p63 и просветный Цитокератины 8 (внизу) и образы с (Конфокальный микроскоп шкалы бар = 100 мкм). (C) целом монтируется человека первичной простаты органоид витражи с базальной Цитокератины 5 или Люминал Цитокератины 8 и counterstained с Фаллоидин и DAPI, отображаемого с конфокального микроскопа (шкала бар = 100 мкм). (D) целом монтируется первичной простаты клеток человека органоид, окрашенных с дневно помечены Эду и Счетчик витражи с Hoescht, отображаемого с конфокального микроскопа (шкала бар = 500 мкм) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Organotypic культура является захватывающей новый метод для изложив ткани с удобством обстановки в пробирке . В настоящее время лаборатории растет organoids от многих видов тканей для различных конечных точек. Методы, описанные в настоящем документе кратко полезных конечных точек и выделить новые методы полностью охарактеризовать культур 3D первичных клеток простаты.
Есть множество рецептов СМИ для выращивания простаты клеток человека первичной organoids5,6,13. Хотя все достижения жизнеспособного и сопоставимые результаты, на основе KSFM СМИ13 использует минимальный добавки так это описано здесь. Кроме того документы были опубликованы с использованием нескольких концентрации для матрицы геля, от 10% до 75% к культуре простаты organoids5,6,13. Потому что матрицы геля является дорогим реактивом, и 33% матрицы геля было показано, чтобы быть достаточно, чтобы культивировать долгосрочные (2-3 недели), жизнеспособной, unclumped organoids13, это рекомендуемая концентрация. Однако матрица гель может варьироваться в концентрации белка между много чисел, так что это должно приниматься во внимание, когда покрытие. Мы также рекомендуем приобрести матрицы геля навалом для использования через несколько экспериментов, чтобы уменьшить несоответствие между партиями. Другие лаборатории опубликовали различные форматы для покрытие матрицы геля, как капельки вместо покрытия хорошо 96-луночных плита5. Оба метода формирования жизнеспособной organoids, но формат, описанный здесь позволяет для ячеек с покрытием более редко, которое было показано, содействовать расширению клеток в больших organoids13. Однако покрытие плотности должны быть оптимизированы в зависимости от эффективности формирования конкретного пациента. Матрицы геля доступен во многих форматах, в том числе фактор роста снижение, фенола Красного бесплатно, высокая концентрация и т.д. Фактор роста снижение рекомендуется для определенных условий культуры и свободного фенола Красного рекомендуется при работе с ячейками, которые выражают GFP или в экспериментах, которые включают захват изображения z стека. Важно, что любой матрицы геля обшивка действия с ледяной реагентов, как матрица гель быстро затвердевает при комнатной температуре.
Organoids, выращиваемые в различных экспериментальных процедур может привести к изменениям в форму, поэтому светлые области изображения широко используется для изучения наблюдаемых морфологических фенотипов. Тем не менее, запись и количественного определения области или фигуры является проблемой по двум причинам: 1) систематическая во время захвата изображения и 2) трехмерный образец применения двумерных параметра как области. Одна стратегия захвата изображения – записать случайное поле и измерить определенное количество organoids в этой области, но это может создать предвзятость во время выбора, и все organoids в выбранном поле не может быть в центре внимания. Целом ну изображений, оптимизированный для 96-луночных микропланшетов формат устраняет этой погрешности выборки, собирая всю органоид населения интерес. Однако в зависимости от целей Микроскоп на руке, несколько полей может потребоваться быть собраны и плиткой для того чтобы получить образ в целом хорошо. Некоторые лаборатории описали измерительной области из одной плоскости z12, но захватить все organoids в фокусе, рекомендуется собирать и стек несколько плоскостей в единый EDF-изображения-13. В некоторых случаях мениска в матрице геля может вызвать виньетирование в изображении, и методы коррекции фона может потребоваться применить с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Точный объем идеально наиболее подходящие измерения для размера органоид; Однако это трудно точно получить, даже с несколькими изображениями z стека. Другие полезные морфологических измерения, такие как округлости и максимального/минимального соотношения, легко могут быть рассчитаны от всех organoids в целом ну EDF изображения. Вместе эти методы преодолеть выборки смещения проблемы и включить измерение параметров 2D 3D объектов в трехмерном пространстве.
Формалин фиксации и парафин встраивание organoids является распространенным методом для получения гематоксилином и эозином (H & E), иммуногистохимический (IHC) и immunofluorescent (если) пятная для визуализации и анализа6,11, 20. Однако, публикаций, которые описал эту технику отсутствуют подробные сведения о процессе внедрения. Кроме того обнаружение organoids в блоке парафин может быть сложным. Некоторые лаборатории предварительно пятно organoids с Трипановый синий до внедрения для помощи в месте при резании11. Метод, описанный здесь включает в себя использование гистологический краситель для ориентации органоид/гистология gelplug во время внедрения для повышения эффективности секционирование. H & E слайды содействовать изучению некроза, ядерной текстуры и распространением, и таким образом она должна быть обязательной конечную точку для органоид культуры для обеспечения того, чтобы клетки здоровых всей области. Сила органоид культуры является, что образцы состоят из гетерогенных смесь клеток, которые лучше напоминают в vivo пациента ткани. Например, в предстательной железе, базальную и просветный клетки присутствуют в простаты organoids5, при этом клетки, выращенных в 2D отсутствие Люминал дифференцировки8. Чтобы оценить органоид дифференциации, рекомендуется, что исследователи оценить базальной маркеры например CK5 и Р63 и просветный маркеры например андрогенных рецепторов и CK88. Любые другие экспериментальные протеинов интереса также могут быть изучены с помощью эти методы окраски.
Хотя FFPE разделы позволяют визуализации ячеек, проживающих в внутренний отсек через гистологических методов (H & E, если, ИГХ), изображения ограничены сечения, и органоид формы могут быть изменены в процессе внедрения. Целом гора окрашивание позволяет органоид витражи и наблюдается в месте, сохраняя морфологических фенотипы и разрешение изображения белка локализации. Целом монтаж представляет собой инструмент использовать пятно целом ткани или целое животное образцов, например мыши или zebrafish эмбриона и легко адаптируется для organoids. Метод, описанный здесь была изменена от процедуры Маэи др. 11, в котором детали первоначального роста и культуры желудочно-кишечного тракта organoids прямо на слайде камеры для окраски и требует фиксации всей родительской культуры. Метод конспектированный здесь включает в себя передачу одного органоид (или organoids) интерес на камере слайд во время окрашивания. Это позволяет выбор отдельных organoids для анализа состава Гора в ходе текущего эксперимента без фиксации родительской культуры. При выполнении всего гора окрашивание, необходимо оптимизировать permeabilization и время инкубации для первичных и вторичных антител для обеспечения проникновения во всем образца (везде от одного или более дней рекомендуется). После того, как образ через confocal микроскопии, 3D визуализации могут быть изготовлены для включения визуализации и локализации определенного белка и рассчитать количество положительно окрашенных клеток в образце. Проточной цитометрии является полезным конечной точкой для количественного определения населения базальной, Люминал, или стволовых клеток5,14. Чтобы сделать это, клетки оправился от матрицы геля и аккуратно отделить для окрашивания. Пользователям следует тщательно выбрать соответствующие маркеры для разделения на основе текущей литературы. Для человека первичной эпителиальных клеток простаты CD26 и CD49f являются подходящей Люминал и базальной маркеры, соответственно5,21.
Таким образом этот протокол детали роста человека первичной простаты органоид, коллекции и экспериментальной конечные точки. Следует отметить описал технику монтажа может применяться к целому ряду других анализов, которые обычно используются для 2D клеток, таких как флуоресцентный зонд на основе экспериментов, глядя на распространение19, апоптоз и внутриклеточных органелл пятна. Кроме того сбор и диссоциации метод, описанный здесь могли бы использоваться в рамках подготовки к одной клеточной РНК последовательности18. Коллективно это демонстрирует возможность для различных роман, высококачественный конечные точки, которые исследователи могут оптимизировать и изучить в будущем.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим членов МСЖД Biorespository, доктор Klara Valyi-Надя и Алекс Сюзьмы, а также урологи, Drs. Майкл Эйберн, Даниэль Морейра и Симоне Crivallero, для облегчения приобретения тканей для культур клеток первичного. Мы благодарим МСЖД урологии пациентов за пожертвования их ткани для исследования. Эта работа была, частично финансируется, Департамент из обороны простаты рак исследований программы здравоохранения неравенства идея премии PC121923 (Нонне) и МСЖД центр клинической и перевод науки Pre-doctoral образование для клинической и трансляционная ученых ( МИЧЕСКАЯ) программа (Мак-Крей и Ричардс) и национальных институтов здравоохранения Национальный институт рака, Грант номера U54CA202995, U54CA202997, и U54CA203000, известный как Чикаго здоровья справедливости совместной (Нонне и Ричардс). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здравоохранения или Министерство обороны.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells of interest | |||
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
| Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
| 5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
| Ice Bucket | |||
| Cell Culture Hood | |||
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
| Centrifuge | |||
| Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
| DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
| Organoids | |||
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
| Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
| Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
| Organoids | |||
| Ice pack | |||
| Masking tape | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Razor blade | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
| HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Pencil | |||
| "Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
| Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
| Container to hold fixative | |||
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water | |||
| Paraffin | Leica | various | |
| Tissue processor | |||
| Embedding workstation | |||
| Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
| Microtome | |||
| Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
| Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
| Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
| ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
| Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
| FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water (DI H2O) | |||
| Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
| Staining dish | IHC World | M900-12B | |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
| Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
| 50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
| Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
| Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
| Organoids | |||
| Ice bucket | |||
| Cell culture hood | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
| Microcentrifuge | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
| Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Cytokeratin 5 Antibody - FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
| Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
| CD49f - Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
| CD26 - PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |
| Flow cytometer |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2. The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).
- Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue. Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).
- Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1. The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).
- Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).
- Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids. iScience. , in press (2018).
- Hu, W. -Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
- Peehl, D. M. Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro. Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. Whole-mount Enteroid Proliferation Staining. Bio-Protocol. 6 (12), (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
