Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/59063
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

In dit protocol beschrijven we de synthese van PODS, een phenyoxadiazolyl methyl-sulfon gebaseerde reagens voor de site-selectieve bevestiging van cargos aan de thiolen van biomoleculen, met name antilichamen. Daarnaast beschrijven we de synthese en de karakterisering van een Peul-bevattende bifunctionele complexvormer en zijn geconjugeerde aan een model antilichaam.

Abstract

Maleimide-bevattende bifunctionele sondes zijn tewerkgesteld voor decennia voor de site-selectieve wijziging van thiolen in biomoleculen, vooral antilichamen. Maleimide gebaseerde geconjugeerde weergeven nog beperkte stabiliteit in vivo omdat de koppeling van de thioether succinimidyl een retro-Michael reactie kan ondergaan. Dit, natuurlijk, kan leiden tot het vrijgeven van de radioactieve lading of de uitwisseling met thiol-bevattende biomoleculen in omloop. Beide processen kunnen produceren verhoogde activiteit concentraties in gezonde organen evenals activiteit concentraties in target weefsel, wat resulteert in verminderde imaging contrast en lagere therapeutische ratio daalde. In 2018, meldden we de oprichting van een modulair, stabiel en gemakkelijk toegankelijk phenyloxadiazolyl methyl-sulfon reagens — genaamd 'Peulen' — als een platform voor thiol gebaseerde bioconjugations. We hebben duidelijk aangetoond dat site-selectieve bioconjugations peulen gebaseerde reproducibly en krachtig homogene, duidelijk omschreven, zeer immunoreactive en zeer stabiele radioimmunoconjugaten maken. Bovendien hebben preklinische experimenten in lymfkliertest modellen van colorectal kanker aangetoond dat deze site-selectief met het label radioimmunoconjugaten tentoonstelling veruit superieur in vivo prestaties in vergelijking met radiolabeled antilichamen gesynthetiseerd via maleimide gebaseerde vervoegingen. In dit protocol beschrijven we de synthese van de vier stappen van PODS, de oprichting van een bifunctionele peulen dragende variant van de alomtegenwoordige complexvormer DOTA (PODS-DOTA), en de vervoeging van PODS-DOTA aan de HER2-targeting antilichaam trastuzumab.

Introduction

Radiofarmaceutische chemici hebben lang benut de selectiviteit en de specificiteit van antilichamen voor biomarkers voor ziekte voor zowel nucleaire beeldvorming en radiotherapie1gericht. Verreweg de meest voorkomende benadering van de radiolabeling van antilichamen is gebaseerd op de blinde bevestiging van radiolabeled prosthetic groepen of radiometal chelaatvormers aan aminozuren — meestal lysines — binnen de structuur van de immunoglobuline ( Figuur 1A)2. Terwijl deze strategie zeker effectief is, kan het willekeurige, niet-site-specifieke karakter leiden tot problemen. Specifiek, traditionele bioconjugation benaderingen produceren slecht gedefinieerde en heterogene immunoconjugates samengesteld uit mengsels van duizenden verschillende regioisomers, elk met een eigen set van biologische en farmacologische eigenschappen3. Bovendien kan willekeurige bioconjugation de immunoreactivity van antilichamen belemmeren, als de lading wordt toegevoegd aan de immunoglobuline van antigeen-bindende domeinen.

Door de jaren heen, een verscheidenheid van site-specific en site-selectieve bioconjugation strategieën werden ontwikkeld om deze problemen4,5. De meest voorkomende van deze benaderingen is afhankelijk van de afbinding van maleimide-bevattende sondes aan de sulfaatzuurstof groepen van cysteines (figuur 1B). IgG1 antilichamen van nature bevatten 4 Inter keten disulfide bruggen, verbanden die kunnen worden selectief verminderd rendement gratis thiolen staat voor het ondergaan van Michael toevoeging reacties met maleimides te succinimidyl thioether obligaties vormen. Het gebruik van thiolen en maleimides is zeker een verbetering ten opzichte van traditionele methoden, en een breed scala aan maleimide-bevattende synthons en bifunctionele chelaatvormers momenteel beschikbaar zijn. Het is echter belangrijk op te merken dat deze methode ernstige beperkingen zo goed heeft. Maleimide gebaseerde immunoconjugates vertonen beperkte stabiliteit in vivo omdat de koppeling van de thioether kan het ondergaan van een retro-Michael reactie (Figuur 2)6,7,8,9, 10. dit, natuurlijk, kan leiden tot het vrijgeven van de radioactieve lading of de uitwisseling met thiol-bevattende biomoleculen in omloop (bijvoorbeeld glutathion of serum albumine). Beide processen kunnen verhogen activiteit concentraties in gezonde organen evenals activiteit concentraties in target weefsel, wat resulteert in verminderde imaging contrast en lagere therapeutische verhoudingsgetallen verlagen. Verschillende alternatieve thiol-reactieve reagentia zijn ontwikkeld in een poging om het omzeilen van deze kwesties, met inbegrip van tosylates, bromo - en jood-acetyls, en vinyl sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. echter, al deze benaderingen hebben beperkingen die hun wijdverbreide toepassing hebben gehinderd.

Ongeveer vijf jaar geleden, pionier het laboratorium van de late Carlos Barbas III at The Scripps Research Institute het gebruik van phenyloxadiazolyl methyl sulfones als reagentia voor de selectieve vorming van zeer stabiele verbanden met thiolen (Figuur 1 c en figuur 3) 18 , 19. de auteurs werkzaam een phenyloxadiazolyl methyl-sulfon dragende variant van fluoresceïne wijzigen van verschillende antilichamen ontworpen om vrije cysteïne residuen, uiteindelijk het produceren van immunoconjugates met hogere stabiliteit dan analoog constructies gemaakt met behulp van de maleimide gebaseerde sondes. Bij het zien van dit veelbelovende werk, waren we enigszins verrast dat deze technologie alleen nauwelijks in de radiochemie gebruikt was en nog al helemaal niet in de synthese van bifunctionele chelaatvormers of radioimmunoconjugaten20,21 gebruikt had . Dit gebrek aan toepassingen, maar al snel begon te meer zin te maken: verschillende pogingen tot aanschaf van de reagens van Sigma-Aldrich resulteerde in de ontvangst van complexe mengsels van afbraakproducten daarvan met < 15% van de gewenste stof. Bovendien, synthese van het gerapporteerde reagens onszelf was niet een realistische optie hetzij, als de gepubliceerde synthetische route enigszins omslachtig is en verfijnde organische chemie apparatuur vereist dat de meeste radio-chemie en moleculaire beeldvorming laboratoria — met inbegrip van onze — gewoon doen niet bezitten.

In reactie op deze belemmeringen zetten we uit te maken van een gemakkelijk toegankelijk en zeer stabiele phenyloxadiazolyl-methyl-sulfon reagens dat kan worden verkregen via een robuust en redelijk facile synthetische route. Eerder dit jaar, berichtten we de oprichting van een modulair, stabiel en gemakkelijk toegankelijk phenyloxadiazolyl methyl-sulfon reagens — genaamd 'Peulen' — als een platform voor thiol gebaseerde bioconjugations (Figuur 1 c en figuur 3)22. Het belangrijkste verschil tussen peulen en het reagens gerapporteerd door Barbas, et al. is dat de voormalige maakt gebruik van een aniline ring gehecht aan de phenyloxadiazolyl-methyl-sulfon groep, terwijl de laatste beschikt over een fenol in dezelfde positie (Figuur 4). Deze wijziging vereenvoudigt een meer eenvoudige en toegankelijke synthetische route, evenals — als onze ervaring met de verkrijgbare compound emblematisch is — een stabieler definitieve reagens. In dit werk, we ook een paar peulen dragende bifunctionele chelaatvormers gesynthetiseerd — PODS-DFO en peulen-CHX-A''-DTPA — ter vergemakkelijking van de oprichting van 89Zr- en 177Lu-label radioimmunoconjugaten, respectievelijk. Zoals we bespreken zullen, hebben we aangetoond dat site-selectieve bioconjugations peulen gebaseerde reproducibly en krachtig homogene, duidelijk omschreven, zeer immunoreactive en zeer stabiele radioimmunoconjugaten maken. Bovendien hebben preklinische experimenten in lymfkliertest modellen van colorectal kanker aangetoond dat deze site-selectief met het label radioimmunoconjugaten tentoonstelling superieur in vivo prestaties in vergelijking met radiolabeled antilichamen gesynthetiseerd via maleimide gebaseerde vervoegingen.

Het overkoepelende doel van dit werk is het maken van duidelijke, homogene, zeer stabiele en zeer immunoreactive immunoconjugates voor in vitro en in vivo toepassingen vereenvoudigen. De synthetische benadering is eenvoudig genoeg om te worden uitgevoerd in bijna elk laboratorium, en de bovenliggende PODS-reagens kan worden aangepast met een overvloed aan verschillende chelaatvormers, fluorophores of lading. In dit protocol en de begeleidende video beschrijven we de eenvoudige, vier-stappen synthese van peulen (Figuur 5); de oprichting van een variant van de peulen-invloed van DOTA, een veel gebruikte complexvormer voor de coördinatie van 64Cu, 68Ga 111In, 177Lu en 225Ac (Figuur 6); en de bioconjugation van PODS-DOTA aan een model antilichaam, de HER2-targeting IgG1-trastuzumab (Figuur 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. de synthese van 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)

Opmerking: Als gevolg van de licht-gevoeligheid van de compound, houden alle reacties in folie bedekte vaartuigen.

  1. In een 10 mL ronde onderkant kolf, los 100 mg (0.517 mmol, 1 equivalent) van 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol in 3 mL methanol.
  2. Voeg aan deze oplossing, 360 l diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 equivalenten; watervrij) en een kleine magnetische roer bar. Bedek de kolf met een rubberstop en schud de oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Met behulp van een spuit van 1 mL glas, zak een gat door de rubberstop en snel 32 μL (0.517 mmol, 1 equivalent) van Joodmethaan aan dit mengsel toevoegen. Laat het mengsel gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur reageren.
    Opmerking: Als gevolg van de potentiële schadelijke effecten van Joodmethaan, deze reactie moet gebeuren in een chemische zuurkast.
  4. Instellen van het waterbad van een rotatieverdamper tot 40 ° C en de druk te verwijderen van het oplosmiddel om een witte vaste stof langzaam afnemen.
  5. Los van de vaste stof in 3 mL ethylacetaat en ten minste driemaal wassen met een 5 mL oplossing van 0,1 M natriumcarbonaat met behulp van een separatory trechter.
    Opmerking: Neem regelmatig plek-tests van de waterige fase onder een UV-lamp; Zodra er niets is zien onder de lamp, kunt u het wast stoppen.
  6. De organische fase in een trechter separatory verzamelen en wassen met water totdat de pH van de waterige fase 6,8-7.0 bereikt (met behulp van de pH-papier).
  7. Verzamelen van de organische fase en toevoegen van magnesium-sulfaat als u wilt verwijderen van alle sporen van water.
    Opmerking: De magnesium-sulfaat moet worden toegevoegd met een kleine spatel, waarna de oplossing moet worden wervelde. Als fijne deeltjes van het drogen agent nog steeds gezien zijn, is de oplossing droog. Als dat niet het geval is, Voeg kleine hoeveelheden magnesiumsulfaat tot fijne deeltjes kunnen worden gezien.
  8. Filtreer het mengsel met behulp van een middelgrote glasfritten of filtreerpapier.
  9. Verdampen de vluchtige stoffen met behulp van een roterende verdamper, een proces dat het gewenste product als witte naalden produceren moet.

2. de synthese van tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamaat (2)

Opmerking: Als gevolg van de licht-gevoeligheid van de compound, houden alle reacties in folie bedekte vaartuigen.

  1. In een 25 mL ronde onderkant kolf, los 387 mg (0.92 mmol, 1.0 equivalent) NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine in 10 mL dichloormethaan.
  2. Voor deze oplossing, voeg 480 l (2.76 mmol, 3 equivalenten) DIPEA, 264 mg (1.38 mmol; 1.5 equivalenten) van N-ethyl - N′-[3-(dimethylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride (EDCI), en 200 mg (0.97 mmol, 1.1 equivalenten) 1. Zegel van het vaartuig met een glazen stop en laat de reactie roer gedurende 5 dagen bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Wees bewust van de verdamping van dichloormethaan. Indien nodig, voeg meer gedurende de week.
  3. Het wassen van het mengsel in een separatory trechter met een oplossing van 1 M zoutzuur (3 x 5 mL).
  4. Verzamelen van de organische fase en blijven wassen in een separatory trechter, eerst met een oplossing van 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL) en vervolgens met water (3 x 5 mL).
  5. Verzamelen van de organische fase en toevoegen van magnesium-sulfaat als u wilt verwijderen van alle sporen van water (zie stap 1.7). Filtreer het mengsel met behulp van een middelgrote glasfritten of filtreerpapier.
  6. Met behulp van een roterende verdamper, verwijder de vluchtige oplosmiddelen onder verlaagde druk veroorloven een gebroken wit solid.
  7. Opnieuw los deze solid in 10 mL ethylacetaat en neerslag van het product via de geleidelijke (b.v., 2 mL tegelijk) toevoeging van 30 mL van cyclohexaan.
  8. Filtreer de oplossing met filtreerpapier of een middellange glasfritten te verkrijgen van het product als een wit poeder.

3. de synthese van tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamaat (3)

Opmerking: Als gevolg van de licht-gevoeligheid van de compound, houden alle reacties in folie bedekte vaartuigen.

  1. In een rondbodemkolf 10 mL, los op 30 mg (0,05 mmol; 1 gelijk) 2 in 4 mL dichloormethaan.
  2. Langzaam in 49 mg (0,2 mmol; 4 equivalenten) van 70% m-chloroperbenzoic zuur toevoegen aan dit mengsel en dekking van het reactievat met een glazen stop. Roer de oplossing om 's nachts bij kamertemperatuur, uiteindelijk bezwijken een gele mengsel.
  3. Wassen het gele mengsel in een separatory trechter, eerst met een 0,1 M oplossing van NaOH (3 x 5 mL) en vervolgens met water (3 x 5 mL).
  4. Droog de organische fase met magnesium-sulfaat en filteren van het mengsel met behulp van een middelgrote glasfritten of filtreerpapier.
  5. Met behulp van een roterende verdamper, verwijder de oplosmiddelen onder verlaagde druk te verkrijgen van het product als een bleke stevige.

4. de synthese van N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] fenyl} succinamide (PODS)

  1. In een 25 mL ronde onderkant kolf, los op 30 mg 3 in 2,0 mL dichloormethaan.
  2. Voeg 400 l trifluorazijnzuur en verzegel de kolf met een glazen stop.
  3. Roer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
  4. Met behulp van een roterende verdamper, verwijder de vluchtige stoffen onder verlaagde druk bij kamertemperatuur, een olieachtige residu verlaten.
  5. Los de olieachtige residu in 7 mL water en, met behulp van een separatory trechter, wassen met ethylacetaat (3 x 4 mL). De waterige laag houden.
  6. Lyophilize de waterige laag te veroorloven peulen als een wit poeder.
    Opmerking: De molaire absorptie coëfficiënten voor PODS bij 280 en 298 nm zijn 9,900 en 12.400 cm-1M-1, respectievelijk.

5. de synthese van PODS-DOTA

  1. In een 1,5 mL microcentrifuge buis, los van 10 mg van PODS bij 300 μL van dimethylsulfoxide (0,018 mmol; 1 gelijk) en voeg 26 μL van N, N-diisopropylethylamine (0,15 mmol; 8-equivalenten).
  2. Los 15.2 mg DOTA-Bn-NCS (0,02 mmol; 1.2-equivalenten) in 100 μl van dimethylsulfoxide en combineren van deze oplossing met de oplossing van stap 5.1. Het zegel van de microcentrifuge buis.
  3. Toestaan dat de reactie op de na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur.
  4. Het zuiveren van het product met behulp van reverse-fase C18 HPLC chromatografie te verwijderen elke spoorverontreiniging DOTA-Bn-NCS.
    Opmerking: De retentietijden zijn uiteraard sterk afhankelijk van de HPLC-apparatuur van elk laboratorium (pompen, kolommen, leidingen, enz.), en passende controles moeten worden uitgevoerd vóór de zuivering. Echter voor te leggen van een voorbeeld, als een gradiënt van 5:95 acetonitril/H2O (beide met 0,1% TFA) te 70:30 acetonitril/H2O (beide met 0,1% TFA) meer dan 30 min, een semi-preparatieve 19 x 250 mm C18 kolom en een debiet van 6 mL/min worden gebruikt , Peulen, p-SCN-Bn-DOTA en peulen-DOTA retentietijden van rond 14.4, 18,8 en 19.6 min, respectievelijk zal hebben. Alle drie verbindingen kunnen worden gecontroleerd op 254 nm.

6. de bioconjugation van PODS-DOTA aan trastuzumab

Opmerking: Voor deze stap, we begonnen met een 16.4 mg/mL stockoplossing van trastuzumab.

  1. Verdun in een laag eiwitgehalte bindende 1,5 mL microcentrifuge buis, 61 μL van de stockoplossing van trastuzumab (1 mg; 6.67 nmol, 1 equivalent) met 859 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7.4).
  2. Voeg aan dit mengsel, 6,7 l versgemaakte 10 mM in een oplossing van TCEP H2O (66,7 nmol, 10-equivalenten).
  3. Bereid een 1 mg/mL oplossing van PODS-DOTA in DMSO en 73 μL van deze peulen-DOTA oplossing toevoegen aan het reactiemengsel (66.67 nmol, 10-equivalenten).
  4. Verzegel de microcentrifuge buis en laat de oplossing inwerken voor 2 uur bij kamertemperatuur.
  5. Na 2 uur de immunoconjugate met behulp van een uitsluiting van de demineralisatie kolom van voorverpakte disposable grootte te zuiveren.
    1. Eerst, equilibreer de kolom grootte uitsluiting, zoals beschreven door de leverancier conserveringsmiddelen huidig in de kolom verwijderen tijdens de opslag. Een typische procedure hiervoor is het wassen van de kolom 5 keer met een volume van PBS die overeenkomt met het volume van de kolom: 5 x 2.5 mL PBS.
    2. Voeg vervolgens het reactiemengsel naar de grootte uitsluiting kolom vaststellend van het volume van het reactiemengsel.
    3. Nadat het reactiemengsel heeft de kolom ingevoerd, een passend bedrag van PBS toe zodat het totale volume van oplossing toegevoegd aan de kolom toevoegen tot 2,5 mL. Bijvoorbeeld, als de vervoeging reactie geleid tot een totaal volume van 1.3 mL, zou 1,2 mL extra PBS moeten worden toegevoegd aan de kolom.
    4. Ten slotte verzamelen het product met behulp van 2 mL PBS als het eluent.
  6. De laatste immunoconjugate met centrifugaal filtratie units met een 50 kDa molecuulgewicht cut-off concentreren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eerste vier fasen van dit protocol — de synthese van PODS — zijn ontworpen om robuust en betrouwbaar. De deprotonering en vervanging van 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol om te vormen van de gewenste thioether-product biedt de thioether in > 99% rendement na slechts 45 minuten. Vervolgens werd de afbinding tussen 1 en N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine bereikt via een standaard peptide koppeling procedure, wat resulteert in de collectie van het product (2) in 55% rendement. Vervolgens, de oxidatie van 2 werd uitgevoerd met behulp van m-Chloorperoxybenzoëzuur zuur, een veel gebruikte oxidant. Na de stappen wassen, 3 werd verkregen als een bleke stevige in ~ 90% rendement. Tot slot, het verwijderen van de groep tert-butyloxycarbonyl bescherming van 3 werd gedaan volgens standaardprocedures, met behulp van een 4:1 verhouding van dichloromethane:trifluoroacetic zuur. Na de lyofilisatie van de waterige fase, onze product — peulen — werd verkregen als een wit poeder in 98% rendement. De voortgang van de reactie via Dunnelaagchromatografie werd gevolgd, en de identiteit van elk product werd bevestigd via 1H-NMR, 13C-NMR en HRMS-ESI (tabel 1).

Een van de belangrijkste voordelen van de peulen reagens is zijn modulariteit. Een scala aan chelaatvormers, fluorophores, toxines of andere lading kan worden toegevoegd aan van de compound hanger amine. In het protocol bij de hand, zijn we met behulp van de alomtegenwoordige complexvormer DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing) als een representatieve payload. DOTA, natuurlijk, is gebruikt in een breed scala van biomoleculaire radiofarmaceutica als een complexvormer voor radiometals met inbegrip van 68Ga, 64Cu, 111In, 90Y, 177Lu, en 225Ac. Te dien einde werd een isothiocyanaat dragende variant van DOTA (p-SCN-Bn-DOTA) werkzaam en gekoppeld aan de hanger amine van PODS via eenvoudige koppeling voorwaarden. De resulterende bifunctionele complexvormer werd vervolgens gezuiverd via omgekeerde fase C18 HPLC en geïsoleerd in ~ 75% rendement. Net als bij de andere precursoren, de voortgang van de reactie volgden via Dunnelaagchromatografie, en de identiteit van het product was bevestigd via 1H-NMR, 13C-NMR en HRMS-ESI (tabel 1).

In de laatste stap van het protocol bespreken we de site-selectieve bioconjugation van PODS-DOTA naar een model immunoglobuline, de HER2-targeting antilichaam trastuzumab. Te dien einde zijn de bisulfide verbanden van het antilichaam van scharnier regio selectief verminderd met de reductor TCEP [tris(2-carboxyethyl) Fosfine]. Na deze vermindering stap, is het antilichaam met PODS-DOTA gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens gezuiverd via grootte uitsluiting chromatografie. In dit geval de gezuiverde, DOTA dragende immunoconjugate werd verkregen in ~ 80% rendement, en MALDI-ToF analyse toonde een mate van labeling (DOL) van ~1.8 DOTA/mAb. In het algemeen, hebben we vonden dat 10 equivalenten van TCEP, 10-equivalenten van de peulen reagens, en een 2 h incubatie volstaan om de opbrengst van een immunoconjugate met een DOL van 2 PODS/mAb (tabel 2). Dit resultaat blijft consistent in een heel scala van menselijke, gehumaniseerd en chimeer IgG1 antilichamen; dezelfde voorwaarden produceren echter immunoconjugates met een DOL van alleen ~1.5 bij het werken met lymfkliertest IgG1 antilichamen. Dit alles gezegd zijnde, onderzoekers zou moeten optimaliseren deze reactie voorwaarden voor nieuwe antilichamen en peulen dragende lading. Tot slot en bovenal ten aanzien van het eindproduct, hebben we herhaaldelijk en reproducibly gevonden dat peulen gebaseerde immunoconjugates vertonen immunoreactivities gelijk is aan of beter dan analoog constructies die zijn gemaakt met behulp van willekeurige of maleimide gebaseerde vervoeging strategieën.

Figure 1
Figuur 1: Schematische illustratie van bioconjugations met behulp van (A) amine-reactieve, (B) maleimide-peiling, en (C) peulen dragende lading. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: De Michael toevoeging van een thiol-bevattende Biomolecuul (groen) en een radionuclide dragende maleimide (geel) vormen een radiolabeled bioconjugate, evenals de extra reacties die de radiolabeled constructie kan ondergaan in het bijzijn van endogene thiol-bevattende moleculen (roze). RT = kamertemperatuur. Figuur overgenomen met toestemming van Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactieve bifunctionele chelaatvormers voor de creatie van Site-selectief bewerkt radioimmunoconjugaten met verbeterde stabiliteit. Bioconjugate chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Schematische voorstelling van de reactie tussen peulen en een thiol. Figuur overgenomen met toestemming van Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactieve bifunctionele chelaatvormers voor de creatie van Site-selectief bewerkt radioimmunoconjugaten met verbeterde stabiliteit. Bioconjugate chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: De structuur van de peulen (A) evenals (B) het reagens gerapporteerd door Barbas, et al.18,19Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Schema van de synthese van de vier stappen van peulen. Figuur overgenomen met toestemming van Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactieve bifunctionele chelaatvormers voor de creatie van Site-selectief bewerkt radioimmunoconjugaten met verbeterde stabiliteit. Bioconjugate chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Schema van de synthese van PODS-DOTA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: Schema van de bioconjugation van trastuzumab met PODS-DOTA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: Vergelijking van de in vivo werking van 89Zr-label radioimmunoconjugaten van huA33 die zijn gemaakt met behulp van PODS gebaseerde (89Zr-DFO-PODS-huA33) en maleimide gebaseerde (89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation strategieën. Planar (links) en maximale intensiteit projectie (rechts) PET beelden van athymic naakt muizen die A33 antigeen-uiten SW1222 colorectal kanker xenografts (witte pijl) na de injectie van 89Zr-DFO-PODS-huA33 en 89 Zr-DFO-mal-huA33 (140 µCi, 60-65 µg). De coronale plakjes snijden het midden van de tumoren. Figuur overgenomen met toestemming van Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactieve bifunctionele chelaatvormers voor de creatie van Site-selectief bewerkt radioimmunoconjugaten met verbeterde stabiliteit. Bioconjugate chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9: Vergelijking van de in vivo werking van 89Zr-label radioimmunoconjugaten van huA33 die zijn gemaakt met behulp van PODS gebaseerde (89Zr-DFO-PODS-huA33) en maleimide gebaseerde (89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation strategieën. Ook gegevens na de toediening van 89Zr-DFO-PODS-huA33 en 89Zr-DFO-mal-huA33 (30 µCi, 15-18 µg) te athymic naakt muizen die A33 antigeen-uiten onderhuids SW1222 menselijke colorectal kanker xenografts. De waarden voor de maag, dunne darm en dikke darm bevatten inhoud. Figuur overgenomen met toestemming van Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactieve bifunctionele chelaatvormers voor de creatie van Site-selectief bewerkt radioimmunoconjugaten met verbeterde stabiliteit. Bioconjugate chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Samengestelde 1 H-NMR verschuivingen 13 C-NMR verschuivingen HRMS
1 (500 MHz, CDCl3) 7.79 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,72 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 4.04 (2 H, br-s), 2,75 (3 H, s) (125 MHz, CDCl3) 166.3, 163,7, 149.7, 128.5, 114,8, 113.5, 14,8 m/z Calcd voor [C9H9N3OS + H]+: 208.0539; gevonden: 208.0539; Δ: 0,0 ppm
2 (500 MHz, CDCl3) 9.68 (1H, s), 7,91 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.71 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6.82 (1H, s), 4.99 (1H, s), 3.70-3.45 (12H, m), 3.41 (2H, q, J = 6.0 Hz), 3,20 (2H, q, J = 6.5 Hz), 2,76 (3H, s) 2.71 (2H, m), 2,63 (2H m), 1.80-1,70 (4 H, m), 1.42 (9 H, s) (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.3, 165,8, 164,6, 156.2, 141,8, 127.7, 119.6, 118.6, 79,2, 70,6, 70,5, 70.3, 70,1, 69,6, 38,8, 38,5, 33,5, 31,6, 29,9, 28,6, 14,8 m/z Calcd voor [C28H43N5O8S + nb]+: 632.2725; gevonden: 632.2722; Δ:-0.47 ppm
3 (500 MHz, CDCl3) 9,99 (1 H, s), 7,98 (2 H, d, J = 9.0 Hz), 7,75 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,88 (1 H, s), 4.99 (1 H, s), 3,66-3,50 (15 H, m), 3.41 (2 H, q, J = 6.0 Hz), 3,20 (2 H, q, J = 6.5 Hz), 2.71 (2 H, m), 2.65 (2 H, m) , 1.80-1,70 (4H, m), 1,43 (9H, s) (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.5, 166,5, 161,6, 156,1, 143,4, 128,7, 119.6, 116,4, 79,1, 70,5, 70,4, 70,2, 70,0, 69,4, 43.0, 38,8, 38,4, 33.2, 31.3, 29,7, 28.4 m/z  Calcd voor [C28H43N5O10S + H]+: 642.2803; gevonden: 642.2797; Δ:-0.93 ppm
PEULEN (500 MHz, D2O) 7.85 (2 H, d, J = 9.0 Hz), 7.55 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 3,60-3.45 (15 H, m), 3.45 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3,20 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.04 (2 H, t, J = 7.0 Hz), 2,67 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 2,54 (2 H t, J = 6.5 Hz), 1.87 (2 H, qt, J = 6.5 Hz), 1,70 (2 H, qt, J = 6.5 Hz) (125 MHz, D2O) 174.5, 173.2, 166,8, 161,4, 142,2, 128,6, 120,3, 116,6, 69,4, 69,4, 69,3, 69.2, 68,2, 68,2, 42,5, 37,6, 36.2, 31,9, 30,7, 28,2, 26.4 m/z  Calcd voor [C23H35N5O8S + H]+: 542.2279; gevonden: 542.2281; Δ: 0.37 ppm
PEULEN-DOTA (600 MHz, DMSO-d6) 10.46 (1 H, s), 9,74 (1 H, bs), 8.04 (2 H, d, J = 8.6 Hz), 7.99 (1 H, s), 7,90 (1 H, t, J = 5.0 Hz), 7.86 (2 H, d, J = 6.5 Hz), 7.44 (2 H, d, J = 7.9 Hz), 7.24 (2 H, d, J = 7.1 Hz), 4,35-2.41 (45 H, m) , 3.70 (3H, s), 1.76 (2H, q, J = 6,3 Hz), 1.61 (2H, q, J = 6.5 Hz) (125 MHz, DMSO-d6) 171,8, 171.4, 166,1, 162,2, 158.8, 158,6, 129.8, 129.0, 127.6, 123.3, 119,5, 118.5, 116.5, 116,4, 70,2, 70,1, 70,0, 68,7, 68,5, 43.4, 41,8, 36,3, 32.2, 30.4, 29,8, 29.1 m/z  Calcd voor [C47H68N10O16S2+ H]+: 1093.4334; gevonden: 1093.4327; Δ:-0.64 ppm

Tabel 1. Karakterisering gegevens voor de synthetische tussenproducten beschreven evenals peulen en peulen-DOTA.

Antilichaam Type Constante regio Verhouding van de peulen: mAb
Menselijk plasma IgG Menselijke Mens IgG 2.1 ± 0,1
Trastuzumab Gehumaniseerd Menselijke IgG1 2,0 ± 0,1
huA33 Gehumaniseerd Menselijke IgG1 2.1 ± 0,1
Cetuximab Chimeer Menselijke IgG1 2.2 ± 0,1
AR 9.6 RattenUitrustingen Lymfkliertest IgG1 1.4 ± 0,1
Muis plasma IgG RattenUitrustingen RattenUitrustingen IgG 1,5 ± 0,1

Tabel 2. Mate van etikettering van verschillende antilichamen na conjugatie met een Peul-bevattende fluorophore. Standaardafwijking worden waarden weergegeven. Tabel overgenomen met toestemming van Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactieve bifunctionele chelaatvormers voor de creatie van Site-selectief bewerkt radioimmunoconjugaten met verbeterde stabiliteit. Bioconjugate chemie. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit verslag, hebben wij besloten niet op te nemen van de eventuele protocollen voor radiolabeling of in vivo experimenten. Onze redenen zijn eenvoudig. Met betrekking tot de voormalige, de radiolabeling van een immunoconjugate peulen gebaseerde verschilt niet helemaal van die van een immunoconjugate gesynthetiseerd met behulp van andere strategieën van bioconjugation, en deze procedures hebben uitvoerig herzien elders2 . Met betrekking tot de laatste, kunnen de specifieke kenmerken van preklinische in vivo experimenten (d.w.z., muismodellen, doses, enz.) variëren in het algemeen volgens zowel de toepassing als het antilichaam/antigeen-systeem.

Onze vorige onderzoeken met 89Zr-geëtiketteerden varianten van huA33 bieden een dwingende illustratie van de voordelen van PODS gebaseerde bioconjugations. HuA33 is een gehumaniseerd IgG1 antilichaam dat zich richt op het A33-antigeen, een transmembraan glycoproteïne uitgedrukt op > 95% van colorectal kanker23,24. In onze vorige manuscript22rapporteren we de synthese van 89Zr-DFO-huA33-radioimmunoconjugate met behulp van beide peulen - en maleimide-gebaseerde bioconjugation strategieën. De twee radiolabeled antilichamen — 89Zr-DFO-PODS-huA33 en 89Zr-DFO-mal-huA33 — werden geproduceerd in bijna identieke opbrengst, zuiverheid, specificiteit activiteit en immunoreactivity. Kritisch, echter, de twee radioimmunoconjugaten tentoongesteld drastisch verschillende stabilities in menselijk serum: Na incubatie gedurende zeven dagen bij 37 ° C, 89Zr-DFO-PODS-huA33 86 ± 1% intact gebleven, terwijl haar neef maleimide gebaseerde slechts 61 ± 5 was % intact. In vivo PET beeldvorming en ook experimenten in athymic naakt muizen die A33 antigeen-uiten SW1222 menselijke colorectal kanker xenografts geopenbaarde grote verschillen in de in vivo werking van de twee radioimmunoconjugaten (Figuur 8 en Figuur 9). Zowel 89Zr-DFO-PODS-huA33 en 89Zr-DFO-mal-huA33 produceren hoogactieve concentraties in tumor weefsel: 56.4 ± 6.9%ID/g en 49.6 ± 9.3%ID/g, respectievelijk 48 uur na toediening. De maleimide gebaseerde radioimmunoconjugate had echter aanzienlijk hogere concentraties van de activiteit in de gezonde weefsels dan de peulen gebaseerde agent. Bijvoorbeeld, 89Zr-DFO-mal-huA33 geproduceerd activiteit concentraties van 3.1 ± 0,5 2,7 ± 0,4 en 12.2 ± 0,4% ID/g in de nieren, de lever en de bot, respectievelijk op 120 h na injectie, waarden die aanzienlijk hoger zijn dan de concentraties van de activiteit geproduceerd door 89Zr-DFO-PODS-huA33 in de dezelfde weefsels (1.4 ± 0,1, 1.2 ± 0,3, en 4.3 ± 0,6% ID/g). Inderdaad, 89Zr-DFO-PODS-huA33 geproduceerd lagere activiteit concentraties in alle niet tot de doelsoorten weefsels (met uitzondering van de dikke darm) 120 h na injectie in vergelijking tot en met 89Zr-DFO-mal-huA33. Dientengevolge, de ratio's van tumor-naar-orgel activiteit, concentratie voor 89Zr-DFO-PODS-huA33 in het algemeen superieur zijn aan die van 89Zr-DFO-mal-huA33; met name de tumor-naar-lever, tumor-naar-milt, tumor-naar-nier, en tumor-naar-bot activiteit concentratie zijn ratio's bijna het dubbele voor de peulen gebaseerde immunoconjugate in vergelijking met zijn neef maleimide-afgeleide. Gezien het feit dat het belangrijkste verschil tussen de twee radioimmunoconjugaten de bioconjugation greep van de complexvormer was, is de verhoogde stabiliteit van de peulen-thiol koppeling vrijwel zeker verantwoordelijk voor deze in vivo prestatieverbetering.

Het nemen van een bredere visie, is de niet-site-selectieve bioconjugation van sondes voor lysines binnen antilichamen weliswaar een ongecompliceerd en facile benadering van de wijziging van antilichamen. De aanwezigheid van meerdere lysines verspreid over de structuur van immunoglobulinen betekent echter dat het onmogelijk is te oefenen controle over de precieze site of de mate van bioconjugation2. Dientengevolge, deze willekeurige strategie produceert vaak slecht gedefinieerde en zeer heterogene immunoconjugates die kan vertonen verminderde immunoreactivity als ligations binnen de antigeen-bindende domeinen3optreden. De voordelen van site-selectieve benaderingen van bioconjugation is herhaaldelijk aangetoond voor beide radioimmunoconjugaten en antilichaam-drug conjugaten8,14,25,26, 27,28,29,30. Kortom, niet alleen doen site-selectieve bioconjugation strategieën produceren meer duidelijk omschreven en homogene immunoconjugates dan traditionele methoden, ze ook maken imaging agenten, radioimmunotherapeutics en ADCs met in vivo prestatieverbetering. Maar waar peulen gebaseerde ligations staan in vergelijking tot andere site-selectieve wijziging strategieën? In het algemeen, de benaderingen van de site-selectieve wijziging van antilichamen kunnen worden ingedeeld in vier categorieën: (1) ligations tot cysteïne residuen, (2) de manipulatie van de zware ketting glycanen, (3) chemoenzymatic transformaties en (4) het gebruik van gentechnologie4,5. Natuurlijk, dit classificatiesysteem is niet perfect, en sommige benaderingen (bijv. de wijziging van de zware ketting glycanen met enzymen) onvermijdelijk kwalificeer voor twee categorieën. Elke strategie heeft zijn eigen voor- en nadelen. Genetische modificatie gebaseerde benaderingen bieden uitstekende controle over de site van conjugatie, maar ze complexe en dure31,32,33 zijn. Oxidatieve koppelingen naar de zware ketting glycanen zijn goedkoop en eenvoudig, maar zij dreigen oxidatieve schade aan de structurele integriteit van de immunoglobuline34,35,,36,37 ,,38.

Het belangrijkste voordeel van thiol gebaseerde bioconjugations — peulen opgenomen — hun eenvoud en modulariteit. Hun voornaamste beperking, daarentegen, vloeit voort uit de aanwezigheid van meerdere thiolen binnen een antilichaam, een karaktertrek die de mate van controle over zowel de site van geconjugeerde en het aantal wijzigingen per antilichaam vermindert. In die zin is is de combinatie van thiol gebaseerde ligations en antilichamen, die al genetisch gemanipuleerde hebben om te bezitten vrije cysteïne residuen een bijzonder aantrekkelijk benadering. Zoals we al hebben opgemerkt, is een andere beperking van de maleimide gebaseerde thiol ligations de gevoeligheid van de succinimidyl thioether obligatie voor retro-Michael toevoegingen in vivo. Nog kritisch, intrekt het gebruik van PODS dit probleem.

Voordat we concluderen, is het belangrijk op te merken dat de opkomende natuur van PODS technologie zijn eigen set van obstakels kunt maken. Bijvoorbeeld geen peulen dragende bifunctionele chelaatvormers (momenteel) commercieel beschikbaar zijn, en er is geen informatie die aanpak van de klinische farmacologie, toxicologie of immunogeniciteit van PODS gebaseerde immunoconjugates. Wij zijn echter van mening dat peulen gebaseerde bioconjugations het potentieel hebben om fundamenteel veranderen de manier waarop immunoconjugates worden gesynthetiseerd in zowel het laboratorium en kliniek. Op dit moment, we hebben alleen toegepast deze chemische technologie aan de ontwikkeling van radioimmunoconjugaten voor nucleaire beeldvorming en radioimmunotherapy, hoewel onderzoek naar het nut van deze benadering voor de bouw van antilichaam-drug vervoegt en andere geneesmiddelen biomoleculaire zijn momenteel aan de gang. Op het einde, we hopen vurig dat dit protocol — en met name de eenvoudig en simpel chemie die we hebben ontwikkeld — zal helpen het gebruik van phenyloxadiazolyl methyl sulfones sulfaatzuurstof gebaseerde vervoegingen bevorderen en aanmoedigen van een verschuiving in het veld van maleimides tot stabieler en betrouwbaarder alternatieven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Dr. Sai Kiran Sharma voor nuttig gesprekken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol Sigma-Aldrich 675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube Eppendorf 925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube Fisherbrand 05-408-129
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore EN300000141G
Cyclohexane Fisher Scientific C556-4
Dichloromethane Fisher Scientific AC383780010
Diisopropylethylamine MP Biomedicals, LLC 150915
Dimethylsulfoxide Fisher Scientific 31-727-5100ML
Ethyl Acetate Fisher Scientific E145 4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Iodomethane Sigma-Aldrich 289566-100G
Magnesium Sulfate Acros Organics 413485000
m-chloroperbenzoic acid Sigma-Aldrich 273031
Methanol Fisher Scientific A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine Sigma-Aldrich 671401 Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 3450
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P5493 10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich S7795
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
TCEP ThermoFischer Scientific 20490
Triethylamine Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid Fisher Scientific A116-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  3. Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
  4. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
  5. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
  6. Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
  7. Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
  8. Shen, B. -Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
  9. Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
  10. Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
  11. Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
  12. Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
  13. Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
  14. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  15. Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
  16. Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -w, Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
  17. Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
  18. Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
  19. Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. III Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
  20. Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
  21. Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
  22. Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
  23. Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
  24. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
  25. Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
  26. Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
  27. Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
  28. Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
  29. Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
  30. Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
  31. Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
  32. Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
  33. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  34. Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
  35. Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
  36. O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
  37. Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
  38. Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).

Tags

Chemie kwestie 145 Site-specific bioconjugation site-selectieve bioconjugation maleimide thiol sulfaatzuurstof radioimmunoconjugate immunoconjugate
Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davydova, M., Dewaele Le Roi, G.,… More

Davydova, M., Dewaele Le Roi, G., Adumeau, P., Zeglis, B. M. Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates. J. Vis. Exp. (145), e59063, doi:10.3791/59063 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter