Summary
Het doel van dit protocol is te illustreren hoe gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe de verschillende factoren kunnen wijzigen zuurstofverbruik in het hart.
Abstract
Mitochondriën en oxidatieve metabolisme zijn kritisch voor de handhaving van de functie van de hartspier. Onderzoek heeft aangetoond dat mitochondriale dysfunctie is een belangrijke factor die bijdraagt aan verminderde hartfunctie bij hartfalen gevonden. Daarentegen, kan herstel van defecte mitochondriale functie hebben gunstige effecten ter verbetering van de hartfunctie in het falende hart. Dus, de regulerende mechanismen te bestuderen en het identificeren van nieuwe regelgevende instanties voor mitochondriale functie kunnen inzicht geven die kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hart-en vaatziekten. Hier, wordt cardiale myocyte mitochondriale ademhaling geanalyseerd met behulp van een unieke celcultuur. Ten eerste, een protocol is geoptimaliseerd om snel isoleren en hoge levensvatbaarheid neonatale muis cardiomyocytes cultuur. Vervolgens wordt een 96-Wells-indeling extracellulaire flux analyzer gebruikt ter beoordeling van de zuurstof verbruik tarief van deze cardiomyocytes. Voor dit protocol, we geoptimaliseerd zaaien voorwaarden en aangetoond dat pasgeborenen muis cardiomyocytes zuurstof verbruik tarief kan gemakkelijk worden beoordeeld in een extracellulaire flux-analysator. Tot slot, wij stellen vast dat ons protocol kan worden toegepast op een groter formaat van de cultuur en andere studies, zoals de intracellulaire signalering en contractiele functie analyse.
Introduction
Om een continue contractiele hartfunctie, moeten cardiomyocytes behouden een constante aanvoer van cellulaire energie voornamelijk in de vorm van ATP1. In het hart, wordt ongeveer 95% van ATP gegenereerd door mitochondriën, voornamelijk door middel van oxidatieve fosforylatie, waaruit blijkt dat de mitochondria een sleutelrol in de bio-energetische in hartfunctie2,3 spelen. Het ondersteunen van dit begrip is dat disregulatie van mitochondriale functie kan leiden tot cardiomyopathie en hartfalen4,5. Omgekeerd, herstel van mitochondriale functie is aangetoond dat verbetering van de hartfunctie van het falende hart6,7. Daarom, bestuderen van het mechanisme van de mitochondriale Bioenergetica en het identificeren van nieuwe toezichthouders van mitochondriale functie in cardiomyocytes mechanistische inzichten van cardiale energieproductie alleen niet zal onthullen maar ook kunnen inzicht geven die zal leiden aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hart-en vaatziekten6,8.
Vergeleken met het hele hart, waarin een mengsel van myocytes en niet-myocytes9, cardiomyocyte culturen zijn uiterst zuiver, met minimale besmetting van niet-myocytes vanuit het hart, zoals fibroblasten en endotheliale cellen10. Bovendien, isoleren van cardiomyocytes van neonatale pups kan kweken een groot aantal cellen in een kleine hoeveelheid tijd, in vergelijking met isolerende cellen van volwassen harten10,11. Bovenal primaire gekweekte volwassen muis cardiomyocytes hebben korte overleving tijden (bijv. 24 uur) en bij langere tijd punten-onderscheid maken. Neonatale muis cardiomyocytes kunnen overleven en voor meer dan 7 dagen in de cultuur, waardoor ze ideaal zijn voor het testen van de effecten van de drug compounds en genetische manipulatie op de functie van mitochondriën in cardiomyocytes10worden gemanipuleerd. Natuurlijk, er zijn aanzienlijke biologische verschillen tussen de volwassen en neonatale cellen, maar de langere duur die beschikbaar zijn voor cultuur van neonatale cellen maakt ze geschikt voor vele verschillende types van studies, met inbegrip van die van mitochondriale functie.
Tot op heden, zijn primaire gekweekte neonatale muis en rat cardiomyocytes gebruikt als modellen om te studeren cardiale Bioenergetica12,13. In de afgelopen jaren gebruikt studies een extracellulaire flux analyzer meten van zuurstof verbruik tarief (OCR) en evalueren van oxidatieve capaciteit in muis en rat neonatale cardiomyocytes14,15. Terwijl in vergelijking met ratten, de levensvatbaarheid van de cellen van de neonatale cardiomyocytes muis is lager en heeft grotere variabiliteit16. De mogelijkheid te bestuderen van cellen uit genetisch gemodificeerde Muismodellen maakt de mobiele muismodel ook, heel belangrijk. Gezien het feit dat OCR studies zo gevoelig zijn voor cel nummer en dichtheid te zaaien, is de ontwikkeling van een protocol reproduceerbaar, betrouwbare en eenvoudig te bereiken consistente cel opbrengst en levensvatbaarheid nodig.
Wij rapporteren hier een geoptimaliseerde protocol dat is ontwikkeld die gebruik maakt van de neonatale cardiomyocytes gekweekte muis samen met een 96-goed-formaat extracellulaire flux analyzer voor OCR analyse. Dit protocol verhoogt de reproduceerbaarheid van de test. Bovendien, het protocol biedt niet alleen een roman en reproduceerbare methode voor de analyse van de OCR, maar ook tot een grotere grootte cultuur zou kunnen worden aangepast voor andere experimentele doeleinden, zoals die die wellicht nodig zijn om te studeren van myofibrillar functies en intracellulaire Signaalroutes.
Met name beschrijft dit protocol een eendaagse procedure voor isolatie en cultuur van neonatale muis cardiomyocytes in een 96-Wells cel cultuur plaat. Bovendien, het wordt de procedure beschreven voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van een extracellulaire flux-analyzer. Alle oplossingen gebruikt worden steriel of steriele gefilterd. Alle tools zijn gesteriliseerd door 75% ethanol. Wij bieden een Tabel van materialen voor diverse onderdelen van de procedure. Voor het kweken van cardiomyocytes, worden alle procedures en stappen uitgevoerd in een standaard cel cultuur kap. Dit protocol is ontwikkeld voor de isolatie van neonatale muis harten uit één nest (ongeveer 8-10 pups). Het protocol kan echter ook worden aangepast voor het isoleren van cardiomyocytes uit meerdere nesten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor werk met neonatale muizen, verwijzen naar lokale universiteit/Instituut richtsnoeren set weer door de dierenverzorgers programma's en zich houden aan iemands institutionele en andere verordeningen. Alle methoden die worden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de UC San Diego institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en voldoen aan de federale en nationale regelgeving.
1. bereiding van reagentia
- Bereiden van 25 mL pre vergisting oplossing: HBSS (zonder Ca2 + en Mg2 +) aangevuld met trypsine (0,5 mg/mL). De oplossing om met een 0,22 µm filter steriliseren en houd op ijs tot gebruik. Pre vergisting oplossing maken op de dag van het experiment.
Opmerking: Het is essentieel voor het gebruiken van HBSS zonder Ca2 + en Mg2 +, als Ca2 + en Mg2 + myocyte contractie en latere celdood tijdens isolatie zal veroorzaken. - Bereiden van 30 mL collagenase spijsvertering buffer: collagenase (0,8 mg/mL, ongeveer 350 U/mL) opgelost in HBSS (zonder Ca2 + en Mg2 +) buffer. De oplossing om met een 0,22 µm filter steriliseren en houd op ijs tot gebruik. Maak collagenase spijsvertering oplossing op de dag van het experiment.
- 500 mL cardiomyocyte voedingsbodems (groei media)bereiden: Meng 375 mL DMEM, 125 mL M-199, 25 mL serum van paard en 12,5 mL FBS. Te vullen met 1% penicilline en streptomycine 1%-oplossing.
- Mitochondriale stress testmediumbereiden: Maak 200 mL van DMEM gebaseerd stress testmedium (DMEM zonder NaHCO3, Zie Tabel van materialen) aangevuld met natrium pyruvaat van 1 mM, 2 mM L-glutamine, en 10 mM glucose en 2 mM Hepes.
Opmerking: 1 L medium met DMEM zonder natrium pyruvaat, L-glutamine, glucose en Hepes, filer steriele, maken en opslaan in 4 ° C. Bereid het testmedium van stress op de dag van de bepaling door de toevoeging van andere reagentia. Met behulp van DMEM is medium zonder NaHCO3 van cruciaal belang. - Breng de pH van mitochondriale stresstest media aan 7.4 op de dag van gebruik. Warme media tot 37 ° C vóór gebruik.
- Oligomycinbereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.
- FCCPbereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.
- Antimycin Abereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.
- Rotenonbereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.
Opmerking: Alle reagentia en oplossingen gebruikt in dit protocol zijn vermeld in tabel 1.
2. oogsten en pre vergisting van harten van neonatale muizen (dag 1)
- Autoclaaf schaar, pincet en een Moria lepel te steriliseren.
- Voer alle stappen in de cel cultuur kap voor steriliteit.
- Aliquot 5 mL HBSS (zonder Ca2 +, Mg2 +) aan elk putje van de plaat van een 6-well cel cultuur; plaats op het ijs. Aliquot 10 mL HBSS in een 10 cm schotel voor de cultuur van de cel.
- Bereiden 20 mL trypsine pre vergisting oplossing in een 50 mL steriele conische buis. Houd alle oplossingen op het ijs.
- Snel duik pasgeborene (dag 0) muizen in 70% ethanol oplossing voor sterilisatie.
- Decapitate pups met behulp van steriele schaar (recht) zonder verdoving, en open vervolgens de borst langs het borstbeen toegang te verlenen tot de borstholte en het hart. (Figuur 1A)
Opmerking: 1) is het essentieel te gebruiken P0 neonatale muizen om de levensvatbaarheid van de hoge cellen. 2) deze methode euthanasie is toegestaan voor pasgeborenen overeenkomstig NIH en Amerikaanse veterinaire medische vereniging richtsnoeren 17. - Harten uittreksel uit het lichaam met een goede schaar en overdracht onmiddellijk in de steriele cel cultuur schotel met HBSS (zonder Ca2 +, Mg2 +) (figuur 1B).
- Verwijder eventuele resterende longweefsel, grotere schepen, etc. (en atria, indien gewenst). Wassen harten in de HBSS oplossing met behulp van zachte agitatie.
- Elk hart met een fijne schaar in 8 stukken gesneden en breng het alle hartweefsel met een tang in een putje van een 6-well cel cultuur plaat met HBSS (Figuur 1 c en 1 D).
- Het wassen van het hart door de overdracht van de harten van goed tot goed in de 6-well plaat gevuld met HBSS, met behulp van een lepel Moria (Figuur 1 d).
Opmerking: Overdracht van de harten van goed tot goed is genoeg om het bloed wassen. Aangezien bloed met enzymatische spijsvertering interfereert is het belangrijk te wassen de harten met HBSS en verwijderen van bloed. - Pipetteer van het hart met een lepel Moria in een conische buis met 20 mL trypsine (0,5 mg/mL) en incubeer met zachte agitatie bij 4° C voor 4 h (figuur 1E).
3. het opstellen van een cultuur van de 96-wells-plaat (dag 1)
- Bereiden van 5 mL van de oplossing van de coating: PBS met 0,5% gelatine (autoclaaf vóór gebruik) en 1% fibronectine oplossing. (bijv. 5 mL gelatine oplossing plus 50 µL van fibronectine oplossing)
- Aliquot 50 µL van coating oplossing in elk putje van de 96-Wells cel cultuur plaat (Zie Tabel van materialen). Als bubbels aanwezig zijn, kunt u ze verwijderen met behulp van een pipet 20 µL te bellen uit te zuigen.
Opmerking: Het is belangrijk ter dekking van de oppervlakte van elk putje met coating oplossing. - Incubeer de plaat in een 37 ° C cel cultuur incubator voor 1 uur of meer te laten drogen van de coating van de matrix.
- Elke resterende coating oplossing vóór het zaaien van cardiomyocytes gecombineerd.
4. enzymatische spijsvertering en beplating van cellen (dag 1)
- Vooraf warm collagenase spijsvertering oplossing in een waterbad 37 ° C.
Opmerking: Dit is stap is belangrijk voor het bereiken van efficiënte enzymatische spijsvertering. - Verplaats de conische buis met harten en pre vergisting oplossing van 4 ° C voor een cel cultuur kap. (Figuur 1F)
- Laat de harten zinken naar de bodem van de buis en de pre vergisting oplossing verwijderen met behulp van serologische Pipetteer 10 mL (1 tot 2 mL van het medium van de isolatie kan blijven in de buis).
- Voeg 10 mL van HBSS in de buis. Resuspendeer de harten met HBSS 2 - 3 keer te wassen met behulp van serologische Pipetteer 10 mL trypsine. HBSS gecombineerd (1 tot 2 mL kan blijven in de buis).
- Voeg 10 mL van voorverwarmde collagenase spijsvertering oplossing in de buis met hart. (Figuur 1G)
- Incubeer de buis met hart in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten zonder agitatie (1ste spijsvertering).
- Na 1e spijsvertering, door de buis naar de cel cultuur kap te verplaatsen. Zachtjes triturate harten door opnieuw de schorsing van het hart in de buis zachtjes 10 keer met behulp van serologische Pipetteer 10 mL. Hierdoor zal harten te verspreiden en cellen die moeten worden vrijgesteld van hartweefsel. (Figuur 1 H)
Opmerking: Aangezien cardiomyocytes kwetsbaar zijn, is zachte verpulvering belangrijk om te bereiken hoog levensvatbaarheid. - Laat het onverteerd weefsel zinken, breng verteerd oplossing verrijkt in cardiomyocytes (ongeveer 9-10 mL) aan een nieuwe conische buis en onmiddellijk toevoegen een gelijke hoeveelheid van cel cultuur media om te stoppen met de vertering van collagenase.
- Voeg 10 mL van collagenase spijsvertering oplossing in de buis met de resterende onverteerd hartweefsel.
- Incubeer de buis met hartweefsel van het in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten (2de spijsvertering).
- Herhaal de procedure 4.7 en 4.8.
Opmerking: Als er nog steeds veel onverteerd weefsel, spijsvertering nog een keer herhalen In de meeste gevallen zijn twee spijsvertering echter genoeg om te dispergeren allermeest naar de cellen van het hartweefsel. - Plaats een steriele cel-zeef (100 µm nylon gaas) in een nieuwe steriele 50 mL conische buis. Vooraf nat de cel zeef met 2-3 mL cel cultuurmedia en doorgeven van cellen door de cel-zeef. Spoel de cel-zeef met 2-3 mL cel voedingsbodems. (Figuur 1I)
- Centrifugeer conische buis met cardiomyocytes gedurende 5 min. op 180 x g (figuur 1J). Gecombineerd het supernatant (Figuur 1 K), die zal bevatten cel weefsel puin en resuspendeer de pellet cel in cel voedingsbodems (Figuur 1 L) 10 mL.
- Zachtjes resuspendeer de cellen en de plaat cellen op een 10 cm cel cultuur schotel (kunststof zonder enige vorm van coating) en incubeer gedurende 1 uur in een cel cultuur incubator (1e pre beplating) (Figuur 1 M). Deze pre plating stap staat niet-cardiomyocytes, zoals fibroblasten en endotheliale cellen, zich te houden aan de schotel niet gestreken cel-cultuur.
Opmerking: Op dit punt cardiomyocytes zijn doorgaans een ronde vorm en verschijnen glanzende onder de Microscoop. (Figuur 1N). - Na de incubatie 1 h zachtjes doorroeren van de plaat, niet-aanhanger cellen (verrijkt in cardiomyocytes) uit de 10 cm cultuur schotel wassen en resuspendeer de cellen door herhaaldelijk pipetteren het kweekmedium cel over de schotel met behulp van serologische Pipetteer 10 mL. Vervolgens breng niet-aanhanger cellen (verrijkt in cardiomyocytes) in een nieuwe 10 cm cel cultuur schotel (kunststof zonder enige coating) en incubeer gedurende een extra 1 uur in een cel cultuur incubator (2e pre beplating).
Opmerking: Cellen die aan de niet-gecoate plaat hechten zijn dominant niet-cardiomyocytes: fibroblasten en endotheliale cellen, die onder een microscoop (figuur 1O) kunnen worden gevisualiseerd. - Na 2e pre beplating, zachtjes doorroeren van de plaat, wassen niet-aanhanger cellen (cardiomyocytes) uit de 10 cm cultuur schotel en breng de cardiomyocytes in een nieuwe conische tube van 50 mL.
5. tellen cellen en Plating cellen in een cel van de 96-Wells cultuur plaat (dag 1)
- Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
- Plaat van de cellen in een extracellulaire matrix gecoat 96-Wells cel cultuur plaat duikt met een dichtheid tussen 10-30 x 103 cellen per putje met behulp van een pipet meerkanaals in een eindvolume van 200 µL (Figuur 1 P). Wells A1, A12, H1 en H12 gebruiken voor achtergrond: 200 µL cultuurmedium toevoegen als andere putten in deze putten (geen cellen). Incubeer de plaat in een 37 ° C incubator voor de cultuur van de cel.
Opmerking: In deze studie, werd zuurstofverbruik getest met behulp van verschillende cel dichtheden zoals 10 x 10320 x 10-3en 30 x 103 cellen per putje. (Figuur 2A). Ook, zoals hierboven, cardiomyocytes onmiddellijk na isolatie zijn doorgaans een ronde vorm en verschijnen glanzende onder de Microscoop. Levensvatbare cellen zal afvlakken uit binnen 16-24 uur van cultuur.
6. zuurstof verbruik Assay met behulp van een 96-goed-formaat extracellulaire Flux Analyzer (dag 2)
Opmerking: Zuurstof verbruik bepaling kan worden uitgevoerd in één dag na de cellen plating of hoger. Neonatale cardiomyocytes gekweekt met behulp van dit protocol tot 7 dagen kan overleven post isolatie.
- Hydrateer een flux analyzer sensor cartridge (Zie Tabel van materialen) gedurende ten minste 3 uur, maar ideaal voor een volledige dag, voor de bepaling. Voeg 200 µL van kalibrant oplossing (Zie Tabel van materialen) in de elk putje van de plaat utility, zet de sensor cartridge terug op het bord van nut, en broeden in een incubator 37 ° C zonder CO2 of O2 suppletie.
- Wijzigen in cel voedingsbodems mitochondriën stresstest gemiddeld één uur voorafgaand aan de test. Cardiomyocytes zijn kwetsbaar. Daarom voorzichtig de voedingsbodems cel verwijderen door met behulp van een precisiepipet multi-kanaals en wassen van de cellen met 200 µL voorverwarmde mitochondriale stresstest media tweemaal. Na tweede wash, voeg 175 µL voorverwarmde mitochondriën stress test media en cultuur van de cellen in een incubator 37 ° C zonder CO2 of O2 suppletie.
- Geconcentreerde test verbindingen voor te bereiden. Voorbereiden voor stresstest mitochondriën, 3,0 mL elke 16 µM oligomycin, 9 µM FCCP en een mengsel van 20 µM rotenon en 20 µM antimycin A, alle in mitochondriale stress testmedium.
Opmerking: Elke verbinding in de concentratie beschreven is getest. Titrating van de concentratie van elke stof in iemands eigen laboratorium is echter noodzakelijk. - 25 µL van elke stof in de havens van de injector van de patroon van de sensor met een meerkanaalspipet (figuur 1T) laden. Het volume en de eindconcentratie worden beschreven in tabel 2.
- Extracellulaire flux assay protocol instellen. Het programma wordt beschreven tabel 3.
- Start het programma. Eerst, zet de sensor-cartridge in de machine voor kalibratie (figuur 1R). Vervang de kalibrant voor de plaat assay zodra de kalibratie stap is gedaan.
Opmerking: Met behulp van de software die wordt geleverd door fabrikant, geven groepen van putten en elke compound en poort. - Indien gewenst, na de assay, zorgvuldig negeren alle assay medium door met behulp van een precisiepipet meerkanaals en opslaan van de cel cultuur microplate bij-20 ° C voor toekomstige cel normalisatie met behulp van eiwit bepaling.
- Gehalte aan andere melkeiwitten meten. Voeg 50 µL van RIPA cellysis van de standaardoplossing (Zie Tabel van materialen). Incubeer de plaat op het ijs gedurende 30 minuten volledig lyse cellen. Alle materiaal overbrengen in een nieuwe duidelijk platte 96 goed assay bodemplaat.
- Meten eiwitconcentratie door BCA assay volgens protocol van de fabrikant.
Opmerking: De put met de extracellulaire matrix coating resulteert in een eiwitrijk-concentratie in elk putje. Daarom afgetrokken het bedrag van de well(s) (geen cellen) van de achtergrond te krijgen van de werkelijke cel eiwitconcentratie. De eiwitconcentratie afgeleid van cellen is laag in een cultuur van de 96-wells-plaat. Bovendien kan de eiwitconcentratie variëren van goed-te-goed als gevolg van de extracellulaire matrix coating. Daarom is met behulp van mobiele nummer te normaliseren van de OCR aanbevolen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het protocol beschreven, werden harten geïsoleerd van de neonatale pups dag 0. 5 x 105 cellen/pup zijn verkregen, en cardiomyocytes waren agarvoedingsbodem op dichtheid van 10 x 10,3, 20 x 103of 30 x 103 cellen/well, in 96 goed platen (figuur 2A). Na overnachting cultuur, cardiomyocytes bleken goed verbonden met het plastic gecoate oppervlak en er waren weinig niet-vastgemaakte cellen (de niet-vastgemaakte cellen verschijnen nog wel als ronde en glanzend, in vergelijking met de gezonde, gekoppelde cellen die spreadout zijn) () Figuur 2A en B). Op dit moment waren spontaan aanbestedende cardiomyocytes gemakkelijk zichtbaar. Een seeding dichtheid van 30 x 103 cellen per putje toonde samenvloeiing één dag na het zaaien van de cellen, verspreid. Als het aantal ronde (dode) cellen zeer laag waren, toonden deze resultaten aan dat het protocol de levensvatbaarheid van de hoge cellen van cardiomyocytes geeft. Cardiomyocytes waren immunostained met een antilichaam tegen sarcomeric α-actinin, een specifieke marker cardiomyocyte18 als bewijs van deze verklaring. Zoals aangetoond in figuur 2C, toonde de meeste cellen positieve kleuring van α-actinin tonen de hoge zuiverheid van de cardiomyocyte isolatie.
Een schema van een typische mitochondriale stresstest is afgebeeld in Figuur 3. De mitochondriale stress-test begint met een nulmeting van de zuurstof verbruik tarief (OCR). Dit wordt gevolgd door de injectie van oligomycin, die ATPase remt. Het verschil voor en na oligomycin injectie toont de OCR gekoppeld aan ATP productie. Vervolgens werd de ontkoppelingseiwit agent FCCP voor het meten van de maximale zuurstof verbruik tarief geïnjecteerd. Respiratoire reservecapaciteit kan worden berekend als het verschil tussen de basale en de maximale OCR. Tot slot, met de injectie van twee elektronentransport complexe remmers (antimycin A en rotenon), mitochondriale ademhaling volledig stopt, en OCR af tot het laagste niveau. Door het blokkeren van mitochondriale activiteit, op dit niveau is het zuurstofverbruik niet-mitochondriale. Basale ademhaling, proton lek en maximale ademhaling kunnen worden berekend als het verschil tussen niet-mitochondriale ademhaling (OCR in aanwezigheid van antimycin A en rotenon) en nulmeting, OCR in aanwezigheid van oligomycin en OCR in de aanwezigheid van FCCP, respectievelijk.
In deze studie, werd OCR-analyse uitgevoerd met behulp van een 96-Wells formaat extracellulaire flux analyzer systeem één dag na de isolatie van de cel. Bovendien, om te testen van het effect van serum honger op OCR, drie uur voorafgaand aan de test, de cel kweekmedia werden veranderd in regelmatige cel groei voedingsbodems met serum of zonder het serum. Na de run, werden OCR meetgegevens 1 tot 12 voor elk goed, geëxporteerd naar een spreadsheet voor registratie en verdere analyse. Metabole kenmerken werden als volgt bepaald:
Non-mitochondriale ademhaling = gemiddelde OCR (10, 11, 12)
Basale ademhaling = gemiddelde OCR (1, 2, 3)-gemiddelde OCR (10, 11, 12)
ATP productie = gemiddelde OCR (1, 2, 3)-gemiddelde OCR (4, 5, 6)
Proton lek = gemiddelde OCR (4, 5, 6) - gemiddelde OCR (10, 11, 12)
Maximale ademhaling = gemiddelde OCR (7, 8, 9) - gemiddelde OCR (10, 11, 12)
Zoals blijkt uit figuur 4A, OCR waarden gemakkelijk werden geanalyseerd en de effecten van ingespoten verbindingen waren ook duidelijk. Nog belangrijker is, de variatie van goed tot goed was klein, zoals blijkt uit de standaardfout. Stijging van de cel nummer resulteerde in toegenomen nulmeting, Oligomycin en FCCP-behandelde ademhaling. Vergeleken met serum uitgehongerd cellen, was OCR hoger in cellen geanalyseerd die had zijn geïncubeerd met groei media. Zoals blijkt uit figuur 4B, OCR wordt weergegeven als basale ademhaling, proton lek (Oligo) en maximale ademhaling (FCCP) per 1 x 104 cellen. OCR per 10 x 103 cellen is hoger in de seeding van de dichtheid van 20 K en 30 K cellen per putje dan die van 10 K cellen per putje. Zoals afgebeeld in figuur 4C, met het uitspreken van OCR ten opzichte van de basale ademhaling, de relatieve OCR van Proton lek (Oligo) en maximale (FCCP) Toon gelijkaardige waarden tussen groei media en serum uitgehongerd groepen. Deze resultaten suggereren dat zaaien van dichtheid heeft geen invloed op de relatieve proton lek en maximale oxidatieve capaciteit.
Over het geheel genomen met behulp van dit protocol, uitstekende rendementen van muis neonatale cardiomyocytes werden met succes geïsoleerd en gekweekt. OCR kan worden beoordeeld met behulp van deze myocytes in een extracellulaire flux-analysator. Uit de resultaten blijkt ook dat zaaien van dichtheid niet aanzienlijk OCR berekend door het aantal cellen beïnvloedt. Korte termijn (3 h) serum honger vermindert echter OCR. De informatie is nuttig voor het testen van muis neonatale cardiomyocytes OCR met verschillende experimentele omstandigheden.
Figuur 1: isolatie en cultuur van neonatale cardiomyocytes van pasgeboren muizen dag 0. (A) pasgeborenen zijn euthanized, en het hart van de thorax is ontleed. (B) harten zijn gewassen in HBSS (zonder Ca2 +, Mg2 +). (C) elk hart is in 8 stukken gesneden. (D) harten worden verplaatst naar een 6-well plaat gevuld met HBSS. Harten zijn gewassen met behulp van een lepel Moria ze over te brengen van goed tot goed. (E) harten zijn vooraf verteerd in trypsine-HBSS bij 4 ° C met zachte agitatie. (F) Predigested heart weefsel na een incubatieperiode van 4 uur bij 4 ° C. (G) hart weefsels na 10 min collagenase spijsvertering. (H) Collagenase verteerd hart weefsels zijn triturated. (ik) geïsoleerd cardiomyocytes werden gefilterd door een zeef van de cel. (J) Cardiomyocytes zijn Ingehuld door centrifugeren. (K) Collagenase en voedingsbodems worden verwijderd door aspiratie. (L) Cardiomyocytes zijn opnieuw geschorst in verse kweekmedium. (M) Cardiomyocytes worden gekweekt in een 10 cm kunststof schotel voor pre beplating. (N) A representatief beeld van cardiomyocytes (ronde en glanzend cellen) na 1 h van pre plating. (O) na pre plating en vervolgens verwijdering van niet-aanhanger cardiomyocytes, resterende cellen die meestal fibroblasten en endotheliale cellen zichtbaar zijn. (P) Plating cardiomyocytes in een 96-wells-plaat. (Q) reagentia in injectie havens van sensor cartridge laden. (R) Putting sensor cartridge in een machine van extracellulaire flux analyzer. Schaal bar = 0,1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: cultuur van cardiomyocytes op extracellulaire flux analyzer 96-wells-plaat. (A) representatieve beelden van cardiomyocytes in 96-wells-platen met aangegeven cell dichtheden, onmiddellijk na het zaaien (bovenste rij) of 18u post zaaien (onderste rij). (B) een hogere vergroting beeld van cardiomyocytes 18 h post zaaien op een celdichtheid van 10 x 103 cellen per putje. (C) Cardiomyocytes werden gekleurd met anti-sarcomeric α-actinin antilichaam (groen) en de DAPI (als een nucleaire vlek) (blauw). Schaal bar = 0,1 mm. De methoden die worden gebruikt voor immunokleuring vindt u in onze eerdere publicatie18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Schematische weergave van mitochondriale stresstest. Bio-energetische parameters, met inbegrip van basale, ATP-linked, maximale en Non-mitochondriale ademhaling en luchtwegen reservecapaciteit alsmede Proton lek, worden beschreven op het spoor met bijbehorende mitochondriale effectoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: mitochondriale stress assay. (A) representatieve tracering van zuurstof verbruik (OCR, in pMoles/min) van neonatale muis cardiomyocytes. Op de aangegeven tijden, oligomycin (Oligo, 1 µM), FCCP (800 nM), en RAA (rotenon en antimycin A, elke 1 µM) werden ingespoten. Voor elke meting, wordt het gemiddelde en de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) van 10 individuele putten gepresenteerd. (B) OCR wordt berekend als basale ademhaling, Oligo (Proton lek) en FCCP (maximale ademhaling) per 10 x 103 cellen. (C) OCR wordt uitgedrukt ten opzichte van de basale ademhaling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Naam van reagens en oplossing | Voorbereiding | Notities |
| Trypsine pre vergisting oplossing | Ontbinden trypsine in HBSS (zonder Ca2 + en Mg2 +). Eindconcentratie is 0,5 mg/mL. De oplossing om met een 0,22 µm filter steriliseren en houd op ijs tot gebruik. | Pre vergisting oplossing maken op de dag van het experiment. |
| Collagenase spijsvertering oplossing | Ontbinden trypsine in HBSS (zonder Ca2 + en Mg2 +). Eindconcentratie is 0,5 mg/mL. De oplossing om met een 0,22 µm filter steriliseren en houd op ijs tot gebruik. | Maak collagenase spijsvertering oplossing op de dag van het experiment. |
| Cardiomyocyte kweekmedia | Mix-375 mL DMEM, 125 mL M-199, 25 mL serum van paard en 12,5 mL FBS. Te vullen met 1% penicilline en streptomycine 1%-oplossing. | Cardiomyocyte voedingsbodems voorafgaand aan het experiment kan worden gemaakt en voor een maand bij 4 ° C worden bewaard. |
| Mitochondriale stress testmedium | Eerst maken 1 L van medium met DMEM zonder enige natrium pyruvaat, L-glutamine, glucose en Hepes, filteren om te steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Op de dag van assay, natrium pyruvaat, L-glutamine, glucose en Hepes toevoegen. Breng de pH aan 7.4 vóór gebruik (sterilisatie is niet vereist). | Eindconcentratie voor supplementen volgen: natrium pyruvaat (1 mM), L-glutamine (2 mM) en glucose (10 mM) Hepes (2 mM) |
| Oligomycin voorraad | Los oligomycin in DMSO. Ten eerste bereiden 5 mL van de stockoplossing. Zodra de oligomycin volledig is opgelost in DMSO, maken van 250 µL aliquots, opgeslagen bij-20 ° C. | Op de dag van de test, neem één aliquot te gebruiken. Vermijd veel cycli bevriezen-ontdooien. |
| FCCP voorraad | Los FCCP in DMSO. Ten eerste bereiden 5 mL van de stockoplossing. Eindconcentratie is 5 mM. Zodra de FCCP volledig is opgelost in DMSO, maken van 250 µL aliquots, opgeslagen bij-20 ° C. | Op de dag van de test, neem één aliquot te gebruiken. Vermijd veel cycli bevriezen-ontdooien. |
| Antimycin A voorraad | Los antimycin A in DMSO. Ten eerste bereiden 5 mL van de stockoplossing. Eindconcentratie is 5 mM. Antimycin A volledig is opgelost in DMSO, eenmaal 250 µL aliquots, opgeslagen bij-20 ° C. | Op de dag van de test, neem één aliquot te gebruiken. Vermijd veel cycli bevriezen-ontdooien. |
| Rotenon voorraad | Ontbinden rotenon in DMSO. Ten eerste bereiden 5 mL van de stockoplossing. Eindconcentratie is 5 mM. Zodra rotenon volledig is opgelost in DMSO, maken van 250 µL aliquots, opgeslagen bij-20 ° C. | Op de dag van de test, neem één aliquot te gebruiken. Vermijd veel cycli bevriezen-ontdooien. |
| Cel cultuur plaat coating oplossing | Controleer eerst 200 mL 0,5% gelatine oplossing. Ontbinden gelatine in PBS en autoclaaf. Op de dag van het experiment, voeg toe 50 µL van fibronectine oplossing in 5 mL gelatine oplossing om coating oplossing te maken. | 0,5% gelatine oplossing kan bij kamertemperatuur maximaal 2 maanden worden opgeslagen. |
Tabel 1: Reagentia en oplossingen.
| Injectie poort | Verbindingen en concentratie | Tijdens de run (µl) geïnjecteerd volume | Eindconcentratie in de bepaling |
| A | 16 µM oligomycin | 25 | 2 ΜM |
| B | 9 ΜM FCCP | 25 | 1 ΜM |
| C | 20 µM rotenon (Rot) en nog 20 µM antimycin A (AA) |
25 | 2 µM van elk |
Tabel 2: Injectie mengsels.
| Stappen en Procedures | Metingen en Loops |
| Kalibratie | - |
| Evenwichtsinstelling | - |
| Nulmeting | 3 keer: 3 min mixen, 2 min wachten, meten 3 min |
| Injecteren poort een (Oligomycin) | - |
| Metingen | 3 keer: 3 min mixen, 2 min wachten, meten 3 min |
| Injecteren van poort B (FCCP) | - |
| Metingen | 3 keer: 3 min mixen, 2 min wachten, meten 3 min |
| Injecteren van poort C (RAA) | - |
| Metingen | 3 keer: 3 min mixen, 2 min wachten, meten 3 min |
Tabel 3: Extracellulaire flux analyzer programma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie hebben we een eenvoudig protocol om te isoleren en kweken van muis neonatale cardiomyocytes opgericht. Met behulp van deze cardiomyocytes, we ook de voorwaarden voor het meten van zuurstof verbruik tarief met behulp van een systeem van extracellulaire flux analyzer geoptimaliseerd. Het protocol maakt het mogelijk om het gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe verschillende factoren zuurstofverbruik in de belangrijkste werkende cellen van het hart, verwant aan wat zou worden gemeten in de intact orgel kunnen wijzigen. Ons protocol is anders dan eerder gepubliceerde protocollen16,18. Ten eerste, om te bereiken hoog levensvatbaarheid, enige pups onmiddellijk bij de geboorte zijn gebruikt (d.w.z. P0), in plaats van degenen van dagen nul tot drie dagen oud (P0 naar P3 pups), die vaak worden gebruikt in andere protocollen16,19. Ten tweede om te minimaliseren van de tijd van het experiment, werden harten alleen vooraf verteerd met trypsine voor 4 uur. Bovendien, om te maken de procedure eenvoudig en reproduceerbare resultaten te bereiken, werkzaam we een minimum aantal stappen, zoals beschreven. Bijvoorbeeld, onze protocol gebruikt slechts twee soorten buffers, PBS en HBSS en slechts één type cel cultuurmedia en doet niet gebruikmaken van agitatie tijdens collagenase spijsvertering.
Om hoge levensvatbaarheid van neonatale muis cardiomyocytes, die belangrijk is voor de reproduceerbaarheid van de OCR-bepaling, zijn er enkele kritieke punten. Eerst, met behulp van P0 pasgeboren pups en pre spijsvertering van de trypsine en collagenase spijsvertering uitvoeren op dezelfde dag zijn essentieel voor het bereiken van hoge levensvatbaarheid. In de tweede plaats tijdens de collagenase spijsvertering, is het niet aanbevolen om doorroeren het hartweefsel in het waterbad 37 ° C. Hoewel agitatie wordt voorgesteld in vele protocollen, vonden we dat dit is niet nodig omdat P0 harten gemakkelijk zijn te worden verteerd door collagenase. Ten slotte, zachtjes triturating hartweefsel is kritisch te distantiëren van de cardiomyocytes na collagenase spijsvertering.
We hebben ook getest myocytes van P1 en P2 pup hartweefsel, met behulp van hetzelfde protocol. Echter voor deze oudere hart monsters vonden we dat het is noodzakelijk voor het uitvoeren van trypsine pre vergisting 's nachts om voldoende cel opbrengsten (gegevens niet worden weergegeven). Bovendien, was de levensvatbaarheid van de cellen voor P1 en P2 cardiomyocytes ongeveer 60%, vergelijkbaar met dat in andere studies16gepubliceerd. Deze resultaten suggereren dat P0 myocard relatief lagere bedragen van extracellulaire matrix dan oudere harten, wat mogelijk maakt kortere tijden voor trypsine pre vergisting heeft, wat resulteert in hogere levensvatbaarheid van de cellen en opbrengsten uit deze jongere hart.
Extracellulaire flux (XF) analyse is uitgegroeid tot een grote en populaire methode voor het meten van bio-energetische functioneren in cellen en geïsoleerde mitochondriën20,21. Tot op heden, een aantal studies gebruikt rat neonatale cardiomyocytes en zuurstofverbruik, met behulp van een Agilent XF24 systeem22,23,24 gemeten. Deze studies cuvetten van rat in tegenstelling tot de muis-afgeleide cellen, werden waarschijnlijk uitgevoerd zoals de rat cellen hebben over het algemeen hogere levensvatbaarheid van de cellen en reproduceerbaarheid van de bepaling, in vergelijking met de muis cardiale myocytes studeerde hier. Gezien het feit dat genetisch gemodificeerde dieren zijn voornamelijk gegenereerd in muis lijnen, biedt een eenvoudige en reproduceerbare protocol voor het analyseren van de bio-energetische functie in muis neonatale cardiomyocytes, zoals we in dit manuscript bespreken, mogelijkheden om te studeren mitochondriale functie in muis cardiale myocytes. Deze methode kan gemakkelijker worden vertaald naar gegevens die leiden kunnen tot het begrijpen van nieuwe mechanismen voor bio-energetische verordening in het hart, met behulp van nieuwe of bestaande genetisch gemanipuleerd muis lijnen25,26.
In deze studie werd getest we het effect van celaantal en dichtheid op OCR. Zoals blijkt uit figuur 4B, was OCR gemeten in putjes met 10 x 103, 20 x 10-3en 30 x 103 cellen/well, vergelijkbaar. Gezien het feit dat plating 30 x 103 cellen per putje geproduceerd een confluente goed binnen één dag na het zaaien, is het raadzaam cellen tussen 10 x 10,3 tot en met 30 x 10,3 cellen per putje in een 96-wells-plaat, voor de OCR-assay splitsen. Interessant vonden we 3 h serum hongerdood daalde OCR. Groeifactoren zijn bekend om te activeren glycolyse en verhoging van de zuurstof verbruik27. Het werd ook gemeld dat factoren die de groei over het geheel genomen versterken cellulaire activiteit en samentrekking van cardiomyocytes3,28. Cardiomyocyte contractie ATP generatie vereist2, die afhangt van zuurstofverbruik. Daarom suggereren deze gegevens dat serum honger zuurstofverbruik door inactivatie van cardiomyocytes afneemt. Wij raden het testen van het effect van serum honger op OCR in iemands eigen experimentele instelling.
Zoals vermeld, spelen mitochondria een sleutelrol in hartfunctie. Daarom kon identificeren roman regelgevers en trajecten oxidatieve metabolisme reguleren bieden een middel om het identificeren van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hartfalen. Aangezien een 96 goed formaat de mogelijkheid om te testen voor een groter aantal voorwaarden ten opzichte van een 24 goed formaat testen biedt, kan dit protocol ook gemakkelijk aan te passen aan het scherm van de hoge doorvoer voor de identificatie van nieuwe bio-energetische regelgevers in cardiomyocytes29 . Dus, door het combineren van ons protocol met genetisch gemanipuleerd neonatale cardiomyocytes, zoals degenen die heb mitochondriale mutaties30, kon bieden interessante studies naar de effecten van chemische verbindingen of cDNA bibliotheken, op OCR in screen wild-type vs. metabolisch-defecte cardiomyocytes.
We zijn bewust dat Neonatale en volwassen cardiomyocytes hebben vele verschillende kenmerken en metabolische functies31, met inbegrip van expressie niveaus van glucose en vetzuren metabolische enzymen32. Daarom, ideaal om te gebruiken in vitro gekweekte cardiomyocytes als een modelsysteem voor het intact hart, zou het belangrijk voor de verdere ontwikkeling van een protocol om te analyseren efficiënt OCR in volwassen cardiomyocytes, zodat men hun oxidatieve capaciteit vergelijken kan en kenmerken met neonatale cardiomyocytes. Toekomstige studies zal moeten worden voortgezet om het aanpassen van deze methodologie een reproduceerbare systeem met volwassen cardiale myocytes.
Kortom, laten we zien een eenvoudige en reproduceerbare protocol voor het analyseren van zuurstofverbruik met behulp van primaire gekweekte muis neonatale muis cardiomyocytes. Met behulp van dit protocol, kunnen wij met succes isoleren en cultuur muis neonatale cardiomyocytes en voeren deze OCR-assay met behulp van een 96-Wells formaat extracellulaire flux analyzer systeem. Ons protocol geeft hoge levensvatbaarheid en bovenal consequent reproduceerbare resultaten. Hoewel de huidige studie voornamelijk op zuurstofverbruik en een mitochondriale stress test gericht is, kan het protocol gemakkelijk worden aangepast om oxidatie van de vetzuren en glycolyse in cardiomyocytes te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken alle Ross lab en Murphy lab leden. Dit werk wordt ondersteund door de American Heart Association (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) en VA verdienste (BX003260) aan R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
