Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att vägleda människans primära prostata organoid hantering då föreslå slutpunkter för att bedöma fenotyp. Sådd, kultur underhåll, återhämtning från matrix gel, beskrivs morphologic kvantifiering, inbäddning och snittning, FFPE snittning, hela-mount färgning och tillämpning av kommersiella analyser.
Abstract
Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för tredimensionella (3D) odling, hantering och utvärdering av människans primära prostata organoids. Processen omfattar sådd av epitelceller glest i en 3D matrix gel på en 96 brunnar mikroplattan med media ändringar att odla expansion i organoids. Morfologi bedöms sedan av hela-väl fånga av z-stack bilder. Komprimering av z-stackar skapar en enda i-fokus bild från vilka organoids mäts för att kvantifiera en mängd utgångar, inklusive loopkontroll, rundhet och område. DNA, RNA och protein kan hämtas från organoids återhämtat sig från matrix gelen. Cellpopulationer av intresse kan bedömas av organoid dissociation och flödescytometri. Formalin-fixering-paraffin-inbäddning (FFPE) följt av snittning används för histologisk bedömning och antikropp färgning. Hela-mount Immunofluorescerande färgning bevarar organoid morfologi och underlättar observation av protein lokalisering i organoids i situ. Kommersiella analyser som traditionellt används för 2D enskiktslager celler kan ändras för 3D organoids. Tekniker i detta protokoll används tillsammans, och ger en robust verktygslåda för att kvantifiera prostata organoid tillväxt, morphologic kännetecken och uttryck av differentiering markörer.
Introduction
Organoids är ett värdefullt verktyg att studera organogenes och sjukdom. De ger ett billigare alternativ till djurmodeller, och patientderiverade organoids utvecklas som en strategi för personlig medicin1,2,3. Detta tredimensionella (3D) kultur system innebär sådd stamceller eller stamceller celler (skördas från vävnad eller inducerade pluripotenta stamceller) i en gel av extracellulär matrix komponenter (matrix gel)4. Cellerna föröka sig och differentiera, vilket resulterar i organotypic strukturer som recapitulate cellulära hierarkin och morfologi av organ av intresses funktionell enhet. Organoids har odlats med celler som härrör från en mängd olika organ, inklusive Saliv-körtel, mage, tarm, lever, prostata, lung och hjärnan4. Det finns många protokoll som beskriver stegen för att etablera prostata organoids5,6, är det utmanande att hitta tillräckligt detaljerade metoder om hur man uppnår kvantitativa slutpunkter från organoids. Detta dokument sammanfattar metoder utvecklats för människans primära prostata celler och en rad föreslagna slutpunkter att bedöma de organoid fenotyperna. Dessa tekniker var optimerad för prostata organoids och kan tillämpas på andra 3D cellkulturer.
Prostata organoid kulturer har nyligen dykt upp som en värdefull i vitro -modell som saknar begränsningar i enskiktslager kulturer med etablerade cellinjer som förevigade. Godartad prostata epitel och prostatacancer är utmanande att modellen i vitro som använder förevigade cellinjer. Antalet godartade cellinjer är begränsad, och alla har genomgått omvandling med onkgener7. Primära prostata epitelceller i enskiktslager inte differentieras till luminala celler och saknar androgen receptorer8. Majoriteten av prostata cancer cellinjer har inte funktionella androgenreceptorer, en betydande medlare av tidiga sjukdomstillstånd och brist på viktiga genetiska förändringar som har hittats i patientens tumörer9. Prostata organoid kulturer kan odlas enkelt från godartade epitel och är värdefulla i studerar stamceller boenden, stamceller, differentiering och effekterna av experimentella förändringar i närmiljön4,5. Prostatacancer organoids kan odlas som en del av en precisionsinflygning medicin till modellering patientens sjukdom och svar till terapier10.
Detta protokoll har sammanställts utifrån befintliga protokoll som använder olika celltyper, men det här har optimerats för användning i människans primära prostata celler. Den komplimanger protokoll som beskrivs av Sawyers, Clevers och Shen5,6 som beskriver tillväxt, passaging, ljusa-området imaging, frysförvaring och RNA och DNA isolering av prostata mus och mänskliga organoids. Hela-mount protokollet ändras från Mahé o.a. 11, som används för gastrointestinala epitelceller organoids och beskriver levande imaging och frysta och paraffin inbäddning. Borten o.a. 12 beskrivs analysen av bröst-, kolon och kolorektal cancer organoid morfologi från ljusa-området imaging. Dessutom Richards et al. 13 används en metod för morphologic bedömning av prostata organoids. Slutligen, Hu et al. 14 beskrivs en metod för att följa prostata organoids till en kammare bild över natten före Immunofluorescerande färgningen för att observera enstaka celler och spridning av sfärer för flödescytometri Flödesanalys.
Målet med detta protokoll är att demonstrera i tillräcklig detalj dessa tekniskt krävande metoder som protokoll, inklusive cell sådd; Media och matrix gel underhåll; samling av celler för flödescytometri; RNA, DNA och protein utvinning; morphologic bedömning från ljusa fält z-stack analys; inbäddning, bearbetning och snittning för histologiska färgning; och hela-montering för immunofluorescens eller fluorescerande sonden analyser. Den biologiska relevansen och tolkningen av dessa olika slutpunkter varierar bland experimentell design och antikroppar som används för analys. Genom utnyttjande av detta protokoll, bör användare känna beredda att utforma ett experiment med en verktygslåda av slutpunkter.
Humana primära prostata (PrE) epitelceller fastställdes i labbet av protokollet beskrivs av Peehl15,16 och underhålls på ett begränsat antal passager (upp till fyra) som tidigare beskrivna17, men de är också tillgängliga från kommersiella leverantörer. Hepatocyte serumfritt mediebaserad6, KSFM-baserade13och R-spondin 1-villkorade5 media publiceras alla som har framgångsrikt producerat organoids. KSFM-baserade kräver minst antal tillsatser, så den beskrivs här.
Protocol
Följande protokoll var optimerad med humana primära prostata epitelceller som skördas från patientens vävnad vid University of Illinois i Chicago sjukhuset. Alla mänskliga vävnader används för dessa experiment var förvärvade via en institutionell Review Board-godkända protokoll eller skattebefrielse vid University of Illinois i Chicago. Medan odlingsbetingelserna varierar beroende på vilken cell intresse, kan ändpunkterna tillämpas på organoids av andra vävnader.
1. sådd av epitelceller i Matrix Gel och byte av Media
- Samla in nödvändigt material: humana primära prostata epitelceller (PrE), matrix gel på is, 96 brunnar mikroplattan, keratinocyter serum-fria medier (KSFM) på isen, charcoal avskalade fetalt bovint serum (FBS) och dihydrotestosteron (DHT).
- Förbered KSFM-baserade organoid genom att kombinera 47,5 mL KSFM med 2,5 mL av träkol avskalade FBS och dihydrotestosteron (DHT) till en slutlig koncentration av 10 nM DHT, sedan reserv på is.
- Platta celler i en 3D matrix i en cell kultur huva med steril teknik.
- Försiktigt blanda kalla KSFM-baserade organoid media med iskall matrix gel för att få en 50% matris gel blandning av långsamt pipettering upp och ner, att undvika bubblor.
Obs: Matrix gel bör vara tinat över natten vid 4 ° C och hållas på isen när det är möjligt. Det stelnar snabbt vid rumstemperatur (RT). - Förväg blöta en pipettspetsen i kallt media och överföring 40 – 50 μl av 50% matris gel på undersidan av varje brunn för att användas på en plattan med 96 brunnar. Täck botten av brunnen för att bilda ett underställ.
Obs: Inte fullt fördela till andra stopp på pipett som detta kan skapa bubblor. - Placera plattan med 96 brunnar i 37 ° C inkubator för 30 – 45 min att stelna baslagret.
Obs: Inte platta epitelceller på baslagret tills det har stelnat eller celler kan falla igenom matrisen på undersidan av plattan och växa som en enskiktslager. - Blanda epitelceller upphängd i KSFM-baserade organoid media med matrix gel för att uppnå en slutlig koncentration på 100 – 1 000 celler/100 μL och 33% matrix gel. Platta epitelceller ovanpå bas lager med 100 μL av 33% matrix gel deponicell blandningen per brunn.
Obs: Tidigare experiment har visat att sådd epitelceller alltför tätt i 3D kommer att begränsa storleken på organoid tillväxt, medan alltför glest sådd kan resultera i mycket låg avkastning13. Det är viktigt att optimera sådd villkor för den celltyp av ränta, baserat på patient-specifika organoid bildandet effektivitet.
- Försiktigt blanda kalla KSFM-baserade organoid media med iskall matrix gel för att få en 50% matris gel blandning av långsamt pipettering upp och ner, att undvika bubblor.
- Placera plattan med 96 brunnar i en 37 ° C inkubator för 30 – 45 min till tillåta matrix gelen stelna, sedan varsamt Tillsätt 100 μL av KSFM-baserade organoid media ovanpå celler genom pipettering långsamt mot kanten av brunnen.
- Ändra media efter 2 – 3 dagar. Pipettering mot brunnen sida med utrymme mellan media och matrix gelen, försiktigt bort 50 μL av media och ersätta med 50 μL av färska media.
Obs: För en långsiktig kultur, matrix gelen behöver ändras varje 2 – 3 veckor. Om matris gel kulturen visas instabil men genomskinlig rynkor under mikroskopet, sedan matrix gelen har gått sönder och behöver bytas.
2. insamling av Organoids från Matrix Gel
Obs: Samling av organoids är nödvändigt för matrix gel förändringar, passaging eller ändpunkterna i RNA-extraktion, DNA-extraktion, protein utvinning och flödescytometri.
- Varma neutrala proteas och Hanks balanserad saltlösning (HBSS) i 37 ° C vattenbad.
- Ta försiktigt bort media från wells utan att störa matrix gelen.
- Tillsätt ~ 200 μL av neutralt proteas till varje brunn på en ~ 1:2 andelen matrix gel: neutralt proteas och Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C.
- Mekaniskt separera matrix gel: neutralt proteas blandningen av pipettering upp och ner.
- Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C.
- Överföra neutralt proteas-matrix gel-cells blandningen till en mikrocentrifug rör eller koniska tube, beroende på volym. Centrifugera vid 300 x g i 3 – 5 min till pellet celler.
Obs: Om ingen cellpelleten visas matrisen gelen kan inte helt kan skiljas och kan visualiseras som en genomskinlig fas på botten av röret skiljer sig från Rosa supernatanten. Avlägsna supernatanten och lägga till mer neutralt proteas i förhållandet 1:2 i matris gel pelleten, inkubera i en annan 20 – 40 minuter vid 37 ° C och upprepa centrifugering vid 300 x g. - När en organoid pellet förvärvas, avlägsna supernatanten. Fortsätt med passaging (se steg 2.7.1), organoid lysis för RNA, DNA eller protein utvinning (se punkt 2.7.2), bearbetning enstaka celler genom flödescytometri och encelliga sekvensering (se steg 2.7.3).
- För långsiktiga kultur, försiktigt resuspendera intakt organoids i 33% färska matrix gel och plattan genom att följa stegen som beskrivs i steg 1,1-1,5. För att skilja organoids och replate som enstaka celler, återsuspendera pelleten i 1 mL varm cell-dissociation enzymer och inkubera vid 37 ° C i 10 – 15 min, tvätta en gång med 5 mL HBSS och åter tallrik i färska matrix gel efter steg 1,1-1,5.
- Återsuspendera pelleten organoid i en lämplig lyseringsbuffert för RNA-extraktion, DNA-extraktion eller protein utvinning som förtecknas i Tabell för material och följ tillverkarens protokollet.
- Återsuspendera organoids i 1 mL varm cell-dissociation enzymer och inkubera vid 37 ° C i 10 – 15 min att sära organoids till enstaka celler. Tvätta en gång med 5 mL HBSS och fortsätt med protokollet för flöde flödescytometri5 eller encelliga sekvensering18.
Obs: För att dissociera in enstaka celler vid låga koncentrationer av matrix gel, den neutralt proteasen kanske inte behövs, och cell-dissociation enzymer kan appliceras direkt på brunnen efter steg 2.2.
3. hela-väl bild förvärv och analys av Organoid morfologi
- Förvärva hela-väl z-stack bilder med en överförda inverterat ljusmikroskop med en motoriserad X / Y skanning scenen (arbetsflöde illustreras i figur 1A).
- Med den fokala position justeras till botten av brunnen, börja fokusera uppåt tills den första organoid påträffas, som kommer att vara i mitten av brunnen på grund av menisken från baslagret. Ställ in botten z-planet på denna position.
- Fortsätta fokusera uppåt tills den sista organoid är i fokus, som kommer att vara i peripheryen av brunnen. Ställ in top z-planet på denna position.
Obs: Efter att toppen och botten av z-stacken, säkerställa att dessa positioner fånga organoids inom alla återstående brunnar och justera översta/nedersta som behövs. Detta möjliggör den z-serien ska användas för en enda skanning som innehåller varje organoid inom varje brunn. - Fånga 15 – 35 z-plan per brunn, med ett större numrerar för större upplösning. Fånga hela väl bilden, sammanfoga och samla kvadranter eller underavsnitt om det behövs.
Obs: Det rekommenderas att ta flera z-plan i motsats till en enda z-planet, som illustreras i figur 1B där organoids är ur fokus när fånga endast en z-planet. - Spara z-stack bilder för efterföljande analys.
- Analysera bilder med bildbehandlingsprogram med freeform ritfunktionerna.
- Öppna en bild i z-planet från steg 3.1.4.
- Om det behövs, kakel bilder tagna på varje enskild z-plan till en enda, hela-bra bild. Spara den nya bilden som en separat fil. Upprepa processen för varje z-planet förvärvade.
- Använda bildbehandlingsprogram, öppna hela-väl bilden för varje z-planet från en enda brunn och skapa en utökad djup av fält (EUF) bild från stacken av z-plan.
Obs: Denna typ av bild väljer regionen bästa fokus i varje z-plan att skapa en enda i fokus-bilden av brunnen. - Ställ in pixel skalan av programvaran på skalstapeln av bilden som mäts.
- Använda verktyget frihand ritade av bildbehandlingsprogram, spåra omkretsen av varje organoid i brunnen.
- Få mätning mätvärden för spårade organoid perimetrar från bildbehandlingsprogram.
Obs: Rekommenderade parametrarna är området, loopkontroll och största/minsta radie baserat. Representativa resultat som illustrerar tillämpningen av dessa mätvärden visas i figur 1 c. Området beräknas från polygonen definieras av den organoid omkrets. Loopkontroll är förhållandet av området av organoid till området av en cirkel med en diameter som är lika organoid's högsta iller, där 0 är mindre cirkulära och 1 är mer cirkulär. Största/minsta radie-förhållandet är förhållandet mellan den maximala radien och minsta radien för den spårade organoid.
Loopkontroll =
Baserat på radie =
4. formalin fixering och Paraffin inbäddning av Organoids för histologiska slutpunkter
- Förbereda inbäddning leveranser: HBSS, 2% agar lösningen, histologiska märkfärgen, histologi gel, Pipettera tip mögel, tejp, kolven från en 1 cc insulinspruta, is pack, kassetter, 10% neutral buffrad formalin (NBF), penna och 75% histologisk grad etanol (EtOH).
- Förbered två mikrocentrifugrör 2% agar lösning. Inkubera i ett vattenbad eller på en värme block på 100 – 110 ° C att upprätthålla agar i flytande form. Lägg till 1 – 2 droppar histologisk märkning dye till en av de 2% agar lösningar, som kommer att beteckna toppen av agar plugg och hjälpa till att bibehålla orientering under inbäddning. Blanda väl.
- Värma histologi gelen i ett vatten bad eller värme block på 55 – 65 ° C.
- Skapa med en 1000 μl pipettspetsen formar genom att skära ut en liten del av pipettspetsen att göra en cylinder som håller ~ 50 μL. Skapa en andra, bredare mögel som passar runt första mögel.
- Skapa ett kallt block genom att Linda en is pack med tejp (självhäftande sidan uppåt) och följa formar till bandet.
- Skapa en kolven genom att ta bort kolven från en 1 cc insulinspruta.
- Bädda in organoids i en histologi gel plugg för bearbetning, efter det arbetsflöde som avbildas i figur 2A.
- Separera matrix gelen och pellet organoids genom att följa steg 2.1 – 2.7.
- Tvätta organoid pelleten en gång med 1 mL HBSS och åter pellet genom spinning för 3 – 5 min vid 300 x g och ta bort supernatanten.
- Re centrifugerade organoid i 30 – 50 μL av flytande histologi gel. Blanda försiktigt genom pipettering långsamt upp och ner. Överföra histologi gel/organoid blandningen i en form på kall blocket och låt provet svalna och stelna till en plugg.
- Använd en kolv för att driva pluggen ur små formen och in i större formen. Pipettera klart 2% agar runt pluggen att fylla större mögel.
- Pipettera histologisk dye-tonade 2% agar ovanpå kontakten att beteckna toppen av provet.
- När svalnat, använda en kolv för att överföra kontakten till en histologi kassett. Etikett kassett med en penna och plats kassett till 10% NBF för fixering över natten.
- Överföra kassett från 10% NBF till 70% histologisk grad EtOH.
- Processen histologi gelen Anslut med ett protokoll som förinställda biopsi på en processor, om tillgängligt. Om förinställning inte är tillgänglig, mata in följande sekvens och längder: 70% EtOH i 6 min, 70% EtOH för 10 min, 80% EtOH i 10 min, 95% EtOH 2 gånger under 10 minuter, 100% EtOH 3 gånger i 10 min, xylen 3 gånger för 15 min , och paraffin 3 gånger för 15 min. avviker från den rekommenderade Bearbetningsordning kan resultera i brusten organoids (figur 3A).
- Bädda in i histologi gel kontakten med den färgade delen uppåt, eftersom detta gör att missfärgade portion som innehåller organoids att vara sektioneras till första.
- Avsnitt av FFPE-histologi gel block:
- Samla in nödvändiga förnödenheter: FFPE histologi gel block, histologi penna, vävnad float vattenbad, ishink med is, mikrotom, mikrotomen blad, inbäddning arbetsstation, positivt laddade objektglas och laboratorium ugn.
- Fyll vattenbad tills väldigt full och set till 40 ° C, då pre varma laboratorium ugnen till 45 – 50 ° C.
- Förbereda en ishink, och sedan fylla med is och tillsätt vatten för att skapa ett is-vatten flytgödsel. Chill block på is tills de är mycket kallt.
Obs: Blocken kan ställas in på isen för 1 dag, men om kvar över natten, blocken kommer att bli uttorkad och behöver upparbetas. - Infoga ett block i mikrotomen kassettklämma, lägga till bladet i knivhållaren och låsa upp någon låsning skyddsåtgärder på maskinen.
- Börja med att trimma inför paraffin blocket (inför) 10 µm tjock. När ett avsnitt framträder som innehåller området plug, stoppa trimning, låsa mikrotomen rotorn och överföra blocket tillbaka ut på isen till chill. Om flera block ska vara sektioneras, blockera face-off varje innan han flyttade till steg 4.5.6.
- Flytta bladet till en ny, oanvänd del och överföra blocket tillbaka till klämman. Låsa upp maskinen och börja trimma på 5 μm per sektion.
Obs: 5 μm rekommenderas för bästa resultat, men 3 – 10 μm är också acceptabelt. - Med pincett, överföra avsnittet till 40 ° C vattenbad och låt avsnittet att sprida ut. Överföra avsnittet i en bild genom att doppa vertikalt i vattnet.
Obs: Doppning i vinkel kan överföra bubblor från botten av badet till avsnittet och vålla snedvridning av provet. - Visualisera avsnittet under mikroskopet (figur 2BC).
Obs: Om en organoid närvarande, visas den liknar den röda pilen i figur 2B. Bubblor (figur 2B, blå pil) som visas liknar organoids och är lättare att urskilja en fresh-bilden som torr organoids visas genomskinliga (figur 2 c). Om ingen organoids är närvarande, avsnittet ytterligare i blocket.
- När bilder som innehåller organoids har förvärvats, cirkel området runt avsnittet på baksidan av bilden med en histologi penna och grädda övernattning på 45-50 ° C.
- Samla in bilder och gå vidare till H & E (se steg 4.9.1), immunhistokemisk (se steg 4.9.2), eller Immunofluorescerande färgning (se steg 5).
Obs: Representativa resultat visas i figur 3B.- För att utföra H & E färgning, erhålla ett kit från listan material och följ tillverkarens anvisningar.
- För att utföra immunhistokemisk färgning, få en kit och primär antikropp från listan material och följ tillverkarens anvisningar.
5. Immunofluorescerande färgning av FFPE och sektionerad Organoids
- Samla leveranser: Bakad slide från steg 4, xylen, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, avjoniserat vatten (DI H2O), coplin burkarna, 1 x antigen retrieval lösning (natriumcitrat buffert eller EDTA-Tris buffert), fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 5% normal häst serum ( NHS) med 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS, 1% bovint serumalbumin (BSA) med 0,3% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS, färgning rack, färgning maträtt, decloaking kammare, hydrofoba barriär penna, fuktkammare, ämnesnummer 1 och 2 ° antikroppar av intresse och counterstains av intresse.
- Deparaffinize och rehydrera bilderna genom doppning i coplins fylld med följande lösningar: xylen (3 dips, 5 min varje), 100% EtOH (2 dips, 3 min varje), 95% EtOH (2 dips, 3 min varje), 70% EtOH (2 dips, 3 min varje) och DI H2O (2 dips 3 min varje).
- Fyll färgning skålen med antigen retrieval lösning och förvärmning decloaking kammare till 100 ° C.
- Utföra antigen hämtning av nedsänkning diabilder i förvärmda färgning skålen och inkubera i 5 – 10 min vid 100 ° C. När cykeln är klar, låt decloaking kammaren att sitta i 20 min innan du öppnar locket.
- När bilden skålen har svalnat till RT, placera färgning skålen under rinnande DI H2O skölja glasen för 5 min.
- Ta bort bilderna från färgning skålen, rita en cirkel runt provet med en hydrofoba barriär penna och lägga bilden på fuktkammare.
- Blockera någon icke-specifik antikropp färgning genom att tillämpa 5% NHS med 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS hydrofoba cirkeln runt provet (ca 30 μL behövs att täcka provet).
- Tvätta objektglas i coplins fylld med PBS 3 gånger för 5 min varje.
- Lägg till 1° antikropparna (Tabell för material) utspätt i 1% BSA med 0,3% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS att hydrofoba cirkeln runt provet (ca 30 μL bör omfatta avsnittet), sedan Inkubera i 1 h på RT eller över natten vid 4 ° C i fuktkammare.
- Tvätta bilderna i coplins fylld med PBS 3 gånger för 5 min varje.
- Lägg till 2° antikroppen utspätt i 1% BSA med 0,3% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS att hydrofoba cirkeln runt provet (ca 30 μL täcker området), sedan Inkubera i 1 h på RT i fuktkammare.
- Tvätta bilderna i coplin fylld med PBS 3 gånger för 5 min varje.
- Lägg DAPI, utspädd till tillverkarens specifikationer, i 1% BSA med 0,3% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS att hydrofoba cirkeln runt provet, sedan Inkubera i 2 – 5 min vid RT i mörkret (30 μL).
- Tvätta bilderna i coplins fylld med PBS 3 gånger för 5 min varje.
- Montera bilder med antifade montering media och täckglas och visualisera resultaten under ett mikroskop.
6. hela-montering av Organoids för Immunofluorescerande färgning
- Samla leveranser: kammaren bild eller confocal maträtt, fosfatbuffrad saltlösning (PBS), fixativ, 50 mM NH4Cl i PBS, 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS, 5% NHS med 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS, 1% BSA med 0,3% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS, 1 °, 2 ° antikroppar av intresse och counterstains av intresse.
- Ta försiktigt bort så mycket media som möjligt utan att störa organoid kulturen genom pipettering mot brunnen, lämnar utrymme mellan media och matrix gel sida.
- Använda en trimmade, pre våt med media eller PBS, 1000 μl pipettspetsen, utarbeta en droppe (25 – 50 μL) matrix gel som innehåller organoid(s) av intresse och fördela på mitten av en kammare bild väl eller confocal maträtt.
Obs: 33% matrix gel är inte en solid. Det är en geléartad vätska som hanterar liknar en Jello som inte har helt in. En trimmade pipettspetsen med en stor öppning kommer att förhindra att organoids bryts under överföringar. - Om organoids förblir i överordnad kultur, ersätta media med varm KSFM-baserade medier.
- Med blotta ögat eller dissekera omfattning, aspirera överskott media och matrix gelen från kammaren bilden med böter-tip pipett (10 – 200 μL).
Obs: Det är frivilligt att förbehandla kammare bilden med en följsamhet reagens. - Plåt en lika stor volym av matrix gel i en tom brunn av kammaren bilden som en valfri kontroll att iaktta autofluorescens av överblivna matris.
- Placera i kammaren bilden i en 37 ° C inkubator för 30 – 45 min att främja organoid följa glaset och förhindra förlust av prover under tvätta stegen.
- Pipettering långsamt att förhindra lösgörande från bild, tvätta organoids med 200 μL 1 x PBS för 5 min på RT medan försiktigt skaka.
- Ta bort 1 x PBS och fixa med 200 μL av 4% PARAFORMALDEHYD i 30 min på RT medan du försiktigt skaka. Kontrollera att matris gelen visas tydligt efter detta steg.
Obs: Metanol eller formalin fixering är också möjliga. Fixering metod bör optimeras för specifika antikroppar som vissa fixering metoder kanske crosslink antigenerna sevärdheter eller släcka lysrör-märkning-proteiner av intresse. - Ta bort fixeringsvätskan och tvätta två gånger med 200 μL 1 x PBS för 5 min medan du försiktigt skaka.
NOTE: Längden på tvätt steg bör optimeras beroende på organoid storlek. Fem minuter är en tillräcklig utgångspunkt, men steget tvätt kan förlängas efter behov. - Släcka autofluorescens med 200 μL av 50 mM NH4Cl i 1 x PBS för 30 min vid RT medan du försiktigt skaka.
Obs: Detta steg kommer att släcka autofluorescens från skräp i lumen av organoid och fluorescerande proteinuttryck (till exempel GFP) som kan presentera från experimentell design. Det ska tas med om det är önskvärt att använda en fluorophore i 488 kanal men kan hoppas över om så önskas att bevara god Jordbrukarsed signal. - Ta bort NH4Cl och tvätta två gånger med 200 μL 1 x PBS för 5 min medan du försiktigt skaka.
- Permeabilize organoids i 200 μL av 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel-100 i 1 x PBS för 30 min vid RT medan du försiktigt skaka.
- Bort den 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel-100 1 x PBS och tvätta två gånger med 200 μL 1 x PBS för 5 min medan du försiktigt skaka.
- Block med 5% NHS med 200 μL av 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel x-100 i PBS och inkubera 60 min på RT medan du försiktigt skaka.
- Ta bort det blockerande buffert och tvätta två gånger med 200 μL 1 x PBS för 5 min medan du försiktigt skaka.
- Späd 1° antikroppen i 1% BSA med 0,3% Triton x-100 i 1 x PBS och lägga till 200 μL av kammaren bilden och inkubera i 1 – 3 dagar vid 4 ° C.
- Ta bort 1° antikroppen och tvätta två gånger med 200 μL 1 x PBS för 5 min medan du försiktigt skaka.
- Späd 2° antikroppen i 1% BSA med 0,3% Triton x-100 i 1 x PBS och lägga till 200 μL av kammaren bilden och inkubera i 1 – 3 dagar vid 4 ° C i mörker.
NOTE: Längden på inkubationstider bör optimeras för organoid storlek och antikropp. Några kommer att kräva mer tid att tränga igenom organoid. Antikroppskoncentrationen behöver också optimeras. I allmänhet är 2 x den koncentration som används för FFPE sektioner är anslår för 1° antikroppar och samma koncentration för FFPE sektioner är lämpligt för 2° antikroppar. - Ta bort 2° antikroppen och tvätta två gånger med 200 μL 1 x PBS för 5 min medan du försiktigt skaka.
- Motfärg actin med phalloidin och kärnan med DAPI eller Hoescht, efter utspädning enligt tillverkarens rekommendationer i 1% BSA med 0,3% Triton-X i 1 x PBS. Tillsätt 200 μl till kammaren bild och inkubera vid RT i 40 min i mörker.
- Montera i 200 μL av färsk 1 x PBS eller montering media och bilden omedelbart (fluorescens bör bevaras i upp till 5 dagar, om inte längre). Representativa resultat visas i figur 3 c.
Obs: Natriumazid kan läggas till prover att förhindra kontaminering om confocal imaging inte är lätt tillgängliga. Lägga till en clearing agent kan förbättra imaging.
7. hela-montering av Organoids för analyser och fluorescerande sonder
Obs: Det finns kommersiellt tillgängliga analyser och fluorescerande sonder/färgämnen (exempel ingår i listan över material) Parkeringsleverantörer för användning på hela monterade organoids att observera en mängd användbar slutpunkter19. Följande protokoll är för fluorescently-märkt EdU spridning kit, men alla kit kan ändras för användning med en monterade på hela provet.
- Försiktigt bort 50 μL av media och ersätta med 50 μl av 20 μM 2 x arbetar EdU lösning av pipettering mot brunnen, lämnar utrymme mellan media och matrix gel sida.
- Inkubera vid 4 ° C i 1 – 3 dagar (önskad längd av tid för EdU inkorporering bör optimeras för celltyp val).
- Följ steg 6,2 – 6,8 att överföra organoids av intresse på en kammare bild eller confocal maträtt.
- Ta bort PBS och fixa med 200 μL av 3,7% PARAFORMALDEHYD i 30 min på RT medan du försiktigt skaka. Säkerställa att matrisen gel visas tydligt efter detta steg.
- Ta bort fixeringsvätskan och tvätta två gånger med 200 μL 1 x PBS för 5 min medan du försiktigt skaka. Ta bort PBS och tillsätt 200 μl av 0,5% icke-joniskt rengöringsmedel-100 i 1 x PBS för 30 min vid RT medan du försiktigt skaka.
- Bered 1 x fluorescerande reaktion cocktail enligt tillverkarens specifikationer.
- Ta bort 0,5% icke-joniskt rengöringsmedel-100 och tvätta två gånger med 200 μL av 3% BSA i 1 x PBS för 5 min medan du försiktigt skaka.
- Lägg till reaktion cocktail och inkubera i 30 min på RT i mörkret.
- Ta bort den fluorescerande reaktionen cocktail och tvätta en gång med 200 μL av 3% BSA i 1 x PBS för 5 min medan du försiktigt skaka. Motfärg och montera genom att följa steg 6,21 – 6.22 (figur 3D).
Representative Results
Vid framgångsrik kultur av mänskliga primära prostata organoids, kan morfologi och differentiering bedömas med ljusa fält bildanalys- och FFPE- och hela-mount färgning teknik.
Processen med ljusa fält Bildinsamling illustreras i figur 1A. Organoids odlas i en 3D matrix och spridda över olika focal plan. För att observera organoids i fokus på många plan, föreslås det för att använda bildens EUF (figur 1B, höger) istället för en enda z-plan (figur 1B, vänster). I labbet, kan organoids odlas under olika experimentella förhållanden resultera i förändringar i morfologi. Använda området, loopkontroll (definieras av hur lika organoid är att en cirkel) och max/min radie (längdmått) ger användare en indikation på organoid storlek och form och ger en kvantifierbar avläsning av morfologi. För att betona nyttan av dessa åtgärder, visas representativa bilder av organoids med liknande område men varierande morfologi i figur 1 c, där en lång organoid kommer att vara mindre rund och har en större största/minsta förhållande än en sfärisk Organoid.
Det är en användbar slutpunkt att iaktta inre av prover och se till att nekros inte är närvarande i kärnan av en organoid att bädda in organoids för histologi. Ett arbetsflöde för denna process och representativa resultat av de ofärgade, sektionerad proverna i ljusa fält Mikroskop tillhandahålls i figur 2AB, C. Figur 3A visar en misskött organoid (vänster) jämfört med korrekt räckte organoids i figur 3A (höger) och figur 3B. För att avgöra differentiering-tillstånd för provet, rekommenderas det att titta på basalcellscancer markörer (cytokeratin 5 och p63)8 tillsammans med luminala cell markörer (cytokeratin 8)8. Om det önskas att färga organoids i situ, hela-mount färgning är ett bekvämt alternativ, och dessa representativa resultat tillhandahålls i figur 3 cD.
Figur 1: morfologi bedömning av organoids i 3D kultur. (A) bild insamling och komprimering arbetsflöde för människans primära prostata organoids förvärvat en genomlysning inverterade Mikroskop med en motoriserad X / Y scenen och följeslagare programvara för skanning. (B) representativa bilder av en enda z-stack (vänster) vs. en EDF bild (höger) av ett hela-bra urval av människans primära prostata organoids, visar att mer organoids är i fokus när flera z-stackar kombineras till en enda projicerade bilden (skalstapeln = 1000 µm). (C) representativa bilder för området, loopkontroll och max/min förhållande av morfologiskt olika människors primära prostata organoids som har samma område (skalstapeln = 200 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Organoid inbäddning arbetsflöde och representant snittning resultat. (A) människans primära prostata organoid inbäddning arbetsflöde. (B) representativ bild av en ofärgade, fräsch bild som innehåller mänskliga primära prostata organoids i ljusa fält Mikroskop föreställande agar (grön pil), histologi gel (svart pil), bubbla (blå pil), organoids (röda pilar) (skalstapeln = 1000 µ (m). (C) ofärgade nyklippt bilden (vänster) vs. ofärgade torr bild (höger), organoids (röda pilar) visas genomskinligt när det torkar (skalstapeln = 500 µm) och är svårare att urskilja i ljusa fält Mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: histologiska färgning på sektionerad och hela monterade organoids. (A) H & E färgning av en trasig människa primära prostata organoid från misskötsel (aggressiv pipettering, fel behandling protokoll, vänster) bredvid en väl hanterat organoid (höger) (skalstapeln = 100 µm). (B) människans primära prostata organoid som varit formalin-fast, paraffin-inbäddat, sektioneras, och färgas med basala cytokeratin 5 eller luminala cytokeratin 8 (överst) eller basal p63 och luminala cytokeratin 8 (nederst) och avbildas med confocal Mikroskop ( skalstapeln = 100 µm). (C) en hela-monterad människans primära prostata organoid färgas med basala cytokeratin 5 eller luminala cytokeratin 8 och counterstained med phalloidin och DAPI, avbildas med confocal Mikroskop (skalstapeln = 100 µm). (D) en hela-monterad humana primära prostata cell organoid färgas med fluorescently märkt EdU och counter färgas med Hoescht, avbildas med confocal Mikroskop (skalstapeln = 500 µm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Organotypic kultur är en spännande ny metod för går igenom vävnad med bekvämligheten av en in vitro- miljö. För närvarande växer labs organoids från många typer av vävnader för olika endpoints. De metoder som beskrivs i detta dokument sammanfattar användbar slutpunkter och lyfta fram nya tekniker för att karakterisera fullt 3D primära prostata cellkulturer.
Det finns en mängd olika media recept för odla humana primära prostata cell organoids5,6,13. Medan alla uppnå livskraftiga och jämförbara resultat, använder KSFM-baserat median13 minimala tillsatser så är det beskrivs här. Dessutom, har papper publicerats med flera koncentrationer för matrix gel, från 10% till 75% till kultur prostata organoids5,6,13. Eftersom matrisen gel är ett dyrt reagens, och 33% matrix gel har visat sig vara tillräckligt för att odla långsiktiga (2-3 veckor), livskraftig, unclumped organoids13, detta är den rekommendera koncentrationen. Matrix gel kan emellertid variera i proteinkoncentration mellan partinummer, så detta bör beaktas när plätering. Det rekommenderas också att köpa matrix gel i bulk för användning över flera experiment att minska inkonsekvens mellan massor. Andra laboratorier har publicerat olika format för plätering matrix gel, såsom droppar istället för beläggning en plattan med 96 brunnar väl5. Båda metoderna bilda livskraftiga organoids, men det format som beskrivs här kan för celler att beläggas mer glest, vilket har visat sig främja utbyggnaden av celler in i större organoids13. Dock bör plätering densitet optimeras baserat off patientspecifika bildandet effektivitet. Matrix gel finns i många format inklusive tillväxtfaktor-reducerad, fenolrött-fri, hög koncentration, etc. Tillväxtfaktor-reducerad rekommenderas för definierade kultur förhållanden och fenolrött-fri rekommenderas när du arbetar med celler som uttrycker GFP eller i experiment som involverar z-stack Bildinsamling. Det är viktigt att någon matris gel plätering steg utföras med iskall reagenser, som matris gelen stelnar snabbt i rumstemperatur.
Organoids odlas under olika experimentella behandlingar kan resultera i förändringar till formen, så ljusa-området imaging ofta används för att studera iakttagna morfologiska fenotyper. Inspelning och kvantifiera område eller form är dock en utmaning av två skäl: 1) urval bias under Bildinsamling och 2) tillämpa en tvådimensionell parameter såsom område på en tredimensionell provet. En strategi av Bildinsamling är att en slumpmässig postens och mäta ett förutbestämt antal organoids i fältet, men detta kan skapa bias under urval och alla organoids i det markerade fältet får inte vara i fokus. Hela-väl imaging optimerad för formatet 96 brunnar mikroplattan eliminerar denna provtagning partiskhet genom att samla hela organoid befolkningen av intresse. Dock kan flera fält beroende på mikroskopet målen å behöva samlas in och klinkergolv för att få en helhet-bra bild. Vissa labs har beskrivit mätområdet från en enda z-plan12, men för att fånga alla organoids i fokus, det rekommenderas att samla och stapla flera plan i en enda EUF-bild13. I vissa fall en menisk i matrix gel kan orsaka vinjettering i bilden, och bakgrunden korrigering metoder kan behöva tillämpas med hjälp av bild analys programvara. Exakta volymen är idealiskt det mest lämpliga måttet för organoid storlek; Detta är dock svårt att just få, även med flera z-stack bilder. Andra användbara morfologiska dimensioner, till exempel loopkontroll och högsta/lägsta förhållandet, kan enkelt beräknas från alla organoids i en hela-väl EUF bild. Tillsammans, dessa metoder övervinna provtagning bias utmaningar och möjliggöra mätning av 2D parametrar från 3D-objekt i en 3D-rymden.
Formalin fixering och paraffin inbäddning av organoids är en vanlig metod att få hematoxylin och eosin (H & E), immunhistokemisk (IHC) och Immunofluorescerande (om) färgning för visualisering och analys6,11, 20. dock publikationer som har beskrivit denna teknik saknar heltäckande Detaljer på inbäddning process. Dessutom kan det vara svårt att lokalisera organoids inom kvarteret paraffin. Vissa labs fläcken före organoids med trypan blå före inbäddning stöd i läge vid snittning11. Den metod som beskrivs här omfattar användning av en histologisk färgämne för orientering av den organoid/histologi gelplug under inbäddning för att främja effektiviteten i snittning. H & E diabilder underlätta prövningen av nekros, nukleära textur och spridning, och det bör alltså vara en obligatorisk slutpunkt för organoid kultur så att cellerna är friska hela sfären. En styrka med organoid kultur är att prover utgörs av en heterogen blandning av celler som bättre liknar i vivo patientens vävnad. I prostatan, till exempel är både basal och luminala celler närvarande i prostata organoids5, medan celler odlade i 2D brist luminal differentiering8. För att bedöma organoid differentiering, är det rekommenderat att forskare bedöma basala markörer såsom CK5 och p63 och luminala markörer såsom androgenreceptorer och CK88. Några andra experimentella proteiner av intresse kan också studeras med hjälp av dessa färgning tekniker.
Även om FFPE sektioner kan visualisering av celler som är bosatta i innerfack via histologisk metoderna (H & E, IF, IHC), bilder är begränsade till tvärsnitt och organoid form kan ändras av inbäddning process. Hela-mount färgning kan en organoid färgas och observerats i situ, bevara morfologiska fenotyper och tillåter bilder av protein lokalisering. Hela-montering är ett verktyg som används för att färga hela-vävnad eller hela djur prover, såsom zebrafisk eller mus embryot, och enkelt anpassas för organoids. Den teknik som beskrivs här ändrades från förfarandet av Mahéo.a. 11, som information om initial tillväxt och kultur av gastrointestinala organoids direkt på en kammare bild för färgning och kräver fixering av hela överordnad kultur. Den metod som beskrivs här innebär överföring av en enda organoid (eller organoids) av intresse i en kammare bild vid tidpunkten för färgning. Detta gör valet av enskilda organoids för hela-mount analys i ett pågående experiment utan fixering av överordnad kultur. När du utför hela-mount färgning, är det nödvändigt att optimera permeabilisering och inkubationstiden för primära och sekundära antikroppar att säkerställa penetration i hela preparatet (någonstans från en eller flera dagar rekommenderas). När avbildas via konfokalmikroskopi, kan 3D-renderingar produceras för att aktivera visualisering och lokalisering av ett specifikt protein och beräkna antalet positivt färgade celler i en provet. Flödescytometri är en användbar slutpunkt att kvantifiera populationer av basal, luminala eller stamceller5,14. Detta gör celler återhämtat sig från matrix gelen och försiktigt isär för färgning. Användare bör noga välja lämpliga markörer för separation utifrån den aktuella litteraturen. För humana primära prostata epitelceller är CD26 och CD49f passande luminala och basala markörer, respektive5,21.
Sammanfattningsvis Detaljer detta protokoll människans primära prostata organoid tillväxt, insamling och experimentella slutpunkter. Notera kan den montering teknik som beskrivs tillämpas på en mängd andra analyser som normalt är anställd för 2D celler, till exempel fluorescerande sond-baserade experiment tittar på spridningen19, apoptos och subcellulär organell fläckar. Dessutom kunde den insamling och dissociation metod som beskrivs här utnyttjas inför encelliga RNA-sekvensering18. Sammantaget visar detta möjligheten för en mängd roman, HiFi-slutpunkter som forskare kan optimera och utforska i framtiden.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar UIC Biorespository medlemmar, Dr. Klara Valyi-Nagy och Alex Susma, liksom urologerna, Drs. Michael Abern, Daniel Moreira och Simone Crivallero, för underlättande av vävnad förvärv för de primära cellkulturerna. Vi tackar UIC urologi patienterna för att donera sin vävnad till forskning. Detta arbete var delvis finansieras av den avdelning av försvar prostata Cancer forskning Program hälsa skillnader idé Award PC121923 (Nonn) och UIC centrum för klinisk och översättning Science Pre-doctoral utbildning för klinisk och translationell forskare ( NAR) Program (McCray och Richards) och av National Institutes of Health's National Cancer Institute, Grant nummer U54CA202995, U54CA202997 och U54CA203000, känd som den Chicago Health Equity Collaborative (Nonn och Richards). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health eller försvarsdepartementet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells of interest | |||
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
| Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
| 5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
| Ice Bucket | |||
| Cell Culture Hood | |||
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
| Centrifuge | |||
| Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
| DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
| Organoids | |||
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
| Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
| Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
| Organoids | |||
| Ice pack | |||
| Masking tape | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Razor blade | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
| HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Pencil | |||
| "Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
| Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
| Container to hold fixative | |||
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water | |||
| Paraffin | Leica | various | |
| Tissue processor | |||
| Embedding workstation | |||
| Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
| Microtome | |||
| Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
| Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
| Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
| ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
| Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
| FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water (DI H2O) | |||
| Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
| Staining dish | IHC World | M900-12B | |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
| Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
| 50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
| Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
| Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
| Organoids | |||
| Ice bucket | |||
| Cell culture hood | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
| Microcentrifuge | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
| Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Cytokeratin 5 Antibody - FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
| Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
| CD49f - Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
| CD26 - PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |
| Flow cytometer |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2. The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).
- Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue. Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).
- Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1. The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).
- Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).
- Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids. iScience. , in press (2018).
- Hu, W. -Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
- Peehl, D. M. Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro. Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. Whole-mount Enteroid Proliferation Staining. Bio-Protocol. 6 (12), (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
