Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntese og Bioconjugation Thiol-reaktive reagenser for etableringen av nettstedet-selektivt endret Immunoconjugates

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/59063
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

I denne protokollen, vil vi beskrive syntesen av PODS, en phenyoxadiazolyl methyl sulfone-baserte reagens for området-selektiv feste Last til thiols av biomolecules, spesielt antistoffer. I tillegg vil vi beskrive syntese og karakterisering av en PODS-bærende bifunctional chelator og dens Bøyning til en modell antistoff.

Abstract

Maleimide-bærende bifunctional sonder har vært ansatt i tiår området-selektiv endring av thiols i biomolecules, spesielt antistoffer. Likevel vise maleimide-baserte conjugates begrenset stabilitet i vivo fordi succinimidyl thioether sammenhengen kan gjennomgå en retro-Michael reaksjon. Dette, selvfølgelig, kan føre til utgivelsen av radioaktivt nyttelast eller sin exchange thiol-bærende biomolecules i sirkulasjon. Begge disse prosessene kan produsere opphøyet aktivitet konsentrasjoner i friske organer samt redusert aktivitet konsentrasjonene i målet vev, som resulterer i redusert tenkelig kontrast og lavere terapeutiske forhold. I 2018, rapporterte vi etableringen av en modulær, stabil og lett tilgjengelig phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagens-kalt "PODS", som en plattform for thiol-basert bioconjugations. Vi har vist at PODS-basert nettsted-selektiv bioconjugations reproduserbar og robustly opprette homogene, veldefinerte, svært immunoreactive og svært stabile radioimmunoconjugates. Videre har prekliniske eksperimenter i murine modeller av tykktarmskreft vist at dette området-selektivt merket radioimmunoconjugates utstillingen langt overlegen i vivo ytelse sammenlignet med radiolabeled antistoffer syntetisert via maleimide-basert conjugations. I denne protokollen, vil vi beskrive fire trinn syntesen av PODS, etableringen av en bifunctional PODS rentebærende variant av den allestedsnærværende chelator DOTA (PODS-DOTA) og Bøyning av PODS-DOTA til HER2 målretting antistoffet trastuzumab.

Introduction

Radiopharmaceutical kjemikere har lenge utnyttet selektivitet og spesifisitet av antistoffer for biomarkers sykdom for både kjernefysiske bildebehandling og målrettet strålebehandling1. Langt unna de vanligste tilnærming til radiolabeling av antistoffer forutsetter vilkårlige feste radiolabeled prosthetic grupper eller radiometal chelater til aminosyrer, oftest lysines-i strukturen av immunglobulin ( Figur 1A)2. Selv om denne strategien er sikkert effektivt, kan tilfeldig, ikke-område-spesifikk natur skape problemer. Spesielt tradisjonelle bioconjugation tilnærminger produsere dårlig definert og heterogene immunoconjugates består av blandinger av forskjellige regioisomers, hver med sitt eget sett av biologisk og farmakologisk egenskaper3. Videre kan tilfeldig bioconjugation hindre immunoreactivity av antistoffer Hvis lasten er lagt til av immunglobulin antigen bindende domener.

Gjennom årene, en rekke områdespesifikke og området-selektive bioconjugation strategier er utviklet for å møte disse problemer4,5. Den vanligste av disse avhengig av ligation av maleimide-bærende sonder til sulfhydryl grupper med cysteinene (figur 1B). IgG1 antistoffer inneholder naturlig 4 mellom kjeden disulfidbroer, sammenhengene som reduseres selektivt for å gi gratis thiols i stand til å gjennomgå Michael tillegg reaksjoner med maleimides til succinimidyl thioether obligasjoner. Bruk av thiols og maleimides er absolutt en forbedring over tradisjonelle metoder, og en rekke maleimide-bærende synthons og bifunctional chelater er tilgjengelige. Det er imidlertid viktig å merke seg at denne metoden har alvorlige begrensninger også. Maleimide-baserte immunoconjugates utstilling begrenset stabilitet i vivo fordi thioether sammenhengen kan gjennomgå en retro-Michael reaksjon (figur 2)6,7,8,9, 10. dette, selvfølgelig, kan føre til utgivelsen av radioaktivt nyttelast eller sin exchange thiol-bærende biomolecules i sirkulasjon (f.eks glutation eller serum albumin). Begge disse prosessene kan øke aktiviteten konsentrasjoner i friske organer samt redusere aktivitet konsentrasjonene i målet vev, som resulterer i redusert tenkelig kontrast og lavere terapeutiske forhold. Flere alternative thiol-reaktive reagenser er utviklet i et forsøk på å omgå disse problemene, inkludert tosylates, bromo - og iodo-acetyls, og vinyl sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. alle disse tilnærmingene har imidlertid begrensninger som har hemmet utbredt programmet.

Fem år siden, pioner laboratoriet av sen Carlos Barbas III ved Scripps Research Institute i bruk av phenyloxadiazolyl methyl sulfones som reagenser for selektiv dannelsen av svært stabile sammenhengene med thiols (figur 1 c og figur 3) 18 , 19. forfatterne ansatt en phenyloxadiazolyl methyl sulfone-bærende variant av fluorescein endre flere antistoffer konstruert for å inneholde gratis cystein rester, til slutt produsere immunoconjugates med høyere stabilitet enn analoge konstruksjoner laget med maleimide-baserte sonder. Da han så dette lovende arbeidet, var vi litt overrasket over at denne teknologien var bare brukt knapt i radiochemistry og hadde ennå ikke er brukt på alle i syntesen av bifunctional chelater eller radioimmunoconjugates20,21 . Denne mangel på programmer, men snart begynte å gjøre mer fornuftig: flere forsøk på å skaffe reagensen fra Sigma Aldrich resulterte i mottak av komplekse blandinger av nedbrytningsprodukter med < 15% av den ønskede sammensatt. I tillegg syntetisere rapporterte reagensen oss var ikke en realistisk opsjon, som publiserte syntetiske ruten er noe tungvint og krever sofistikerte organisk kjemi utstyr som de fleste radiochemistry og molekylære bildebehandling laboratorier, inkludert vår-bare ikke har.

Svar på disse hindringene satt vi å lage en lett tilgjengelig og svært stabil phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagens som kan fås via en robust og rimelig lettvinte syntetisk prosess. Tidligere i år, rapporterte vi etableringen av en modulær, stabil og lett tilgjengelig phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagens-kalt "PODS", som en plattform for thiol-baserte bioconjugations (figur 1 c og figur 3)22. Hovedforskjellen mellom PODS og reagens rapportert av Barbas, et al. er at tidligere benytter en anilinhud ring festet til phenyloxadiazolyl methyl sulfone moiety, mens sistnevnte har en fenol i samme stilling (Figur 4). Denne endringen gir en mer enkel og tilgjengelig syntetisk prosess som, hvis vår erfaring med det kommersielt tilgjengelige sammensatt er illustrerende-en mer stabil siste reagens. I dette arbeidet, vi også syntetiseres et par PODS-bærende bifunctional chelater-PODS-DFO og PODS-CHX-A''-DTPA-å forenkle etableringen av 89Zr- og 177Lu-merket radioimmunoconjugates, henholdsvis. Som vi vil diskutere, har vi vist at PODS-basert nettsted-selektiv bioconjugations reproduserbar og robustly opprette homogene, veldefinerte, svært immunoreactive og svært stabile radioimmunoconjugates. Videre har prekliniske eksperimenter i murine modeller av tykktarmskreft vist at dette området-selektivt merket radioimmunoconjugates utstillingen overlegen i vivo ytelse sammenlignet med radiolabeled antistoffer syntetisert via maleimide-basert conjugations.

Det overordnede målet med dette arbeidet er å forenkle etableringen av veldefinerte, homogen, svært stabile og svært immunoreactive immunoconjugates for i vitro og in vivo programmer. Den syntetiske tilnærmingen er enkel nok utføres i nesten alle laboratorium, og overordnede PODS reagensen kan endres med en mengde forskjellige chelater, fluorophores eller Last. I denne protokollen og på videoen, vil vi beskrive enkle, fire-trinns syntesen av PODS (figur 5); etableringen av en PODS rentebærende variant av DOTA, en brukte chelator for koordinering av 64Cu, 68Ga, 111i 177Lu og 225Ac (figur 6). og bioconjugation av PODS-DOTA til en modell antistoff, HER2 målretting IgG1 trastuzumab (figur 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. syntese av 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)

Merk: På grunn av lys-følsomheten av sammensatt, holde alle reaksjoner i folie-dekket fartøyer.

  1. I en 10 mL runde bunnen kolbe, oppløse 100 mg (0.517 mmol, 1 tilsvarende) av 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol i 3 mL av metanol.
  2. Denne løsningen, legge til 360 μL diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 ekvivalenter; vannfri) og en liten magnetic røre bar. Dekke en gummipropp flasken og rør løsningen i 10 minutter ved romtemperatur.
  3. Bruke en 1 mL glass sprøyte, stikk et hull gjennom gummipropp og raskt legge til 32 μL (0.517 mmol, 1 tilsvarende) i iodomethane til denne blandingen. La blandingen til å reagere i 45 minutter ved romtemperatur.
    Merk: På grunn av potensielle skadevirkninger av iodomethane, dette bør gjøres i kjemisk avtrekksvifte.
  4. Angi vannbad i en roterende fordamperen til 40 ° C og sakte redusere presset for å fjerne løsemiddelet råd til en hvit solid.
  5. Oppløse solid i 3 mL ethyl acetate og vask minst tre ganger med en 5 mL løsning på 0,1 M natriumkarbonat bruker en separatory trakt.
    Merk: Regelmessig ta spot-tester av vandige fasen under en UV-lampe; Når noe er sett under lampen, kan du stoppe vasker.
  6. Samle den organiske fasen i en separatory trakt og vaske det med vann til pH i den vandige fasen når 6.8 7.0 (med pH-papir).
  7. Samle den organiske fasen og Legg magnesium sulfat for å fjerne alle spor av vann.
    Merk: Magnesium-sulfat bør legges med en liten spatel, hvoretter løsningen skal være virvlet. Hvis fine partikler av tørking agent er fortsatt sett, er løsningen tørr. Hvis ikke, legge til små mengder magnesium-sulfat til fine partikler kan sees.
  8. Filtrere blandingen med en middels glass frit eller filter papir.
  9. Fordampe flyktige bruker en roterende fordamperen, en prosess som skal føre til det ønskede produktet som hvite pinner.

2. syntese av tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamate (2)

Merk: På grunn av lys-følsomheten av sammensatt, holde alle reaksjoner i folie-dekket fartøyer.

  1. I en 25 mL runde bunnen kolbe, oppløse 387 mg (0,92 mmol, 1.0 tilsvarende) av NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine i 10 mL av diklormetan.
  2. Denne løsningen, legge til 480 μL (2.76 mmol, 3 ekvivalenter) DIPEA, 264 mg (1,38 mmol, 1,5 ekvivalenter) n-etyl - N′-[3-(dimethylamino) propyl] carbodiimide hydroklorid (EDCI), og 200 mg (0.97 mmol, 1.1 ekvivalenter) 1. Forsegle fartøyet korket og la reaksjonen rør i 5 dager ved romtemperatur.
    Merk: Vær oppmerksom på fordampning av diklormetan. Hvis nødvendig, legge til flere hele uken.
  3. Legg blandingen i en separatory trakt med en løsning på 1 M saltsyre (3 x 5 mL).
  4. Samle den organiske fasen og fortsette å vaske det i en separatory trakt, først med en løsning av 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL) og deretter med vann (3 x 5 mL).
  5. Samle den organiske fasen og Legg magnesium sulfat for å fjerne alle spor av vann (se trinn 1.7). Filtrere blandingen med en middels glass frit eller filter papir.
  6. Bruker en roterende fordamperen, fjerne flyktige løsemidlene under redusert trykk råd til et off-white solid.
  7. Å oppløse denne solide i 10 mL ethyl acetate og føre produktet via gradvis (f.eks 2 mL samtidig) tillegg av 30 mL av cyclohexane.
  8. Filtrere løsningen med filter papir eller en middels glass frit å få produktet som et hvitt pulver.

3. syntese av tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamate (3)

Merk: På grunn av lys-følsomheten av sammensatt, holde alle reaksjoner i folie-dekket fartøyer.

  1. I en 10 mL runde bunn kolbe, løses 30 mg (0,05 mmol, 1 tilsvarende) 2 i 4 mL av diklormetan.
  2. Sakte Legg i 49 mg (0,2 mmol, 4 ekvivalenter) 70% m-chloroperbenzoic syre til denne blandingen og dekke reaksjonen fartøyet korket. Rør løsningen over natten i romtemperatur, til slutt gir en gul blanding.
  3. Vask gule blandingen i en separatory trakt, først med en 0.1 M løsning av NaOH (3 x 5 mL) og deretter med vann (3 x 5 mL).
  4. Tørk den organiske fasen med magnesium sulfat og filtrere blandingen med en middels glass frit eller filter papir.
  5. Bruker en roterende fordamperen, fjerne løsemidlene under redusert Trykk for å få produktet som en blek solid.

4. syntese av N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] fenyl} succinamide (PODS)

  1. I en 25 mL runde bunnen kolbe, oppløse 30 mg 3 i 2.0 mL av diklormetan.
  2. Legge til 400 μL trifluoroacetic syre og forsegle kolbe korket.
  3. Rør reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 3 timer.
  4. Bruker en roterende fordamperen, fjerne flyktige under redusert trykk i romtemperatur, forlate en fettrester.
  5. Oppløse fettrester i 7 mL vann, og bruker en separatory trakt, vask med ethyl acetate (3 x 4 mL). Holde vandig laget.
  6. Lyophilize vandig laget råd til PODS som et hvitt pulver.
    Merk: Molar absorpsjon koeffisientene for PODS på 280 og 298 nm er 9,900 og 12 400 cm-1M-1, henholdsvis.

5. syntese av PODS-DOTA

  1. I en 1,5 mL microcentrifuge tube, oppløse 10 mg PODS i 300 μL dimethyl sulfoxide (0.018 mmol, 1 tilsvarende) og legge til 26 μL N, N-diisopropylethylamine (0,15 mmol, 8 ekvivalenter).
  2. Oppløse 15.2 mg DOTA-Bn-sokkel (0.02 mmol, 1,2 ekvivalenter) i 100 μL dimethylsulfoxide og kombinerer denne løsningen med løsningen fra trinn 5.1. Forsegle microcentrifuge røret.
  3. At reaksjonen å ruge over natten i romtemperatur.
  4. Rense produktet bruker omvendt-fase C18 HPLC kromatografi fjerne noen Ureagert DOTA-Bn-sokkel.
    Merk: Tid er åpenbart svært avhengig HPLC utstyret av hvert laboratorium (pumper, kolonner, rør, etc.), og aktuelle kontroller bør kjøres før rensing. Imidlertid å presentere et eksempel, hvis en stigning på 5:95 MeCN/T2O (begge med 0,1% TFA) til 70:30 MeCN/T2O (begge med 0,1% TFA) over 30 min, en semi preparative 19 x 250 mm C18 kolonne og en flow rate på 6 mL/min brukes , PODS, p-SCN-Bn-DOTA, og PODS-DOTA vil ha tid av rundt 14.4, 18,8 og 19,6 min, henholdsvis. Alle tre stoffer kan overvåkes på 254 nm.

6. bioconjugation av PODS-DOTA til trastuzumab

Merk: For dette trinnet, vi startet med en 16.4 mg/mL lager løsning av trastuzumab.

  1. I en lav protein bindende 1,5 mL microcentrifuge tube, fortynne 61 μL trastuzumab lager løsningen (1 mg, 6,67 nmol, 1 tilsvarende) med 859 μL fosfat bufret saltvann (pH 7.4).
  2. Til denne blandingen, tilsett 6,7 μL av en nystekte 10 mM løsning av TCEP i H2O (66.7 nmol, 10 ekvivalenter).
  3. Forberede en 1 mg/mL løsning av PODS-DOTA i DMSO og legge til 73 μL PODS-DOTA løsningen reaksjonsblandingen (66.67 nmol, 10 ekvivalenter).
  4. Seal microcentrifuge røret og ruge løsningen i 2 timer ved romtemperatur.
  5. Etter 2 timer, rense immunoconjugate bruker en pre-pakket disponibel størrelse utelukkelse avsalting kolonne.
    1. Først equilibrate størrelse utelukkelse kolonnen som beskrevet av leverandøren fjerne konserveringsmidler i kolonnen under lagring. En typisk prosedyren innebærer vaske kolonnen 5 ganger med et volum på PBS som tilsvarer volumet av kolonnen: 5 x 2,5 mL PBS.
    2. Deretter legge til reaksjonsblandingen størrelse utelukkelse kolonnen merke volumet reaksjonsblandingen.
    3. Når reaksjonsblandingen er inn kolonnen, legge til en passende mengde PBS å bringe det totale volumet av løsning lagt til kolonnen opptil 2,5 mL. For eksempel hvis Bøyning reaksjonen resultert i et totalt volum på 1,3 mL, må 1,2 mL ekstra PBS legges til i kolonnen.
    4. Til slutt, samle produktet bruker 2 mL PBS som eluent.
  6. Konsentrere seg det siste immunoconjugate med sentrifugal filtrering enheter med en 50 kDa molekylvekt cut-off.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De fire første trinnene av denne protokollen-syntese av PODS, er designet for å være robust og pålitelig. Deprotonering og substitusjon av 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol å danne ønskede thioether produktet gir thioether i > 99% avkastning etter bare 45 minutter. Neste, ligation mellom 1 og N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine ble nådd via en standard peptid kopling prosedyren, som resulterer i samlingen av produktet (2) i 55% avkastning. Deretter ble oksidasjon av 2 utført med m-chloroperoxybenzoic acid, en brukte oksiderende. Etter vask trinnene, 3 ble oppnådd som en blek solid i ~ 90% avkastning. Endelig ble fjerning av gruppen tert-butyloxycarbonyl beskytte 3 gjort i henhold til standard prosedyrer, bruke 4:1 forholdet dichloromethane:trifluoroacetic syre. Etter lyophilization i den vandige fasen, vårt produkt-PODS, ble oppnådd som et hvitt pulver i 98% avkastning. Fremdriften av reaksjonen ble fulgt via tynt lag Ture, og identiteten til hvert produkt ble bekreftet via 1H-NMR, 13C-NMR og HRMS-ESI (tabell 1).

En av de viktigste fordelene med PODS reagensen er dens modularitet. En rekke chelater, fluorophores, giftstoffer eller andre laster kan legges til den sammensatte anheng Amin. I protokollen for hånden bruker vi den allestedsnærværende chelator DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid) som en representant nyttelast. DOTA, selvfølgelig, har vært brukt i en rekke biomolecular radiopharmaceuticals som en chelator for radiometals inkludert 68Ga, 64Cu, 111i 90Y, 177Lu og 225Ac. Dette var en isothiocyanate-bærende variant av DOTA (p-SCN-Bn-DOTA) ansatt og koblet til anheng Amin i PODS via direkte kobling forhold. Den resulterende bifunctional chelator var så renset via omvendt fase C18 HPLC og isolert i ~ 75% avkastning. Som med andre forløpere, fremdriften av reaksjonen ble fulgt via tynt lag Ture, og identiteten til produktet ble bekreftet via 1H-NMR, 13C-NMR og HRMS-ESI (tabell 1).

I det siste trinnet av protokollen diskutere vi nettstedet-selektiv bioconjugation for PODS-DOTA til en modell immunglobulin, HER2 målretting antistoffet trastuzumab. Dette disulfide sammenhengen antistoffers hengsel regionen selektivt reduseres med redusert agent TCEP [tris(2-carboxyethyl) phosphine]. Etter dette reduksjon trinnet antistoffer er ruges med PODS-DOTA i 2 timer ved romtemperatur og senere renset via størrelse utelukkelse kromatografi. I dette tilfellet den renset, DOTA-bærende immunoconjugate ble oppnådd i ~ 80% avkastning, og MALDI-ToF analyse viste en grad av merking (DOL) av ~1.8 DOTA/mAb. Generelt sett har vi funnet at 10 ekvivalenter av TCEP, 10 ekvivalenter PODS reagensen og en 2t inkubasjon er tilstrekkelig til å gi en immunoconjugate med en DOL av 2 PODS/mAb (tabell 2). Dette resultatet forblir konsekvent på tvers av en rekke menneskelige, humanized og chimeric IgG1 antistoffer; men produsere vilkårene immunoconjugates med en DOL av bare ~1.5 når du arbeider med murine IgG1 antistoffer. Alt dette sagt, forskere skal optimalisere disse reaksjonen forhold for nye antistoffer og PODS rentebærende gods. Til slutt, og viktigere, med hensyn til det endelige produktet, har vi gjentatte ganger og reproduserbar funnet at PODS-baserte immunoconjugates utstilling immunoreactivities lik eller bedre enn analoge konstruksjoner laget med tilfeldig eller maleimide-basert Bøyning strategier.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av bioconjugations (A) Amin-reaktive, (B) maleimide-bærende og (C) PODS rentebærende Last. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Michael tillegg av en thiol-bærende biomolecule (grønn) og en radionuklidenes-bærende maleimide (gul) til en radiolabeled bioconjugate, samt ekstra reaksjonene som den radiolabeled konstruere kan gjennomgå i nærvær av endogene thiol-bærende molekyler (rosa). RT = romtemperatur. Figur gjengitt med tillatelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelater for den etableringen av nettstedet-selektivt endret Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kjemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk av reaksjonen PODS og en thiol. Figur gjengitt med tillatelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelater for den etableringen av nettstedet-selektivt endret Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kjemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Strukturen i PODS (A) samt (B) reagensen rapportert av Barbas, et al.18,19Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Ordningen med fire trinn syntesen av PODS. Figur gjengitt med tillatelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelater for den etableringen av nettstedet-selektivt endret Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kjemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Ordningen med syntese av PODS-DOTA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Ordningen med bioconjugation av trastuzumab med PODS-DOTA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Sammenligning av i vivo virkemåten til 89Zr-merket radioimmunoconjugates av huA33 opprettet med PODS-basert (89Zr-DFO-PODS-huA33) og maleimide-basert (89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation strategier. Planar (venstre) og maksimale intensitet projeksjon (høyre) PET bilder athymic naken mus bærer A33 antigen-uttrykke SW1222 tykktarmskreft xenografts (hvit pil) etter injeksjon av 89Zr-DFO-PODS-huA33 og 89 Zr-DFO-mal-huA33 (140 µCi, 60-65 µg). Koronale skiver krysser sentrum av tumorer. Figur gjengitt med tillatelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelater for den etableringen av nettstedet-selektivt endret Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kjemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: Sammenligning av i vivo virkemåten til 89Zr-merket radioimmunoconjugates av huA33 opprettet med PODS-basert (89Zr-DFO-PODS-huA33) og maleimide-basert (89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation strategier. Biodistribution data etter administrasjon av 89Zr-DFO-PODS-huA33 og 89Zr-DFO-mal-huA33 (30 µCi, 15-18 µg) til athymic naken mus bærer A33 antigen-uttrykke subkutan SW1222 menneskelige tykktarmskreft xenografts. Verdiene for mage, tynntarm og tykktarmen inkluderer innhold. Figur gjengitt med tillatelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelater for den etableringen av nettstedet-selektivt endret Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kjemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sammensatte 1 H-NMR Skift 13 C-NMR Skift HRMS
1 (500 MHz, CDCl3) 7.79 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6.72 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 4.04 (2 H, br s), 2,75 (3 H, s) (125 MHz, CDCl3) 166.3, 163.7, 149.7, 128.5, 114.8, 113.5, 14,8 m/z beregnet årlig beløp for [C9H9N3OS + H]+: 208.0539; funnet: 208.0539; Δ: 0.0 ppm
2 (500 MHz, CDCl3) 9.68 (1H, s), 7.91 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.71 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6.82 (1H, s), 4.99 (1H, s) 3.70-3,45 (12H, m) 3.41 (2H, q, J = 6.0 Hz), 3,20 (2H, q, J = 6,5 Hz), 2.76 (3H, s), 2,71 (2H, m), 2.63 (2H m), 1.80-1,70 (4 H, m) 1.42 (9 H, s) (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.3, 165.8, 164.6, 156.2, 141.8, 127.7, 119.6, 118.6, 79.2, 70.6, 70,5, 70,3, 70.1, 69.6, 38,8, 38,5, 33,5, 31,6, 29,9, 28,6, 14,8 m/z beregnet årlig beløp for [C28H43N5O8S + Na]+: 632.2725; funnet: 632.2722; Δ:-0.47 ppm
3 (500 MHz, CDCl3) 9.99 (1 H, s), 7.98 (2 H, d, J = 9.0 Hz), 7,75 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,88 (1 H, s), 4.99 (1 H, s) 3,66-3,50 (15 H, m) 3.41 (2 H, q, J = 6.0 Hz), 3,20 (2 H, q, J = 6,5 Hz), 2,71 (2 H, m), 2,65 (2 H, m) , 1.80-1,70 (4H, m) 1,43 (9H, s) (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.5, 166.5, 161.6, 156.1, 143.4, 128.7, 119.6, 116.4, 79.1, 70.5, 70,4, 70.2, 70.0, 69,4, 43.0, 38,8, 38.4, 33.2, 31.3, 29,7, 28.4 m/z  Beregnet årlig beløp for [C28H43N5O10S + H]+: 642.2803; funnet: 642.2797; Δ:-0.93 ppm
PODS (500 MHz, D2O) 7.85 (2 H, d, J = 9.0 Hz), 7.55 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 3,60-3,45 (15 H, m) 3,45 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3,20 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3.04 (2 H, t, J = 7.0 Hz), 2,67 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 2,54 (2t t, J = 6,5 Hz), 1.87 (2 H, qt, J = 6,5 Hz), 1,70 (2 H, qt, J = 6,5 Hz) (125 MHz, D2O) 174.5, 173.2, 166.8, 161.4, 142.2, 128.6, 120.3, 116.6, 69,4, 69,4, 69.3, 69,2, 68,2, 68,2, 42,5, 37,6, 36,2, 31,9, 30,7, 28,2, 26,4 m/z  Beregnet årlig beløp for [C23H35N5O8L +]+: 542.2279; funnet: 542.2281; Δ: 0.37 ppm
PODS-DOTA (600 MHz, DMSO d6) 10.46 (1 H, s), 9.74 (1t, bs), 8.04 (2 H, d, J = 8.6 Hz), 7,99 (1 H, s), 7.90 (1 H, t, J = 5.0 Hz), 7,86 (2 H, d, J = 6,5 Hz), 7.44 (2 H, d, J = 7.9 Hz), 7.24 (2 H, d, J = 7.1 Hz), 4,35-2.41 (45 H, m) , 3.70 (3H, s), 1.76 (2H, q, J = 6,3 Hz), 1.61 (2H, q, J = 6,5 Hz) (125 MHz, DMSO d6) 171.8, 171.4, 166.1, 162.2, 158,8, 158.6, 129.8, 129.0, 127.6, 123.3, 119.5, 118.5, 116.5, 116.4, 70.2, 70.1, 70.0, 68.7, 68,5, 43,4, 41.8, 36,3, 32,2, 30,4, 29,8, 29.1 m/z  Beregnet årlig beløp for [C47H68N10O16S2+ H]+: 1093.4334; funnet: 1093.4327; Δ:-0.64 ppm

Tabell 1. Karakterisering dataene for syntetiske intermediates beskrevet PODS og PODS-DOTA.

Antistoff Type Konstant Region Forholdet mellom PODS: mAb
Humant plasma IgG Menneskelige Human IgG 2.1 ± 0,1
Trastuzumab Humanized Menneskets IgG1 2.0 ± 0,1
huA33 Humanized Menneskets IgG1 2.1 ± 0,1
Cetuximab Chimeric Menneskets IgG1 2.2 ± 0,1
AR 9.6 Trouble Murine IgG1 1.4 ± 0,1
Musen plasma IgG Trouble Trouble IgG 1,5 ± 0,1

Tabell 2. Graden av merking av ulike antistoffer etter Bøyning med en PODS-bærende fluorophore. Vises standard avvik. Tabellen gjengitt med tillatelse fra Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktive Bifunctional chelater for den etableringen av nettstedet-selektivt endret Radioimmunoconjugates med forbedret stabilitet. Bioconjugate kjemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne rapporten, har vi valgt ikke å inkludere alle protokoller for radiolabeling eller i vivo eksperimentering. Våre grunner er grei. Med hensyn til tidligere, radiolabeling av en PODS-baserte immunoconjugate ikke avvike hele fra av en immunoconjugate syntetisert andre bioconjugation strategier, og disse prosedyrene er grundig gjennomgått andre steder2 . Når det gjelder sistnevnte, kan detaljene i preklinisk i vivo eksperimenter (dvs. mus modeller, doser, etc.) variere bredt både programmet og antistoff/antigen systemet.

Våre tidligere undersøkelser med 89Zr-merket varianter av huA33 gir en overbevisende illustrasjon fordelene av PODS-baserte bioconjugations. HuA33 er et humanized IgG1 antistoff som mål A33 antigen, en transmembrane glykoprotein på > 95% av kolorektal kreft23,24. I vår tidligere manuskript22rapportere vi syntesen av 89Zr-DFO-huA33 radioimmunoconjugate begge PODS og maleimide-baserte bioconjugation strategier. To radiolabeled antistoffer- 89Zr-DFO-PODS-huA33 og 89Zr-DFO-mal-huA33-ble produsert i nesten identiske avkastning, renhet, spesifisitet aktivitet og immunoreactivity. Kritisk, men de to radioimmunoconjugates viste dramatisk annerledes stabilitet i humant serum: etter inkubasjon i syv dager på 37 ° C 89Zr-DFO-PODS-huA33 forble 86 ± 1% intakt, mens dens maleimide-basert sin fetter var bare 61 ± 5% intakt. In vivo PET bildebehandling og biodistribution eksperimenter i athymic naken mus bærer A33 antigen-uttrykke SW1222 menneskelige tykktarmskreft xenografts avslørt stark forskjellene i i vivo atferden til de to radioimmunoconjugates (Figur 8 og Figur 9). Både 89Zr-DFO-PODS-huA33 og 89Zr-DFO-mal-huA33 produsere høy aktivitet konsentrasjoner i tumor vev: 56.4 ± 6.9%ID/g og 49.6 ± 9.3%ID/g, henholdsvis 48 timer etter administrasjon. Men produsert den maleimide-baserte radioimmunoconjugate betydelig høyere aktivitet konsentrasjonene i sunt vev enn PODS-baserte agent. For eksempel 89Zr-DFO-mal-huA33 produsert aktivitet konsentrasjoner av 3.1 ± 0,5 2,7 ± 0,4 og 12.2 ± 0,4% ID/g i nyrer, lever og bein, henholdsvis på 120 timer etter injeksjon, verdier som dramatisk overstiger aktivitet konsentrasjonen produsert av 89Zr-DFO-PODS-huA33 i samme vev (1,4 ± 0.1, 1,2 ± 0,3 og 4.3 ± 0,6% ID/g). 89Zr-DFO-PODS-huA33 produsert faktisk lavere aktivitet konsentrasjonene i alle ikke-mål vev (unntatt tykktarmen) 120 timer etter injeksjon sammenlignet 89Zr-DFO-mal-huA33. Resultatet er av svulst-til-orgel aktivitet konsentrasjon for 89Zr-DFO-PODS-huA33 generelt overlegen til 89Zr-DFO-mal-huA33; i spesielt, svulst til leveren, svulst til milt, tumor-til-nyre og svulst-til-Ben aktivitet konsentrasjon er nesten dobbelt for PODS-baserte immunoconjugate forhold til sin maleimide-avledet fetter. Vurderer at den største forskjellen mellom de to radioimmunoconjugates var bioconjugation håndtaket på chelator, er økt stabilitet av PODS-thiol sammenhengen nesten helt sikkert ansvarlig for denne forbedret i vivo ytelse.

Tar et bredere syn, er den ikke-området-selektive bioconjugation av sonder til lysines innen antistoffer riktignok en enkel og lettvint tilnærming til endring av antistoffer. Men betyr tilstedeværelsen av flere lysines distribuert i hele strukturen i immunglobuliner at det er umulig å utøve kontroll over nøyaktig området eller graden av bioconjugation2. Derfor denne tilfeldig strategien gir dårlig definert og svært heterogen immunoconjugates som kan vise redusert immunoreactivity hvis ligations forekommer i antigen bindende domener3. Fordelene med nettstedet-selektiv tilnærminger til bioconjugation har blitt illustrert gjentatte ganger for både radioimmunoconjugates og antistoff-stoff conjugates8,14,25,26, 27,28,29,30. Kort sagt, ikke bare gjøre området-selektiv bioconjugation strategier produsere mer veldefinerte og homogen immunoconjugates enn tradisjonelle metoder, de også opprette tenkelig agenter, radioimmunotherapeutics og ADFS med forbedret i vivo ytelse. Men hvor PODS-baserte ligations står sammenligning til andre område-selektiv endring strategier? Generelt, tilnærmingene til området-selektiv endring av antistoffer kan klassifiseres i fire kategorier: (1) ligations til cystein rester, (2) manipulering av den tunge kjeden glykaner, (3) chemoenzymatic transformasjoner og bruke (4) genteknologi4,5. Selvfølgelig, dette klassifikasjonssystem er ikke perfekt, og noen metoder (f.eks endring av den tunge kjeden glykaner med enzymer) uunngåelig kvalifisere for to kategorier. Hver strategi har sine egne fordeler og ulemper. Genteknologi tilnærminger gir deg utsøkt kontroll over området av Bøyning, men de er komplekse og dyre31,32,33. Oksidativt koblinger til den tunge kjeden glykaner er rimelig og enkelt, men de risikerer oksidative skader til den strukturelle integriteten til den immunglobulin34,35,36,37 ,38.

Den viktigste fordelen med thiol-baserte bioconjugations-PODS inkludert-er deres enkelhet og fleksibilitet. Deres viktigste begrensning, derimot, stammer fra tilstedeværelsen av flere thiols i et antistoff, et trekk som reduserer graden av kontroll over både området av bøyning og antall endringer per antistoff. I denne forstand er kombinasjonen av thiol-baserte ligations og antistoffer som har blitt genmodifisert for å ha gratis cystein rester en spesielt attraktivt tilnærming. Som vi har nevnt, er en annen begrensning maleimide-baserte thiol ligations mottakelighet av succinimidyl thioether bindingen til retro-Michael tillegg i vivo. Men kritisk, opphever bruk av PODS problemet.

Før vi konkludere, er det viktig å merke seg at emergent natur PODS teknologi kan opprette en rekke hindringer. For eksempel ingen PODS-bærende bifunctional chelater er (for øyeblikket) kommersielt tilgjengelig, og det er ingen data adressering det Klinisk farmakologi, toksikologi, eller immunogenisitet av PODS-baserte immunoconjugates. Vi tror imidlertid at PODS-baserte bioconjugations har potensial til å fundamentalt endre måten immunoconjugates er syntetisert i både laboratorium og klinikken. I dag, vi har bare brukt denne kjemisk teknologi til utvikling av radioimmunoconjugates for kjernefysisk bildebehandling og radioimmunotherapy, om undersøkelser verktøyet av denne tilnærmingen for bygging av antistoff-stoff conjugates og andre biomolecular medisiner er i gang. Til slutt, vi oppriktig håper at denne protokollen, og spesielt den grei og enkel kjemien som vi har utviklet-hjelper fremme bruken av phenyloxadiazolyl methyl sulfones for sulfhydryl-basert conjugations og anspore et skifte i feltet fra maleimides til mer stabil og sikrere alternativer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Sai Kiran Sharma for nyttig samtaler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol Sigma-Aldrich 675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube Eppendorf 925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube Fisherbrand 05-408-129
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore EN300000141G
Cyclohexane Fisher Scientific C556-4
Dichloromethane Fisher Scientific AC383780010
Diisopropylethylamine MP Biomedicals, LLC 150915
Dimethylsulfoxide Fisher Scientific 31-727-5100ML
Ethyl Acetate Fisher Scientific E145 4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Iodomethane Sigma-Aldrich 289566-100G
Magnesium Sulfate Acros Organics 413485000
m-chloroperbenzoic acid Sigma-Aldrich 273031
Methanol Fisher Scientific A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine Sigma-Aldrich 671401 Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 3450
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P5493 10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich S7795
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
TCEP ThermoFischer Scientific 20490
Triethylamine Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid Fisher Scientific A116-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  3. Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
  4. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
  5. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
  6. Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
  7. Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
  8. Shen, B. -Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
  9. Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
  10. Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
  11. Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
  12. Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
  13. Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
  14. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  15. Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
  16. Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -w, Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
  17. Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
  18. Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
  19. Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. III Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
  20. Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
  21. Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
  22. Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
  23. Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
  24. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
  25. Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
  26. Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
  27. Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
  28. Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
  29. Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
  30. Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
  31. Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
  32. Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
  33. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  34. Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
  35. Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
  36. O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
  37. Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
  38. Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).

Tags

Kjemi problemet 145 områdespesifikk bioconjugation området-selektive bioconjugation maleimide thiol sulfhydryl radioimmunoconjugate immunoconjugate
Syntese og Bioconjugation Thiol-reaktive reagenser for etableringen av nettstedet-selektivt endret Immunoconjugates
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davydova, M., Dewaele Le Roi, G.,… More

Davydova, M., Dewaele Le Roi, G., Adumeau, P., Zeglis, B. M. Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates. J. Vis. Exp. (145), e59063, doi:10.3791/59063 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter