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Chemistry

Synthèse et bioconjugaison de Thiol-réactifs pour la création de Site-sélectivement modifiés immunoconjugués

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/59063
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

Dans ce protocole, nous allons décrire la synthèse des GOUSSES, un réactif à base de sulfone phenyoxadiazolyl méthyl pour la fixation site sélectif de cargaisons sur les thiols de biomolécules, en particulier les anticorps. En outre, nous allons décrire la synthèse et la caractérisation d’un chélateur bifonctionnel portant des GOUSSES et sa conjugaison à un anticorps de modèle.

Abstract

Sondes bifonctionnels Maléimide-roulement ont été utilisés pendant des décennies pour la modification site sélectif des thiols dans des biomolécules, en particulier les anticorps. Axée sur le maléimide conjugués affichent in vivo de stabilité limitée parce que le lien de thioéther succinimidyl peut subir une réaction de rétro-Michael. Cela, bien sûr, peut conduire à la libération de la charge radioactive ou son échange avec des biomolécules thiol porteur en circulation. Ces deux processus peuvent produire des concentrations élevées d’activité dans les organes sains ainsi qu’une diminution des concentrations d’activité dans les tissus cibles, ce qui réduit d’imagerie de contraste et rapports thérapeutiques plus faibles. En 2018, nous avons signalé la création d’un modulaire, stable et réactif de phenyloxadiazolyl facilement accessible methyl sulfone — surnommé « PODS » — comme une plate-forme pour bioconjugations thiol-basé. Nous avons clairement démontré que bioconjugations site-sélective axée sur les GOUSSES de façon reproductible et robuste créer radioimmunoconjugates homogène, bien définis, hautement immunoréactive et très stable. En outre, les expériences précliniques dans des modèles murins de cancer colorectal ont montré que ces site sélectivement marqués radioimmunoconjugates pièce bien supérieure performance in vivo par rapport aux anticorps radiomarqués synthétisés par axée sur le maléimide conjugaisons. Dans ce protocole, nous allons décrire la synthèse de quatre étapes de GOUSSES, la création d’une variante de GOUSSES porteuses bifonctionnelle de l’omniprésent chélateur DOTA (GOUSSES-DOTA) et la conjugaison de PODS-DOTA pour le trastuzumab anticorps ciblant HER2.

Introduction

Radiopharmaceutiques chimistes ont longtemps exploité la sélectivité et la spécificité des anticorps pour les biomarqueurs de la maladie pour les deux imagerie nucléaire et ciblé de radiothérapie1. Approche et de loin la plus courante pour le radiomarquage d’anticorps se fonde sur l’attachement aveugle de radiomarquées groupes prosthétiques ou radiometal chélateurs aux acides aminés — le plus souvent les lysines — au sein de la structure de l’immunoglobuline ( Figure 1 a)2. Si cette stratégie est certainement efficace, son caractère aléatoire et non spécifique au site peut créer des problèmes. Plus précisément, des approches traditionnelles bioconjugaison produisent mal défini et immunoconjugués hétérogène composé de mélanges de milliers de régioisomères différents, chacun avec son propre ensemble de propriétés biologiques et pharmacologiques3. En outre, bioconjugaison aléatoire peut entraver l’immunoréactivité d’anticorps si la cargaison est annexée aux domaines d’antigène-liant de l’immunoglobuline.

Au cours des années, une variété de stratégies spécifiques au site et site sélectif bioconjugaison ont été développés afin de répondre à ces problèmes4,5. Le plus commun de ces approches s’appuie sur la ligature des sondes maléimide portant aux groupes sulfhydryles des cystéines (Figure 1 b). Les anticorps IgG1 contiennent naturellement des 4 ponts disulfure de chaîne inter, liens qui peuvent être réduites de manière sélective pour produire des thiols libres capables de subir des réactions d’addition de Michael avec maléimides forment des liaisons thioéther succinimidyl. L’utilisation des thiols et maléimides est certainement une amélioration par rapport aux méthodes traditionnelles et une grande variété de synthons maléimide-roulement et bifonctionnels chélateurs sont actuellement disponibles. Cependant, il est important de noter que cette méthode a des limites sérieuses aussi bien. Axée sur le Maléimide immunoconjugués présentent une stabilité limitée in vivo car le lien thioéther peut subir une réaction de rétro-Michael (Figure 2)6,7,8,9, 10. cela, bien sûr, peut conduire à la libération de la charge radioactive ou son échange avec des biomolécules thiol porteur en circulation (p. ex., glutathion ou albumine sérique). Ces deux processus peuvent augmenter les concentrations d’activité dans les organes sains ainsi que diminuer les concentrations d’activité dans les tissus cibles, ce qui réduit d’imagerie de contraste et rapports thérapeutiques plus faibles. Plusieurs réactifs thiol réactif alternatives ont été développées dans le but de contourner ces problèmes, y compris les tosylates, bromo - et iodo-acétyles et vinyle sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. Cependant, toutes ces approches ont des limites qui ont nui à leur application généralisée.

Environ cinq ans, le laboratoire du feu Carlos Barbas III au Scripps Research Institute pionnier dans l’utilisation des sulfones méthyl phenyloxadiazolyl comme réactifs pour la formation sélective des liens extrêmement stables avec les thiols (Figure 1 et Figure 3) 18 , 19. les auteurs salariés une variante de sulfone-roulement de méthyle phenyloxadiazolyl de fluorescéine pour modifier plusieurs anticorps conçus pour contenir des résidus de cystéine libre, produisant finalement immunoconjugués ont une stabilité supérieure qu’analogue constructions créées à l’aide de sondes maléimide. En voyant ces travaux prometteur, nous étions un peu surpris que cette technologie n’avait été utilisée guère en radiochimie et qu’il n'avait pas encore été utilisée du tout dans la synthèse des chélateurs bifonctionnels ou radioimmunoconjugates20,21 . Ce manque d’applications, cependant, ne tarda pas à être plus judicieux : plusieurs tentatives de se procurer le réactif de Sigma-Aldrich a donné lieu à la réception des mélanges complexes de produits de dégradation avec < 15 % du composé désiré. En outre, synthétisant le réactif déclaré nous-mêmes n’était pas une option réaliste non plus, comme la voie de synthèse publiée est un peu encombrante et nécessite du matériel sophistiqué de chimie organique qui la plupart radiochimie et imagerie moléculaire laboratoires, y compris la nôtre — ne possèdent tout simplement pas.

En réponse à ces obstacles, nous présentons à créer facilement accessible et très stable phenyloxadiazolyl methyl sulfone réactif qui peut être obtenu via une voie de synthèse robuste et assez facile. Plus tôt cette année, nous avons signalé la création d’un modulaire, stable et réactif de phenyloxadiazolyl facilement accessible methyl sulfone — surnommé « PODS » — comme une plate-forme pour bioconjugations axée sur les thiols (Figure 1 et Figure 3)22. La différence essentielle entre les GOUSSES et le réactif rapporté par Barbas, Al est que le premier emploie un anneau aniline attaché à la portion de sulfone de méthyle phenyloxadiazolyl, alors que ce dernier dispose d’un phénol dans la même position (Figure 4). Ce changement facilite une voie de synthèse plus simple et plus accessible que — si notre expérience avec le composé disponible dans le commerce est emblématique — un réactif final plus stable. Dans ce travail, nous aussi synthétisé une paire de GOUSSES renfermant des chélateurs bifonctionnels — dosettes-MPO et GOUSSES-CHX-A''-DTPA — pour faciliter la création de 89Zr - et 177marqué Lu radioimmunoconjugates, respectivement. Comme nous allons le voir, nous avons démontré que bioconjugations site-sélective axée sur les GOUSSES de façon reproductible et robuste créer radioimmunoconjugates homogène, bien définis, hautement immunoréactive et très stable. En outre, les expériences précliniques dans des modèles murins de cancer colorectal ont montré que ces site sélectivement marqués radioimmunoconjugates pièce performance in vivo supérieure par rapport aux anticorps radiomarqués synthétisés par axée sur le maléimide conjugaisons.

L’objectif primordial de ce travail est de faciliter la création des immunoconjugués bien définis, homogène, très stable et hautement immunoréactives pour applications in vitro et in vivo. L’approche synthétique est assez simple à effectuer dans n’importe quel laboratoire, et le réactif de GOUSSES parent peut être modifié avec une pléthore de différents chélateurs, fluorophores ou des cargaisons. Dans ce protocole et la vidéo qui l’accompagne, nous allons décrire la synthèse simple, quatre étapes des GOUSSES (Figure 5) ; la création d’une variante de GOUSSES porteuses de DOTA, un chélateur largement utilisé pour la coordination des 64Cu, 68Ga, 111, 177Lu et 225Ac (Figure 6) ; et la bioconjugaison de GOUSSES-DOTA d’un anticorps de modèle, le trastuzumab IgG1 ciblant HER2 (Figure 7).

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Protocol

1. la synthèse de 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)

Remarque : En raison de la lumière-sensibilité du composé, garder toutes les réactions dans les vaisseaux recouverts de papier.

  1. Dans une 10 mL rond ballon, dissoudre 100 mg (0,517 mmol, 1 équivalent) de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol dans 3 mL de méthanol.
  2. Ajouter à cette solution, 360 μL de diisopropyléthylamine (DIPEA ; 2,07 mmol ; 4 équivalents ; anhydre) et d’un bar de petite agitation magnétique. Couvrir le ballon avec un bouchon en caoutchouc et agiter la solution pendant 10 minutes à température ambiante.
  3. À l’aide d’une seringue de verre de 1 mL, piquez un trou dans le bouchon en caoutchouc et rapidement ajouter 32 μL (0,517 mmol, 1 équivalent) d’iodométhane à ce mélange. Laissez le mélange agir pendant 45 minutes à température ambiante.
    Remarque : En raison de la nocivité potentielle des iodométhane, cette réaction doit être faite sous une hotte chimique.
  4. La valeur de l’eau du bain d’un évaporateur rotatif à 40 ° C et réduire lentement la pression pour enlever le solvant pour s’offrir un solide blanc.
  5. Dissoudre le solide dans 3 mL d’acétate d’éthyle et laver au moins trois fois avec 5 mL de solution de carbonate de sodium 0,1 M à l’aide d’une ampoule à décanter.
    Remarque : Prendre périodiquement spot-essais de la phase aqueuse sous une lampe UV ; une fois que rien n’est vu sous la lampe, vous pouvez arrêter les lavages.
  6. Recueillir la phase organique dans une ampoule à décanter et laver à l’eau jusqu'à ce que le pH de la phase aqueuse atteint 6,8 et 7,0 (à l’aide de papier pH).
  7. Recueillir la phase organique et ajouter du sulfate de magnésium pour enlever toute trace d’eau.
    Remarque : Le sulfate de magnésium doit être ajouté avec une petite spatule, après quoi la solution devrait être tourbillonnait. Si les particules fines de l’agent de séchage sont encore visibles, la solution est sec. Si ce n’est pas le cas, ajouter de petites quantités de sulfate de magnésium jusqu'à ce que les particules fines sont visibles.
  8. Filtrer le mélange en utilisant un moyen de verre fritté ou papier filtre.
  9. Faire évaporer les volatiles à l’aide d’un évaporateur rotatif, un processus qui devrait produire le produit désiré en aiguilles blanches.

2. la synthèse de tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamate (2)

Remarque : En raison de la lumière-sensibilité du composé, garder toutes les réactions dans les vaisseaux recouverts de papier.

  1. Dans un 25 mL rond ballon, dissoudre 387 mg (0.92 mmol, 1,0 équivalent) de NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine dans 10 mL de dichlorométhane.
  2. Pour cette solution, ajouter μL 480 (2.76 mmol, 3 équivalents) de DIPEA, 264 mg (1,38 mmol ; 1,5 équivalent) de N-éthyl - N′-[3-(diméthylamino) propyl] carbodiimide chlorhydrate (EDCI) et 200 mg (0.97 mmol, 1,1 équivalents) de 1. Sceller le réservoir avec un bouchon en verre et laisser la réaction remuez pendant 5 jours à température ambiante.
    NOTE : Soyez conscient de l’évaporation du dichlorométhane. Si nécessaire, ajouter d’autres tout au long de la semaine.
  3. Laver le mélange dans une ampoule à décanter avec une solution d’acide chlorhydrique de 1 M (3 x 5 mL).
  4. Recueillir la phase organique et continuer à le laver dans une ampoule à décanter, tout d’abord avec une solution 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL), puis avec de l’eau (3 x 5 mL).
  5. Recueillir la phase organique et ajouter du sulfate de magnésium pour enlever toutes traces d’eau (voir étape 1.7). Filtrer le mélange en utilisant un moyen de verre fritté ou papier filtre.
  6. À l’aide d’un évaporateur rotatif, éliminer les solvants volatils sous pression réduite pour s’offrir un solide blanc cassé.
  7. Dissoudre à nouveau ce solide dans 10 mL d’acétate d’éthyle et précipiter le produit via l’addition progressive (par exemple, 2 mL à la fois) de 30 mL de cyclohexane.
  8. Filtrer la solution avec le papier filtre ou fritte de verre moyen pour obtenir le produit sous forme de poudre blanche.

3. la synthèse de tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamate (3)

Remarque : En raison de la lumière-sensibilité du composé, garder toutes les réactions dans les vaisseaux recouverts de papier.

  1. Dans un ballon à fond rond 10 mL, dissoudre 30 mg (0,05 mmol ; 1 équivalent) de 2 à 4 mL de dichlorométhane.
  2. Lentement, 49 mg (0,2 mmol ; 4 équivalents) de 70 % d’acide m-chloroperbenzoïque ajouter à ce mélange et couvrir la cuve de réaction avec un bouchon en verre. Agiter la solution du jour au lendemain à la température ambiante, en fin de compte, ce qui donne un mélange de jaune.
  3. Laver le mélange jaune dans une ampoule à décanter, tout d’abord avec une solution 0,1 M de NaOH (3 x 5 mL), puis avec de l’eau (3 x 5 mL).
  4. Sécher la phase organique avec le sulfate de magnésium et filtrer le mélange en utilisant un moyen de verre fritté ou papier filtre.
  5. À l’aide d’un évaporateur rotatif, éliminer les solvants sous pression réduite pour obtenir le produit sous forme de solide pâle.

4. la synthèse de N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4- succinamide {4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] phényl} (PODS)

  1. Dans un 25 mL rond ballon, dissoudre 30 mg de 3 à 2,0 mL de dichlorométhane.
  2. Ajouter 400 ml d’acide trifluoroacétique et sceller le ballon avec un bouchon en verre.
  3. Remuez le mélange réactionnel à température ambiante pendant 3 heures.
  4. À l’aide d’un évaporateur rotatif, enlever les substances volatiles sous pression réduite, à température de la pièce, laissant un résidu huileux.
  5. Dissoudre le résidu huileux dans 7 mL d’eau et, à l’aide d’une ampoule à décanter, laver avec l’acétate d’éthyle (3 x 4 mL). Garder la couche aqueuse.
  6. Lyophiliser la couche aqueuse pour s’offrir les GOUSSES sous forme de poudre blanche.
    NOTE : Les coefficients d’absorption molaire pour dosettes à 280 et 298 nm sont 9 900 et 12 400 cm-1M-1, respectivement.

5. la synthèse des GOUSSES-DOTA

  1. Dans un tube de microtubes de 1,5 mL, dissoudre 10 mg de GOUSSES dans 300 μl de diméthylsulfoxyde (0,018 mmol ; 1 équivalent) et ajouter 26 μL de N, N-diisopropyléthylamine (0,15 mmol ; 8 équivalents).
  2. Dissoudre 15,2 mg de DOTA-Bn-NCS (0,02 mmol ; 1,2 équivalents) dans 100 μl de diméthylsulfoxyde et combiner cette solution avec la solution d’étape 5.1. Sceller le tube de microcentrifuge.
  3. Permettre la réaction à incuber une nuit à température ambiante.
  4. Purifier le produit à l’aide de chromatographie HPLC en phase inverse C18 pour enlever tout DOTA-Bn-NCS n’ayant pas réagi.
    NOTE : Temps de rétention sont évidemment fortement tributaires de l’équipement CLHP chaque laboratoire (pompes, colonnes, tuyaux, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Toutefois, pour présenter un exemple, si une pente de 5 : 95 MeCN/H2O (tous deux avec 0,1 % TFA) à 70 : 30 MeCN/H2O (tous deux avec 0,1 % TFA) pendant 30 min, une colonne de18 semi-préparative 19 x 250 mm C et un débit de 6 mL/min sont utilisés , GOUSSES, p-SCN-Bn-DOTA et GOUSSES-DOTA aura des temps de rétention d’autour de 14,4 et 18,8 19,6 min, respectivement. Les trois composés peuvent être étudiés à 254 nm.

6. la bioconjugaison de GOUSSES-DOTA au trastuzumab

Remarque : Pour cette étape, nous avons commencé avec une solution mère de 16,4 mg/mL de trastuzumab.

  1. Dans un tube de microcentrifuge hypoprotidique liaison 1,5 mL, diluer 61 μL de la solution mère de trastuzumab (1 mg ; 6,67 nmol, 1 équivalent) avec 859 μL de solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4).
  2. Ajouter à ce mélange, 6,7 μL d’une solution fraîchement 10 mM de PTCE en H2O (66,7 nmol, 10 équivalents).
  3. Préparer une solution de 1 mg/mL de PODS-DOTA dans le DMSO et ajouter 73 μl de cette solution de PODS-DOTA au mélange réactionnel (66.67 nmol, 10 équivalents).
  4. Sceller le tube de microcentrifuge et incuber la solution pendant 2 heures à température ambiante.
  5. Après 2 heures, purifier l’immunoconjugué en utilisant une colonne de dessalement exclusion préemballages taille jetables.
    1. Tout d’abord, équilibrer la colonne d’exclusion de taille tel que décrit par le fournisseur à supprimer tous les préservatifs présents dans la colonne pendant le stockage. Un procédé typique implique la colonne 5 fois avec un volume de PBS qui correspond au volume de la colonne de lavage : 5 x 2,5 mL de PBS.
    2. Ensuite, ajoutez le mélange réactionnel à la colonne d’exclusion de taille notant le volume du mélange réactionnel.
    3. Une fois le mélange réactionnel est entré dans la colonne, ajouter une quantité appropriée de PBS pour porter le volume total de solution ajoutée à la colonne à 2,5 mL. Par exemple, si la réaction de conjugaison conduit à un volume total de 1,3 mL, 1,2 mL de PBS supplémentaires devraient être ajoutés à la colonne.
    4. Enfin, recueillir le produit à l’aide de 2 mL de PBS comme l’éluant.
  6. Concentrer l’immunoconjugué final avec des unités de filtration centrifuge avec un poids moléculaire de séparation de 50 kDa.

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Representative Results

Les quatre premières étapes du présent protocole, la synthèse des GOUSSES — ont été conçus pour être robustes et fiables. La déprotonation et la substitution de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol pour former le produit désiré thioéther offre les thioéthers dans > 99 % de rendement après seulement 45 minutes. Ensuite, la ligature entre 1 et N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine a été atteint par un peptide standard procédure de couplage, ayant pour résultat la collecte du produit (2) avec un rendement de 55 %. Ensuite, l’oxydation du 2 a été réalisée à l’aide de l’acide m-chloroperbenzoïque, un oxydant utilisé. Après les étapes de lavage, 3 a été obtenue comme un pâle solide avec un rendement d’environ 90 %. Enfin, le retrait du groupe protecteur tert-butyloxycarbonyl de 3 a été fait selon des procédures normalisées, en utilisant un ratio de 4:1 de l’acide dichloromethane:trifluoroacetic. Après la lyophilisation de la phase aqueuse, notre produit — dosettes — a été obtenue sous forme de poudre blanche avec un rendement de 98 %. L’état d’avancement de la réaction a été suivie par chromatographie sur couche mince, et l’identité de chaque produit a été confirmée par 1H RMN, 13C-RMN et SGRH-ESI (tableau 1).

L’un des principaux avantages du réactif GOUSSES est sa modularité. Une variété de chélateurs, fluorophores, toxines ou autres cargaisons peut être ajoutée à amine pendentif du composé. Dans le protocole à portée de main, nous utilisons le chélateur omniprésent DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tétraacétique) comme une charge représentative. DOTA, bien sûr, a été utilisé dans un large éventail de produits radiopharmaceutiques biomoléculaire comme un chélateur pour radiometals y compris 68Ga, 64Cu, 111, 90Y, 177Lu et 225Ac. À cette fin, une variante isothiocyanate-roulement de DOTA (p-SCN-Bn-DOTA) a été employée et couplée à l’amine de pendentif de GOUSSES par simple couplage conditions. Le chélateur bifonctionnel qui en résulte a été ensuite purifié par l’intermédiaire de phase inverse C18 HPLC et isolé avec un rendement d’environ 75 %. Comme avec les autres précurseurs, l’état d’avancement de la réaction a été suivie par chromatographie sur couche mince, et l’identité du produit a été confirmée par 1H RMN, 13C-RMN et SGRH-ESI (tableau 1).

Dans l’étape finale du protocole, nous discutons la bioconjugaison site sélectif de PODS-DOTA d’une immunoglobuline de modèle, le trastuzumab anticorps ciblant HER2. À cette fin, les disulfures de région charnière de l’anticorps diminuent sélectivement avec l’agent réducteur PTCE [tris(2-carboxyethyl) phosphine]. Après cette étape de la réduction, l’anticorps est incubé avec les dosettes-DOTA pendant 2 h à température ambiante et ensuite purifié par chromatographie d’exclusion. Dans ce cas, l’immunoconjugué purifiée, DOTA-roulement a été obtenu avec un rendement d’environ 80 %, et analyse de MALDI-ToF a révélé un degré d’étiquetage (DOL) de ~1.8 DOTA/mAb. De manière générale, nous avons constaté que 10 équivalents de TCEP, 10 équivalents du réactif de GOUSSES et une incubation de 2 h suffisent donner une immunoconjugué avec un DOL de 2 GOUSSES/mAb (tableau 2). Ce résultat reste cohérent à travers une gamme d’anticorps IgG1 humaines, humanisés et chimériques ; Toutefois, les mêmes conditions produisent immunoconjugués avec un DOL de ~1.5 uniquement lorsque vous travaillez avec des anticorps murins IgG1. Cela dit, les chercheurs devraient optimiser ces conditions réactionnelles de nouveaux anticorps et GOUSSES renfermant des cargaisons. Enfin et surtout, en ce qui concerne le produit final, nous avons à plusieurs reprises et de façon reproductible identifié qu’axée sur les GOUSSES immunoconjugués pièce immunoréactivités égales ou meilleures que des constructions analogues créées à l’aide axée sur le maléimide ou au hasard stratégies de conjugaison.

Figure 1
Figure 1 : Illustration schématique des bioconjugations à l’aide de (A) (B) amine-réactives, maléimide-roulement et (C) GOUSSES renfermant des cargaisons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : L’addition de Michael d’une biomolécule thiol-roulement (verte) et un radionucléide-roulement maléimide (jaune) pour former un bioconjugate radioactif, ainsi que les réactions supplémentaires que la construction radioactive peut subir en présence d’endogène molécules de thiol-roulement (rose). RT = température de la pièce. Figure reproduite avec la permission de Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. Thiol-réactifs bifonctionnels chélateurs pour la création de Radioimmunoconjugates les Site sélective modifiée avec une stabilité améliorée. Chimie Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Schéma de la réaction entre les GOUSSES et un thiol. Figure reproduite avec la permission de Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. Thiol-réactifs bifonctionnels chélateurs pour la création de Radioimmunoconjugates les Site sélective modifiée avec une stabilité améliorée. Chimie Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : La structure des GOUSSES (A) ainsi que (B) le réactif rapporté par Barbas, Al.18,19s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Schéma de la synthèse de quatre étapes des GOUSSES. Figure reproduite avec la permission de Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. Thiol-réactifs bifonctionnels chélateurs pour la création de Radioimmunoconjugates les Site sélective modifiée avec une stabilité améliorée. Chimie Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Schéma de la synthèse des GOUSSES-DOTA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Schéma de la bioconjugaison du trastuzumab avec cosses-DOTA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Comparaison du comportement in vivo de 89radioimmunoconjugates Zr marqués de huA33 créé à l’aide axée sur les GOUSSES (89Zr-MPO-dosettes-huA33) et des stratégies axées sur le maléimide (89Zr-MPO-mal-huA33) bioconjugaison. Planar (à gauche) et intensité maximale (à droite) projection PET images de souris nude athymique portant A33 exprimant l’antigène SW1222 cancer colorectal xénogreffes (flèche blanche) après l’injection de 89Zr-MPO-dosettes-huA33 et 89 ZR-MPO-mal-huA33 (µCi 140, 60-65 µg). Les tranches coronales croisent au centre de ces tumeurs. Figure reproduite avec la permission de Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. Thiol-réactifs bifonctionnels chélateurs pour la création de Radioimmunoconjugates les Site sélective modifiée avec une stabilité améliorée. Chimie Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Comparaison du comportement in vivo de 89radioimmunoconjugates Zr marqués de huA33 créé à l’aide axée sur les GOUSSES (89Zr-MPO-dosettes-huA33) et des stratégies axées sur le maléimide (89Zr-MPO-mal-huA33) bioconjugaison. Données de biodistribution après l’administration de 89Zr-MPO-dosettes-huA33 et 89Zr-MPO-mal-huA33 (µCi 30, 15-18 µg) de souris nude athymique portant A33 exprimant l’antigène sous-cutanée SW1222 cancer colorectal humain aux xénogreffes. Les valeurs de l’estomac, intestin grêle et gros intestin inclure contenu. Figure reproduite avec la permission de Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. Thiol-réactifs bifonctionnels chélateurs pour la création de Radioimmunoconjugates les Site sélective modifiée avec une stabilité améliorée. Chimie Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Composé 1 Déplacements en H-RMN 13 Déplacements en C-RMN SGRH
1 (500 MHz, CDCl3) 7,79 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,72 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 4.04 (2 H, br s), 2,75 (3 H, s) (125 MHz, CDCl3) 166,3 163,7, 149,7, 128,5, 114,8, 113,5, 14,8 m/z calculé [C9H9N3OS + H]+: 208.0539 ; trouvé : 208.0539 ; Δ : 0,0 ppm
2 (500 MHz, CDCl3) 9,68 (1H, s), 7.91 (2H, d, J = 9,0 Hz), 7.71 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6,82 (1H, s), 4,99 (1H, s), 3,70 3,45 (12H, m), 3.41 (2H, q, J = 6,0 Hz), 3,20 (2H, q, J = 6,5 Hz), 2,76 (3H, s), 2.71 (2H, m), 2,63 (2H m), 1.80 1.70-(4 H, m), 1,42 (9 H, s) (125 MHz, CDCl3) 172,6, 171,3, 165,8, 164,6, 156,2, 141,8, 127,7, 119,6, 118.6, 79.2, 70.6, 70,5, 70.3, 70.1, 69,6, 38,8, 38,5, 33,5, 31,6, 29,9, 28,6, 14,8 m/z calculé pour [C28H43N5O8S + Na]+: 632.2725 ; trouvé : 632.2722 ; Δ :-0,470 ppm
3 (500 MHz, CDCl3) 9,99 (1 H, s), 7,98 (2 H, d, J = 9,0 Hz), soit 7,75 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,88 (1 H, s), 4,99 (1 H, s), 3,66-3.50 (15 H, m), 3.41 (2 H, q, J = 6,0 Hz), 3,20 (2 H, q, J = 6,5 Hz), 2.71 (2 H, m), 2,65 (2 H, m) , 1.80 1.70-(4H, m), 1,43 (9H, s) (125 MHz, CDCl3) 172,6, 171,5, 166,5, 161,6, 156.1, 143,4, 128,7, 119,6, 116,4, 79.1, 70.5, 70,4, 70.2, 70,0, 69,4, 43,0, 38,8, 38,4, 33.2, 31,3, 29,7, 28,4 m/z  Montant annuel calculé pour [C28H43N5O10S + H]+: 642.2803 ; trouvé : 642.2797 ; Δ :-0,930 ppm
GOUSSES (500 MHz, D2O) 7,85 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7.55 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 3,60-3,45 (15 H, m), 3,45 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3,20 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3.04 (2 H, t, J = 7,0 Hz), 2,67 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 2.54 (2 H t, J = 6,5 Hz), 1,87 (2 H, qt, J = 6,5 Hz), 1,70 (2 H, qt, J = 6,5 Hz) (125 MHz, D2O) 174,5, 173,2, 166,8, 161.4, 142,2, 128,6, 120,3, 116,6, 69,4, 69,4, 69,3, 69,2, 68.2, 68.2, 42,5, 37,6, 36.2, 31,9, 30,7, 28.2, 26,4 m/z  Montant annuel calculé pour [C23H35N5O8S + H]+: 542.2279 ; trouvé : 542.2281 ; Δ : 0,37 ppm
DOSETTES-DOTA (600 MHz, DMSO-d6) 10.46 (1 H, s), 9.74 (1 H, bs), 8.04 (2 H, d, J = 8,6 Hz), 7,99 (1 H, s), 7.90 (1 H, t, J = 5,0 Hz), 7,86 (2 H, d, J = 6,5 Hz), 7,44 (2 H, d, J = 7,9 Hz), 7,24 (2 H, d, J = 7,1 Hz), 4.35-2.41 (45 H, m) , 3.70 (3H, s), 1.76 (2H, q, J = 6,3 Hz), 1.61 (2H, q, J = 6,5 Hz) (125 MHz, DMSO-d6) 171,8, 171,4, 166,1, 162,2, 158,8, 158,6, 129,8, 129,0, 127,6, 123.3, 119,5, 118,5, 116,5, 116,4, 70.2, 70.1, 70,0, 68,7, 68,5, 43.4, 41,8, 36,3, 32,2, 30,4, 29,8, 29.1 m/z  Montant annuel calculé pour [C47H68N10O16S2+ H]+: 1093.4334 ; trouvé : 1093.4327 ; Δ :-0,640 ppm

Table 1. Les données de caractérisation pour les intermédiaires de synthèse décrites ainsi que les GOUSSES et GOUSSES-DOTA.

Anticorps Type de Région constante Ratio de GOUSSES : mAb
Plasma humain IgG Humaine IgG humain 2,1 ± 0,1
Trastuzumab Humanisé IgG1 humaine 2,0 ± 0,1
huA33 Humanisé IgG1 humaine 2,1 ± 0,1
Cetuximab Chimériques IgG1 humaine 2,2 ± 0,1
AR 9,6 Murin Murin IgG1 1,4 ± 0,1
Plasma de souris IgG Murin Murin IgG 1,5 ± 0,1

Le tableau 2. Degré de l’étiquetage des différents anticorps après conjugaison avec un fluorophore portant des GOUSSES. Valeurs sont indiquées les écarts-types. Tableau reproduit avec permission du Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, b. M. Thiol-réactifs bifonctionnels chélateurs pour la création de Radioimmunoconjugates les Site sélective modifiée avec une stabilité améliorée. Chimie Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society.

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Discussion

Dans ce rapport, nous avons choisi de ne pas faire figurer tous les protocoles d’expérimentation radiolabeling ou in vivo. Nos motifs sont simples. En ce qui concerne le premier cas, le radiomarquage d’un immunoconjugué axée sur les GOUSSES ne diffère pas du tout celle d’une immunoconjugué synthétisé à l’aide d’autres stratégies de bioconjugaison, et ces procédures ont été largement examinés ailleurs2 . Dans ce dernier domaine, les spécificités de précliniques expériences in vivo (modèles de souris, des doses, etc.) peuvent varier largement selon l’application et le système d’anticorps/antigène.

Nos enquêtes précédentes avec 89marqués au Zr variantes de huA33 fournissent une illustration convaincante des avantages de bioconjugations axée sur les GOUSSES. HuA33 est un anticorps humanisé de IgG1 ciblant l’antigène A33, une glycoprotéine transmembranaire exprimée sur > 95 % des cancers colorectaux23,24. Dans notre précédente du manuscrit22, nous rapportons la synthèse de 89Zr-MPO-huA33 radioimmunoconjugate à l’aide de ces deux stratégies de bioconjugaison base de dosettes et maléimide. Les deux radiomarqué anticorps — 89Zr-MPO-dosettes-huA33 et 89Zr-MPO-mal-huA33 — ont été produites en rendement presque identique, la pureté, activité de la spécificité et l’immunoréactivité. Critique, cependant, les deux radioimmunoconjugates présentait des stabilités radicalement différentes dans le sérum humain : après une incubation de 7 jours à 37 ° C, 89Zr-MPO-dosettes-huA33 intacts 86 ± 1 %, tandis que son cousin axée sur le maléimide était seulement 61 ± 5 % intact. Imagerie in vivo de PET et de biodistribution des expériences chez la souris nude athymique A33 exprimant l’antigène SW1222 cancer colorectal humain xénogreffes révélée stark différences dans le comportement in vivo des deux radioimmunoconjugates (Figure 8 et Figure 9). Les 89Zr-MPO-dosettes-huA33 et 89Zr-MPO-mal-huA33 produisent des concentrations d’activité élevé dans le tissu tumoral : 56,4 ± 6.9%ID/g et 49,6 ± 9.3%ID/g, respectivement, 48 h après l’administration. Cependant, la radioimmunoconjugate axée sur la maléimide produit les concentrations d’activité significativement plus élevées dans les tissus sains que l’agent basé sur les GOUSSES. Par exemple, 89Zr-MPO-mal-huA33 produit des concentrations d’activité de 3,1 ± 0,5 2,7 ± 0,4 et 12,2 ± 0,4 % ID/g dans les reins, le foie et OS, respectivement, après l’injection 120 h, valeurs qui dépassent considérablement les concentrations d’activité produit par 89Zr-MPO-dosettes-huA33 dans les mêmes tissus (1,4 ± 0,1, 1,2 ± 0.3 et 4,3 ± 0,6 % ID/g). En effet, 89Zr-MPO-dosettes-huA33 produit des concentrations plus faibles de l’activité dans tous les tissus non visés (à l’exception du gros intestin) après l’injection 120 h par rapport aux 89Zr-MPO-mal-huA33. En conséquence, le taux de concentration de tumeur pour grand orgue activité pour 89Zr-MPO-dosettes-huA33 est généralement supérieurs à ceux de 89Zr-MPO-mal-huA33 ; en particulier, la tumeur-de-foie, tumeur-à-rate, tumeur-de-reins et concentration de l’activité tumorale-aux-os, les ratios sont près du double pour l’immunoconjugué axée sur les GOUSSES par rapport à son cousin maléimide dérivés. Étant donné que la principale différence entre les deux radioimmunoconjugates était la poignée bioconjugaison de l’agent chélateur, l’augmentation de la stabilité de la tringlerie de PODS-thiol est presque certainement responsable de cette amélioration des performances in vivo.

Prendre une vue plus large, le site-non-sélective bioconjugaison des sondes pour les lysines au sein de l’anticorps est certes une approche simple et facile à la modification des anticorps. Toutefois, la présence de plusieurs lysines distribués tout au long de la structure des immunoglobulines signifie qu’il est impossible d’exercer un contrôle sur le site précis ou de bioconjugaison2. Par conséquent, cette stratégie aléatoire produit souvent mal défini et immunoconjugués très hétérogènes qui peuvent présenter une diminution immunoréactivité si des trompes se produisent dans les domaines de liaison antigène3. Les avantages des approches sélectives site bioconjugaison ont été illustrés à plusieurs reprises pour les deux radioimmunoconjugates et anticorps-médicament conjugue8,14,25,26, 27,28,29,30. En bref, non seulement bioconjugaison site sélectif stratégies produisent plus bien définis et immunoconjugués homogène que les méthodes traditionnelles, ils également créent des agents d’imagerie, de radioimmunotherapeutics et convertisseurs a/n avec l’amélioration des performances in vivo. Mais alors, quelle sont axée sur les GOUSSES des trompes position en comparaison à d’autres stratégies de modification sélective-site ? De manière générale, les approches à la modification site sélectif des anticorps peuvent être classés en quatre catégories : (1) des trompes pour les résidus de cystéine, (2) la manipulation des chaîne lourde de glycanes, les transformations de chimioenzymatique (3) et (4) l’utilisation génie génétique4,5. Bien sûr, ce système de classification n’est pas parfait, et certaines approches (par exemple, la modification des chaîne lourde de glycanes avec enzymes) inévitablement se qualifier pour les deux catégories. Chaque stratégie a ses propres avantages et inconvénients. Approches axées sur le génie génétique offrent un contrôle exquis sur le site de conjugaison, pourtant ils sont complexes et coûteuses31,32,,33. Couplages oxydants aux chaîne lourde de glycanes sont peu coûteux et simple, et pourtant ils risquent des dommages oxydatifs à l’intégrité structurale de l’immunoglobuline34,35,36,37 ,,38.

L’avantage principal de thiol-basé bioconjugations — dosettes inclus — est leur simplicité et leur modularité. Leur principale limite, d’autre part, découle de la présence de thiols multiples au sein d’un anticorps, un trait qui réduit le degré de maîtrise aussi bien le site de conjugaison et le nombre de modifications par anticorps. En ce sens, la combinaison de thiol-basé des trompes et des anticorps qui ont été génétiquement modifiées pour posséder des résidus cystéine libre est une approche particulièrement intéressante. Comme nous l’avons noté, une autre limitation de trompes axée sur le maléimide thiol est la susceptibilité de la liaison Thioether succinimidyl rétro-Michael additions in vivo. Encore un oeil critique, l’utilisation de dosettes abroge ce problème.

Avant de conclure, il est important de noter que la nature émergente de GOUSSES technologie peut créer son propre ensemble d’obstacles. Par exemple, aucun chélateurs bifonctionnels portant des GOUSSES ne sont (actuellement) disponibles dans le commerce et il n’y a aucune donnée sur la pharmacologie clinique et toxicologie immunogénicité des immunoconjugués axée sur les GOUSSES. Cependant, nous croyons que bioconjugations axée sur les GOUSSES sont susceptibles de changer fondamentalement la façon dont immunoconjugués sont synthétisées en laboratoire et en clinique. À l’heure actuelle, nous avons seulement appliqué cette technologie chimique à l’élaboration de radioimmunoconjugates pour l’imagerie nucléaire et en radio-immunothérapie, bien que les enquêtes sur l’utilité de cette approche pour la construction d’anticorps-médicament conjugués et autres médicaments biomoléculaire sont actuellement en cours. En fin de compte, nous espérons sincèrement que ce protocole — et en particulier la chimie simple et direct que nous avons élaborée — contribuera à promouvoir l’utilisation des sulfones méthyl phenyloxadiazolyl pour axée sur les sulfhydryles conjugaisons et stimuler un changement dans le domaine de maléimides pour des solutions de rechange plus stables et plus fiables.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Dr Sai Kiran Sharma pour les conversations utiles.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol Sigma-Aldrich 675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube Eppendorf 925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube Fisherbrand 05-408-129
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore EN300000141G
Cyclohexane Fisher Scientific C556-4
Dichloromethane Fisher Scientific AC383780010
Diisopropylethylamine MP Biomedicals, LLC 150915
Dimethylsulfoxide Fisher Scientific 31-727-5100ML
Ethyl Acetate Fisher Scientific E145 4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Iodomethane Sigma-Aldrich 289566-100G
Magnesium Sulfate Acros Organics 413485000
m-chloroperbenzoic acid Sigma-Aldrich 273031
Methanol Fisher Scientific A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine Sigma-Aldrich 671401 Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 3450
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P5493 10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich S7795
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
TCEP ThermoFischer Scientific 20490
Triethylamine Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid Fisher Scientific A116-50

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Chimie numéro 145 bioconjugaison in situ bioconjugaison site sélectif maléimide thiol sulfhydryle radioimmunoconjugate immunoconjugué
Synthèse et bioconjugaison de Thiol-réactifs pour la création de Site-sélectivement modifiés immunoconjugués
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Davydova, M., Dewaele Le Roi, G.,… More

Davydova, M., Dewaele Le Roi, G., Adumeau, P., Zeglis, B. M. Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates. J. Vis. Exp. (145), e59063, doi:10.3791/59063 (2019).

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