Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntese og Bioconjugation af Thiol-reaktiv reagenser til oprettelse af hjemmeside-selektivt modificerede Immunoconjugates

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/59063
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

I denne protokol, vil vi beskrive syntesen af BÆLG, en phenyoxadiazolyl methyl sulfon-baserede reagens for cargos websted-selektiv tillægger dithioler af biomolekyler, især antistoffer. Derudover vil vi beskrive syntesen og karakterisering af en BÆLG-bærende bifunctional chelator og dets konjugering til en model antistof.

Abstract

Maleimide-bærende bifunctional sonder har været ansat i årtier for site-selektiv ændring af dithioler i biomolekyler, især antistoffer. Endnu vise maleimide-baserede konjugater begrænset stabilitet in vivo fordi succinimidyl thioether kobling kan undergå en retro-Michael reaktion. Dette, selvfølgelig, kan føre til udgivelsen af det radioaktive nyttelast eller dens udveksling med thiol-bærende biomolekyler i omløb. Begge af disse processer kan producere forhøjede aktivitetskoncentrationer i raske organer samt faldt aktivitetskoncentrationer i målvæv, hvilket resulterer i reducerede imaging kontrast og lavere terapeutiske nøgletal. I 2018, rapporterede vi oprettelsen af et modulopbygget, stabil og let tilgængeligt phenyloxadiazolyl methyl sulfon reagens — døbt «BÆLG» — som en platform for thiol-baseret bioconjugations. Vi har klart vist, at BÆLG-baseret websted-selektive bioconjugations reproducerbar og håndfast oprette homogen, veldefinerede, meget immunoreaktive og meget stabil radioimmunoconjugates. Derudover har prækliniske forsøg i murine modeller af kolorektal cancer vist at disse site-selektivt mærket radioimmunoconjugates udstille langt overlegen in vivo ydeevne i forhold til radiolabeled antistoffer syntetiseres via maleimide-baserede Bøjning af udsagnsord. I denne protokol, vil vi beskrive fire-trins syntesen af BÆLG, oprettelsen af en bifunctional BÆLG-bærende variant af den allestedsnærværende chelator DOTA (BÆLG-DOTA) og konjugation af BÆLG-DOTA til målretning af HER2 antistof trastuzumab.

Introduction

Radioaktive kemikere har længe udnyttet selektivitet og specificitet af antistoffer for biomarkører af sygdom for både nukleare billeddannelse og målrettet strålebehandling1. Langt den mest almindelige metode til radiolabeling af antistoffer er baseret på den vilkårlige fastgørelse af radiolabeled proteser grupper eller radiometal chelatorer aminosyrer — oftest lysines — inden for strukturen af immunglobulin ( Figur 1A)2. Mens denne strategi er helt sikkert effektiv, kan dens tilfældige, ikke-site-specifikke karakter skabe problemer. Specifikt, traditionelle bioconjugation metoder producerer dårligt defineret og heterogene immunoconjugates består af blandinger af tusindvis af forskellige regioisomers, hver med sit eget sæt af biologiske og farmakologiske egenskaber3. Derudover kan tilfældige bioconjugation hæmme immunoreactivity af antistoffer, hvis lasten er føjet til den immunoglobulin antigen-bindende domæner.

Gennem årene er blevet udviklet en række stedspecifikke og site-selektive bioconjugation strategier for at imødegå disse problemer4,5. Den mest almindelige af disse tilgange er baseret på ligatur af maleimide-bærende sonder til sulfhydryl grupper af cysteines (figur 1B). IgG1 antistoffer naturligt indeholder 4 Inter kæde disulfidbroer, forbindelser, der selektivt kan reduceres for at give gratis dithioler kan undergå Michael tilføjelse reaktioner med maleimides at danne succinimidyl thioether obligationer. Brugen af dithioler og maleimides er helt sikkert en forbedring i forhold til traditionelle metoder, og en bred vifte af maleimide-bærende synthons og bifunctional chelatorer er tilgængelige i øjeblikket. Det er dog vigtigt at bemærke, at denne metode har alvorlige begrænsninger samt. Maleimide-baseret immunoconjugates udviser begrænset stabilitet in vivo fordi tilknytningen af thioether kan underkastes en retro-Michael reaktion (figur 2)6,7,8,9, 10. dette, selvfølgelig, kan føre til udgivelsen af det radioaktive nyttelast eller dens udveksling med thiol-bærende biomolekyler i omløb (f.eks glutathion eller serum albumin). Begge af disse processer kan øge aktivitetskoncentrationer i raske organer samt reducere aktivitetskoncentrationer i målvæv, hvilket resulterer i reducerede imaging kontrast og lavere terapeutiske nøgletal. Flere alternative thiol-reaktiv reagenser er blevet udviklet i et forsøg på at omgå disse problemer, herunder tosylates, bromo - og iodo-acetyls, og vinyl sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. men, alle disse tilgange har begrænsninger, der har hæmmet deres udbredte anvendelse.

Omkring fem år siden, banebrydende laboratoriet for den sene Carlos Barbas III på Scripps Research Institute brug af phenyloxadiazolyl methyl sulfones som reagenser for selektiv dannelsen af meget stabile forbindelser med dithioler (figur 1 c og figur 3) 18 , 19. forfatterne ansat en phenyloxadiazolyl methyl sulfon-bærende variant af fluorescein at ændre flere antistoffer manipuleret til at indeholde restkoncentrationer, gratis cystein, i sidste ende producerer immunoconjugates med højere stabilitet end analoge konstruktioner oprettet ved hjælp af maleimide-baseret sonder. Ved at se denne lovende arbejde, var vi noget overrasket over, at denne teknologi havde kun været brugt næppe i radiokemi og havde endnu ikke blevet brugt på alle i syntesen af bifunctional chelatorer eller radioimmunoconjugates20,21 . Denne mangel på ansøgninger, men snart begyndte at være mere fornuftigt: flere forsøg på at skaffe reagenset fra Sigma Aldrich resulterede i modtagelsen af komplekse blandinger af nedbrydningsprodukter med < 15% af den ønskede sammensatte. Derudover syntetisere den rapporterede reagens os heller ikke var en realistisk mulighed, som de offentliggjorte syntesevejen er lidt besværlig og kræver avanceret organisk kemi udstyr som de fleste radiokemi og molekylær billeddannelse laboratorier-herunder vores — simpelthen ikke besidder.

Svar på disse hindringer satte vi sig for at skabe en let tilgængelig og meget stabil phenyloxadiazolyl methyl sulfon reagens, der kan opnås via en robust og rimelig facile syntesevejen. Tidligere i år, rapporterede vi oprettelsen af et modulopbygget, stabil og let tilgængeligt phenyloxadiazolyl methyl sulfon reagens — døbt «BÆLG» — som en platform for thiol-baserede bioconjugations (figur 1 c og figur 3)22. Den vigtigste forskel mellem BÆLG og reagens rapporteret af Barbas, et al. er, at førstnævnte beskæftiger en anilin ring fastgjort til phenyloxadiazolyl methyl sulfon gruppe, mens sidstnævnte har en fenol i den samme position (figur 4). Denne ændring muliggør en mere enkel og tilgængelig syntesevejen samt — hvis vores erfaring med den kommercielt tilgængelige sammensatte er symbolske — en mere stabil endelige reagens. I dette arbejde, vi også syntetiseres et par BÆLG-bærende bifunctional chelatorer — BÆLG-DFO og BÆLG-CHX-A''-DTPA — at lette oprettelsen af 89Zr- og 177Lu-mærket radioimmunoconjugates, henholdsvis. Vi vil diskutere, har vi bevist, at BÆLG-baseret websted-selektive bioconjugations reproducerbar og håndfast oprette homogen, veldefinerede, meget immunoreaktive og meget stabil radioimmunoconjugates. Derudover har prækliniske forsøg i murine modeller af kolorektal cancer vist at disse site-selektivt mærket radioimmunoconjugates udstille overlegen in vivo ydeevne i forhold til radiolabeled antistoffer syntetiseres via maleimide-baserede Bøjning af udsagnsord.

Det overordnede mål for dette arbejde er at lette oprettelsen af veldefinerede, homogen, meget stabilt og højt immunoreaktive immunoconjugates til in vitro- og in vivo applikationer. Den syntetiske metode er enkel nok skal udføres i næsten ethvert laboratorium, og den overordnede BÆLG reagens kan ændres med et væld af forskellige chelatorer, fluorophores eller last. I denne protokol og den ledsagende video, vil vi beskrive den enkle, fire-trins syntese af BÆLG (figur 5); oprettelsen af en BÆLG-bærende variant af DOTA, en meget udbredt chelator for koordinering af 64Cu, 68Ga, 111i 177Lu og 225Ac (figur 6); og bioconjugation af BÆLG-DOTA til en model antistof, HER2-targeting IgG1 trastuzumab (figur 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sammenfatning af 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)

Bemærk: På grund af lys-følsomhed af sammensat, holde alle reaktioner i folie-dækket fartøjer.

  1. I en 10 mL rund bund kolbe, 100 mg (0.517 mmol, 1 ækvivalent) af 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol i 3 mL metanol opløses.
  2. Denne løsning, tilføje 360 μL af diisopropylethylamine (DIPEA; 2,07 mmol; 4 ækvivalenter; vandfri) og en lille magnetiske rør bar. Dække kolben med en gummiprop og omrystes løsningen i 10 minutter ved stuetemperatur.
  3. Bruger en 1 mL glas sprøjte, stikke en hul gennem gummiprop og hurtigt tilføje 32 μl (0.517 mmol, 1 ækvivalent) af metyliodid til denne blanding. Lad blandingen reagerer i 45 minutter ved stuetemperatur.
    Bemærk: På grund af de potentielle skadelige virkninger af metyliodid, denne reaktion bør ske i en kemisk stinkskab.
  4. Indstil vandbad i en rotationsfordamper til 40 ° C og langsomt reducere presset for at fjerne opløsningsmiddel råd til en hvid solid.
  5. Opløse solid i 3 mL ethylacetat og vaskes mindst tre gange med 5 mL opløsning af 0,1 M natriumcarbonat ved hjælp af en skilletragt.
    Bemærk: Regelmæssigt tage stedet-undersøgelser af den vandige fase under en UV-lampe; Når intet er set under lampen, kan du stoppe vasker.
  6. Indsamle den organiske fase i en skilletragt og vask det med vand, indtil pH af den vandige fase når 6,8-7,0 (ved hjælp af pH papir).
  7. Indsamle den organiske fase og tilføje magnesium sulfat for at fjerne alle spor af vand.
    Bemærk: Magnesium-sulfat tilføjes med en lille spatel, hvorefter løsningen bør være svirrede. Hvis fine partikler af den tørremiddel ses stadig, er løsningen tør. Hvis ikke, tilsættes små mængder af magnesium-sulfat, indtil fine partikler kan ses.
  8. Filtrer blandingen ved hjælp af en mellemlang glasfritte eller filtrerpapir.
  9. Fordampe de flygtige stoffer ved hjælp af en rotationsfordamper, en proces, der skal producere den ønskede vare som hvide nåle.

2. syntese af tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] karbamat (2)

Bemærk: På grund af lys-følsomhed af sammensat, holde alle reaktioner i folie-dækket fartøjer.

  1. I et 25 mL rund bund målekolbe, opløses 387 mg (0.92 mmol, 1,0 tilsvarende) af NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine i 10 mL dichlormethan.
  2. Denne løsning, tilføje 480 μL (2,76 mmol, 3 ækvivalenter) DIPEA, 264 mg (1,38 mmol; 1,5 ækvivalenter) af N-ethyl - N′-[3-(dimethylamino) propyl] carbodiimide hydrochlorid (EDCI), og 200 mg (0,97 mmol, 1,1 ækvivalenter) af 1. Forsegle fartøj med en prop, glas og lad reaktionen rør til 5 dage ved stuetemperatur.
    Bemærk: Være opmærksomme på fordampningen af dichlormethan. Hvis det er nødvendigt, tilføje mere i hele ugen.
  3. Vask blandingen i en skilletragt med en opløsning af 1 M saltsyre (3 x 5 mL).
  4. Indsamle den organiske fase og fortsætte med at vaske det i en skilletragt, først med en opløsning af 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL) og derefter med vand (3 x 5 mL).
  5. Indsamle den organiske fase og tilføje magnesium sulfat for at fjerne alle spor af vand (Se trin 1.7). Filtrer blandingen ved hjælp af en mellemlang glasfritte eller filtrerpapir.
  6. Ved hjælp af en roterende fordamper Fjern de flygtige opløsningsmidler under reduceret tryk har råd til en off-white solid.
  7. Re opløses dette solid i 10 mL ethylacetat og bundfald produkt via gradvis (f.eks. 2 mL ad gangen) tilsætning af 30 mL med cyclohexan.
  8. Filtrer løsning med filtrerpapir eller en mellemlang glasfritte at få produktet som et hvidt pulver.

3. syntesen af tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] karbamat (3)

Bemærk: På grund af lys-følsomhed af sammensat, holde alle reaktioner i folie-dækket fartøjer.

  1. 30 mg (0,05 mmol; 1 ækvivalent) 2 i 4 mL dichlormethan opløses i en 10 mL runde-bunden kolbe.
  2. Langsomt tilføje i 49 mg (0.2 mmol; 4 ækvivalenter) 70% m-chloroperbenzoic syre til denne blanding og dække reaktion fartøj med en prop, glas. Opløsningen omrøres natten over ved stuetemperatur, i sidste ende giver en gul blanding.
  3. Vaske gul blandingen i en skilletragt, først med en 0,1 M opløsning af NaOH (3 x 5 mL) og derefter med vand (3 x 5 mL).
  4. Tør den organiske fase med magnesium-sulfat og Filtrer blandingen ved hjælp af en mellemlang glasfritte eller filtrerpapir.
  5. Ved hjælp af en roterende fordamper Fjern opløsningsmidler under reduceret tryk at få produktet som en bleg solid.

4. syntese af N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] phenyl} succinamide (BÆLG)

  1. I et 25 mL rund bund kolbe, 30 mg 3 i 2,0 mL dichlormethan opløses.
  2. Tilsæt 400 μL af trifluoreddikesyre og forsegle kolben med en prop, glas.
  3. Rør reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 3 timer.
  4. Ved hjælp af en roterende fordamper Fjern flygtige stoffer under reduceret tryk ved stuetemperatur, forlade en olieagtig rest.
  5. Remanensen opløses fedtet i 7 mL vand, og bruger en skilletragt, vask med ethylacetat (3 x 4 mL). Holde den vandige lag.
  6. Lyophilize den vandige lag råd til BÆLG som et hvidt pulver.
    Bemærk: De molære absorption koefficienter for BÆLG på 280 og 298 nm er 9.900 og 12.400 cm-1M-1, henholdsvis.

5. syntesen af BÆLG-DOTA

  1. I en 1,5 mL microcentrifuge rør, 10 mg BÆLG i 300 μL af dimethylsulfoxid (0,018 mmol; 1 ækvivalent) opløses og tilsæt 26 μL af N, N-diisopropylethylamine (0,15 mmol; 8 ækvivalenter).
  2. 15.2 mg DOTA-Bn-NCS (0,02 mmol; 1,2 ækvivalenter) i 100 μL af dimethylsulfoxide opløses og kombinere denne løsning med løsningen fra trin 5.1. Forsegle microcentrifuge røret.
  3. Tillad reaktion på inkuberes natten over ved stuetemperatur.
  4. Rense den fabrikat benytter omvendt-fase C18 HPLC kromatografi for at fjerne enhver ureageret DOTA-Bn-NCS.
    Bemærk: Retentionstiderne er naturligvis meget afhængige af HPLC-udstyr af hvert laboratorium (pumper, kolonner, slanger, etc.), og passende kontrol bør køres før rensning. Men at præsentere et eksempel, hvis et forløb af 5:95 MeCN/H2O (begge med 0,1% TFA) til 70:30 MeCN/H2O (begge med 0,1% TFA) over 30 min, en semi-forberedende 19 x 250 mm C18 kolonne og en gennemstrømningshastighed på 6 mL/min. der bruges , BÆLG, p-SCN-Bn-DOTA og BÆLG-DOTA vil have retentionstider af omkring 14,4, 18,8 og 19,6 min, henholdsvis. Alle tre forbindelser kan overvåges ved 254 nm.

6. bioconjugation af BÆLG-DOTA til trastuzumab

Bemærk: For dette trin, vi startede med en 16,4 mg/mL stamopløsning af trastuzumab.

  1. I en lav protein bindende 1,5 mL microcentrifuge tube, fortyndes 61 μL af trastuzumab stamopløsningen (1 mg; 6,67 nmol, 1 ækvivalent) med 859 μL af fosfatbufferet saltopløsning (pH 7,4).
  2. Til denne blanding, tilføje 6,7 μL af frisklavet 10 mM opløsning af TCEP i H2O (66.7 nmol, 10-ækvivalenter).
  3. Forberede en 1 mg/mL opløsning af BÆLG-DOTA i DMSO og tilføje 73 μL af denne BÆLG-DOTA løsning til reaktionsblandingen (66.67 nmol, 10-ækvivalenter).
  4. Forsegle microcentrifuge rør og Inkuber løsningen i 2 timer ved stuetemperatur.
  5. Efter 2 timer, rense immunoconjugate ved hjælp af en færdigpakket engangs størrelse udstødelse udvanding kolonne.
    1. Først, Blandingen henstår kolonnen størrelse udelukkelse som beskrevet af leverandøren til at fjerne enhver konserveringsmidler findes i kolonnen under opbevaring. En typisk procedure indebærer vask kolonnen 5 gange med et volumen på PBS, der svarer til mængden af kolonnen: 5 x 2,5 mL PBS.
    2. Næste, Tilføj reaktionsblandingen til kolonnen størrelse udstødelse noterer sig omfanget af reaktionsblandingen.
    3. Efter reaktionsblandingen er trådt kolonnen, tilføje en passende mængde af PBS til at bringe den samlede mængde af løsningen føjes til kolonnen op til 2,5 mL. For eksempel, hvis konjugation reaktion resulterede i en samlet maengde paa 1,3 mL, skulle 1,2 mL yderligere PBS føjes til kolonnen.
    4. Endelig indsamle den fabrikat benytter 2 mL PBS, som af elueringsvæsken.
  6. Koncentrere sig den endelige immunoconjugate med centrifugal filtrering enheder med 50 kDa molekylvægt afskæring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De første fire trin i denne protokol-syntesen af BÆLG — har været designet til at være robust og pålidelig. Deprotonation og substitution af 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol til at danne det ønskede thioether produkt frembyder thioether i > 99% udbytte efter blot 45 minutter. Næste, ligatur mellem 1 og N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine blev opnået via en standard peptid kobling procedure, hvilket resulterer i samlingen af vare (2) i 55% udbytte. Derefter, oxidation af 2 blev udført ved hjælp af m-chloroperoxybenzoic syre, en udbredte oxidant. Efter vask trin, 3 blev fremstillet som en bleg solid i ~ 90% udbytte. Fjernelse af gruppen tert-butyloxycarbonyl beskyttelse fra 3 blev endelig gjort standardprocedurer, ved hjælp af forholdet 4:1 af dichloromethane:trifluoroacetic syre. Efter ingot af den vandige fase, vores produkt — BÆLG — blev fremstillet som et hvidt pulver i 98% udbytte. Udviklingen i reaktionen blev fulgt op via tyndtlagskromatografi, og hvert produkts identitet blev bekræftet via 1H-NMR, 13C-NMR og HRMS-ESI (tabel 1).

En af de vigtigste fordele ved BÆLG reagens er dens modularitet. En række chelatorer, fluorophores, toksiner eller anden last kan føjes til den sammensatte vedhæng Amin. I protokollen ved hånden bruger vi den allestedsnærværende chelator DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic syre) som en repræsentativ nyttelast. DOTA, selvfølgelig, er blevet brugt i en bred vifte af Biomolekylær radioaktive lægemidler som en chelator for radiometals herunder 68Ga, 64Cu, 111i 90Y, 177Lu, og 225Ac. Med henblik herpå, blev en isothiocyanat-bærende variant af DOTA (p-SCN-Bn-DOTA) ansat og koblet til vedhæng Amin af BÆLG via enkel kobling betingelser. Den resulterende bifunctional chelator blev derefter renset via omvendt fase C18 HPLC og isoleret i ~ 75% udbytte. Som med de andre prækursorer fremskridt reaktion blev fulgt via tyndtlagskromatografi, og produktet identitet blev bekræftet via 1H-NMR, 13C-NMR og HRMS-ESI (tabel 1).

I det sidste trin i protokollen diskutere vi BÆLG-DOTA site-selektive bioconjugation til en model immunoglobulin, HER2-targeting antistof trastuzumab. Med henblik herpå, disulfid forbindelser af det antistof hængslet regionen reduceres selektivt med reduktionsmiddel TCEP [tris(2-carboxyethyl) phosphine]. Efter denne nedsættelse trin, er antistoffet inkuberes med BÆLG-DOTA i 2 timer ved stuetemperatur og efterfølgende renset via størrelse udstødelse kromatografi. I dette tilfælde den renset, DOTA-bærende immunoconjugate blev fremstillet i ~ 80% udbytte, og MALDI-ToF analyse afslørede en grad af mærkning (DOL) af ~1.8 DOTA/mAb. Generelt har vi fundet at 10 ækvivalenter af TCEP, 10 ækvivalenter af BÆLG reagens, og en 2 h inkubation er tilstrækkelige til at give en immunoconjugate med en DOL af 2 BÆLG/mAb (tabel 2). Dette resultat forbliver konsistent på tværs af en række menneskelige, humaniseret og kimære IgG1 antistoffer; men de samme betingelser producere immunoconjugates med en DOL af kun ~1.5 når du arbejder med murine IgG1 antistoffer. Alt dette er sagt, forskere skal optimere disse reaktionsbetingelser for nye antistoffer og BÆLG-bærende ladninger. Endelig, og ikke mindst med hensyn til det endelige produkt, har vi gentagne gange og reproducerbar fundet at BÆLG-baserede immunoconjugates udviser immunoreactivities lig med eller bedre end analoge konstruktioner lavet ved hjælp af tilfældige eller maleimide-baserede konjugation strategier.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af bioconjugations ved hjælp af (A) Amin-reaktiv, (B) maleimide-bærende, og (C) BÆLG-bærende ladninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Michael tilføjelsen af en thiol-bærende biomolekyle (grøn) og en radionukleid-bærende maleimide (gul) til at danne en radiolabeled bioconjugate, såvel som de yderligere reaktioner, der radiolabeled konstruktionen kan undergå under overværelse af endogene thiol-bærende molekyler (lyserød). RT = stuetemperatur. Figur genoptrykt med tilladelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelatorer for den skabelse af Site-selektivt ændrede Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Skematisk af reaktionen mellem BÆLG og en thiol. Figur genoptrykt med tilladelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelatorer for den skabelse af Site-selektivt ændrede Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Strukturen i BÆLG (A) samt (B) reagenset rapporteret af Barbas, et al.18,19venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Ordningen af fire-trins syntesen af BÆLG. Figur genoptrykt med tilladelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelatorer for den skabelse af Site-selektivt ændrede Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Ordningen af syntesen af BÆLG-DOTA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Ordningen af bioconjugation af trastuzumab med BÆLG-DOTA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Sammenligning af in vivo funktionsmåden for 89Zr-mærket radioimmunoconjugates af huA33 skabt ved hjælp af BÆLG-baseret (89Zr-DFO-BÆLG-huA33) og maleimide-baserede (89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation strategier. Planar (venstre) og maksimal intensitet projektion (højre) PET billeder af athymiske nøgen mus forsynet med A33 antigen-udtrykker SW1222 kolorektal cancer xenografts (hvid pil) efter injektion af 89Zr-DFO-BÆLG-huA33 og 89 Zr-DFO-mal-huA33 (140 µCi, 60-65 µg). De koronale skiver skærer midt i tumorer. Figur genoptrykt med tilladelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelatorer for den skabelse af Site-selektivt ændrede Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Sammenligning af in vivo funktionsmåden for 89Zr-mærket radioimmunoconjugates af huA33 skabt ved hjælp af BÆLG-baseret (89Zr-DFO-BÆLG-huA33) og maleimide-baserede (89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation strategier. Biodistribution data efter indgift af 89Zr-DFO-BÆLG-huA33 og 89Zr-DFO-mal-huA33 (30 µCi, 15-18 µg) til athymiske nøgen mus forsynet med A33 antigen-udtrykker subkutane SW1222 menneskelige kolorektal cancer xenografts. Værdier for mave, tyndtarmen og tyktarmen omfatter indholdet. Figur genoptrykt med tilladelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelatorer for den skabelse af Site-selektivt ændrede Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Sammensatte 1 H-NMR Skiftehold 13 C-NMR Skiftehold HRMS
1 (500 MHz, CDCl3) 7,79 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6.72 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 4,04 (2 H, br s), 2,75 (3 H, s) (125 MHz, CDCl3) 166.3, 163.7, 149.7, 128.5, 114.8, 113,5, 14,8 m/z beregnet årligt beløb for [C9H9N3OS + H]+: 208.0539; fundet: 208.0539; Δ: 0.0 ppm
2 (500 MHz, CDCl3) 9.68 (1H, s), 7.91 (2H, d, J = 9,0 Hz), 7.71 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6.82 (1H, s), 4,99 (1H, s), 3.70-3,45 (12H, m), 3.41 (2H, q, J = 6.0 Hz), 3,20 (2H, q, J = 6,5 Hz), 2,76 (3H, s), 2,71 (2H, m), 2,63 (2H m), 1,80-1.70 (4 H, m), 1.42 (9 H, s) (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.3, 165.8, 164.6, 156.2, 141.8, 127.7, 119.6, 118.6, 79.2, 70.6, 70,5, 70,3, 70,1, 69,6, 38,8, 38,5, 33,5, 31,6, 29,9, 28,6, 14,8 m/z beregnet årligt beløb for [C28H43N5O8S + Na]+: 632.2725; fundet: 632.2722; Δ:-0.47 ppm
3 (500 MHz, CDCl3) 9,99 (1 H, s), 7,98 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7,75 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6.88 (1 H, s), 4,99 (1 H, s), 3,66-3,50 (15 H, m), 3.41 (2 H, q, J = 6.0 Hz), 3,20 (2 H, q, J = 6,5 Hz), 2,71 (2 H, m), 2,65 (2 H, m) , 1,80-1.70 (4H, m), 1.43 (9H, s) (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.5, 166.5, 161,6, 156.1, 143.4, 128.7, 119.6, 116.4, 79.1, 70,5, 70,4, 70.2, 70,0, 69,4, 43,0, 38,8, 38,4, 33.2, 31.3, 29,7, 28,4 m/z  Beregnet årligt beløb til [C28H43N5O10S + H]+: 642.2803; fundet: 642.2797; Δ:-0.93 ppm
BÆLG (500 MHz, D2O) 7,85 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7,55 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 3.60-3,45 (15 H, m), 3,45 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3,20 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3.04 (2 H, t, J = 7,0 Hz), 2,67 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 2,54 (2 H t, J = 6,5 Hz), 1,87 (2 H, qt, J = 6,5 Hz), 1,70 (2 H, qt, J = 6,5 Hz) (125 MHz, D2O) 174.5, 173.2, 166.8, 161.4, 142.2, 128.6, 120,3, 116.6, 69,4, 69,4, 69,3, 69,2, 68,2, 68,2, 42,5, 37.6, 36,2, 31,9, 30,7, 28.2, 26.4 m/z  Beregnet årligt beløb for [C23H35N5O8S + H]+: 542.2279; fundet: 542.2281; Δ: 0,37 ppm
BÆLG-DOTA (600 MHz, DMSO-d6) 10.46 (1 H, s), 9.74 (1 H, bs), 8.04 (2 H, d, J = 8,6 Hz), 7,99 (1 H, s), 7,90 (1 H, t, J = 5,0 Hz), 7,86 (2 H, d, J = 6,5 Hz), 7.44 (2 H, d, J = 7,9 Hz), 7.24 (2 H, d, J = 7.1 Hz), 4.35-2,41 (45 H, m) , 3.70 (3H, s), 1,76 (2H, q, J = 6.3 Hz), 1.61 (2H, q, J = 6,5 Hz) (125 MHz, DMSO-d6) 171.8, 171.4, 166.1, 162,2, 158.8, 158.6, 129.8, 129.0, 127.6, 123.3, 119,5, 118.5, 116.5, 116.4, 70.2, 70,1, 70,0, 68.7, 68,5, 43,4, 41,8, 36,3, 32.2, 30.4, 29,8, 29.1 m/z  Beregnet årligt beløb for [C47H68N10O16S2+ H]+: 1093.4334; fundet: 1093.4327; Δ:-0.64 ppm

Bord 1. Karakterisering data for de syntetiske mellemprodukter beskrives og BÆLG og BÆLG-DOTA.

Antistof Type Konstant Region Forholdet mellem BÆLG: mAb
Humant plasma IgG Menneskelige Human IgG 2.1 ± 0,1
Trastuzumab Humaniseret Menneskelige IgG1 2.0 ± 0,1
huA33 Humaniseret Menneskelige IgG1 2.1 ± 0,1
Cetuximab Kimære Menneskelige IgG1 2.2 ± 0,1
AR 9,6 Murine Murine IgG1 1.4 ± 0,1
Musen plasma IgG Murine Murine IgG 1,5 ± 0,1

Tabel 2. Graden af mærkning af forskellige antistoffer efter konjugation med en BÆLG-bærende fluorophore. Værdier er vist standardafvigelser. Tabel genoptrykt med tilladelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelatorer for den skabelse af Site-selektivt ændrede Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne betænkning, har vi valgt ikke at medtage nogen protokoller til radiolabeling eller in vivo forsøg. Vores grunde er ligetil. Med hensyn til tidligere radiolabeling af en BÆLG-baserede immunoconjugate adskiller sig ikke på alle fra af en immunoconjugate, der er syntetiseret ved hjælp af andre bioconjugation strategier, og disse procedurer har blevet grundigt gennemgået andetsteds2 . Hvad angår sidstnævnte, kan detaljerne i prækliniske undersøgelser in vivo forsøg (dvs. musemodeller, doser, etc.) variere bredt både programmet og antistof/antigen system.

Vores tidligere undersøgelser med 89Zr-mærket varianter af huA33 giver en overbevisende illustration af fordelene ved BÆLG-baseret bioconjugations. HuA33 er en humaniseret IgG1 antistof, der er rettet mod A33 antigen, en transmembrane glycoprotein udtrykt på > 95% af tyktarms-og endetarmskræft23,24. I vores tidligere manuskript22rapporterer vi syntesen af 89Zr-DFO-huA33 radioimmunoconjugate ved hjælp af begge BÆLG - og maleimide-baserede bioconjugation strategier. To radiolabeled antistoffer — 89Zr-DFO-BÆLG-huA33 og 89Zr-DFO-mal-huA33 — blev produceret i næsten identiske udbytte, renhed, specificitet aktivitet og immunoreactivity. Kritisk, men de to radioimmunoconjugates udstillet dramatisk anderledes stabilitet i humant serum: efter inkubation i syv dage ved 37 ° C, 89Zr-DFO-BÆLG-huA33 forblev 86 ± 1% intakt, mens dens maleimide-baserede fætter var kun 61 ± 5% intakt. In vivo PET imaging og biodistributionen eksperimenter i athymiske nøgen mus forsynet med A33 antigen-udtrykker SW1222 menneskelige kolorektal cancer xenografts afslørede voldsomme forskelle i de to radioimmunoconjugates (figur 8 og in vivo adfærd Figur 9). Både 89Zr-DFO-BÆLG-huA33 og 89Zr-DFO-mal-huA33 giver høj aktivitetskoncentrationer i tumor væv: 56.4 ± 6.9%ID/g og 49,6 ± 9.3%ID/g, henholdsvis 48 timer efter indgift. Men de maleimide-baserede radioimmunoconjugate produceret betydeligt højere aktivitetskoncentrationer i sundt væv end BÆLG-baserede agent. For eksempel, 89Zr-DFO-mal-huA33 produceret aktivitetskoncentrationer 3.1 ± 0,5, 2,7 ± 0,4 og 12,2 ± 0,4% ID/g i nyrerne, leveren og knogle, henholdsvis på 120 h efter injektion, værdier som dramatisk overstiger aktivitetskoncentrationer produceret af 89Zr-DFO-BÆLG-huA33 i de samme væv (1,4 ± 0,1, 1,2 ± 0,3 og 4,3 ± 0,6% ID/g). Faktisk, 89Zr-DFO-BÆLG-huA33 produceret lavere aktivitetskoncentrationer i alle ikke-målarter væv (undtagen tyktarmen) på 120 h efter injektion i forhold til 89Zr-DFO-mal-huA33. Som et resultat, er tumor til orgel aktivitet koncentration nøgletal for 89Zr-DFO-BÆLG-huA33 generelt bedre end 89Zr-DFO-mal-huA33; især, svulsten til leveren, tumor til milt, tumor til nyre, og tumor-til-knogle aktivitet koncentration er nøgletal næsten dobbelte af det BÆLG-baseret immunoconjugate i forhold til dens maleimide-afledte fætter. I betragtning af at den væsentligste forskel mellem de to radioimmunoconjugates var bioconjugation håndtaget af chelator, er øget stabilitet af BÆLG-thiol koblingen næsten helt sikkert ansvarlig for denne forbedrede in vivo ydeevne.

Tager en bredere synsvinkel, er den ikke-site-selektive bioconjugation i sonder til lysines inden for antistoffer ganske vist en enkel og let tilgang til ændring af antistoffer. Tilstedeværelsen af flere lysines fordelt i hele strukturen af immunoglobuliner betyder imidlertid, at det er umuligt at udøve kontrol over præcis websted eller graden af bioconjugation2. Som et resultat, dette tilfældige strategi producerer ofte dårligt defineret og særdeles heterogene immunoconjugates, som kan udstille faldt immunoreactivity hvis ligations forekommer inden for den antigen-bindende domæner3. Fordelene ved site-selektive metoder til bioconjugation har været illustreret gentagne gange for både radioimmunoconjugates og antistof-drug konjugater8,14,25,26, 27,28,29,30. Kort sagt, ikke kun site-selektive bioconjugation strategier producerer mere veldefinerede og homogene immunoconjugates end traditionelle metoder, de skaber også tænkelig agenter, radioimmunotherapeutics og ADCs med forbedret in vivo ydeevne. Men hvor BÆLG-baserede ligations stå i sammenligning til andre site-selektiv ændring strategier? Generelt tilgange til site-selektiv ændring af antistoffer kan inddeles i fire kategorier: (1) ligations til cystein restkoncentrationer, (2) manipulationen af tunge kæde glycans, (3) chemoenzymatic transformationer, og (4) anvendelsen genteknologi4,5. Selvfølgelig, dette klassifikationssystem er ikke perfekt, og nogle metoder (f.eks. ændring af tunge kæde glycans med enzymer) uundgåeligt kvalificere sig til to kategorier. Hver strategi har sine egne fordele og ulemper. Genteknologi-baserede tilgange giver udsøgt kontrol over stedet for konjugering, men de er komplekse og dyre31,32,33. Oxidative koblinger til tunge kæde glycans er billig og ligetil, men de risikerer oxidativ skade på den strukturelle integritet af immunoglobulin34,35,36,37 ,38.

Den øverste fordel af thiol-baserede bioconjugations — BÆLG inkluderet — er deres enkelhed og modularitet. Deres vigtigste begrænsning, på den anden side skyldes tilstedeværelsen af flere dithioler inden for et antistof, et træk, hvilket reducerer graden af kontrol over både site af konjugering og antallet af ændringer pr. antistof. I denne forstand er kombinationen af thiol-baserede ligations og antistoffer, der er blevet genetisk manipuleret til at besidde gratis cystein rester et særligt attraktivt tilgang. Som vi har bemærket, er en anden begrænsning af maleimide-baseret thiol ligations modtagelighed for succinimidyl thioether obligation til retro-Michael tilføjelser in vivo. Endnu kritisk, ophæver brug af PODS dette problem.

Inden vi slutter, er det vigtigt at bemærke, at den emergente karakter af BÆLG teknologi kan skabe sit eget sæt af forhindringer. For eksempel, ingen BÆLG-bærende bifunctional chelatorer er (i øjeblikket) kommercielt tilgængelige, og der er ingen data, der beskæftiger sig med klinisk farmakologi, toksikologi eller immunogenicitet af BÆLG-baseret immunoconjugates. Vi mener imidlertid, at BÆLG-baserede bioconjugations har potentiale til at ændre fundamentalt den måde immunoconjugates er syntetiseret i både laboratorium og klinik. I øjeblikket har vi kun anvendt denne kemiske teknologi til udvikling af radioimmunoconjugates for nukleare billeddannelse og radioimmunotherapy, selvom undersøgelser af nytten af denne tilgang til opførelse af antistof-drug konjugater og andre Biomolekylær medicin er i øjeblikket undervejs. I sidste ende, håber vi inderligt, at denne protokol — og især den enkle og simple kemi, som vi har udviklet — vil hjælpe med at fremme brugen af phenyloxadiazolyl methyl sulfones til sulfhydryl-baserede bøjninger og anspore et skift i feltet fra maleimides til mere stabile og mere pålidelige alternativer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Dr. Sai Kiran Sharma til nyttige samtaler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol Sigma-Aldrich 675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube Eppendorf 925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube Fisherbrand 05-408-129
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore EN300000141G
Cyclohexane Fisher Scientific C556-4
Dichloromethane Fisher Scientific AC383780010
Diisopropylethylamine MP Biomedicals, LLC 150915
Dimethylsulfoxide Fisher Scientific 31-727-5100ML
Ethyl Acetate Fisher Scientific E145 4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Iodomethane Sigma-Aldrich 289566-100G
Magnesium Sulfate Acros Organics 413485000
m-chloroperbenzoic acid Sigma-Aldrich 273031
Methanol Fisher Scientific A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine Sigma-Aldrich 671401 Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 3450
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P5493 10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich S7795
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
TCEP ThermoFischer Scientific 20490
Triethylamine Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid Fisher Scientific A116-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  3. Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
  4. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
  5. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
  6. Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
  7. Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
  8. Shen, B. -Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
  9. Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
  10. Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
  11. Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
  12. Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
  13. Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
  14. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  15. Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
  16. Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -w, Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
  17. Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
  18. Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
  19. Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. III Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
  20. Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
  21. Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
  22. Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
  23. Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
  24. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
  25. Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
  26. Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
  27. Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
  28. Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
  29. Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
  30. Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
  31. Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
  32. Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
  33. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  34. Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
  35. Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
  36. O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
  37. Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
  38. Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).

Tags

Kemi sag 145 lokationsspecifikke bioconjugation site-selektive bioconjugation maleimide thiol sulfhydryl radioimmunoconjugate immunoconjugate
Syntese og Bioconjugation af Thiol-reaktiv reagenser til oprettelse af hjemmeside-selektivt modificerede Immunoconjugates
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davydova, M., Dewaele Le Roi, G.,… More

Davydova, M., Dewaele Le Roi, G., Adumeau, P., Zeglis, B. M. Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates. J. Vis. Exp. (145), e59063, doi:10.3791/59063 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter