Summary
L'obiettivo del presente protocollo è quello di illustrare come utilizzare cardiomiociti neonatali del mouse come sistema modello per esaminare come i vari fattori possono alterare il consumo di ossigeno nel cuore.
Abstract
Mitocondri e metabolismo ossidativo sono fondamentali per mantenere la funzione del muscolo cardiaco. La ricerca ha dimostrato che la disfunzione mitocondriale è un fattore importante che contribuisce alla funzione cardiaca alterata trovato nello scompenso cardiaco. Al contrario, ristabilimento della funzione mitocondriale difettosa può avere effetti benefici per migliorare la funzione cardiaca nel cuore di venire a mancare. Pertanto, lo studio dei meccanismi di regolamentazione e identificando nuovi regolatori per la funzione mitocondriale potrebbe fornire insight che potrebbero essere usate per sviluppare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento di malattie cardiache. Qui, la respirazione mitocondriale cardiaca del miocita è analizzata utilizzando un sistema di coltura cellulare unico. In primo luogo, un protocollo è stato ottimizzato per isolare rapidamente e cardiomiociti neonatali del mouse ad alta redditività della coltura. Quindi, un analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti viene utilizzato per valutare il tasso di consumo di ossigeno di questi cardiomiociti. Per questo protocollo, abbiamo ottimizzato le condizioni di semina ed abbiamo dimostrato che tasso di consumo ossigeno cardiomiociti neonatali del mouse può essere facilmente valutata in un analizzatore di flusso extracellulare. Infine, notiamo che il nostro protocollo può essere applicato a una dimensione maggiore di cultura e altri studi, come ad esempio la segnalazione intracellulare e contrattile funzionano analisi.
Introduction
Per sostenere una continua funzione contrattile cardiaca, cardiomiociti devono mantenere una fornitura costante di energia cellulare principalmente sotto forma di ATP1. Nel cuore, circa il 95% del trifosfato di adenosina è generato dai mitocondri, principalmente attraverso la fosforilazione ossidativa, mostrando che i mitocondri svolgono un ruolo cruciale di bioenergetico nella funzione cardiaca2,3. Sostenere questa nozione è che disregolazione della funzione mitocondriale può condurre a cardiomiopatia e insufficienza cardiaca4,5. Al contrario, ripristinare la funzione mitocondriale è stato indicato per migliorare la funzione cardiaca di failover cuore6,7. Pertanto, studiando il meccanismo della bioenergetica mitocondriale e identificando nuovi regolatori della funzione mitocondriale in cardiomiociti non rivelerà solo intuizioni meccanicistiche della produzione di energia cardiaca ma anche potrebbe fornire la comprensione che porterà allo sviluppo di nuovi bersagli terapeutici per il trattamento di malattie di cuore6,8.
Rispetto a tutto il cuore, che contiene una miscela di miociti e non miociti9, culture dei cardiomiociti sono estremamente puro, con contaminazione minima del non-miociti dal cuore, come fibroblasti e cellule endoteliali10. Inoltre, isolando cardiomiociti da cuccioli neonatali consente la coltura di un gran numero di cellule in una piccola quantità di tempo, rispetto alle celle d'isolamento dal cuore adulto10,11. La cosa più importante, cardiomiociti coltivati primari del topo adulto hanno breve sopravvivenza volte (es. 24 ore) e a più lungo tempo punti de-differenziano. Cardiomiociti neonatali del mouse possono sopravvivere ed essere manipolati per più di 7 giorni nella cultura, che li rende ideali per testare gli effetti della droga composti e manipolazione del gene sulla funzione dei mitocondri in cardiomiociti10. Naturalmente, ci sono significative differenze biologiche tra le cellule adulte e neonatali, ma la durata più lunga disponibile per la coltura di cellule neonatali li rende adatti a diversi tipi di studi, compresi quelli della funzione mitocondriale.
Ad oggi, cardiomyocytes neonatali coltivati primario di topo e di ratto sono stati utilizzati come modelli per lo studio cardiaco bioenergetica12,13. Negli ultimi anni, studi utilizzato un analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e valutare la capacità ossidativa nel topo e nel ratto cardiomiociti neonatali14,15. Mentre rispetto ai ratti, l'attuabilità delle cellule di cardiomiociti neonatali del mouse è più basso e ha una maggiore variabilità16. Inoltre, la possibilità di studiare le cellule da modelli murini geneticamente rende il modello di cella del mouse molto importante. Dato che gli studi OCR sono così sensibili alla cella numero e densità di semina, è necessario lo sviluppo di un protocollo riproducibile, affidabile e semplice per raggiungere la redditività e il rendimento delle celle coerente.
Qui, segnaliamo un protocollo ottimizzato che è stato sviluppato che utilizza cardiomyocytes neonatali coltivati del topo con un analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti per analisi OCR. Questo protocollo aumenta notevolmente la riproducibilità del test. Inoltre, il protocollo non solo fornisce un romanzo e un metodo riproducibile per analisi OCR, ma anche può essere adattato ad una cultura di dimensioni più grande per altri scopi sperimentali, come quello che potrebbe essere necessario per studiare funzioni miofibrillare e intracellulare vie di segnalazione.
In particolare, il presente protocollo descrive una procedura di un giorno di isolamento e coltura dei cardiomiociti neonatali del mouse in una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti. Inoltre, descrive la procedura per misurare il consumo di ossigeno utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Tutte le soluzioni utilizzate sono sterili o filtrato sterile. Tutti gli strumenti sono sterilizzati con etanolo al 75%. Forniamo una Tabella materiali per le varie parti della procedura. Per la coltura di cardiomiociti, tutte le procedure e i passaggi vengono eseguiti in una cappa di cultura cellulare standard. Questo protocollo è sviluppato per l'isolamento dei cuori neonatali del mouse da una cucciolata (circa 8-10 cuccioli). Tuttavia, il protocollo può anche essere adattato per isolare i cardiomiociti da cucciolate più.
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Protocol
Per il lavoro con topi neonatali, fare riferimento al set di linee guida locale Università/Istituto indietro dai programmi di cura degli animali e aderire a di uno istituzionali e altri regolamenti appropriati. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal UC San Diego istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) e rispettano i regolamenti federali e statali.
1. preparazione dei reagenti
- Preparare 25 mL della soluzione di pre-digestione: HBSS (senza Ca2 + e Mg2 +) completati con tripsina (0,5 mg/mL). Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 µm e tenere il ghiaccio fino all'utilizzo. Fare pre-digestione soluzione il giorno dell'esperimento.
Nota: È fondamentale utilizzare HBSS senza Ca2 + e Mg2 +, come Ca2 + e Mg2 + provocherà la contrazione del miocita e morte successiva delle cellule durante l'isolamento. - Preparare 30 mL di buffer di digestione della collagenosi: collagenasi (0,8 mg/mL, circa 350 U/mL) disciolto nel buffer di HBSS (senza Ca2 + e Mg2 +). Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 µm e tenere il ghiaccio fino all'utilizzo. Il giorno dell'esperimento effettuare soluzione digestione della collagenosi.
- Preparare 500 mL di cardiomyocyte terreni di coltura (coltura): mescolare 375 mL di DMEM, 125 mL di M-199, 25 mL di siero equino e 12,5 mL di FBS. Supplemento con penicillina 1% e 1% soluzione di streptomicina.
- Preparare il supporto mitocondriale stress test: fare 200 mL di DMEM basato stress test medium (DMEM senza NaHCO3, Vedi Tabella materiali) completate con piruvato di sodio di 1 mM, 2 mM L-Glutammina e glucosio di 10 mM e 2 mM Hepes.
Nota: Fare 1 L del mezzo con DMEM senza sodio piruvato, L-Glutammina, glucosio e Hepes, filer sterile e conservare a 4 ° C. Preparare il supporto di test di stress il giorno del test con l'aggiunta di altri reagenti. Utilizzando DMEM medio senza NaHCO3 è importante. - Regolare il pH dei mitocondriale stress test media 7.4 il giorno di utilizzo. Media calda a 37 ° C prima dell'uso.
- Preparare oligomycin: preparare 5 mL di una soluzione di riserva di 5 mM in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l e conservare a-20 ° C.
- Preparare FCCP: preparare 5 mL di una soluzione di riserva di 5 mM in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l e conservare a-20 ° C.
- Preparare antimycin A: preparare 5 mL di una soluzione di riserva di 5 mM in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l e conservare a-20 ° C.
- Preparare il rotenone: preparare 5 mL di una soluzione di riserva di 5 mM in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l e conservare a-20 ° C.
Nota: Tutti i reagenti e le soluzioni utilizzate in questo protocollo sono elencati nella tabella 1.
2. raccolta e pre-digestione dei cuori dai topi neonatali (giorno 1)
- Autoclave forbici, pinze e un cucchiaio di Moria per sterilizzare.
- Eseguire tutti i passaggi della cappa di cultura delle cellule per la sterilità.
- Aliquotare 5ml di HBSS (senza Ca2 +, Mg2 +) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura delle cellule 6 pozzetti; mettere sul ghiaccio. Aliquotare 10 mL di HBSS in una piastra di coltura delle cellule di 10 cm.
- Preparare 20 mL della soluzione di pre-digestione della tripsina in una provetta conica sterile 50 mL. Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio.
- Immergere rapidamente topi neonati (giorno 0) in soluzione di etanolo 70% per la sterilizzazione.
- Decapitare cuccioli utilizzando forbici sterili (dritto) senza anestesia e quindi aprire il torace lungo lo sterno per consentire l'accesso alla cavità toracica e il cuore. (Figura 1A)
Nota: 1) è fondamentale utilizzare topi neonatali P0 per ottenere alta attuabilità. 2) questo metodo di eutanasia è consentito per i neonati in conformità con le linee guida NIH e associazione medica veterinaria americana 17. - Estrarre i cuori dal corpo con una forbice e trasferire immediatamente nella piastra di coltura sterile cella contenente HBSS (senza Ca2 +, Mg2 +) (Figura 1B).
- Rimuovere qualsiasi tessuto polmonare residuo, navi più grandi, ecc (e atri, se lo si desidera). Lavare i cuori nella soluzione di HBSS utilizzando agitazione delicata.
- Tagliare ogni cuore con una forbice in 8 pezzi e trasferire il tessuto cardiaco tutti con forcipe in un pozzetto di una piastra di coltura delle cellule 6-pozzetti con HBSS (Figura 1 e 1 D).
- Lavare i cuori trasferendo i cuori da un pozzetto a altro nella piastra 6-Pozzo riempita con HBSS, utilizzando un cucchiaio di Moria (Figura 1).
Nota: Trasferire i cuori da un pozzetto a altro è sufficiente lavare il sangue. Poiché il sangue interferisce con la digestione enzimatica è importante lavare i cuori con HBSS e rimuovere il sangue. - Trasferire i cuori con un cucchiaio di Moria in un tubo conico contenente 20 mL di tripsina (0,5 mg/mL) e incubare con agitazione delicata a 4° C per 4 h (Figura 1E).
3. preparare una piastra a 96 pozzetti cultura (giorno 1)
- Preparare 5 mL di soluzione di rivestimento: PBS contenente 0.5% di gelatina (in autoclave prima dell'uso) e 1% soluzione di fibronectina. (ad es. 5 mL di soluzione di gelatina più 50 µ l di soluzione di fibronectina)
- Aliquotare 50 µ l di soluzione di rivestimento in tutti i pozzetti della piastra 96 pozzetti cella cultura (Vedi Tabella materiali). Se le bolle sono presenti, è possibile rimuoverli utilizzando una pipetta di 20 µ l a succhiare le bolle fuori.
Nota: È importante coprire tutta l'area della superficie di ciascun pozzetto con soluzione di rivestimento. - Incubare la piastra in un'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C per 1 ora o più per consentire l'asciugatura del rivestimento matrice.
- Aspirare qualsiasi soluzione di rivestimento residuo prima della semina cardiomyocytes.
4. enzimatica digestione e placcatura delle cellule (giorno 1)
- Pre-riscaldare la soluzione di digestione della collagenosi in bagnomaria a 37 ° C.
Nota: Questo passaggio è importante raggiungere efficiente digestione enzimatica. - Spostare il tubo conico che contengono cuori e la soluzione di pre-digestione da 4 ° C per un cappuccio di cultura cellulare. (Figura 1F)
- Lasciate che i cuori sul fondo del tubo e rimuovere la soluzione di pre-digestione utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL (1-2 mL di terreno isolamento può rimanere nel tubo).
- Aggiungere 10 mL di HBSS nel tubo. Risospendere i cuori con HBSS 2 - 3 volte per lavare fuori utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL di tripsina. Aspirare HBSS (1-2 mL può rimanere nel tubo).
- Aggiungere 10 mL di soluzione di digestione della collagenosi pre-riscaldato nel tubo con i cuori. (Figura 1)
- Incubare la provetta con cuori in bagnomaria a 37 ° C per 10 minuti senza agitazione (1 ° digestione).
- Dopo la 1 ° digestione, spostare il tubo alla cappa di cultura cellulare. Triturare delicatamente cuori sospendendo nuovamente i cuori all'interno del tubo delicatamente 10 volte utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL. Ciò consentirà di cuori per disperdere e cellule di essere liberato dal tessuto del cuore. (Figura 1 H)
Nota: Poiché i cardiomiociti sono fragili, triturazione delicato è importante raggiungere alta attuabilità. - Lavello, trasferire digerito soluzione arricchita in cardiomiociti (circa 9-10 mL) ad un nuovo tubo conico e immediatamente aggiungere una pari quantità di terreni di coltura cellulare per interrompere la digestione della collagenosi, lasciare che il tessuto non digerito.
- Aggiungere 10 mL di soluzione di digestione della collagenosi nella provetta contenente il tessuto restante del cuore non digerito.
- Incubare la provetta con il tessuto del cuore in bagnomaria a 37 ° C per 10 min (2 ° digestione).
- Ripetere la procedura 4.7 e 4.8.
Nota: Se c'è ancora molto non digerito tessuto, ripetere ancora una volta di digestione. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, due digestioni sono sufficienti per disperdere la maggior parte delle cellule dal tessuto del cuore. - Inserire un cella sterile-setaccio (maglia di nylon di 100 µm) in una nuova provetta conica sterile 50 mL. Pre-bagnato il filtro cella con 2-3 mL di terreno di coltura cellulare e passare le cellule attraverso la cella-colino. Sciacquare la cella-colino con 2-3 mL di terreno di coltura delle cellule. (Figura 1I)
- Centrifugare la provetta contenente cardiomyocytes per 5 min a 180 x g (Figura 1J). Aspirare il supernatante (Figura 1 K), che conterrà i detriti del tessuto cellulare e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di coltura delle cellule (Figura 1 L).
- Risospendere le cellule e le cellule di piastra su una piastra di coltura di cellule di 10cm (plastica senza alcun tipo di rivestimento) delicatamente e incubare per 1 h in un'incubatrice di coltura cellulare (1 ° pre-placcatura) (Figura 1 M). Questa fase di pre-placcatura permette non-cardiomiociti, come fibroblasti e cellule endoteliali, di aderire al piatto non patinata di coltura cellulare.
Nota: A questo punto, cardiomiociti sono tipicamente una forma rotonda e appaiono lucidi sotto il microscopio. (Figura 1N). - Dopo l'incubazione di 1h, delicatamente agitare la piastra, lavare le cellule non-aderenti (arricchite in cardiomiociti) dalla piastra di coltura di 10cm e risospendere le cellule pipettando ripetutamente il terreno di coltura cellulare sopra il piatto utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL. Quindi, trasferire cellule non aderenti (arricchite in cardiomiociti) in un piatto di coltura delle cellule (plastica senza alcun rivestimento) 10cm nuovo e incubare per un ulteriore 1 h in un'incubatrice di coltura cellulare (2 ° pre-placcatura).
Nota: Le cellule che si attaccano alla piastra non rivestiti sono dominante non cardiomiociti: fibroblasti e cellule endoteliali, che possono essere visualizzate al microscopio (Figura 1O). - Dopo 2 ° pre-placcatura, delicatamente di agitare la piastra, lavare le cellule non-aderenti (cardiomiociti) dalla piastra di coltura di 10cm, quindi trasferire i cardiomiociti in una nuova provetta conica 50 mL.
5. conteggio celle e celle di placcatura in una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti (giorno 1)
- Contare le celle utilizzando un emocitometro.
- Piastra le cellule in una piastra di coltura 96 pozzetti cella matrice extracellulare rivestita con una densità tra 10 – 30 x 103 cellule/pozzetto usando una pipetta multicanale in un volume finale di 200 µ l (Figura 1 P). Utilizzare pozzetti A1, A12, H1 e H12 per sfondo: aggiungere 200 µ l di terreno di coltura come altri pozzi in questi pozzetti (senza cellule). Incubare la piastra in un'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C.
Nota: In questo studio, il consumo di ossigeno è stato testato utilizzando la densità delle cellule differenti quali310 x 10, 20 x 103o 30 x 103 cellule per pozzetto. (Figura 2A). Inoltre, come sopra, cardiomiociti subito dopo l'isolamento sono tipicamente una forma rotonda e appaiono lucidi sotto il microscopio. Cellule vitali si appiattiscono entro 16-24 h di cultura.
6. ossigeno consumo analisi usando un analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti (giorno 2)
Nota: Analisi del consumo di ossigeno può essere effettuata un giorno dopo il placcaggio delle cellule o versione successiva. Cardiomiociti neonatali coltivati utilizzando questo protocollo può sopravvivere fino a 7 giorni post isolamento.
- Idratare una cartuccia sensore di flusso analizzatore (Vedi Tabella materiali) per almeno 3 ore, ma idealmente per un giorno intero, prima del dosaggio. Aggiungere 200 µ l di soluzione di calibratore (Vedi Tabella materiali) nella ciascun pozzetto della piastra utilità, rimettere la cartuccia sensore sulla piastra di utilità e incubare in un incubatore a 37 ° C senza CO2 o il completamento di2 O.
- Cambiare i terreni di coltura delle cellule per mezzo di prova di stress di mitocondri un'ora prima del dosaggio. Cardiomiociti sono fragili. Di conseguenza, delicatamente rimuovere i terreni di coltura cellulare utilizzando una pipetta multicanale e lavare le cellule con 200 µ l di supporti pre-riscaldato mitocondriale stress test due volte. Dopo il secondo lavaggio, 175 µ l di mezzi di prova di stress pre-riscaldato i mitocondri e le cellule in un incubatore a 37 ° C senza CO2 o il completamento di2 O di cultura.
- Preparare composti concentrati prova. Per test di stress di mitocondri, preparare 3,0 mL ciascuna di 16 µM oligomycin, 9 µM FCCP e una miscela di 20 µM rotenone e 20 µM antimycin A, tutti in mezzo mitocondriale stress test.
Nota: Ogni mescola alla concentrazione descritta è stato testato. Tuttavia, la concentrazione di ciascun composto nel proprio laboratorio di titolazione è necessario. - Caricare 25 µ l di ciascun composto nelle porte iniettore della cartuccia sensore usando una pipetta multicanale (Figura 1Q). Il volume e la concentrazione finale sono descritte nella tabella 2.
- Impostare il protocollo di analisi di flusso extracellulare. Il programma è descritto in tabella 3.
- Avviare il programma. In primo luogo, mettere la cartuccia sensore nella macchina per la taratura (Figura 1R). Sostituire il calibratore per la piastra di dosaggio una volta fatto il passo di calibrazione.
Nota: Utilizzando il software fornito dal produttore, indicare gruppi di pozzi e ogni composto e porto. - Se lo si desidera, dopo il dosaggio, attentamente scartare tutti i medium di analisi mediante una pipetta multicanale e memorizzare la micropiastra cultura cella a-20 ° C per la normalizzazione dei futuri cella usando analisi di proteine.
- Misurare il contenuto di proteine. Aggiungere 50 µ l di soluzione di lisi cellulare RIPA standard (Vedi Tabella materiali). Incubare la piastra sul ghiaccio per 30 min a completamente lisare cellule. Trasferire tutto il materiale per una nuova piastra di fondo chiaro piatto 96 ben saggio.
- Misurare la concentrazione di proteina dall'analisi di BCA secondo il protocollo del produttore.
Nota: Rivestimento del pozzo con la matrice extracellulare si traduce in una concentrazione ad alta percentuale proteica in ciascun pozzetto. Quindi sottrarre la quantità di compresi i pozzetti di sfondo (nessuna cella) per ottenere la concentrazione nella proteina di cella effettivo. La concentrazione di proteine derivata da cellule è bassa in una piastra a 96 pozzetti cultura. Inoltre, la concentrazione nella proteina può variare da pozzetto a altro grazie al rivestimento di matrice extracellulare. Di conseguenza, utilizzando il numero di cellulare per normalizzare l'OCR è suggerito.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo descritto, i cuori sono stati isolati da cuccioli neonatale giorno 0. 5 x 105 cellule/pup sono stati ottenuti, e cardiomiociti sono stati seminati a densità di 10 x 103, 20 x 103o 30 x 103 cellule/pozzetto, a 96 pozzetti (Figura 2A). Dopo una notte cultura, cardiomiociti sono stati trovati ben attaccati alla superficie rivestita in plastica e c'erano pochissime cellule non collegate (le celle non collegate apparirà ancora più rotondo e splendente, rispetto alle cellule sane, allegate che sono spreadout) ( Figura 2A e B). A questo punto, cardiomiociti spontaneamente contraenti erano facilmente visibili. Una densità di semina di 30 x 103 cellule/pozzetto ha mostrato confluenza un giorno dopo la semina come le cellule si sono diffuse. Come il numero di cellule rotonde (morte) era molto basso, questi risultati hanno mostrato che il protocollo dà alta attuabilità dei cardiomiociti. Cardiomyocytes immunostained con un anticorpo contro sarcomeriche α-actinina, un marcatore specifico di cardiomyocyte18 come prova di questa affermazione. Come illustrato nella Figura 2, la maggior parte delle cellule ha mostrato la macchiatura positiva di α-actinina mostrando l'elevata purezza dell'isolamento dei cardiomiociti.
Uno schema di un tipico mitocondriale stress test è illustrato nella Figura 3. Il test di stress mitocondriale comincia con una misurazione di base del tasso di consumo di ossigeno (OCR). Questo è seguito dall'iniezione di oligomycin, che inibisce l'atpasi. La differenza prima e dopo iniezione di oligomycin spettacoli l'OCR legata alla produzione di ATP. Quindi, l'agente disgiungente FCCP è stato iniettato per misurare il tasso di consumo massimo di ossigeno. Capacità di riserva respiratoria può essere calcolata come la differenza tra basale e l'OCR di massima. Infine, con l'iniezione di due inibitori del complesso di trasporto dell'elettrone (antimycin A e rotenone), blocca completamente la respirazione mitocondriale e OCR scende al suo livello più basso. Bloccando l'attività mitocondriale, a questo livello, il consumo di ossigeno è non-mitocondriali. Respirazione basale, perdita di protone e massima respirazione può essere calcolate come la differenza tra la respirazione non mitocondriale (OCR in presenza di antimycin A e rotenone) e alla misurazione di riferimento, OCR in presenza di oligomycin e OCR nella presenza di FCCP, rispettivamente.
In questo studio, analisi OCR è stata effettuata usando un sistema di analisi flusso extracellulare formato da 96 pozzetti un giorno dopo l'isolamento delle cellule. Inoltre, per verificare l'effetto di deprivazione di siero su OCR, tre ore prima del test, i terreni di coltura delle cellule sono stati cambiati a cellula normale crescita di coltura con il siero, o senza il siero. Dopo l'esecuzione, i dati di misura di OCR 1 fino a 12 per ogni bene, sono stati esportati in un foglio di calcolo per ulteriori analisi e tenuta dei registri. Caratteristiche metaboliche sono state determinate come segue:
La respirazione mitocondriale non = medio OCR (10, 11, 12)
Respirazione basale = media OCR (1, 2, 3)-media OCR (10, 11, 12)
Produzione di ATP = media OCR (1, 2, 3)-media OCR (4, 5, 6)
Perdita di protone = media OCR (4, 5, 6) - media OCR (10, 11, 12)
Massima respirazione = media OCR (7, 8, 9) - media OCR (10, 11, 12)
Come mostrato in Figura 4A, facilmente sono stati analizzati i valori OCR, e gli effetti dei composti iniettati anche erano evidenti. D'importanza, la variazione da un pozzetto a altro era piccola, come dimostra l'errore standard. Aumentare nella cella numero ha provocato alla misurazione di riferimento aumentato, Oligomycin e respirazione FCCP-trattati. Confrontato alle cellule di siero morto di fame, OCR era più alta in cellule analizzate che avevano state incubate con media di crescita. Come mostrato in Figura 4B, OCR è indicato come respirazione basale, perdita di protone (Oligo) e massima respirazione (FCCP) a 1 x 104 celle. OCR per 10 x 103 cellule era superiore in densità di semina di 20 K e K 30 cellule/pozzetto a quella di 10K cellule per pozzetto. Come mostrato in Figura 4, esprimendo OCR relativa respirazione basale, la relativa perdita di OCR del protone (Oligo) e massima (FCCP) mostrano valori simili tra crescita media e siero affamato gruppi. Questi risultati indicano che la densità di semina non pregiudica la capacità ossidativa di relativo protone, perdita e maximal.
Nel complesso, utilizzando questo protocollo, ottimi rendimenti di cardiomiociti neonatali del mouse correttamente isolati e coltivati. OCR può essere valutata utilizzando questi miociti in un analizzatore di flusso extracellulare. I risultati mostrano anche che semina densità non influenzino significativamente OCR calcolato dal numero di cellulare. Tuttavia, la deprivazione di siero di breve termine (3 h) diminuisce OCR. Le informazioni sono utili per il test del mouse cardiomiociti neonatali OCR con varie condizioni sperimentali.
Figura 1: isolamento e coltura dei cardiomiociti neonatali da topi neonati giorno 0. Sono euthanized neonati (A), e il cuore è dissecato dal torace. (B) cuori vengono lavati in HBSS (senza Ca2 +, Mg2 +). (C) ogni cuore è tagliato in 8 pezzi. (D) cuori vengono spostati in una piastra a 6 pozzetti riempita con HBSS. I cuori sono lavati utilizzando un cucchiaio di Moria per trasferirli da un pozzetto a altro. (E) cuori sono pre-digeriti in tripsina-HBSS a 4 ° C con agitazione delicata. (F) Predigested del tessuto del cuore dopo 4 ore di incubazione a 4 ° C. (G) tessuti del cuore dopo digestione della collagenosi 10 min. (H) collagenosi digerito cuore tessuti sono triturati. (io) Isolated cardiomyocytes è stato filtrato attraverso un colino di cella. (J) cardiomiociti sono pellettati mediante centrifugazione. (K) della collagenosi e terreni di coltura vengono rimossi dall'aspirazione. (L) cardiomiociti sono risospesi in terreno di coltura fresco. Cardiomiociti (M) sono coltivati in un piatto di plastica di 10 cm per pre-placcatura. (N), A immagine rappresentativa di cardiomiociti (cellule rotonde e splendente) dopo 1 h di pre-placcatura. (O) dopo pre-placcatura e quindi la rimozione dei cardiomiociti non aderente, restanti cellule che sono in genere fibroblasti e cellule endoteliali sono visibili. (P) placcatura cardiomiociti in una piastra a 96 pozzetti. (Q) caricamento di reagenti in porti di iniezione di cartuccia sensore. (R) cartuccia sensore Putting in una macchina di analizzatore di flusso extracellulare. Barra della scala = 0,1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: cultura di cardiomiociti su piastra a 96 pozzetti analizzatore flux extracellulare. (A) immagini rappresentative dei cardiomiociti in piastre da 96 pozzetti con densità di cella indicata, subito dopo la semina (riga superiore) o 18 h post semina (riga inferiore). (B) un immagine di ingrandimento superiore di cardiomiociti 18h post semina ad una densità di cella di 10 x 103 cellule per pozzetto. (C) cardiomiociti sono stati macchiati con anticorpo anti-sarcomeriche α-actinina (verde) e DAPI (come una macchia nucleare) (blu). Barra della scala = 0,1 mm. I metodi utilizzati per immunostaining possono essere trovati nella nostra precedente pubblicazione18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Rappresentazione schematica di mitocondriale stress test. Parametri bioenergetici, inclusi basali, legata all'ATP, massima e Non-mitocondriale respirazione così come ricambio capacità respiratoria e perdita di protoni, sono delineati sulla traccia con effettori mitocondriali corrispondenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: test di sforzo mitocondriale. (A) analisi rappresentativa dei tassi di consumo di ossigeno (OCR, in pMoles/min) di cardiomiociti neonatali del mouse. Presso l'indicato volte, oligomycin (Oligo, 1 µM), FCCP (800 nM), e sono stati iniettati RAA (rotenone e antimycin A, 1 µM ciascuna). Per ogni misura, la media e l'errore standard della media (SEM) dei 10 singoli pozzetti è presentato. (B) OCR viene calcolato come respirazione basale, Oligo (perdita del protone) e FCCP (massima respirazione) per 10 x 103 celle. (C) OCR è espresso in relazione respirazione basale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome del reagente e soluzione | Preparazione | Note |
| Soluzione pre-digestione della tripsina | Sciogliere la tripsina in HBSS (senza Ca2 + e Mg2 +). Concentrazione finale è di 0,5 mg/mL. Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 µm e tenere il ghiaccio fino all'utilizzo. | Fare pre-digestione soluzione il giorno dell'esperimento. |
| Soluzione di digestione della collagenosi | Sciogliere la tripsina in HBSS (senza Ca2 + e Mg2 +). Concentrazione finale è di 0,5 mg/mL. Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 µm e tenere il ghiaccio fino all'utilizzo. | Il giorno dell'esperimento effettuare soluzione digestione della collagenosi. |
| Terreni di coltura dei cardiomiociti | Mix 375 mL di DMEM, 125 mL di M-199, 25 mL di siero equino e 12,5 mL di FBS. Supplemento con penicillina 1% e 1% soluzione di streptomicina. | Terreni di coltura del cardiomyocyte può essere fatta prima dell'esperimento ed essere conservato a 4 ° C per un mese. |
| Mitocondriale stress test medio | In primo luogo, fare 1 L del mezzo con DMEM senza qualsiasi piruvato di sodio, L-Glutammina, glucosio e Hepes, filtrare per sterilizzare e conservare a 4 ° C. Il giorno del test, aggiungere sodio piruvato, L-Glutammina, glucosio e Hepes. Aggiustare il pH a 7.4 prima dell'uso (non viene richiesta la sterilizzazione). | Concentrazione finale per i supplementi sono i seguenti: sodio piruvato (1 mM), L-Glutammina (2 mM), glucosio (10 mM) e Hepes (2 mM) |
| Oligomycin stock | Sciogliere oligomycin in DMSO. In primo luogo, preparare 5 mL di soluzione di riserva. Una volta oligomycin è completamente dissolto in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l, conservare a-20 ° C. | Il giorno del test, prendere un'aliquota da utilizzare. Evitare molti cicli di gelo-disgelo. |
| Stock FCCP | Sciogliere FCCP in DMSO. In primo luogo, preparare 5 mL di soluzione di riserva. Concentrazione finale è 5 mM. Una volta FCCP completamente è dissolto in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l, conservare a-20 ° C. | Il giorno del test, prendere un'aliquota da utilizzare. Evitare molti cicli di gelo-disgelo. |
| Antimycin A stock | Sciogliere antimycin A in DMSO. In primo luogo, preparare 5 mL di soluzione di riserva. Concentrazione finale è 5 mM. Una volta che antimycin A è completamente dissolto in DMSO, aliquote di 250 µ l, conservare a-20 ° C. | Il giorno del test, prendere un'aliquota da utilizzare. Evitare molti cicli di gelo-disgelo. |
| Stock di rotenone | Sciogliere il rotenone in DMSO. In primo luogo, preparare 5 mL di soluzione di riserva. Concentrazione finale è 5 mM. Una volta che il rotenone è completamente dissolto in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l, conservare a-20 ° C. | Il giorno del test, prendere un'aliquota da utilizzare. Evitare molti cicli di gelo-disgelo. |
| Soluzione di rivestimento di cella cultura piastra | In primo luogo, fare 200 mL di soluzione di gelatina di 0,5%. Sciogliere la gelatina in PBS e autoclave. Il giorno dell'esperimento, è necessario aggiungere 50 µ l di soluzione di fibronectina in 5 mL di soluzione gelatina per rendere la soluzione di rivestimento. | 0,5% soluzione di gelatina possa essere memorizzati a temperatura ambiente fino a 2 mesi. |
Tabella 1: Reagenti e soluzioni.
| Foro di iniezione | Composti e concentrazione | Volume iniettato durante l'esecuzione (µ l) | Concentrazione finale nel dosaggio |
| A | 16 µM oligomycin | 25 | 2 ΜM |
| B | 9 ΜM FCCP | 25 | 1 ΜM |
| C | Rotenone 20 µM (Rot) e 20 µM antimycin A (AA) |
25 | 2 µM di ciascuno |
Tabella 2: Miscele di iniezione.
| Passaggi e le procedure | Misurazioni e loop |
| Calibrazione | - |
| Equilibrazione | - |
| Misurazione di riferimento | 3 volte: mescolare 3 min, attendere 2 min, 3 min di misurare |
| Iniettare porta un (Oligomycin) | - |
| Misure | 3 volte: mescolare 3 min, attendere 2 min, 3 min di misurare |
| Iniettare porta B (FCCP) | - |
| Misure | 3 volte: mescolare 3 min, attendere 2 min, 3 min di misurare |
| Iniettare la porta C (RAA) | - |
| Misure | 3 volte: mescolare 3 min, attendere 2 min, 3 min di misurare |
Tabella 3: Flusso extracellulare analyzer programma.
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Discussion
In questo studio, abbiamo stabilito un protocollo semplice per isolamento e la coltura del mouse cardiomiociti neonatali. Utilizzando questi cardiomiociti, abbiamo ottimizzato anche le condizioni per misurare il tasso di consumo di ossigeno utilizzando un sistema di analisi di flusso extracellulare. Il protocollo permette di utilizzare cardiomiociti neonatali del mouse come sistema modello per esaminare come i vari fattori possono alterare il consumo di ossigeno nelle cellule del lavoro principale del cuore, simile a quello che sarebbe misurato nell'organo intatto. Il nostro protocollo è diverso dai protocolli precedentemente pubblicati16,18. In primo luogo, per ottenere alta attuabilità, solo i cuccioli immediatamente alla nascita sono utilizzati (cioè P0), invece di quelli da giorni da zero a tre giorni di età (P0 a P3 cuccioli), che vengono comunemente utilizzati in altri protocolli16,19. In secondo luogo, per minimizzare il tempo dell'esperimento, cuori solo erano pre-digeriti con tripsina per 4 h. Inoltre, per rendere semplice la procedura e ottenere risultati riproducibili, abbiamo impiegato un numero minimo di passaggi, come indicato. Ad esempio, il nostro protocollo utilizza solo due tipi di buffer, PBS e HBSS e un solo tipo di terreni di coltura delle cellule e non impiegare agitazione durante la digestione della collagenosi.
Per raggiungere alta attuabilità dei cardiomiociti neonatali del mouse, che è importanti per la riproducibilità del dosaggio OCR, ci sono parecchi punti critici. In primo luogo, tramite pups neonati P0 ed esecuzione pre-digestione della tripsina e digestione della collagenosi nello stesso giorno è fondamentale per raggiungere alta attuabilità. In secondo luogo, durante la digestione della collagenosi, non si consiglia di agitare il tessuto cardiaco nel bagno d'acqua di 37 ° C. Anche se agitazione è suggerito in molti protocolli, abbiamo trovato che questo non è necessario come P0 cuori sono facili da essere digeriti da collagenosi. Infine, delicatamente triturazione tessuto cardiaco è fondamentale per dissociare i cardiomiociti dopo digestione della collagenosi.
Abbiamo anche testato miociti dal tessuto del cuore cucciolino P1 e P2, usando lo stesso protocollo. Tuttavia, per questi vecchi campioni di cuore, abbiamo trovato che è necessario eseguire pre-digestione della tripsina durante la notte per ottenere un sufficiente delle cellule (dati non mostrati). Inoltre, l'attuabilità delle cellule per P1 e P2 cardiomyocytes era circa 60%, simile a che in altri pubblicati studi16. Questi risultati indicano che il miocardio P0 ha relativamente minori quantità di matrice extracellulare di cuori più anziani, che consente tempi più brevi per pre-digestione della tripsina, con conseguente maggiore vitalità cellulare e produce da questi giovani cuori.
Analisi di flusso extracellulare (XF) è diventata un importante e popolare metodo per misurare la funzione bioenergetica in cellule e mitocondri isolati20,21. Ad oggi, una serie di studi utilizzato cardiomiociti neonatali del ratto e misurato il consumo di ossigeno, utilizzando un sistema di Agilent XF2422,23,24 . Questi studi utilizzando cellule del ratto in contrasto con le cellule del mouse, probabilmente sono state effettuate come cellule del ratto hanno generalmente maggiore vitalità cellulare e riproducibilità del saggio, rispetto i miociti cardiaci del mouse studiati qui. Dato che gli animali geneticamente modificati sono stati generati principalmente nelle linee del mouse, un protocollo semplice e riproducibile per l'analisi di funzione bioenergetica in cardiomiociti neonatali del mouse, come discutiamo in questo manoscritto, offre l'opportunità di studiare funzione mitocondriale nei miociti cardiaci del mouse. Questo metodo può essere più facilmente tradotta in dati che possono portare a comprendere nuovi meccanismi per regolazione bioenergetica nel cuore, utilizzando mouse geneticamente manipolato nuove o esistenti linee25,26.
In questo studio, abbiamo verificato l'effetto del numero di cell e densità su OCR. Come mostrato in Figura 4B, OCR misurati in pozzi con310 x 10, 20 x 103e 30 x 103 cellule/pozzetto, era simile. Dato che la placcatura 30 x 103 cellule/pozzetto prodotto un pozzo confluente entro un giorno dopo la semina, si consiglia di dividere le celle tra 10x103 a 30 x 103 cellule/pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, per il dosaggio di OCR. È interessante notare che abbiamo trovato 3 h di inedia del siero è diminuito OCR. Fattori di crescita sono conosciuti per attivare la glicolisi e aumentare il consumo di ossigeno27. È stato anche riferito che i fattori di crescita che permettono di migliorare nel complesso l'attività cellulare e la contrazione dei cardiomiociti3,28. Contrazione dei cardiomiociti richiede ATP generazione2, che dipende dal consumo di ossigeno. Pertanto, questi dati suggeriscono che inedia del siero diminuisce il consumo di ossigeno attraverso l'inattivazione dei cardiomiociti. Vi consigliamo di verificare l'effetto di deprivazione di siero su OCR in proprio ambiente sperimentale.
Come accennato, i mitocondri giocano un ruolo chiave nella funzione del cuore. Pertanto, l'identificazione di nuovi regolatori e vie che regolano il metabolismo ossidativo potrebbe fornire un mezzo per identificare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento di insufficienza cardiaca. Poiché un formato ben 96 prevede la possibilità di testare un numero maggiore di condizioni rispetto ad un formato ben 24 test, questo protocollo potrebbe anche essere facilmente adattato a una schermata di throughput elevato per l'identificazione di nuovi regolatori bioenergetici in cardiomiociti29 . Così, combinando il nostro protocollo con geneticamente manipolato cardiomiociti neonatali, ad esempio quelle che hanno mutazioni mitocondriali30, potrebbe fornire interessanti studi per schermare gli effetti di composti chimici o librerie di cDNA, su OCR in cardiomiociti metabolicamente difettosi di selvaggio-tipo vs. .
Siamo consapevoli che cardiomiociti neonatali e adulti hanno molte caratteristiche diverse e funzioni metaboliche31, compresi i livelli di espressione di enzimi metabolici del glucosio e degli acidi grassi32. Di conseguenza, idealmente per utilizzare cardiomyocytes coltivati in vitro come sistema di modello del cuore intatto, sarebbe importante sviluppare ulteriormente un protocollo per analizzare in modo efficiente OCR in cardiomiociti adulti, in modo che uno potrebbe confrontare la loro capacità ossidativa e caratteristiche con cardiomiociti neonatali. Gli studi futuri dovranno essere perseguiti per adattare questa metodologia ad un sistema riproducibile utilizzando adulto miociti cardiaci.
In sintesi, vi mostriamo un protocollo semplice e riproducibile per analizzare il consumo di ossigeno con cardiomiociti neonatali del mouse coltivati primari del topo. Utilizzando questo protocollo, potremmo isolare con successo e cultura del mouse cardiomiociti neonatali ed eseguire questa analisi OCR utilizzando un sistema di analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti. Il nostro protocollo dà ad alta redditività e, cosa importante, risultati riproducibili in modo coerente. Anche se questo studio si concentra principalmente sul consumo di ossigeno e un test di stress mitocondriale, il protocollo potrebbe essere facilmente adattato per analizzare l'ossidazione dell'acido grasso e glicolisi nei cardiomyocytes.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare tutti i lab di Ross e membri del laboratorio di Murphy. Questo lavoro è supportato da American Heart Association (14SDG17790005) per Y.C. NIH (HL115933, HL127806) e VA al merito (BX003260) a R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
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