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प्राथमिक संस्कृतिक माउस में ऑक्सीजन की खपत दर का विश्लेषण एक Extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर नवजात Cardiomyocytes

Published: February 13, 2019 doi: 10.3791/59052
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Pharmacology, University of California San Diego, 3Cardiology Section, Department of Medicine, Veterans Administration Healthcare, San Diego

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य कैसे विभिंन कारकों दिल में ऑक्सीजन की खपत को बदल सकते है की जांच करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में माउस नवजात cardiomyocytes का उपयोग करने के लिए वर्णन है ।

Abstract

Mitochondria और ऑक्सीडेटिव चयापचय हृदय की मांसपेशी समारोह को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं । अनुसंधान से पता चला है कि mitochondrial शिथिलता हृदय विफलता में पाया बिगड़ा हृदय समारोह के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान कारक है । इसके विपरीत, दोषपूर्ण mitochondrial समारोह बहाल लाभकारी प्रभाव हो सकता है दिल में असफल हृदय समारोह में सुधार होगा । इसलिए, विनियामक तंत्र का अध्ययन और mitochondrial समारोह के लिए उपंयास नियामकों की पहचान अंतर्दृष्टि जो हृदय रोग के इलाज के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों को विकसित किया जा सकता है प्रदान कर सकता है । यहां, कार्डिएक myocyte mitochondrial श्वसन एक अद्वितीय कोशिका संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर विश्लेषण किया है । सबसे पहले, एक प्रोटोकॉल को तेजी से अलग और संस्कृति उच्च व्यवहार्यता नवजात माउस cardiomyocytes को अनुकूलित किया गया है । फिर, एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप extracellular फ्लक्स विश्लेषक इन cardiomyocytes की ऑक्सीजन की खपत दर का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल के लिए, हम बोने की स्थिति को अनुकूलित और दिखा दिया है कि नवजात माउस cardiomyocytes ऑक्सीजन की खपत दर आसानी से एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक में मूल्यांकन किया जा सकता है । अंत में, हम ध्यान दें कि हमारे प्रोटोकॉल एक बड़ा संस्कृति आकार और अंय अध्ययनों के लिए लागू किया जा सकता है, ऐसे intracellular संकेतन और सिकुड़ा समारोह विश्लेषण के रूप में ।

Introduction

एक सतत कार्डियक सिकुड़ा समारोह को बनाए रखने के लिए, cardiomyocytes को मुख्य रूप से एटीपी1के रूप में सेलुलर ऊर्जा की एक निरंतर आपूर्ति बनाए रखना चाहिए । दिल में, एटीपी के लगभग ९५% mitochondria द्वारा उत्पंन होता है, मुख्य रूप से ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के माध्यम से, दिखा रहा है कि mitochondria कार्डियक फंक्शन2,3में एक महत्वपूर्ण ऊर्जावान भूमिका निभाते हैं । इस धारणा का समर्थन है कि mitochondrial समारोह के dysregulation cardiomyopathy और दिल की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते है4,5। इसके विपरीत, mitochondrial समारोह बहाल करने के लिए असफल दिल6,7के कार्डियक समारोह में सुधार दिखाया गया है । इसलिए, mitochondrial के तंत्र का अध्ययन और cardiomyocytes में mitochondrial समारोह के उपंयास नियामकों की पहचान न केवल हृदय ऊर्जा उत्पादन के यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रकट होगा, लेकिन यह भी अंतर्दृष्टि है कि नेतृत्व करेंगे प्रदान कर सकता है हृदय रोगों के उपचार के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों के विकास के लिए6,8.

पूरे दिल की तुलना में, जो myocytes और गैर myocytes9का एक मिश्रण होता है, cardiomyocyte संस्कृतियों अत्यंत शुद्ध कर रहे हैं, गैर के ंयूनतम संदूषण के साथ दिल से myocytes, जैसे fibroblasts और endothelial10कोशिकाओं । इसके अलावा, नवजात पिल्ले से अलग cardiomyocytes, वयस्क दिल10,11से अलग कोशिकाओं की तुलना में समय की एक छोटी राशि में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या संवर्धन सक्षम बनाता है । सबसे महत्वपूर्ण, प्राथमिक संस्कृति वयस्क माउस cardiomyocytes लघु अस्तित्व समय है (जैसे 24 घंटे) और लंबे समय अंक de-अंतर पर । नवजात माउस cardiomyocytes जीवित है और संस्कृति में 7 दिनों के ऊपर के लिए हेरफेर किया जा सकता है, उंहें दवा यौगिकों और mitochondria के cardiomyocytes10में समारोह पर जीन हेरफेर के प्रभाव के परीक्षण के लिए आदर्श बना । बेशक, वहां वयस्क और नवजात कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण जैविक मतभेद हैं, लेकिन अब नवजात कोशिकाओं की संस्कृति के लिए उपलब्ध अवधि उंहें अध्ययन के कई विभिंन प्रकार के लिए उपयुक्त बनाता है, mitochondrial समारोह के उन सहित ।

तारीख करने के लिए, प्राथमिक कल्चरल नवजात माउस और चूहे cardiomyocytes हृदय में12,13अध्ययन करने के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हाल के वर्षों में, अध्ययन एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक के लिए ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) को मापने और माउस और चूहे नवजात cardiomyocytes14,15में ऑक्सीडेटिव क्षमता का मूल्यांकन करते थे । जबकि चूहों की तुलना में, माउस नवजात cardiomyocytes की कोशिका व्यवहार्यता कम है और अधिक परिवर्तनशीलता16है । इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडलों से कोशिकाओं का अध्ययन करने की क्षमता माउस सेल मॉडल बहुत महत्वपूर्ण बनाता है । यह देखते हुए कि ओसीआर अध्ययन सेल संख्या और बोने की सघनता, एक reproducible के विकास के प्रति संवेदनशील हैं, विश्वसनीय, और सरल प्रोटोकॉल अनुरूप कोशिका उपज और व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

यहां, हम रिपोर्ट एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है कि विकसित किया गया है जो एक ९६-अच्छी तरह से ओसीआर विश्लेषण के लिए प्रारूप extracellular फ्लक्स विश्लेषक के साथ साथ संस्कृतिक माउस नवजात cardiomyocytes का उपयोग करता है । इस प्रोटोकॉल बहुत परख के reproducibility बढ़ जाती है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल न केवल एक उपंयास और ओसीआर विश्लेषण के लिए reproducible विधि प्रदान करता है, लेकिन यह भी अंय प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए एक बड़ा आकार संस्कृति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि जो myofibrillar कार्यों और intracellular अध्ययन की जरूरत हो सकती है संकेत रास्ते ।

विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल एक ९६-अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में अलगाव और नवजात माउस cardiomyocytes की संस्कृति के लिए एक दिन की प्रक्रिया का वर्णन । इसके अलावा, यह एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए प्रक्रिया का वर्णन । उपयोग किए गए सभी समाधान बाँझ या बाँझ फ़िल्टर कर रहे हैं. सभी उपकरण ७५% इथेनॉल द्वारा निष्फल रहे हैं । हम प्रक्रिया के विभिंन भागों के लिए सामग्री की एक मेज प्रदान करते हैं । संवर्धन cardiomyocytes के लिए, सभी प्रक्रियाओं और कदम एक मानक सेल संस्कृति हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल एक कूड़े से नवजात माउस दिल के अलगाव के लिए विकसित की है (लगभग 8-10 पिल्ले) । हालांकि, प्रोटोकॉल भी कई कूड़े से cardiomyocytes अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

नवजात चूहों के साथ काम करने के लिए, पशु देखभाल कार्यक्रमों द्वारा उल्लिखित स्थानीय विश्वविद्यालय/संस्थान के दिशा निर्देशों का संदर्भ लें और एक के संस्थागत और अन्य उपयुक्त नियमों का पालन करें । इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी तरीकों को यूसी सैन डिएगो संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है और संघीय और राज्य विनियमों का पालन करें ।

1. रिएजेंट्स की तैयारी

  1. पूर्व पाचन समाधानके 25 मिलीलीटर तैयार: HBSS (2 Ca के बिना+ और2 मिलीग्राम +) trypsin के साथ पूरक (०.५ मिलीग्राम/एमएल) । एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल और उपयोग जब तक बर्फ पर रखना । प्रयोग के दिन पूर्व पाचन समाधान करें ।
    नोट: यह ca 2 के बिना HBSS का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्णहै+ और 2 मिलीग्राम +, के रूप में ca2 + और2 मिलीग्राम + अलगाव के दौरान myocyte संकुचन और बाद में सेल मौत का कारण होगा ।
  2. collagenase पाचन बफरके 30 मिलीलीटर तैयार: collagenase (०.८ मिलीग्राम/एमएल, लगभग ३५० U/एमएल) HBSS में भंग (बिना Ca2 + और2 मिलीग्राम +) बफर । एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल और उपयोग जब तक बर्फ पर रखना । प्रयोग के दिन पर collagenase पाचन समाधान करें ।
  3. cardiomyocyte संस्कृति मीडिया (ग्रोथ मीडिया)के ५०० मिलीलीटर तैयार: मिश्रण ३७५ एमएल के DMEM, १२५ मिलीलीटर की एम-१९९, हार्स सीरम के 25 मिलीलीटर, और FBS के १२.५ मिलीलीटर । 1% पेनिसिलिन और 1% streptomycin समाधान के साथ पूरक ।
  4. तैयार mitochondrial तनाव परीक्षण मध्यम: DMEM आधारित तनाव परीक्षण मध्यम के २०० मिलीलीटर बनाओ (NaHCO3के बिना DMEM, सामग्री की मेजदेखें) 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 2 मिमी एल glutamine, और 10 मिमी ग्लूकोज, और 2 मिमी Hepes के साथ पूरक ।
    नोट: सोडियम पाइरूवेट, एल-glutamine, ग्लूकोज, और Hepes, filer बाँझ के बिना DMEM के साथ मध्यम के 1 एल बनाओ, और 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर. दूसरे रिएजेंट को जोड़कर परख के दिन तनाव टेस्ट मीडियम तैयार करें । 3 NaHCO बिना DMEM माध्यम का प्रयोग महत्वपूर्ण है ।
  5. उपयोग के दिन पर ७.४ के लिए mitochondrial तनाव परीक्षण मीडिया के पीएच समायोजित करें । उपयोग करने से पहले ३७ ° c करने के लिए गर्म मीडिया ।
  6. तैयार oligomycin: DMSO में 5 मिमी स्टॉक समाधान की 5 मिलीलीटर तैयार करें, २५० µ l aliquots बनाएं और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  7. तैयार FCCP: DMSO में 5 मिमी स्टॉक समाधान की 5 मिलीलीटर तैयार करें, २५० µ l aliquots बनाएं और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  8. तैयार antimycin एक: DMSO में 5 मिमी स्टॉक समाधान की 5 मिलीलीटर तैयार, २५० µ l aliquots बनाने, और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  9. तैयार रोटेनोन: DMSO में 5 मिमी स्टॉक समाधान की 5 मिलीलीटर तैयार करें, २५० µ l aliquots बनाएं और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए सभी रिएजेंट और समाधान तालिका 1में सूचीबद्ध हैं ।

2. फसल और नवजात चूहों से दिल के पूर्व पाचन (1 दिन)

  1. आटोक्लेव कैंची, संदंश, और एक मॉरिया को निष्फल कर दूंगी ।
  2. बांझपन के लिए सेल संस्कृति हुड में सभी चरणों का पालन करें ।
  3. Aliquot 5 HBSS के मिलीलीटर (2 Ca के बिना+,2 मिलीग्राम +) एक अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के प्रत्येक कुआं के लिए; बर्फ पर जगह । 10 सेमी सेल कल्चर डिश में HBSS की 10 मिलीलीटर Aliquot ।
  4. एक ५० मिलीलीटर बाँझ शंकु ट्यूब में trypsin पूर्व पाचन समाधान के 20 मिलीलीटर तैयार करें । बर्फ पर सभी समाधान रखें ।
  5. जल्दी से नवजात शिशु (0 दिन) चूहों नसबंदी के लिए ७०% इथेनॉल समाधान में डुबकी ।
  6. Decapitate पिल्ले संज्ञाहरण के बिना बाँझ कैंची (सीधे) का उपयोग, और फिर छाती गुहा और दिल के लिए पहुँच की अनुमति देने के लिए उरोस्थि साथ खुले सीने. (चित्र 1a)
    नोट: 1) यह P0 नवजात चूहों उच्च कोशिका व्यवहार्यता को प्राप्त करने के लिए उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । 2) इस इच्छामृत्यु विधि के अनुसार नवजात शिशुओं के लिए अनुमति दी है NIH और अमेरिकी पशु चिकित्सा एसोसिएशन के दिशा निर्देशों 17।
  7. एक ठीक कैंची के साथ शरीर से दिल निकालने और बाँझ सेल संस्कृति HBSS युक्त पकवान में तुरंत हस्तांतरण (2 सीए के बिना+,2 मिलीग्राम +) (आंकड़ा 1b).
  8. किसी भी अवशिष्ट फेफड़ों के ऊतकों, बड़ा जहाजों, आदि (और atria, यदि वांछित) निकालें । कोमल आंदोलन का उपयोग कर HBSS समाधान में दिल धो लो ।
  9. 8 टुकड़ों में एक ठीक कैंची के साथ एक दिल में कटौती और संदंश के साथ एक 6 अच्छी तरह से HBSS के साथ सेल संस्कृति प्लेट की अच्छी तरह से सभी दिल के ऊतकों हस्तांतरण (चित्रा 1C और 1 डी) ।
  10. अच्छी तरह से 6 में अच्छी तरह से HBSS से भरा थाली में दिल से स्थानांतरित करके दिल धो लो, एक मॉरिया चंमच (चित्रा 1 डी) का उपयोग कर ।
    नोट: अच्छी तरह से दिलों को स्थानांतरित अच्छी तरह से खून को धोने के लिए पर्याप्त है । चूंकि रक्त एंजाइमी पाचन के साथ हस्तक्षेप यह HBSS के साथ दिल धोने और रक्त को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  11. एक शंकु ट्यूब में एक मॉरिया चंमच के साथ दिलों को हस्तांतरित trypsin के 20 मिलीलीटर (०.५ मिलीग्राम/एमएल) और 4 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के साथ गर्मी (चित्रा 1E) ।

3. तैयार एक ९६-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट (1 दिन)

  1. कोटिंग समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार: ०.५% जिलेटिन युक्त पंजाबियों (उपयोग करने से पहले आटोक्लेव) और 1% fibronectin समाधान । (उदा. 5 मिलीलीटर जिलेटिन सॉल्यूशन प्लस ५० µ l of fibronectin solution)
  2. Aliquot ५० µ कोटिंग समाधान के एक अच्छी तरह से ९६-सेल संस्कृति प्लेट ( सामग्री की तालिकादेखें) के एल में । बुलबुले मौजूद हैं, तो उन्हें एक 20 µ l पिपेट का उपयोग करके निकालें बुलबुले चूसना बाहर.
    नोट: यह कोटिंग समाधान के साथ एक अच्छी तरह से सभी की सतह क्षेत्र को कवर करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. 1 ज या अधिक के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति मशीन में थाली मशीन मैट्रिक्स कोटिंग के सुखाने की अनुमति देने के लिए ।
  4. cardiomyocytes बोने से पहले किसी भी अवशिष्ट कोटिंग समाधान महाप्राण ।

4. एंजाइमी पाचन और कोशिकाओं के चढ़ाना (दिन 1)

  1. एक ३७ ° c पानी स्नान में पूर्व गर्म collagenase पाचन समाधान ।
    नोट: यह कदम है कुशल एंजाइमी पाचन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  2. एक कोशिका संस्कृति हूड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से दिल और पूर्व पाचन समाधान युक्त शंकु ट्यूब ले जाएँ. (चित्रा 1F)
  3. दिलों ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक और एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करके पूर्व पाचन समाधान को दूर करने के लिए (1 के लिए 2 मिलीलीटर के अलगाव मध्यम ट्यूब में रह सकते हैं) ।
  4. HBSS के 10 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें । फिर से HBSS 2-3 बार एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर trypsin बाहर धोने के लिए दिलों को सस्पेंड । महाप्राण HBSS (1 से 2 मिलीलीटर ट्यूब में रह सकता है) ।
  5. दिल के साथ ट्यूब में पूर्व गर्म collagenase पाचन समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें । (चित्रा 1G)
  6. आंदोलन के बिना 10 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी स्नान में दिलों के साथ ट्यूब मशीन (1 पाचन) ।
  7. 1 पाचन के बाद, सेल संस्कृति हूड के लिए ट्यूब ले जाएं । धीरे से triturate दिल फिर से ट्यूब के भीतर दिल सस्पैंड धीरे 10 बार एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करके । यह दिल को फैलाने और कोशिकाओं को हृदय ऊतक से जारी किया जा करने की अनुमति देगा । (चित्रा ज)
    नोट: चूंकि cardiomyocytes नाजुक हैं, कोमल trituration उच्च व्यवहार्यता को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  8. अपच ऊतक सिंक, स्थानांतरण पचा समाधान cardiomyocytes में समृद्ध (लगभग 9-10 मिलीलीटर) एक नया शंकु ट्यूब करने के लिए, और तुरंत collagenase पाचन को रोकने के लिए सेल संस्कृति मीडिया के एक बराबर राशि जोड़ें ।
  9. शेष अपच दिल ऊतक युक्त ट्यूब में collagenase पाचन समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  10. 10 मिनट (2 पाचन) के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में दिल के ऊतकों के साथ ट्यूब मशीन ।
  11. दोहराएँ प्रक्रिया ४.७ और ४.८.
    नोट: अगर अभी भी बहुत अपच ऊतक है, एक और अधिक समय पाचन दोहराने । हालांकि, ज्यादातर मामलों में, दो पचा दिल के ऊतकों से कोशिकाओं के सबसे फैलाने के लिए पर्याप्त हैं ।
  12. एक नए बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एक बाँझ सेल छलनी (१०० µm नायलॉन जाल) प्लेस. सेल की संस्कृति मीडिया के 2-3 मिलीलीटर के साथ पूर्व गीला सेल छलनी और सेल के माध्यम से पास कोशिकाओं-छलनी । सेल संस्कृति मीडिया के 2-3 मिलीलीटर के साथ सेल छलनी कुल्ला । (चित्रा 1I)
  13. शंकु ट्यूब १८० x जी (चित्रा 1J) पर 5 मिनट के लिए cardiomyocytes युक्त केंद्रापसारक । महाप्राण supernatant (चित्र १-१०) है, जो सेल ऊतक मलबे और फिर सेल संस्कृति मीडिया (चित्रा 1L) के 10 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित शामिल होंगे ।
  14. धीरे कोशिकाओं और प्लेट कोशिकाओं पर एक 10 सेमी सेल संस्कृति डिश (कोटिंग के किसी भी प्रकार के बिना प्लास्टिक) और 1 एक सेल संस्कृति मशीन (1 पूर्व चढ़ाना) (1m चित्रा) में एच के लिए मशीन resuspend । यह पूर्व-चढ़ाना कदम गैर-cardiomyocytes, जैसे fibroblasts और endothelial कोशिकाओं, अनकोट सेल-कल्चर डिश का पालन करने की अनुमति देता है ।
    नोट: इस बिंदु पर, cardiomyocytes आम तौर पर एक गोल आकार और खुर्दबीन के नीचे चमकदार दिखाई देते हैं । (चित्रा 1N).
  15. 1 एच मशीन के बाद, धीरे थाली, गैर अनुयाई कोशिकाओं को धो (cardiomyocytes में समृद्ध) 10 सेमी संस्कृति पकवान से, और फिर से कोशिकाओं को सस्पेंड बार एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर पकवान पर सेल संस्कृति माध्यम pipetting । फिर, गैर अनुयाई कोशिकाओं हस्तांतरण (cardiomyocytes में समृद्ध) एक नया 10 सेमी सेल संस्कृति डिश में (किसी भी कोटिंग के बिना प्लास्टिक) और एक सेल संस्कृति मशीन में एक अतिरिक्त 1 एच के लिए मशीन (2 पूर्व चढ़ाना) ।
    नोट: कोशिकाओं है कि गैर लेपित प्लेट को संलग्न मुख्य रूप से गैर cardiomyocytes हैं: fibroblasts और endothelial कोशिकाओं, कि एक खुर्दबीन (चित्रा 1O) के तहत visualized किया जा सकता है ।
  16. 2 पूर्व के बाद चढ़ाना, धीरे प्लेट आंदोलन, 10 सेमी संस्कृति पकवान से गैर अनुयाई कोशिकाओं (cardiomyocytes) धो, तो एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब में cardiomyocytes हस्तांतरण ।

5. एक ९६-खैर सेल संस्कृति प्लेट (1 दिन) में कोशिकाओं और चढ़ाना कोशिकाओं गिनती

  1. किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
  2. प्लेट में एक extracellular मैट्रिक्स लेपित ९६-well सेल संस्कृति प्लेट के बीच एक घनत्व पर 10 – 30 x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से २०० µ l (चित्रा 1P) के एक अंतिम मात्रा में एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करके. वेल्स A1, A12, H1, और पृष्ठभूमि के लिए H12 का उपयोग करें: इन कुओं में अन्य कुओं के रूप में संस्कृति माध्यम के २०० µ एल जोड़ें (कोई कोशिकाओं). एक ३७ डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति मशीन में थाली मशीन ।
    नोट: इस अध्ययन में, ऑक्सीजन की खपत के लिए अलग सेल घनत्व जैसे 10 x 103, 20 x 103, या 30 x 103 कोशिकाओं का उपयोग करके परीक्षण किया गया था/ (चित्र 2a) । इसके अलावा, के रूप में ऊपर, cardiomyocytes तुरंत अलगाव के बाद आम तौर पर एक गोल आकार और खुर्दबीन के नीचे चमकदार दिखाई देते हैं । व्यवहार्य कोशिकाओं को संस्कृति के 16-24 ज के भीतर बाहर समतल होगा ।

6. ऑक्सीजन की खपत एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप Extracellular फ्लक्स विश्लेषक (दिवस 2) का उपयोग परख

नोट: ऑक्सीजन की खपत परख बाहर कोशिकाओं चढ़ाना या बाद में एक दिन के बाद किया जा सकता है । नवजात cardiomyocytes इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 7 दिनों के बाद अलगाव के लिए जीवित रह सकते है कल्चरल ।

  1. हाइड्रेट एक फ्लक्स विश्लेषक सेंसर कारतूस ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए ंयूनतम 3 घंटे, लेकिन आदर्श एक पूरा दिन के लिए, परख से पहले । Calibrant समाधान के २०० µ एल जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) उपयोगिता थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से, सेंसर कारतूस उपयोगिता थाली पर वापस डाल दिया, और सह2 या O2 पूरकता के बिना एक 37 डिग्री सेल्सियस मशीन में मशीन ।
  2. बदलें सेल संस्कृति मीडिया mitochondria तनाव परीक्षण मध्यम से एक घंटे पहले परख करने के लिए । Cardiomyocytes नाजुक हैं । इसलिए, धीरे सेल संस्कृति मीडिया एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करके निकालें और २०० µ एल के साथ कोशिकाओं धो पूर्व गर्म mitochondrial तनाव परीक्षण मीडिया दो बार । दूसरा धोने के बाद, पूर्व के १७५ µ एल गर्म mitochondria तनाव परीक्षण मीडिया और संस्कृति सह2 या हे2 पूरकता के बिना एक 37 डिग्री सेल्सियस मशीन में कोशिकाओं को जोड़ें ।
  3. केंद्रित परीक्षण यौगिकों तैयार करें । mitochondria तनाव परीक्षण के लिए, तैयार ३.० मिलीलीटर प्रत्येक के 16 µ m oligomycin, 9 µ एम FCCP, और 20 µ एम रोटेनोन और 20 µ एम antimycin ए का मिश्रण, सभी mitochondrial तनाव परीक्षण माध्यम में ।
    नोट: वर्णित एकाग्रता पर प्रत्येक यौगिक का परीक्षण किया गया है । हालांकि, एक ही प्रयोगशाला में प्रत्येक यौगिक की एकाग्रता titrating आवश्यक है ।
  4. एक मल्टीचैनल पिपेट (चित्रा 1Q) का उपयोग सेंसर कारतूस के इंजेक्टर बंदरगाहों में प्रत्येक यौगिक के 25 µ एल लोड । मात्रा और अंतिम एकाग्रता तालिका 2में वर्णित हैं ।
  5. extracellular फ्लक्स परख प्रोटोकॉल सेट करें । प्रोग्राम तालिका 3 में वर्णन किया गया है ।
  6. प्रोग्राम प्रारंभ करें । सबसे पहले, अंशांकन (चित्रा 1R) के लिए मशीन में सेंसर कारतूस डाल दिया । परख प्लेट के लिए calibrant बदलें एक बार अंशांकन कदम किया जाता है ।
    नोट: निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, कुओं के समूहों और प्रत्येक यौगिक और बंदरगाह से संकेत मिलता है ।
  7. यदि वांछित, परख के बाद, ध्यान से एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग करके सभी परख माध्यम त्याग और सेल संस्कृति microplate की दुकान-20 ° c भविष्य कोशिका सामांय प्रोटीन परख का उपयोग करने के लिए ।
  8. प्रोटीन सामग्री को मापने । मानक RIPA सेल lysis समाधान के ५० µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) । पूरी तरह से लाइसे कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए बर्फ पर थाली मशीन । एक नया स्पष्ट फ्लैट नीचे ९६ अच्छी तरह से परख प्लेट सभी सामग्री स्थानांतरण ।
  9. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार बीसीए परख द्वारा उपाय प्रोटीन एकाग्रता ।
    नोट: एक अच्छी तरह से एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता में extracellular मैट्रिक्स परिणामों के साथ अच्छी तरह से कोटिंग । इसलिए, वास्तविक सेल प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से पृष्ठभूमि (ओं) (कोई कोशिकाओं) की राशि घटाना । कोशिकाओं से व्युत्पंन प्रोटीन एकाग्रता एक ९६-अच्छी संस्कृति की थाली में कम है । इसके अलावा, प्रोटीन एकाग्रता अच्छी तरह से-extracellular मैट्रिक्स कोटिंग के कारण अच्छी तरह से भिंन हो सकते हैं । इसलिए, ओसीआर को सामान्य करने के लिए कक्ष संख्या का उपयोग सुझाया गया है.

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, दिल 0 नवजात पिल्ले दिन से अलग थे । 5 x 105 कोशिकाओं/पिल्ला प्राप्त किया गया था, और cardiomyocytes 10 x 10 3, 20 x103, या 30 x 103 कोशिकाओं के घनत्व में वरीयता दी गई/खैर, ९६ में अच्छी तरह से प्लेट्स (चित्रा 2a) । रात भर संस्कृति के बाद, cardiomyocytes अच्छी तरह से लेपित प्लास्टिक की सतह से जुड़े पाया गया और वहां बहुत कुछ थे unattacheded कोशिकाओं (unattacheded कोशिकाओं को अभी भी दौर और चमकदार के रूप में दिखाई देगा, के रूप में स्वस्थ, संलग्न कोशिकाओं जो spreadout है की तुलना में) ( चित्र 2a और ख) । इस बिंदु पर, अनायास करार cardiomyocytes आसानी से दिखाई दे रहे थे । एक बीज के घनत्व के 30 x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से दिखाया संगम के रूप में बीज बोने के बाद एक दिन कोशिकाओं फैल गया । दौर (मृत) कोशिकाओं की संख्या के रूप में बहुत कम थे, इन परिणामों से पता चला कि प्रोटोकॉल cardiomyocytes के उच्च कोशिका व्यवहार्यता देता है । Cardiomyocytes इस बयान के सबूत के रूप में sarcomeric α-actinin, एक cardiomyocyte विशिष्ट मार्कर18 के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ immunostained थे । जैसा चित्र 2cमें दिखाया गया है, अधिकांश कक्षों में cardiomyocyte अलगाव की उच्च शुद्धता दिखाने वाले α-actinin के सकारात्मक दाग दिखाई दिए.

एक ठेठ mitochondrial तनाव परीक्षण की एक योजना चित्रा 3में दिखाया गया है । mitochondrial तनाव परीक्षण ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) की एक आधारभूत माप के साथ शुरू होता है । यह oligomycin के इंजेक्शन द्वारा पीछा किया जाता है, जो ATPase को रोकता है । पहले और बाद oligomycin इंजेक्शन अंतर एटीपी उत्पादन से जुड़े ओसीआर से पता चलता है । फिर, uncouplन एजेंट FCCP के लिए अधिकतम ऑक्सीजन खपत दर को मापने के लिए इंजेक्शन था । स्पेयर श्वसन क्षमता बेसल और अधिक से अधिक ओसीआर के बीच अंतर के रूप में गणना की जा सकती है । अंत में, दो इलेक्ट्रॉन परिवहन परिसर अवरोधकों के इंजेक्शन के साथ (antimycin एक और रोटेनोन), mitochondrial श्वसन पूरी तरह से बंद हो जाता है, और ओसीआर अपने निम्नतम स्तर तक घट जाती है. mitochondrial गतिविधि को अवरुद्ध करके, इस स्तर पर, ऑक्सीजन की खपत गैर mitochondrial है । बेसल श्वसन, प्रोटॉन रिसाव, और अधिक से अधिक श्वसन गैर के बीच अंतर के रूप में गणना की जा सकती है mitochondrial श्वसन (antimycin की उपस्थिति में ओसीआर एक और रोटेनोन) और आधारभूत माप, oligomycin की उपस्थिति में ओसीआर, और ओसीआर में FCCP की उपस्थिति, क्रमशः ।

इस अध्ययन में, ओसीआर विश्लेषण एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप extracellular फ्लक्स विश्लेषक प्रणाली एक दिन के बाद सेल अलगाव का उपयोग किया गया था । इसके अलावा, ओसीआर पर सीरम भुखमरी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, तीन घंटे पहले परख करने के लिए, सेल संस्कृति मीडिया सीरम के साथ नियमित रूप से सेल संस्कृति विकास मीडिया के लिए बदल रहे थे, या सीरम के बिना. चलाने के बाद, एक अच्छी तरह के लिए 12 तक ओसीआर माप डेटा 1, रिकॉर्ड रखने और आगे विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए निर्यात किया गया । चयापचय विशेषताओं निम्नानुसार निर्धारित किया गया:
गैर mitochondrial श्वसन = औसत ओसीआर (10, 11, 12)
बेसल श्वसन = औसत ओसीआर (1, 2, 3)-औसत ओसीआर (10, 11, 12)
एटीपी उत्पादन = औसत ओसीआर (1, 2, 3)-औसत ओसीआर (4, 5, 6)
प्रोटॉन रिसाव = औसत ओसीआर (4, 5, 6)-औसत ओसीआर (10, 11, 12)
अधिकतम श्वसन = औसत ओसीआर (7, 8, 9)-औसत ओसीआर (10, 11, 12)

के रूप में चित्रा 4aमें दिखाया गया है, ओसीआर मूल्यों आसानी से विश्लेषण किया गया, और इंजेक्शन यौगिकों के प्रभाव भी स्पष्ट थे. महत्वपूर्ण बात, अच्छी तरह से भिंनता के रूप में मानक त्रुटि से दिखाया छोटा था । सेल संख्या में वृद्धि आधारभूत माप, Oligomycin, और FCCP-इलाज श्वसन के परिणामस्वरूप । सीरम भूखे कोशिकाओं की तुलना में, ओसीआर कोशिकाओं में अधिक था विश्लेषण किया है कि विकास मीडिया के साथ किया गया था । चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, ओसीआर बेसल श्वसन के रूप में दिखाया गया है, प्रोटॉन रिसाव (Oligo), और अधिकतम श्वसन (FCCP) प्रति 1 x 104 कोशिकाओं. प्रति ओसीआर 10 x 103 कोशिकाओं 20K और 30K कोशिकाओं के घनत्व बोने में अधिक था/अच्छी तरह से है कि 10k कोशिकाओं की तुलना में/ के रूप में चित्रा 4cमें दिखाया गया है, बेसल श्वसन के सापेक्ष ओसीआर व्यक्त करके, प्रोटॉन रिसाव (Oligo) और अधिक से अधिक (FCCP) के सापेक्ष ओसीआर वृद्धि मीडिया और सीरम भूखे समूहों के बीच समान मान दिखाएँ । इन परिणामों का सुझाव है कि बीज का घनत्व सापेक्ष प्रोटॉन रिसाव और अधिक से अधिक ऑक्सीडेटिव क्षमता को प्रभावित नहीं करता है ।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, माउस नवजात cardiomyocytes के उत्कृष्ट पैदावार सफलतापूर्वक अलग थे और संस्कृति । ओसीआर एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक में इन myocytes का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है । परिणाम भी पता चलता है कि बीज घनत्व काफी सेल संख्या द्वारा गणना ओसीआर को प्रभावित नहीं करता है । हालांकि, अल्पावधि (3 एच) सीरम भुखमरी घट जाती है ओसीआर । जानकारी विभिंन प्रायोगिक शर्तों के साथ माउस नवजात cardiomyocytes ओसीआर परीक्षण के लिए उपयोगी है ।

Figure 1
चित्रा 1: अलगाव और नवजात cardiomyocytes के संस्कृति दिन से 0 नवजात चूहे । (क) नवजात शिशुओं euthanized हैं, और छाती से हृदय विदारक है. (ख) दिल HBSS में धोया जाता है (बिना सीए2 +,2 मिलीग्राम +) । (ग) प्रत्येक हृदय को ८ टुकड़ों में काट लिया जाता है. (घ) दिल HBSS से भरे 6-वेल प्लेट में चले जाते हैं । दिल एक मॉरिया चंमच का उपयोग करने के लिए उंहें अच्छी तरह से अच्छी तरह से स्थानांतरण से धोया जाता है । (ङ) दिल कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर Trypsin-HBSS में पूर्व पचा रहे हैं । (च) 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच की मशीन के बाद अपच दिल ऊतक । (छ) हृदय के ऊतकों को 10 मिनट collagenase पाचन के बाद । (ज) Collagenase पच हृदय के ऊतकों को triturated हैं. (I) पृथक cardiomyocytes एक सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर किया गया । (जंमू) Cardiomyocytes द्वारा गोली कर रहे है केंद्रापसारक । (क) Collagenase और संस्कृति मीडिया आकांक्षा द्वारा निकाली जाती हैं. (ठ) Cardiomyocytes को ताजा संस्कृति माध्यम में पुनः निलंबित कर दिया गया है. (एम) Cardiomyocytes के लिए एक 10 सेमी प्लास्टिक डिश में प्री-चढ़ाना के लिए कल्चरल हैं । (N) cardiomyocytes की एक प्रतिनिधि छवि (दौर और चमकदार कोशिकाओं) 1 के बाद पूर्व चढ़ाना के ज । (ओ) पूर्व चढ़ाना और फिर गैर अनुयाई cardiomyocytes को हटाने के बाद, आम तौर पर fibroblasts और endothelial कोशिकाओं है कि शेष कोशिकाओं दिखाई दे रहे हैं । (पी) एक ९६-अच्छी तरह से थाली में cardiomyocytes चढ़ाना । (क्यू) सेंसर कारतूस के इंजेक्शन बंदरगाहों में एजेंट लोड हो रहा है । (नि.) एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक मशीन में सेंसर कारतूस डाल । स्केल बार = ०.१ mm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: extracellular फ्लक्स विश्लेषक ९६ पर cardiomyocytes की संस्कृति-अच्छी तरह से थाली । (क) ९६ में cardiomyocytes के प्रतिनिधि छवियों-अच्छी तरह से संकेत दिया सेल घनत्व के साथ प्लेटें, बोने के तुरंत बाद (ऊपरी पंक्ति) या 18 एच पोस्ट सीडिंग (निचली पंक्ति) । (ख) 10 x 103 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व पर cardiomyocytes 18 एच पोस्ट सीडिंग की एक उच्च आवर्धन छवि/ (ग) Cardiomyocytes विरोधी sarcomeric α-actinin एंटीबॉडी (हरा) और DAPI (एक परमाणु दाग के रूप में) (नीला) के साथ दाग थे । स्केल बार = ०.१ mm । immunostaining के लिए इस्तेमाल किया तरीकों हमारे पिछले प्रकाशन18में पाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. mitochondrial तनाव परीक्षण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । बेसल, एटीपी से जुड़े, अधिक से अधिक, और गैर mitochondrial श्वसन के रूप में अच्छी तरह से अतिरिक्त श्वसन क्षमता और प्रोटॉन रिसाव सहित, ऊर्जावान मापदंडों, इसी mitochondrial प्रभाव के साथ ट्रेस पर उल्लिखित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Mitochondrial तनाव परख । (ए) नवजात माउस cardiomyocytes के pMoles/मिनट में ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर,) के प्रतिनिधि अनुरेखण । संकेत समय पर, oligomycin (Oligo, 1 µ एम), FCCP (८०० एनएम), और RAA (रोटेनोन और antimycin एक, 1 µ मीटर प्रत्येक) इंजेक्शन थे । प्रत्येक माप के लिए, मतलब है और 10 व्यक्तिगत कुओं का मतलब (SEM) के मानक त्रुटि प्रस्तुत की है । (ख) ओसीआर बेसल श्वसन, Oligo (प्रोटॉन रिसाव), और 10 x 103 कोशिकाओं के प्रति FCCP (अधिकतम श्वसन) के रूप में गणना की है । (ग) ओसीआर बेसल श्वसन के सापेक्ष व्यक्त किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

रिएजेंट और समाधान का नाम तैयारी नोट्स
Trypsin पूर्व पाचन समाधान HBSS (बिना Ca2 + और Mg2 +) में trypsin भंग । अंतिम एकाग्रता 0.5 मिलीग्राम/एमएल है । एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल और उपयोग जब तक बर्फ पर रखना । प्रयोग के दिन पूर्व पाचन समाधान करें ।
Collagenase पाचन समाधान HBSS (बिना Ca2 + और Mg2 +) में trypsin भंग । अंतिम एकाग्रता 0.5 मिलीग्राम/एमएल है । एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल और उपयोग जब तक बर्फ पर रखना । प्रयोग के दिन पर collagenase पाचन समाधान करें ।
Cardiomyocyte कल्चर मीडिया DMEM के ३७५ मिलीलीटर, एम के १२५ एमएल-१९९, घोड़ा सीरम के 25 मिलीलीटर, और FBS के १२.५ मिलीलीटर मिलाएं । 1% पेनिसिलिन और 1% streptomycin समाधान के साथ पूरक । Cardiomyocyte संस्कृति मीडिया प्रयोग करने से पहले किया जा सकता है और एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना है ।
Mitochondrial ताण चाचणी मध्यम सबसे पहले, किसी भी सोडियम पाइरूवेट, एल-glutamine, ग्लूकोज, और Hepes के बिना DMEM के साथ मध्यम के 1 एल बनाओ, निष्फल करने के लिए फिल्टर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान. परख के दिन, सोडियम पाइरूवेट, एल glutamine, ग्लूकोज, और Hepes जोड़ें । उपयोग करने से पहले ७.४ के लिए पीएच समायोजित (नसबंदी की आवश्यकता नहीं है). अंतिम खुराक के लिए एकाग्रता का पालन कर रहे हैं: सोडियम पाइरूवेट (1 मिमी), एल-glutamine (2 मिमी), ग्लूकोज (10 मिमी), और Hepes (2 मिमी)
Oligomycin शेयर DMSO में oligomycin भंग । सबसे पहले, शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार करते हैं । एक बार oligomycin पूरी तरह से DMSO में भंग कर दिया है, २५० µ एल aliquots, स्टोर में-20 डिग्री सेल्सियस बनाओ । परख के दिन, एक aliquot लेने के लिए उपयोग करें । कई फ्रीज-गल चक्र से बचें ।
FCCP शेयर DMSO में FCCP भंग । सबसे पहले, शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार करते हैं । अंतिम एकाग्रता 5 मिमी है । एक बार FCCP पूरी तरह से DMSO में भंग कर दिया है, २५० µ एल aliquots, स्टोर में-20 डिग्री सेल्सियस बनाओ । परख के दिन, एक aliquot लेने के लिए उपयोग करें । कई फ्रीज-गल चक्र से बचें ।
Antimycin एक शेयर भंग antimycin एक मे DMSO । सबसे पहले, शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार करते हैं । अंतिम एकाग्रता 5 मिमी है । एक बार antimycin एक पूरी तरह से DMSO में भंग कर दिया है, बनाने २५० µ एल aliquots, स्टोर पर-20 ° c । परख के दिन, एक aliquot लेने के लिए उपयोग करें । कई फ्रीज-गल चक्र से बचें ।
रोटेनोन शेयर DMSO में रोटेनोन भंग । सबसे पहले, शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार करते हैं । अंतिम एकाग्रता 5 मिमी है । एक बार रोटेनोन पूरी तरह से DMSO में भंग कर दिया है, २५० µ एल aliquots, स्टोर में-20 डिग्री सेल्सियस बनाओ । परख के दिन, एक aliquot लेने के लिए उपयोग करें । कई फ्रीज-गल चक्र से बचें ।
सेल संस्कृति प्लेट कोटिंग समाधान सबसे पहले, ०.५% जिलेटिन समाधान की २०० मिलीलीटर बनाओ । पंजाब और आटोक्लेव में जिलेटिन भंग । प्रयोग के दिन पर, 5 मिलीलीटर जिलेटिन समाधान में fibronectin समाधान के ५० µ एल जोड़ें कोटिंग समाधान करने के लिए । ०.५% जिलेटिन समाधान 2 महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

तालिका 1: रिएजेंट और समाधान ।

इंजेक्शन बंदरगाह यौगिकों और एकाग्रता रन के दौरान इंजेक्शन की मात्रा (µ एल) अंतिम परख में एकाग्रता
ए १६ µ मी oligomycin 25 २ µ मी
बी 9 µ m FCCP 25 1 µ m
सी 20 µ m रोटेनोन (सड़ांध)
और 20 µ m antimycin ए (एए)		 25 २ µ मी प्रत्येकी

तालिका 2: इंजेक्शन मिश्रण ।

कदम और प्रक्रियाओं माप और छोरों
अंशांकन -
Equilibration -
आधारभूत मापन 3 बार: मिश्रण 3 मिनट, 2 मिनट रुको, 3 मिनट उपाय
एक बंदरगाह (Oligomycin) इंजेक्षन -
माप 3 बार: मिश्रण 3 मिनट, 2 मिनट रुको, 3 मिनट उपाय
पोर्ट बी इंजेक्षन (FCCP) -
माप 3 बार: मिश्रण 3 मिनट, 2 मिनट रुको, 3 मिनट उपाय
सुई बंदरगाह सी (RAA) -
माप 3 बार: मिश्रण 3 मिनट, 2 मिनट रुको, 3 मिनट उपाय

तालिका 3: Extracellular फ्लक्स विश्लेषक कार्यक्रम ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम अलग और संवर्धन माउस नवजात cardiomyocytes के लिए एक सरल प्रोटोकॉल की स्थापना की है । इन cardiomyocytes का उपयोग करके, हम भी एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक प्रणाली का उपयोग करके ऑक्सीजन की खपत दर को मापने के लिए शर्तों को अनुकूलित । प्रोटोकॉल एक एक मॉडल प्रणाली के रूप में माउस नवजात cardiomyocytes का उपयोग करने की जांच कैसे विभिंन कारकों दिल की प्रमुख कार्य कोशिकाओं में ऑक्सीजन की खपत में परिवर्तन कर सकते है अनुमति देता है, क्या बरकरार अंग में मापा जाएगा जैसा । हमारे प्रोटोकॉल पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल16,18से अलग है । सबसे पहले, उच्च व्यवहार्यता को प्राप्त करने के लिए, केवल पिल्ले तुरंत जंम के समय (यानी P0) का उपयोग किया जाता है, के बजाय लोगों के दिन शूंय से उंर के तीन दिन (P0 पी 3 पिल्ले के लिए) है, जो सामांयतः अंय16,19में इस्तेमाल किया जाता है प्रोटोकॉल । दूसरा, प्रयोग के समय को कम करने के लिए, दिल केवल पूर्व थे 4 एच के लिए trypsin के साथ पच । इसके अलावा, प्रक्रिया को सरल बनाने और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए, हम कदम की एक ंयूनतम संख्या कार्यरत हैं, के रूप में उल्लिखित । उदाहरण के लिए, हमारे प्रोटोकॉल केवल दो प्रकार के बफ़र्स, पंजाब और HBSS, और केवल एक प्रकार के सेल कल्चर मीडिया का उपयोग करता है, और collagenase पाचन के दौरान आंदोलन को रोजगार नहीं करता है ।

नवजात माउस cardiomyocytes, जो ओसीआर परख के reproducibility के लिए महत्वपूर्ण है की उच्च व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए, वहां कई महत्वपूर्ण अंक हैं । सबसे पहले, P0 नवजात पिल्ले का उपयोग और एक ही दिन पर trypsin पूर्व पाचन और collagenase पाचन प्रदर्शन उच्च व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । दूसरा, collagenase पाचन के दौरान, यह ३७ ° c पानी स्नान में हृदय ऊतक आंदोलन करने के लिए अनुशंसित नहीं है । हालांकि आंदोलन कई प्रोटोकॉल में सुझाव दिया है, हमने पाया यह आवश्यक नहीं है के रूप में P0 दिल आसान कर रहे है collagenase द्वारा पचा सकता है । अंत में, धीरे triturating दिल ऊतक collagenase पाचन के बाद cardiomyocytes अलग कर देना के लिए महत्वपूर्ण है ।

हम भी एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर, P1 और P2 पिल्ला दिल के ऊतकों से myocytes परीक्षण किया है । हालांकि, इन पुराने दिल के नमूनों के लिए, हमने पाया कि पर्याप्त सेल पैदावार प्राप्त करने के लिए trypsin पूर्व पाचन रातोंरात प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है (डेटा दिखाया नहीं) । इसके अलावा, P1 और P2 cardiomyocytes के लिए सेल व्यवहार्यता के आसपास ६०%, कि अंय प्रकाशित अध्ययन में16के समान था । इन परिणामों का सुझाव है कि P0 मायोकार्डियम पुराने दिल से extracellular मैट्रिक्स की अपेक्षाकृत कम मात्रा में है, जो trypsin पूर्व पाचन के लिए कम समय में सक्षम बनाता है, उच्च कोशिका व्यवहार्यता और इन छोटे दिलों से पैदावार में जिसके परिणामस्वरूप ।

Extracellular फ्लक्स (XF) विश्लेषण कोशिकाओं और पृथक mitochondria20,21में ऊर्जावान समारोह को मापने के लिए एक प्रमुख और लोकप्रिय तरीका बन गया है । तारीख करने के लिए, अध्ययन के एक नंबर चूहे नवजात cardiomyocytes और मापा ऑक्सीजन की खपत का इस्तेमाल किया, एक टेक्नोलॉजीज XF24 प्रणाली का उपयोग कर22,23,24 । चूहा कोशिकाओं का विरोध करने के रूप में चूहे व्युत्पंन कोशिकाओं का उपयोग कर इन अध्ययनों, चूहे की कोशिकाओं को आम तौर पर उच्च कोशिका व्यवहार्यता और परख reproducibility के रूप में प्रदर्शन कर रहे थे, माउस कार्डियक myocytes की तुलना में यहां का अध्ययन किया । यह देखते हुए कि आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं को मुख्य रूप से माउस लाइनों, माउस नवजात cardiomyocytes में एक ऊर्जावान समारोह का विश्लेषण के लिए एक सरल और reproducible प्रोटोकॉल में उत्पंन किया गया है, जैसा कि हम इस पांडुलिपि में चर्चा, अध्ययन के अवसर प्रदान करता है माउस कार्डियक myocytes में mitochondrial फ़ंक्शन. इस विधि और अधिक आसानी से डेटा है कि दिल में ऊर्जावान नियमन के लिए नए तंत्र को समझने के लिए नेतृत्व कर सकते है अनुवाद किया जा सकता है, नए या मौजूदा आनुवंशिक रूप से हेरफेर माउस लाइनों25,26का उपयोग करके ।

इस अध्ययन में, हम सेल संख्या और ओसीआर पर घनत्व के प्रभाव का परीक्षण किया । के रूप में चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, ओसीआर 10 x 103, 20 x 103, और 30 x 103 कोशिकाओं के साथ कुओं में मापा/ यह देखते हुए कि चढ़ाना 30 x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक दिन के भीतर बीज बोने के बाद एक धाराप्रवाह का उत्पादन, हम 10 x 103 से 30 x 103 कोशिकाओं के बीच विभाजन कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक ९६-खैर प्लेट में, ओसीआर के लिए परख । दिलचस्प है हम सीरम भुखमरी के 3 एच पाया ओसीआर की कमी हुई । वृद्धि कारकों glycolysis सक्रिय करने के लिए जाना जाता है और ऑक्सीजन की खपत27वृद्धि हुई है । यह भी बताया गया कि विकास कारकों समग्र सेलुलर गतिविधि और cardiomyocytes3,28के संकुचन में वृद्धि । Cardiomyocyte संकुचन की आवश्यकता है एटीपी जनरेशन2, जो ऑक्सीजन की खपत पर निर्भर करता है । इसलिए, इन आंकड़ों का सुझाव है कि सीरम भुखमरी cardiomyocytes की निष्क्रियता के माध्यम से ऑक्सीजन की खपत कम हो जाती है । हम एक ही प्रयोगात्मक सेटिंग में ओसीआर पर सीरम भुखमरी के प्रभाव का परीक्षण करने की सिफारिश करेंगे.

के रूप में उल्लेख किया है, mitochondria दिल समारोह में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इसलिए, उपंयास नियामकों और ऑक्सीडेटिव चयापचय को विनियमित रास्ते की पहचान एक दिल की विफलता के इलाज के लिए उपंयास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने का मतलब प्रदान कर सकता है । के बाद से एक ९६ अच्छी तरह से प्रारूप के लिए परीक्षण की स्थिति की एक बड़ी संख्या में परीक्षण की क्षमता के लिए प्रदान करता है एक 24 अच्छी तरह से प्रारूप की तुलना में, इस प्रोटोकॉल भी आसानी से 29 cardiomyocytes में उपंयास में ऊर्जावान नियामकों की पहचान के लिए एक उच्च प्रवाह स्क्रीन को अनुकूलित किया जा सकता है . इस प्रकार, आनुवंशिक रूप से हेरफेर नवजात cardiomyocytes, ऐसे लोगों कि mitochondrial उत्परिवर्तनों30है के रूप में के साथ हमारे प्रोटोकॉल के संयोजन से, में ओसीआर पर रासायनिक यौगिकों या सीडीएनए पुस्तकालयों के प्रभाव के लिए स्क्रीन दिलचस्प अध्ययन प्रदान कर सकता है जंगली-प्रकार बनाम चयापचय-दोषपूर्ण cardiomyocytes ।

हम जानते है कि नवजात और वयस्क cardiomyocytes कई विभिंन विशेषताओं और चयापचय कार्य31, ग्लूकोज और फैटी एसिड चयापचय एंजाइमों३२की अभिव्यक्ति का स्तर शामिल हैं । इसलिए, आदर्श इन विट्रो में उपयोग करने के लिए बरकरार दिल की एक मॉडल प्रणाली के रूप में cardiomyocytes प्रसंस्कृत, यह आगे के लिए एक प्रोटोकॉल को कुशलतापूर्वक वयस्क cardiomyocytes में ओसीआर का विश्लेषण विकसित महत्वपूर्ण होगा, ताकि एक अपने ऑक्सीडेटिव क्षमता की तुलना कर सकते है और नवजात cardiomyocytes के साथ लक्षण । भविष्य के अध्ययन के लिए एक reproducible वयस्क कार्डिएक myocytes का उपयोग कर प्रणाली के लिए इस पद्धति के अनुकूलन के लिए आगे बढ़ाने की आवश्यकता होगी ।

संक्षेप में, हम प्राथमिक संस्कृति माउस नवजात माउस cardiomyocytes का उपयोग ऑक्सीजन की खपत का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और reproducible प्रोटोकॉल दिखाते हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम सफलतापूर्वक अलग और संस्कृति माउस नवजात cardiomyocytes और इस ओसीआर एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप extracellular फ्लक्स विश्लेषक प्रणाली का उपयोग परख प्रदर्शन कर सकता है । हमारे प्रोटोकॉल उच्च व्यवहार्यता और महत्वपूर्ण बात, लगातार reproducible परिणाम देता है । हालांकि वर्तमान अध्ययन मुख्य रूप से ऑक्सीजन की खपत और एक mitochondrial तनाव परीक्षण पर ध्यान केंद्रित है, प्रोटोकॉल आसानी से cardiomyocytes में फैटी एसिड ऑक्सीकरण और glycolysis का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम सभी रॉस लैब और मर्फी लैब के सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा । यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (14SDG17790005) द्वारा Y.C. NIH (HL115933, HL127806) और VA मेरिट (BX003260) को R.S.R. करने के लिए समर्थित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antimycin A SIGMA A8674 Inhibits complex III of the mitochondria
Cell strainer 100 μm pores FALCON 352360 To capture undigested tissue
Collagenase type II Worthington LS004176 To make collagenase digestion solution
D-Glucose SIGMA 75351 To make mitochodnrial stress test medium
DMEM high glucose Life technologies 11965-092 To make cell culture medium
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes SIGMA D5030-10X1L To make mitochodnrial stress test medium
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) SIGMA C2920 Uncouples mitochondrial respiration
Fetal bovine serum (FBS) Life technologies 26140-079 To make cell culture medium
Fibronectin from bovine plasma SIGMA F1141-5MG To make coating solution for tissue culture plates
Fine scissors Fine Sciences Tools 14060-10 For dissection of hearts
Gelatin from porcine skin SIGMA G-1890 To make coating solution for tissue culture plates
HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) Cellgro 21-022-CV To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution
HEPES (1 M) Fisher scientific 15630080 To make mitochodnrial stress test medium
Horse serum Life technologies 26050-088 To make cell culture medium
L-Glutamine SIGMA G-3126 To make mitochodnrial stress test medium
M-199 Cellgro 10-060-CV To make cell culture medium
Moria spoon Fisher scientific NC9190356 To wash hearts 
Oligomycin SIGMA 75351-5MG Inhibits mitochondrial ATP synthase
RIPA buffer Fisher scientific 89900 To lyse the cells for protein assay
Rotenone SIGMA R8875 Inhibits complex I of the mitochondria
Seahorse XFe96 Extracellular Flux
Analyzer		 Agilent Device used to analyze oxygen consumption rate
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant
Sodium pyruvate SIGMA P2256 To make mitochodnrial stress test medium
Straight scissors Fine Sciences Tools 91401-12 For dissection of hearts
Syringe filter 0.2 μm size For sterile filtration of digestion medium
Trypsin USB Corporation 22715 25GM To make pre-digestion solution

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References

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चिकित्सा मुद्दा १४४ माउस नवजात cardiomyocytes ऑक्सीजन की खपत extracellular फ्लक्स विश्लेषक श्वसन mitochondria दिल
प्राथमिक संस्कृतिक माउस में ऑक्सीजन की खपत दर का विश्लेषण एक Extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर नवजात Cardiomyocytes
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Tachibana, S., Chen, C., Zhang, O. R., Schurr, S. V., Hill, C., Li, R., Manso, A. M., Zhang, J., Andreyev, A., Murphy, A. N., Ross, R. S., Cho, Y. Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer. J. Vis. Exp. (144), e59052, doi:10.3791/59052 (2019).

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