Summary
Burada, insan birincil prostat organoid kullanım kılavuzu sonra fenotip değerlendirmek için bitiş noktaları önermek için bir protokol mevcut. Tohum, kültür bakım, matris jel, kurtarma morfolojik miktar, katıştırma ve kesit, FFPE kesit, Bütün Dağı boyama ve ticari deneyleri uygulanması anlatılmaktadır.
Abstract
Bu kağıt üç boyutlu (3D) kültür, işleme ve insan birincil prostat organoids değerlendirilmesi için detaylı bir protokolünü açıklar. Epitel hücrelerinin seyrek bir 3D matris jel bir 96-şey Mikroplaka medya değişikliklerle organoids doğru genişleme yetiştirmek için tarihinde tohumlama işlemi içerir. Morfoloji sonra bütün iyi z-yığın görüntüleri yakalama tarafından değerlendirilir. Z-yığın sıkıştırma organoids çıkış Döngüsellik, yuvarlaklık ve alanı da dahil olmak üzere, çeşitli ölçmek için ölçülü tek bir odakta görüntü oluşturur. DNA, RNA ve protein organoids matris jel yeniden elde etmek--dan toplanabilir. Hücre popülasyonlarının ilgi organoid ayrışma tarafından değerlendirilmek ve akış sitometresi. Formalin fiksasyon-parafin-kesit tarafından takip gömme (FFPE) histolojik değerlendirme ve antikor boyama için kullanılır. Bütün Dağı immünfloresan boyama organoid morfoloji korur ve protein yerelleştirme organoids in situolarak gözlenmesi kolaylaştırır. Geleneksel 2D monolayer hücreleri için kullanılan ticari deneyleri için 3D organoids değiştirilebilir. Birlikte kullanıldığında, bu iletişim kuralını teknikleri prostat organoid büyüme, morfolojik özellikleri ve ayırt etme belirteçleri ifade ölçmek için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
Organoids çalışma organogenesis ve hastalık için değerli bir araç vardır. Onlar hayvan modelleri için daha ucuz bir alternatif sağlamak ve hasta kaynaklı organoids Kişiselleştirilmiş tıp1,2,3için bir strateji olarak gelişmektedir. Bu üç boyutlu (3D) kültür sistem (dokudan hasat veya pluripotent kök hücreler indüklenen) kök veya progenitör hücre tohum hücre dışı matriks bileşenleri (matris jel)4bir jel karıştırmak. Hücreler çoğalırlar ve ayırt etmek, hücresel hiyerarşi ve morfoloji faiz'ın işlevsel birim organ özetlemek organotypic yapılarda kaynaklanan. Organoids organlar, tükürük bezi, mide, bağırsak, karaciğer, prostat, akciğer ve beyin4de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklanan hücreleri kullanarak büyüdü. Prostat organoids5,6kurmak için adımları açıklayan çok sayıda iletişim kuralları olmakla birlikte, organoids üzerinden nicel bitiş noktaları elde etmek yeterince ayrıntılı yöntemleri bulmak zordur. Bu kağıt insan birincil Prostat hücreleri için geliştirilmiş yöntemleri özetler ve organoid fenotipleri değerlendirmek için önerilen bitiş noktaları bir dizi detayları. Bu teknikler prostat organoids için optimize ve diğer 3D hücre kültürleri için olabilir.
Değerli vitro manken sınırlamalar kullanarak monolayer kültürlerin yoksun ölümsüzleştirdi hücre hatları belirlenen prostat organoid kültürler son zamanlarda ortaya çıkmıştır. İyi huylu prostat epiteli ve prostat kanseri ölümsüzleştirdi hücre hatları kullanarak modeli vitro için zor. İyi huylu hücre satır sayısı sınırlıdır ve tüm oncogenes7ile dönüşüm geçirmiş. Monolayers birincil prostat epitel hücrelerinde luminal hücrelere ayırt etmek ve androjen reseptörleri8eksikliği. Prostat kanseri hücre hatları çoğunluğu fonksiyonel androjen reseptörleri, erken hastalık durumu ve hasta tümörleri9' bulduğu eksikliği anahtar genetik değişiklikler önemli bir aracı yok. Prostat organoid kültür kolayca iyi huylu epitel yetiştirilir ve kök hücre özellikleri, progenitör hücreler, farklılaşma ve microenvironment4,5deneysel değişikliklerin etkisini eğitimi değerlidir. Prostat kanseri organoids hassas tıp yaklaşımının bir parçası hasta hastalık ve tedaviler10yanıt modelleme için yetiştirilen olabilir.
Bu iletişim kuralını kullanan çeşitli hücre tiplerinin varolan iletişim kurallarından derlenmiş, ama burada insan birincil Prostat hücreleri kullanmak için optimize edilmiştir. Sawyers, Clevers, Shen tarafından belirlenen ve protokolleri övgü büyüme, passaging, parlak alan görüntüleme, dondurma ve prostat fare ve insan organoids RNA ve DNA izolasyonu tarif5,6 . Bütün Dağı Protokolü Mahé vd değiştirilir Kim açıklar ve gastrointestinal epitel organoids kullanılan 11, canlı görüntüleme ve donmuş ve katıştırma alkol. Borten vd. 12 meme, kolon ve kolorektal kanser organoid morfoloji parlak alan görüntüleme üzerinden analiz nitelendirdi. Ayrıca, Richards ve ark. 13 prostat organoids morfolojik değerlendirilmesi için kullanılan bir yöntem. Son olarak, Hu vd. 14 yapışan prostat organoids odası slayda immünfloresan tek hücreleri ve küreler Akış Sitometresi Analizi için dispersiyon gözlemlemek için boyama önce gecede bir yöntemi açıklanmıştır.
Bu iletişim kuralı, yeterince ayrıntılı bir biçimde bu teknik olarak zor yöntemleri hücre tohum da dahil olmak üzere, bir iletişim kuralı olarak göstermek için hedeftir; Medya ve matris bakım Jeli; Akış Sitometresi için hücreler topluluğu; RNA, DNA ve protein ayıklama; morfolojik değerlendirmesi alan parlak z-yığın çözümlemesi; Gömme, işleme ve histolojik boyama için kesit; ve bütün-montaj ayirt veya floresan sonda deneyleri için. Biyolojik alaka ve bu çeşitli bitiş noktaları yorumlanması deneysel tasarım ve analiz için antikorlar arasında değişir. Bu iletişim kuralı kullanımı, kullanıcılar bir deney bitiş noktaları toolkit ile kurmak hazır hissetmeniz gerekir.
İnsan birincil prostat epitel (PrE) hücreler laboratuarda Peehl15,16 tarafından açıklanan ve sınırlı sayıda pasajlar (en çok dört) yukarıda açıklanan17olarak tutulan protokolü tarafından kuruldu, ama onlar da ticari satıcılardan temin edilir. Hepatosit serum-özgür medya tabanlı6,13KSFM tabanlı ve R-spondin5 1 şartına medya tüm başarılı organoids üretilen olarak yayımlanır. Burada anlatılan KSFM tabanlı katkı maddeleri, en az sayıda gerektirir.
Protocol
Aşağıdaki iletişim kuralı kullanarak insan birincil prostat epitel hücreleri, Illinois Universitesi, Chicago hastanesinde hasta dokusundan hasat optimize edildi. Bu deneyler için kullanılan tüm insan doku Protokolü edinsel üzerinden bir Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanan ve/veya muafiyet Chicago Illinois Üniversitesi'nde olduğunu. Kültür koşulları faiz hücre türüne bağlı olarak değişir iken, bitiş noktaları için diğer dokuların organoids uygulanabilir.
1. tohum epitel hücrelerinin matris jel ve Medya değiştirme
- Gerekli malzemeleri toplamak: insan birincil prostat epitel hücreleri (PrE), matris jel buz, 96-şey Mikroplaka, keratinosit serum-ücretsiz medya (KSFM) buz üzerinde kömür soyulmuş fetal Sığır serum (FBS) ve dihidrotestosteron (DHT).
- Organoid KSFM tabanlı medya KSFM 47,5 mL kömür soyulmuş FBS ve dihidrotestosteron (DHT) 2.5 mL ile birleştirerek buz son yandan 10 nM DHT, daha sonra rezerv için hazır olun.
- Plaka hücrelere bir 3D matris steril tekniği kullanarak bir hücre kültür Hood.
- Yavaşça KSFM tabanlı organoid medya ile % 50 matris elde etmek için buz gibi matris jel karışımı yavaş yavaş jel karışımı soğuk yukarı ve aşağı pipetting, kabarcıklar kaçınarak.
Not: Matris jel gecede 4 ° C'de çözdürülen ve buza mümkün olan her durumda tutulması gerekir. Hızlı bir şekilde oda sıcaklığında (RT) dönüşür. - % 50 matris μL jel bir 96-şey plaka üzerinde kullanılmak üzere her şey alt üzerine bir pipet ucu soğuk medya ve transfer 40-50 önceden ıslak. Temel katman oluşturmak üzere kuyunun kat.
Not: Bu kabarcıklar oluşturabildiğiniz gibi tam olarak ikinci durağına pipet üzerinde dağıtmak değil. - 96-şey plaka 37 ° C kuluçka temel katmanın kuvvetlendirmek 30-45 dakika yerleştirin.
Not: temel katmanın üzerine epitel hücreleri katılaşmış veya hücreleri aracılığıyla matris alt plaka üzerine düşmek ve bir monolayer büyümek kadar plaka değil. - Epitel hücreleri organoid KSFM tabanlı medya 100 – 1000 hücre/100 μL son bir konsantrasyon ulaşmak için matris jel ve % 33 matris jeli askıya karıştırın. Üstünde tepe-in temel katmanları iyi 100 μL % 33 matris jel/hücre karışımı kullanarak plaka epitel hücreleri.
Not: Önceki deneyler göstermiştir ki tohum çok seyrek çok düşük verim13' te neden olabilir iken epitel hücrelerinde çok yoğun 3D tohum organoid büyüme, boyutunu sınırlar. Hücre tipi hastaya özgü organoid oluşumu verimliliği üzerinde temel ilgi için tohum koşulları optimize etmek önemlidir.
- Yavaşça KSFM tabanlı organoid medya ile % 50 matris elde etmek için buz gibi matris jel karışımı yavaş yavaş jel karışımı soğuk yukarı ve aşağı pipetting, kabarcıklar kaçınarak.
- 30-45 dk kuvvetlendirmek matris jel izin vermek için 37 ° C kuluçka 96-şey plaka yeri, sonra yavaşça yavaşça kuyu kenarına dayanmalıdır pipetting tarafından 100 μL KSFM tabanlı organoid medya hücreleri üzerine ekleyin.
- Medya her 2-3 gün değiştirin. İyi tarafı karşı pipetting medya ve matris jel arasında boşluk ile dikkatli bir şekilde medya 50 μL kaldırın ve taze medya 50 μL ile değiştirin.
Not: uzun vadeli bir kültür için matris jel her 2-3 hafta değiştirilmesi gerekiyor. Matris jel kültür dengesiz görünür ve mikroskop altında yarı saydam kırışıklıkları görüntüler, matris jel bozuldu ve değiştirilmesi gerekir.
2. Organoids Matrix jel üzerinden toplanması
Not: Organoids topluluğu matris jel değişiklikleri, passaging veya RNA ayıklama, DNA ekstraksiyon, protein çıkarma ve akış sitometresi bitiş noktaları için gereklidir.
- Sıcak tarafsız proteaz ve Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 37 ° C su banyosu içinde.
- Dikkatli bir şekilde medya kuyulardan matris jel aksatmadan çıkarın.
- ~ 200 μL tarafsız proteaz olan her şey için bir ~ 1 ekleyin: matris jel: tarafsız proteaz 2 oranı ve 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
- Mekanik matris jel: tarafsız proteaz karışımı yukarı ve aşağı pipetting tarafından ayırmak.
- 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
- Tarafsız proteaz-matris hücre içi jel karışımı bir microcentrifuge tüp ya da hacmine bağlı olarak konik tüp aktarın. 300 x g hücreleri cips için 3-5 dakika için de santrifüj kapasitesi.
Not: hiçbir hücre Pelet görüntülenirse, matris jel değil tamamen ayrışmış ve pembe süpernatant ayrı tüp alt yarı saydam bir aşama olarak görüntülenir. Süpernatant kaldırmak ve daha tarafsız proteaz bir 1:2 oranında matris için jel Pelet ekleyin, başka bir 20-40 dk 37 ° C'de için kuluçkaya ve 300 x gde aralıklarla tekrar. - Bir organoid Pelet alındığında süpernatant kaldırın. (Bkz. Adım 2.7.1), organoid lizis RNA, DNA veya protein çıkarılması için passaging ile devam edin (bkz. Adım 2.7.2), işlem tek hücreleri akış sitometresi ve tek hücreli sıralama tarafından (bkz. Adım 2.7.3).
- Uzun vadeli kültür için 1,1-1,5 adımlarda açıklanan adımları izleyerek % 33 taze matris jel ve plaka sağlam organoids yavaşça resuspend. Organoids ayırmak ve tek hücre olarak replate, pelet 1 mL sıcak hücre-ayrılma enzimlerin resuspend ve 10-15 dk 37 ° C'de kuluçkaya için bir kez HBSS 5 mL ile yıkayın ve aşağıdaki adımları 1,1-1,5 taze matris jel içinde yeniden plakası.
- Malzemeleri tabloda listelendiği gibi uygun lizis arabelleği RNA ayıklama, DNA ekstraksiyon veya protein çıkarma organoid Pelet resuspend ve üreticinin iletişim kuralı izleyin.
- 1 mL sıcak hücre-ayrılma enzimlerin organoids resuspend ve 10-15 dk organoids tek kişilik hücrelere ayırmak için 37 ° C'de kuluçkaya. Bir kez HBSS 5 mL ile yıkayın ve akış sitometresi5 veya tek hücre sıralama18için protokol ile devam edin.
Not: matris jel düşük konsantrasyonlarda tek hücreye ayırmak için tarafsız proteaz değil gerekli olabilir ve hücre-ayrılma enzimler doğrudan kuyuya adım 2.2 sonra uygulanabilir.
3. bütün şey resim alma ve Organoid morfoloji Analizi
- Bütün iyi z-yığın görüntüleri iletilen ışık ters mikroskop ile motorlu kullanarak X / Y sahne ( Şekil 1A' resimli iş akışı) tarama.
- Kuyunun için ayarlanabilir odak konumu ile ilk organoid, temel katmanın üzerinden menisküs nedeniyle kuyunun Center'da olacak karşılaşılana kadar yukarı doğru odaklanarak başlar. Alt z-uçak bu konumda ayarlayın.
- Son organoid iyi çevre-ecek var olmak odak kadar yukarı doğru odaklanarak devam edin. En iyi z-uçak bu konumda ayarlayın.
Not: z yığının altında ve üst ayarladıktan sonra bu pozisyonlar organoids tüm kalan kuyu içinde yakalamak ve üst/alt gerektiği gibi ayarlamak emin olun. Bu her organoid her şey içinde içeren tek bir tarama için kullanılacak z aralığı sağlar. - 15-35 z-uçak başına iyi, daha fazla çözümleme için daha büyük bir sayı kullanarak yakalama. Tüm iyi görüntü yakalama, birleştirme ve gerekirse çeyrek daire veya alt toplamak.
Not: Birden çok z-düzlem olarak karşı tek bir z-uçak, organoids odak dışında tek bir z-uçak yakalarken olan Şekil 1B adımında gösterildiği gibi almak için önerilir. - Aşağı akım analiz için z-yığın görüntü kaydedin.
- Serbest form çizim yetenekleri ile görüntü yazılımı kullanarak görüntüleri analiz.
- Adım 3.1.4 ayarlayın tek bir z-uçak görüntüyü açın.
- Gerekirse, tek tek her z-uçakta bir tek, Bütün-da görüntü içine çekilen görüntüler döşeme. Yeni resmi ayrı bir dosya olarak kaydedin. Alınan her z-uçak için bu işlemi yineleyin.
- Görüntü yazılımı kullanarak, tek bir kuyudan her z-uçak için bütün iyi görüntü açın ve genişletilmiş bir alan (EDF) görüntü derinliği z-uçak yığından oluşturun.
Not: Bu tür bir görüntü iyi tek bir odakta görüntü oluşturmak için her z uçak en iyi odak bölgenin seçecektir. - Yazılım piksel ölçeğini ölçülür görüntü ölçek çubuğu ayarlayın.
- Görüntü yazılımı izleme çevre her organoid iyi ve serbest form çizim aracını kullanarak.
- İzlenen organoid parametreleri için ölçüm metrikleri görüntü yazılımı'nı edinebilirler.
Not: Önerilen alan, Döngüsellik ve maksimum/minimum RADIUS oranı parametreleridir. Bu ölçümler uygulanması gösteren temsilcisi sonuçları Şekil 1 ciçinde gösterilir. Alan organoid'ın çevre tarafından tanımlanan Çokgen hesaplanır. Ürün reçetesinde döngü için 0 daha az dairesel, 1 daha dairesel çapı eşit bir organoid'ın en büyük gelincik, olan bir daire alanı organoid alanı oranıdır. Maksimum yarıçapı ve izlenen organoid en az yarıçapı arasındaki oran maksimum/minimum RADIUS oranıdır.
Ürün reçetesinde döngü =
RADIUS oranı =
4. formalin fiksasyon ve parafin Organoids histolojik bitiş noktaları katıştırma
- Gömme malzemeleri hazırlamak: HBSS, %2 agar çözüm, histolojik işaretleme boya, Histoloji jel, pipet ucu kalıp, teyp, pistonu 1 cc insülin şırınga, buz torbası, kaset, % 10 tarafsız tampon formalin (NBF), kalem ve % 75 histolojik grade etanol (alkol).
- %2 agar çözüm iki microcentrifuge Tüp hazırlayın. Bir su banyosu veya 100-110 ° C agar sıvı formda korumak için bir ısı blok üzerinde kuluçkaya. 1-2 damla histolojik boya agar üst göstermek %2 agar çözümlerden birini için işaretleme takın ve yönlendirme katıştırma sırasında korumada yardımcı ekleyin. İyice karıştırın.
- Sıcak su banyosu veya ısı blok 55-65 ° C'de Histoloji jel
- 1000 μL pipet ucu kullanarak, ~ 50 μL tutan bir silindir yapmak pipet ucu küçük bir bölümünü keserek kalıpları oluşturmak. İlk kalıp uygun ikinci, daha geniş bir kalıp oluşturun.
- Soğuk bir blok buz torbası bandı (yapışkan tarafı yukarı) ile kaydırma ve kalıpları teybe kalarak oluşturun.
- Bir dalgıç pompayı 1 cc insülin şırıngadan kaldırarak oluşturun.
- Organoids 2A rakamtasvir iş akışı aşağıdaki işlem, Histoloji jel fiş katıştırın.
- Matris jel ayırmak ve adımları 2.1-2.7 takip ederek organoids cips.
- Bir kez HBSS ve yeniden cips 1 mL ile organoid Pelet 300 x g de 3-5 dk iplik ve süpernatant kaldırma yıkayın.
- Organoid Pelet sıvı Histoloji jel 30 – 50 μL içinde yeniden askıya alma. Karışımı yavaşça yukarı ve aşağı yavaş yavaş pipetting. Histoloji jel/organoid karışımı bir kalıp içine soğuk blokta aktarmak ve serin ve bir'liğe kuvvetlendirmek numune izin.
- Bir dalgıç tak küçük kalıp dışarı ve daha büyük kalıp içine itmek için kullanırız. NET %2 agar büyük kalıp doldurmak için fiş çevresinde pipet.
- Histolojik boya renkli %2 agar üst örnek belirtmek için fiş üzerine pipet.
- Soğutmalı sonra bir dalgıç fişi Histoloji kaset aktarmak için kullanabilirsiniz. Bir kalem ve yer kaset % 10 kullanarak kaset etiket NBF gecede fiksasyon için.
- Kaset % 10 dan transfer NBF % 70 histolojik Grade alkol.
- İşlem Histoloji jel varsa fiş bir işlemci üzerinde önceden ayarlanmış biyopsi protokolünü kullanarak. Hazır ayar yoksa, aşağıdaki sıra ve uzunlukları giriş: % 70 alkol 6 dk, % 70 alkol 10 dk, %80 alkol 10 dk, 10 min için %95 alkol 2 kat, %100 alkol 3 kat 10 dk, 15 dk için 3 kez ksilen için için , ve parafin 3 kez 15 dakika süreyle sapma önerilen işlem sırasının rüptüre organoids (Şekil 3A) neden olur.
- Bu ilk kesitli organoids içeren renksiz kısmı sağlayacaktır Histoloji jel tak, karşı karşıya renkli kısmı ile gömebilir.
- Bölüm FFPE Histoloji jel blokları:
- Gerekli malzemeleri toplamak: FFPE Histoloji jel blok, Histoloji kalem, doku float su banyosu, buz, microtome, microtome bıçaklar, iş istasyonu, olumlu mikroskop slaytlar ve laboratuvar fırın tahsil katıştırma buz kovası.
- Dolgu su banyosu kadar çok tam ve küme 40 ° c, sonra önceden sıcak laboratuvar fırında 45-50 ° c
- Bir buz kovası hazırlamak sonra buz ile doldurun ve bir buz-su Bulamaç oluşturmak için su ekleyin. Buz blokları chill onlar are çok soğuk kadar.
Not: Blok buz üzerinde 1 gün için ayarlanabilir ancak gecede bırakılırsa, bloklar sulu olmak ve reprocessed gerekir. - Bir taşı microtome kaset kelepçe Ekle, bıçak bıçak tutucu ekleyin ve makinedeki herhangi bir koruyucu kilitleme önlemler kilidini.
- (10 µm kalınlık bakan) parafin blok yüzü çıkararak başlayın. Fiş alanı içeren bir bölümü ortaya sonra kırpma durdurun, microtome rotor kilitleme ve blok geri soğuk buz üzerine aktarın. Birkaç blok kesitli istiyorsak, face-off her blok adım 4.5.6 taşınmadan önce.
- Bir yeni, kullanılmamış bölümüne bıçak taşımak ve blok geri kelepçe için transfer. Makine kilidini ve bölüm başına 5 mikron, kesme başlar.
Not: 5 mikron en iyi sonucu elde etmek için önerilir, ancak 3-10 mikron de kabul edilebilir. - Cımbız kullanarak, bölümün 40 ° C su banyosu için transfer ve yaymak için bölümü sağlar. Bir slayda bölüm dikey olarak suya daldırma tarafından aktarın.
Not: bir açıyla daldırma kabarcıklar banyo derinliklerinden bölümüne transfer ve örnek bozulma neden. - Mikroskop (Şekil 2BC) bölümünde görselleştirin.
Not: bir organoid Eğer mevcut, benzer şekil 2B kırmızı ok görünür. Kabarcıklar (Şekil 2B, mavi ok) organoids için benzer görünebilir ve kuru organoids yarı saydam (Şekil 2C) görüldüğü şekilde taze slaytta ayırt etmek kolaydır. Hiçbir organoids mevcutsa, daha fazla bölüme blok.
- Ne zaman organoids içeren slaytlar elde etmiş, Histoloji kalem ve fırında 45-50 ° C'de gecede ile slayt arka bölümüne çevresi daire
- Slaytlar toplamak ve H & E devam edin (bkz. Adım 4.9.1), immunohistokimyasal (bkz. Adım 4.9.2), veya immünfloresan (bkz. Adım 5) boyama.
Not: Şekil 3B' temsilcisi sonuçları gösterilir.- H & E boyama gerçekleştirmek için malzeme listesinden bir kit alın ve üreticinin belirtimlerine izleyin.
- İmmunohistokimyasal boyama gerçekleştirmek için bir kit ve birincil antikor malzemeleri listeden alın ve üreticinin belirtimlerine izleyin.
5. immünfloresan FFPE boyama ve kesitli Organoids
- Malzemeleri toplamak: adım 4 pişmiş slayttan, ksilen, %100 alkol, %95 alkol, %70 alkol, deiyonize su (DI H2O), coplin Kavanozlar, antijen alma fosfat tamponlu çözüm (sodyum sitrat arabellek veya arabellek EDTA-Tris), serum fizyolojik (PBS), % 5 normal at serum () x 1 NHS) PBS, % 1 sığır serum albumin (BSA) raf boyama, çanak boyama, odası, hidrofobik bariyer kalem, nem odası, 1 ° ve faiz ve counterstains, 2 ° antikorlar beliriyor PBS, %0,3 non-iyonik deterjan ile %0.1 non-iyonik deterjan ile faiz.
- Deparaffinize ve coplins aşağıdaki çözümleri ile dolu içine daldırma slaytları rehydrate: ksilen (3 dips, 5 dk), %100 alkol (2 dips, 3 dk her), %95 alkol (2 dips, 3 dk her), %70 alkol (2 dips, 3 dk her) ve DI H2O (2 dips 3 dk.).
- Antijen alma çözüm ve ön ısı beliriyor odası ile 100 ° c ile boyama çanak doldurmak
- Slaytlar önceden ısıtılmış boyama çanak içine çeker tarafından antijen alma gerçekleştirmek ve 100° C'de 5-10 dk için kuluçkaya Döngüsü tamamlandıktan sonra 20 dk için kapağı açmadan önce oturup decloaking odası izin verir.
- Slayt çanak RT soğuduktan sonra slayt 5 min için durulama için DI H2O koşma altında boyama çanak yerleştirin.
- Slaytlar boyama çanak kaldırmak, hidrofobik bariyer kalemle örnek çevresinde bir daire çizin ve nem odası slaytta yattı.
- Örnek hidrofobik çember %5 NHS PBS %0,1 non-iyonik deterjan ile uygulayarak boyama herhangi bir non-spesifik antikor engellemek (yaklaşık 30 μL örnek kapak için gereklidir).
- Coplins yıkama slaytları PBS 3 kere 5 min için dolu.
- % 1 BSA içinde % 0,3 örnek hidrofobik çember için PBS içinde non-iyonik deterjan ile seyreltilmiş 1 ° antikorlar (Tablo reçetesi) eklemek (yaklaşık 30 μL kısmındaki kapak), 1 h RT veya gecede 4 ° C nem odasında için kuluçkaya.
- Slaytları PBS 3 kere 5 min için dolu coplins yıkayın.
- % 1 BSA içinde % 0,3 örnek hidrofobik çember için PBS içinde non-iyonik deterjan ile seyreltilmiş 2 ° antikor ekleyin (yaklaşık 30 μL alanı kapsayacak), RT nem odasında 1 h için kuluçkaya.
- Slaytları PBS 3 kere 5 min için dolu coplin yıkayın.
- O zaman karanlıkta (30 μL) RT, 2-5 min için kuluçkaya DAPI, üreticinin belirtimlerine, % 1 BSA örnek hidrofobik çember için PBS içinde % 0,3 non-iyonik deterjan ile seyreltilmiş ekleyin.
- Slaytları PBS 3 kere 5 min için dolu coplins yıkayın.
- Antifade montaj medya ve coverslip ile slaytlar monte sonra mikroskop altında sonuç görselleştirin.
6. bütün-montajı Organoids immünfloresan boyama için
- Malzemeleri toplamak: odası slayt veya confocal tabak, fosfat tamponlu tuz (PBS), sabitleştirici, 50 mM NH4Cl PBS, PBS, %5 NHS PBS, % 1 BSA PBS, 1 ° ve 2 ° antikorlar % 0,3 non-iyonik deterjan ile %0.1 non-iyonik deterjan ile %0.1 non-iyonik deterjan faiz ve faiz counterstains.
- Dikkatli bir şekilde kadar medya medya ve matris jel arasında boşluk bırakarak iyi tarafına pipetting tarafından organoid kültür aksatmadan mümkün olduğunca çıkarın.
- Kesilmiş, kullanarak ortam veya PBS, önceden ıslak 1.000 μL pipet ucu, bir damla kadar (25-50 μL) faiz organoid(s) içeren matris jel çizmek ve odası slayt iyi veya confocal çanak orta dağıtmak.
Not: % 33 matris jel bir iyilik değil. Tam olarak ayarlı bir jöle benzer işler jelatinli bir sıvıdır. Kesilmiş pipet ucu büyük bir açılış ile kırma transferleri sırasında organoids önleyecektir. - Organoids üst kültür içinde kalırsanız, ortamı sıcak KSFM tabanlı medya ile değiştirin.
- Çıplak gözle veya parçalanmış kapsamı ile ince uçlu pipet (10-200 μL) ile odası slayttan fazla medya ve matris jel Aspire edin.
Not: Pretreat bir bağlılık reaktif odası slaytla isteğe bağlıdır. - Eşit bir birim matris jel odası slaydın boş bir kuyuya autofluorescence artık matris gözlemlemek için isteğe bağlı bir denetimi olarak plaka.
- 30-45 dk cam için uygun ve yıkama adımları sırasında örnekleri kaybını önlemek için organoid teşvik etmek için 37 ° C kuluçka odası slayt yerleştirin.
- Yavaş yavaş pipetting dekolmanı slayttan önlemek, hafifçe sallayarak süre RT organoids 1 x PBS 5 min için 200 μL ile yıkayın.
- 1 x PBS ve hafifçe sallayarak süre düzeltme ile % 4 paraformaldehyde 30 dk az RT için 200 μL kaldırın. Matris jel bu adımdan sonra açık göründüğünden emin olun.
Not: Metanol veya formalin fiksasyon da mümkün. Belirli fiksasyon yöntemlerini crosslink antijenleri ilgi veya floresan-etiketleme-proteinler ilgi yavaşlaması gibi fiksasyon yöntemi için özel antikorlar optimize edilmelidir. - Sabitleştirici kaldırmak ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın.
Not: adımları yıkama uzunluğu organoid boyutuna bağlı olarak optimize edilmelidir. Beş dakika yeterli bir başlangıç noktasıdır, ama çamaşır adım gerektiği gibi uzamış. - Autofluorescence 50 mM NH4Cl 1 x PBS için RT, 30 dk içinde 200 μL ile hafifçe sallayarak süre gidermek.
Not: Bu adımı autofluorescence organoid lümen enkaz ve deneysel tasarım takdim floresan protein ifade (örneğin, GFP) gidermek. Eğer bir fluorophore 488 kanalda kullanmak için istenen ama GFP sinyal korumak için istenirse atlanabilir dahil edilmelidir. - NH4Cl çıkarın ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın.
- Organoids 200 μL %0,1 non-iyonik deterjan-100 1 x PBS için RT, 30 dk içinde hafifçe sallayarak süre permeabilize.
- %0,1 non-iyonik deterjan-100 1 x PBS ve yıkama 1 x PBS 5 min için 200 μL ile iki kez hafifçe sallayarak süre kaldırın.
- 200 μL %0,1 non-iyonik deterjan X-100 PBS ile %5 NHS ile engellemek ve hafifçe sallayarak süre RT, 60 dk için kuluçkaya.
- Engelleme arabellek kaldırmak ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın.
- 1 ° antikor % 0,3 ile % 1 BSA içinde seyreltik Triton X-100 1 x PBS içinde ve odası slayt 200 μL için ekleyin, sonra 1-3 gün 4 ° C'de için kuluçkaya
- 1 ° antikor kaldırmak ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın.
- 2 ° antikor % 0,3 ile % 1 BSA içinde seyreltik Triton X-100 1 x PBS içinde ve odası slayt 200 μL için ekleyin, sonra 1-3 gün içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C'de için kuluçkaya.
Not: Kuluçka kez uzunluğu organoid boyut ve antikor için optimize edilmelidir. Bazı organoid nüfuz için daha fazla zaman gerektirecektir. Antikor konsantrasyon Ayrıca optimize edilmiş olması gerekir. Genel olarak, 2 x FFPE bölümleri için kullanılan toplama 1 ° antikorlar için uygundur ve FFPE bölümler için aynı toplama 2 ° antikorlar için uygundur. - 2 ° antikor kaldırmak ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın.
- Phalloidin ile aktin ve DAPI veya Hoescht, üreticinin önerilerini içinde % 0,3 ile % 1 BSA göre seyreltilmiş çekirdekle counterstain Triton-X 1 x PBS. 200 μL odası slayda ekleyin, sonra karanlıkta 40 min için RT kuluçkaya.
- Taze 1 x PBS veya montaj medya 200 μL Mount ve hemen görüntü (floresan korunmalıdır 5 güne kadar olmasa bile artık bu). Temsilcisi sonuçları Şekil 3 ciçinde gösterilir.
Not: Sodyum azid confocal görüntüleme hazır değilse kontaminasyonu önlemek için örnekleri eklenebilir. Temizleme Aracısı eklemek görüntüleme artırabilirsiniz.
7. bütün-Organoids deneyleri ve floresan problar için montajı
Not: Ticari olarak mevcut deneyleri ve floresan problar/boyalar (örnekler üzerinde malzeme listesi dahildir) vardır yararlı bitiş noktaları19çeşitli gözlemlemek için bütün monte organoids kullanmak için iyileştirilebilir. Herhangi bir kiti bütün monte edilmiş bir örnek ile kullanmak için değiştirilebilir ancak aşağıdaki fluorescently etiketli EdU nükleer silahların yayılmasına karşı kiti için protokoldür.
- Dikkatli bir şekilde medya 50 μL kaldırın ve medya ve matris jel arasında boşluk bırakarak iyi tarafına pipetting tarafından EdU çözüm çalışma x 20 mikron 2 50 μL ile değiştirin.
- 4 ° C'de 1 – 3 gün (EdU birleşme için istenen süreyi seçim hücre türü için optimize edilmelidir) için kuluçkaya.
- 6.2-6,8 bir odası slayt veya confocal çanak üzerine ilgi organoids aktarmak için adımları.
- PBS kaldırmak ve hafifçe sallayarak süre % 3.7 paraformaldehyde RT, 30 dk için 200 μL ile düzeltin. Matrix emin jel bu adımdan sonra açık görünür.
- Sabitleştirici kaldırmak ve iki kez 5 min için 1 x PBS 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın. PBS kaldırın ve hafifçe sallayarak süre 1 x PBS için RT, 30 dk içinde %0,5 non-iyonik deterjan-100 200 μL ekleyin.
- 1 x floresan tepki üreticinin belirtimlerine göre kokteyl hazırlamak.
- %0,5 non-iyonik deterjan-100 kaldırmak ve iki kez 1 x PBS 5 min için % 3 BSA 200 μL hafifçe sallayarak süre yıkayın.
- Reaksiyon kokteyl ekleyin ve RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya.
- Floresan tepki kokteyl ve % 3 BSA 200 μL ile bir kez yıkama 1 x PBS 5 min için hafifçe sallayarak süre kaldırın. Counterstain ve takip ederek bağlama adımları 6,21 – 6.22 (şekil 3D).
Representative Results
İnsan birincil prostat organoids başarılı kültürü, Morfoloji ve farklılaşma alan parlak görüntü analizi ve FFPE ve bütün Dağı boyama teknikleri kullanılarak değerlendirilebilir.
Şekil 1A' alan parlak görüntü yakalama işlemi gösterilmektedir. Organoids 3D dizey içinde büyüdü ve farklı odak uçaklar arasında dağınık. Organoids odak birçok uçak gözlemlemek için EDF görüntüyü (Şekil 1B, sağ) tek bir z-uçağı yerine (1B rakam, sol) kullanmak için önerilmektedir. Laboratuarda, farklı deneysel koşullar altında yetiştirilen organoids morfoloji değişiklikler neden olabilir. Alan, (ne kadar benzer organoid bir daireye tarafından tanımlanır) Döngüsellik ve max/min yarıçap (uzunluk ölçüsü) kullanılması kullanıcılar organoid boyut ve şekilde bir göstergesidir ve morfoloji ölçülebilir bir okuma sağlar. Bu önlemlerin kullanışlılığı vurgulamak için organoids ile benzer alan ama farklı morfoloji temsilcisi görüntüleri hangi uzun bir organoid daha az dairesel ve daha büyük bir maksimum/minimum oranı daha küresel bir Şekil 1 c, gösterilir organoid.
Organoids Histoloji için gömme örnekleri iç gözlemlemek ve bu nekroz bir organoid çekirdek içinde mevcut değil emin olmak için yararlı bir bitiş noktası olur. Bir iş akışı için bu işlem ve alan parlak mikroskop altında günahı, kesitli örneklerinin temsilcisi sonuçları Şekil 2AB, Ctemin edilmektedir. Şekil 3A düzgün göre (solda) mishandled bir organoid organoids Şekil 3A (sağda) ve Şekil 3Bteslim gösterir. Örnek ayırt etme durumunu belirlemek için bazal hücre işaretleri (cytokeratin 5 ve p63)8 luminal hücre işaretleri (cytokeratin 8)8ile birlikte bakmak için önerilir. Organoids leke istenirse in situ, Bütün-mount boyama uygun bir alternatiftir ve temsilcisi bu sonuçları Şekil 3 cö. sağlanır
Şekil 1: organoids 3D kültür morfoloji değerlendirme. (A) resim koleksiyonu ve sıkıştırma iş akışı insan birincil prostat organoids tarafından iletilen bir ışık elde için ters bir motorlu mikroskopla X / Y sahne ve arkadaşı yazılım tarama. (B) temsilcisi görüntüleri tek z-stack (sol) vs. EDF görüntüsünü (sağda) birden çok z yığınlarının tek bir görüntü birleştirildiğinde daha fazla organoids odakta olduğunuzu gösteren insan birincil prostat organoids bütün iyi örneği (ölçek çubuğu = 1000 µm). (C) temsilcisi görüntüler için aynı bölgede olan morfolojik birbirine benzemeyen insan birincil prostat organoids alanı, Döngüsellik ve max/min oranını (ölçek çubuğu 200 µm =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: iş akışı ve sonuçları kesit temsilcisi katılmasını Organoid. (A) insan birincil prostat organoid iş akışı katıştırma. (B) temsilcisi agar (yeşil ok), Histoloji jel (siyah ok), kabarcık (mavi ok), organoids (kırmızı oklar) gösteren bir parlak alan mikroskop altında insan birincil prostat organoids içeren bir günahı, taze slayt görüntüsünü (ölçek çubuğu = 1000 µ m). (C) taze kesilmiş slayt (solda) vsgünahı. günahı kuru slayt (sağda), organoids (kırmızı oklar) saydam ne zaman kuru görünür (ölçek çubuğu = 500 µm) ve alan parlak mikroskop altında ayırt etmek zordur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: histolojik kesitli ve bütün monte organoids üzerinde boyama. (A) (agresif pipetting, yanlış işlem protokolü, sol) (sağ) iyi işlenmiş bir organoid yanında ilgilenmedikleri üzerinden bir kırık insan birincil prostat organoid, H & E boyama (ölçek çubuğu = 100 µm). (B) formalin sabit, parafin-gömülü, olmuştur insan birincil prostat organoid kesitli ve bazal cytokeratin 5 veya luminal cytokeratin ile 8 (üst) veya bazal p63 ve luminal cytokeratin 8 (alt) lekeli ve yansıma confocal mikroskop () ile ölçek çubuğu = 100 µm). (C) bir bütün monte edilmiş insan birincil prostat organoid bazal cytokeratin 5 veya luminal cytokeratin 8 ile lekeli ve phalloidin ve confocal mikroskopla görüntüsü DAPI, counterstained (ölçek çubuğu = 100 µm). (D) ile fluorescently lekeli bir insan birincil prostat hücre bütün monte organoid EdU etiketli ve karşı Hoescht, confocal mikroskopla görüntüsü ile lekeli (ölçek çubuğu 500 µm =) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Organotypic kültür dokusu vitro ortamda kolaylığı ile recapitulating bir heyecan verici yeni yöntemdir. Şu anda, labs organoids çeşitli bitiş noktası için dokuların birçok türlerinden büyümek. Bu makalede açıklanan yöntemler yararlı bitiş noktaları özetlemek ve tam 3D birincil prostat hücre kültürleri karakterize etmek için yeni teknikler vurgulamak.
İnsan birincil prostat hücre organoids5,6,13yetiştirilmesi için medya tarifleri çeşitli vardır. Tüm geçerli ve benzer sonuçlar elde ederken, KSFM tabanlı medya13 açıklanan bu yüzden en az katkı maddeleri burada kullanır. Ayrıca, kağıtları matris jel, kültür prostat organoids5,6,13%75 %10 için birden fazla konsantrasyonları kullanarak yayınlanmıştır. Çünkü matris jel pahalı bir reaktif ve % 33 matris jel uzun vadeli (2-3 hafta), yetiştirmek için yeterli olmak gösterildiği uygun, unclumped organoids13, önerilen konsantrasyon bu. Ancak, matris jel protein konsantrasyonu lot numaraları, bu hesaba ne zaman kaplama alınması gereken bu yüzden arasında değişebilir. Ayrıca birçok tutarsızlık azaltmak için birden fazla deneyler arasında matris jel kullanım için toplu olarak satın almak için tavsiye edilir. Diğer labs bir 96-şey plaka iyi5kaplama yerine damlacıkları gibi matris jel kaplama için farklı biçimlerde yayımlanmıştır. Her iki yöntem uygun organoids formu ama burada açıklanan biçim hücreleri daha seyrek, kaplama daha büyük organoids13içine hücre genişleme tanıtmak için gösterilen sağlar. Ancak, yoğunluk kaplama hastaya özgü oluşumu verimliliği göre optimize edilmelidir. Matris jel büyüme faktörü düşük, fenol red-alerjik, yüksek konsantrasyon, vbdahil olmak üzere birçok biçimlerinde kullanılabilir. Büyüme faktörü indirgenmiş kültür koşulları tanımlanan ve fenol red ücretsiz GFP hızlı hücrelerle veya z-yığın görüntü yakalama ilgili deneylerde çalışırken önerilir tavsiye edilir. Matris jel hızla oda sıcaklığında katılaşır gibi herhangi bir matris jel kaplama adımları buz gibi kimyasalları ile yapılması önemlidir.
Parlak alan görüntüleme yaygın olarak gözlenen morfolojik fenotipleri incelemek için kullanılır böylece farklı deneysel tedaviler altında yetiştirilen Organoids şekle, değişiklikler neden olabilir. Bununla birlikte, kayıt ve alan veya şekil miktarının iki nedenden dolayı bir meydan okuma olduğunu: 1) seçim önyargı sırasında görüntü yakalama ve uygulama 2) iki boyutlu bir parametre alan gibi üç boyutlu bir örnek. Bir görüntü yakalama rastgele bir alan kayıt ve organoids bu alanda önceden belirlenmiş bir dizi ölçmek için bir stratejidir ama bu önyargı seçimi sırasında oluşturabilirsiniz ve seçili alandaki tüm organoids odakta olmayabilir. Bütün iyi görüntüleme 96-şey Mikroplaka biçimini en iyi duruma getirilmiş tüm organoid nüfus ilgi toplayarak bu örnekleme önyargı ortadan kaldırır. Ancak, el üstünde mikroskop hedefleri bağlı olarak, birden çok alanı toplanacak ve bir bütün-iyi görüntü elde etmek için döşeli gerekebilir. Bazı labs ölçüm alanı tek bir z-uçak12tarif var ancak odak tüm organoids yakalamak için toplamak ve birden çok düzlemin tek bir EDF-görüntü13yığını için önerilir. Bazı durumlarda, bir menisküs matris jel içinde görüntünün içinde vinyet neden olabilir ve arka plan düzeltme yöntemleri görüntü analiz yazılımı kullanmadan uygulanması gerekebilir. Tam ideal organoid boyutu için en uygun ölçüm birimidir; Ancak, bu bile birden çok z-yığın görüntü ile tam olarak elde etmek zordur. Döngüsellik ve maksimum/minimum oranı, gibi diğer yararlı morfolojik boyutları, Bütün iyi EDF yansıma dosyasındaki tüm organoids üzerinden kolayca hesaplanabilir. Birlikte, bu yöntemleri örnekleme önyargı zorlukları aşmak ve 3 boyutlu uzayda 3B nesneleri 2B parametrelerinin ölçüm etkinleştirin.
Formalin fiksasyon ve organoids parafin katıştırma olan Hematoksilen ve eozin (H & E), immunohistokimyasal (IHC) ve immünfloresan (Eğer) görselleştirme ve analiz6,11için, boyama almak için kullanılan genel yöntem 20. ancak, bu tekniği tarif var yayınları gömme işlemi hakkında kapsamlı bilgi eksikliği. Ayrıca, organoids parafin blok içinde bulmak zor olabilir. Bazı labs organoids trypan ile11kesit sırasında konumda yardım için gömme önce mavi önceden leke. Burada açıklanan yöntemi bir histolojik boya kullanımı için kesit verimliliği teşvik için gömme sırasında organoid/Histoloji gelplug yönünü içerir. H & E slaytlar nekroz, nükleer doku ve nükleer silahların yayılmasına karşı incelenmesi kolaylaştırmak ve böylece hücreleri küre sağlıklı olduğundan emin olmak organoid kültür için zorunlu bir bitiş noktası olmalıdır. Bir organoid kültür örnekleri daha iyi benzer vivo içinde hasta doku hücrelerinin heterojen karışımı oluşmaktadır gücüdür. Prostat, örneğin, hücrelerin bazal ve luminal prostat organoids5, 2D eksikliği luminal farklılaşma8' yetiştirilen hücreleri ise mevcut. Organoid farklılaşma değerlendirmek için araştırmacılar CK5 ve p63 gibi bazal işaretleri ve androjen reseptörleri ve CK88gibi luminal işaretleri değerlendirmek önerilir. Diğer deneysel proteinler ilgi de bu boyama teknikleri kullanarak okudu olabilir.
Her ne kadar FFPE bölümler görselleştirme iç bölme ile histolojik yöntemlerle (H & E, Eğer, IHC) ikamet eden hücrelerin olanak sağlar, görüntüleri bölümleri geçmeye sınırlıdır ve organoid şekil gömme işlemi tarafından değişmiş olabilir. Bütün Dağı boyama lekeli ve morfolojik fenotipleri koruyarak ve protein yerelleştirme görüntülerini izin in situ, gözlenen bir organoid sağlar. Bütün montaj bütün doku veya bütün hayvan numuneler, zebra balığı veya fare embriyo gibi leke için kullanılan bir araçtır ve kolayca organoids için uyarlanmıştır. Burada açıklanan tekniği yordam Mahévd tarafından güncellenmiştir Bu bilgi ilk büyüme ve boyama için doğrudan bir odası slaytta gastrointestinal organoids kültürünü ve tüm üst kültür fiksasyonu gerektirir 11. Burada özetlenen yöntem tek bir organoid (veya organoids) devri boyama sırasında odası slayt üzerine ilgi içerir. Bu üst kültür fiksasyonu olmadan devam eden bir deney bütün Dağı analiz bireysel organoids yelpazesi sağlar. Bütün Dağı boyama yaparken, permeabilization ve numune boyunca nüfuz sağlamak birincil ve ikincil antikorları için kuluçka süresi optimize etmek gereklidir (herhangi bir yerde bir veya daha fazla gün sonra önerilir). Bir kez üzerinden confocal mikroskobu görüntüsü, 3D render görselleştirme ve belirli bir protein yerelleştirmesini etkinleştirmek ve olumlu lekeli hücreleri bir örnek mevcut hesaplamak için üretilmektedir. Akış Sitometresi bazal, luminal nüfus ölçmek için yararlı bir bitiş noktası, ya da5,14kök hücreleri. Bunu yapmak için hücreleri matris jel kurtarıldı ve yavaşça boyama için ayrışmış. Kullanıcılar geçerli edebiyat göre ayrılması için uygun işaretleri dikkatle seçmeniz gerekir. İnsan birincil prostat epitel hücreleri için uygun luminal ve bazal işaretleri, sırasıyla5,21CD26 ve CD49f vardır.
Özet olarak, bu protokol insan birincil prostat organoid büyüme, koleksiyon ve deneysel bitiş noktaları ayrıntıları. Not, normalde floresan sonda tabanlı deneyler bakarak yayılması19, apoptozis ve hücre altı organel lekeleri gibi 2D hücreler için istihdam edilen diğer deneyleri çeşitli açıklanan montaj tekniği uygulanır. Ayrıca, burada açıklanan koleksiyonu ve ayrılma yöntemi tek hücreli RNA sıralama18için hazırlık yararlanılabilir. Toplu olarak, bu roman, araştırmacılar optimize etmek ve gelecekte keşfetmek yüksek sadakat bitiş noktaları çeşitli olasılığını gösterir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz yanı sıra doku edinmesinin birincil hücre kültürleri kolaylaştırma için Drs. Michael Abern, Daniel Moreira ve Simone Crivallero, ürolog Dr. Klara Valyi-Nagy ve Alex Susma, UIC Biorespository üyelerini teşekkür ederim. Biz UIC Üroloji hastaların doku araştırma bağış için teşekkür ederim. Bu eser, kısmen, Bakanlığı Savunma prostat kanseri araştırma programı sağlık eşitsizliklerin fikir Ödülü PC121923 (Nonn) ve klinik UIC merkezi ve çeviri bilim Pre-doctoral eğitim için () klinik ve çevirim bilim adamları tarafından finanse edildi PECTS) programı (McCray ve Richards'ı) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nın Ulusal Kanser Enstitüsü, Grant numaraları U54CA202995, U54CA202997 ve U54CA203000 tarafından bilinen Chicago sağlık eşitlik işbirlikçi (Nonn ve Richards'ı). İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri ya da Savunma Bakanlığı resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells of interest | |||
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
| Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
| 5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
| Ice Bucket | |||
| Cell Culture Hood | |||
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
| Centrifuge | |||
| Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
| DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
| Organoids | |||
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
| Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
| Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
| Organoids | |||
| Ice pack | |||
| Masking tape | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Razor blade | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
| HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Pencil | |||
| "Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
| Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
| Container to hold fixative | |||
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water | |||
| Paraffin | Leica | various | |
| Tissue processor | |||
| Embedding workstation | |||
| Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
| Microtome | |||
| Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
| Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
| Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
| ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
| Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
| FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water (DI H2O) | |||
| Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
| Staining dish | IHC World | M900-12B | |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
| Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
| 50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
| Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
| Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
| Organoids | |||
| Ice bucket | |||
| Cell culture hood | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
| Microcentrifuge | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
| Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Cytokeratin 5 Antibody - FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
| Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
| CD49f - Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
| CD26 - PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |
| Flow cytometer |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2. The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).
- Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue. Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).
- Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1. The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (4), 217-240 (2013).
- Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).
- Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids. iScience. , in press (2018).
- Hu, W. -Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
- Peehl, D. M. Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro. Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S. Whole-mount Enteroid Proliferation Staining. Bio-Protocol. 6 (12), (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
