Summary
En este protocolo, se describe la síntesis de las vainas, un reactivo phenyoxadiazolyl metil sulfona-basado para el acoplamiento selectivo sitio de cargos a los tioles de biomoléculas, especialmente de anticuerpos. Además, se describen la síntesis y caracterización de un quelante bifuncional de rodamiento de las vainas y su conjugación a un anticuerpo de modelo.
Abstract
Rodamiento de maleimida bifuncionales sondas han sido utilizadas durante décadas para la modificación sitio selectivo de tioles en biomoléculas, especialmente de anticuerpos. Pero conjugados de maleimida Mostrar estabilidad limitada en vivo porque el vínculo thioether de succinimidyl puede experimentar una reacción de retro-Michael. Esto, por supuesto, puede conducir a la liberación de la carga radiactiva o su intercambio con biomoléculas de tiol-cojinete en circulación. Ambos de estos procesos pueden producir concentraciones elevadas de actividad en órganos sanos como disminución de las concentraciones de actividad en los tejidos diana, dando por resultado contraste imagen reducida y menores relaciones terapéuticas. En 2018, nos informó de la creación de un modular, estable y fácilmente accesible phenyloxadiazolyl metil sulfona reactivo — apodado 'Vainas' — como una plataforma para bioconjugations base de tiol. Hemos demostrado claramente que bioconjugations sitio selectiva basada en las vainas reproducible y robusto crear radioimmunoconjugates homogénea, bien definida, altamente immunoreactive y muy estable. Además, los experimentos preclínicos en modelos murinos de cáncer colorrectal han demostrado que estos sitio selectivamente con la etiqueta radioimmunoconjugates exposición rendimiento en vivo muy superior en comparación con los anticuerpos radiactivos sintetizados vía base de maleimida conjugaciones. En este protocolo, se describe la síntesis de cuatro pasos de vainas, la creación de una variante de rodamiento de las vainas bifuncional de la omnipresente quelante de DOTA (DOTA de vainas) y la conjugación de vainas-DOTA a lo dirigidos a la HER2 anticuerpo trastuzumab.
Introduction
Radiofármacos químicos durante mucho tiempo han explotado la selectividad y la especificidad de los anticuerpos de biomarcadores de la enfermedad para ambas imágenes nucleares y dirigidos radioterapia1. Enfoque lejos más común para el radiolabeling de anticuerpos se basa en el acoplamiento indiscriminado de grupos prostéticos radiactivos o quelantes del radiometal a aminoácidos, a menudo lisinas — dentro de la estructura de la inmunoglobulina ( Figura 1A)2. Mientras que esta estrategia es ciertamente efectiva, su naturaleza aleatoria, sitio-específica puede crear problemas. Específicamente, bioconjugation tradicionales enfoques producen poco definido y immunoconjugates heterogéneo compuesto por mezclas de miles de regioisomers diferentes, cada uno con su propio conjunto de propiedades biológicas y farmacológicas3. Además, al azar bioconjugation puede impedir el immunoreactivity de anticuerpos si la carga se anexa a los dominios de unión a antígeno de la inmunoglobulina.
Con los años, han desarrollado una variedad de estrategias bioconjugation específico y selectivo de sitio para hacer frente a estos problemas4,5. El más común de estos enfoques se basa en la ligación de sondas de maleimida-teniendo a los grupos sulfidrilo de cisteínas (figura 1B). Anticuerpos IgG1 naturalmente contienen 4 puentes disulfuro inter-cadena, vínculos que pueden reducirse selectivamente para producir tioles libres capaces de sufrir reacciones de adición de Michael con maleimides para formar succinimidyl thioether bonos. El uso de tioles y maleimides es sin duda una mejora sobre los métodos tradicionales y una gran variedad de rodamientos de maleimida sintones y quelantes bifuncionales están actualmente disponibles. Sin embargo, es importante señalar que esta metodología tiene también serias limitaciones. Immunoconjugates base de maleimida exhiben estabilidad limitada en vivo porque el vínculo thioether puede experimentar una reacción de retro-Michael (figura 2)6,7,8,9, 10. esto, por supuesto, puede conducir a la liberación de la carga radiactiva o su intercambio con biomoléculas de tiol-rodamiento en la circulación (por ejemplo, glutatión o albúmina sérica). Ambos de estos procesos pueden aumentar las concentraciones de actividad en órganos sanos así como disminuir las concentraciones de actividad en los tejidos diana, dando por resultado contraste imagen reducida y menores relaciones terapéuticas. Varios reactivos de tioles reactivos alternativos se han desarrollado en un esfuerzo para evitar estos problemas, incluyendo tosylates, bromo y iodo acetyls y vinilo Sulfonas11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. sin embargo, todos estos enfoques tienen limitaciones que han obstaculizado su aplicación generalizada.
Aproximadamente hace cinco años, el laboratorio de la tarde Carlos III de Barbas en el Scripps Research Institute fue pionero en el uso de Sulfonas de metilo phenyloxadiazolyl como reactivos para la formación selectiva de vínculos muy estables con los tioles (figura 1 y figura 3) 18 , 19. los autores emplean una variante de rodamiento de sulfona de metil phenyloxadiazolyl de fluoresceína a modificar varios anticuerpos diseñados para contener residuos de cisteína libre, produciendo en última instancia immunoconjugates con mayor estabilidad que el análogo construcciones creadas utilizando sondas de maleimida. Al ver este trabajo prometedor, nos sorprendió un poco que esta tecnología se ha utilizado apenas en radioquímica y no había aún sido utilizada en todos en la síntesis de quelantes bifuncionales o radioimmunoconjugates20,21 . Esta escasez de aplicaciones, sin embargo, pronto comenzó a tener más sentido: varios intentos de procurar el reactivo de Sigma-Aldrich dio lugar a la recepción de mezclas complejas de productos de degradación con < 15% del compuesto deseado. Además, sintetizando el reactivo informó nosotros mismos no era una opción realista, como la ruta sintética publicada es algo engorrosa y requiere de equipo sofisticado de química orgánica que mayoría de radioquímica y la proyección de imagen molecular laboratorios, incluido el nuestro — simplemente no poseen.
En respuesta a estos obstáculos, nos propusimos crear una fácilmente accesible y altamente estable reactivo de phenyloxadiazolyl metil sulfona que puede obtenerse a través de una ruta sintética razonablemente fácil y robusta. Este año, informó de la creación de un modular, estable y fácilmente accesible phenyloxadiazolyl metil sulfona reactivo — apodado 'Vainas' — como una plataforma para el22de bioconjugations basados en tiol (figura 1 y figura 3). La diferencia clave entre las vainas y el reactivo reportado por Barbas, et al es que el primero emplea un anilina anillo unido a la molécula de sulfona de phenyloxadiazolyl metílico, mientras que este último cuenta con un fenol en la misma posición (figura 4). Este cambio facilita una ruta sintética más sencilla y accesible, así como — si nuestra experiencia con el compuesto comercialmente disponible es emblemático, un reactivo final más estable. En este trabajo, sintetiza también un par de vainas-cojinete quelantes bifuncionales, DFO de vainas y vainas-CHX-A''-DTPA — para facilitar la creación de 89Zr - y 177marcado con Lu radioimmunoconjugates, respectivamente. Como vamos a discutir, hemos demostrado que bioconjugations sitio selectiva basada en las vainas reproducible y robusto crear radioimmunoconjugates homogénea, bien definida, altamente immunoreactive y muy estable. Además, los experimentos preclínicos en modelos murinos de cáncer colorrectal han demostrado que estos sitio selectivamente con la etiqueta radioimmunoconjugates exposición rendimiento en vivo superior en comparación con los anticuerpos radiactivos sintetizados vía base de maleimida conjugaciones.
El objetivo primordial de este trabajo es facilitar la creación de immunoconjugates bien definida, homogénea, muy estable y altamente immunoreactive para aplicaciones in vitro e in vivo. El enfoque sintético es simple de realizar en casi cualquier laboratorio, y el reactivo de las vainas de los padres puede modificarse con una plétora de diferentes quelantes, fluoróforos o cargas. En este protocolo y el video que lo acompaña, describimos la síntesis simple de cuatro pasos de vainas (figura 5); la creación de una variante de rodamiento de las vainas de DOTA, un quelante utilizado para la coordinación de 64Cu 68Ga, 111en 177Lu y 225Ac (figura 6); y el bioconjugation de vainas DOTA a un anticuerpo de la modelo, el trastuzumab IgG1 dirigidos a la HER2 (figura 7).
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Protocol
1. la síntesis de 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Nota: Debido a la sensibilidad a la luz de la sustancia, mantenga todas las reacciones en los vasos cubiertos de papel de aluminio.
- De 10 mL redondo matraz de fondo, disolver 100 mg (0.517 mmol, 1 equivalente) de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol en 3 mL de metanol.
- A esta solución, añadir 360 μL de diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 equivalentes; anhidro) y una barra de agitación magnética pequeña. Cubrir el matraz con un tapón de caucho y agitar la solución durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Utilizando una jeringa de vidrio de 1 mL, haga un orificio a través del tapón de goma y añadir rápidamente 32 μL (0.517 mmol, 1 equivalente) de Yodometano a esta mezcla. Deje que la mezcla reaccione durante 45 minutos a temperatura ambiente.
Nota: Debido a los efectos nocivos potenciales de Yodometano, esta reacción debe realizarse en una campana de humos químicos. - Ajuste el baño de agua de un evaporador rotatorio a 40 ° C y reducir lentamente la presión para quitar el solvente para dar un sólido blanco.
- Disolver el sólido en 3 mL de acetato de etilo y lavar por lo menos tres veces con una solución de 5 mL de carbonato de sodio de 0.1 M utilizando un embudo.
Nota: Periódicamente tomar pruebas de punto de la fase acuosa bajo una lámpara de UV; una vez que nada se ve debajo de la lámpara, puede detener los lavados. - Recoger la fase orgánica en un matraz y lavar con agua hasta que el pH de la fase acuosa alcanza 6.8-7.0 (usar papel pH).
- Recoger la fase orgánica y agregar sulfato de magnesio para eliminar cualquier rastro de agua.
Nota: El sulfato de magnesio se debe agregar con una espátula pequeña, después de que la solución debe ser remolinada. Si todavía se ven las partículas finas de la agente de secado, la solución es seco. Si no, añadir pequeñas cantidades de sulfato de magnesio hasta que las partículas finas pueden verse. - Filtra la mezcla utilizando un filtro de papel o medio frita.
- Evaporar los volátiles utilizando un evaporador rotatorio, un proceso que debe producir el producto deseado como agujas blancas.
2. la síntesis de tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamato (2)
Nota: Debido a la sensibilidad a la luz de la sustancia, mantenga todas las reacciones en los vasos cubiertos de papel de aluminio.
- En 25 mL del matraz de fondo redondo, disolver 387 mg (0.92 mmol, equivalente a 1,0) de NBoc-N′-succinil-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine en 10 mL de diclorometano.
- A esta solución, añadir 480 μL (2.76 mmol, 3 equivalentes) de DIPEA, 264 mg (1.38 mmol; 1,5 equivalentes) de N-etil - N′-[3-(dimetilamino) propil] carbodiimida clorhidrato (EDCI) y 200 mg (0,97 mmol, 1,1 equivalentes) de 1. Sellar el recipiente con un tapón de vidrio y dejar que la reacción agitar durante 5 días a temperatura ambiente.
Nota: Sea consciente de la evaporación del diclorometano. Si es necesario, añadir más a lo largo de la semana. - Lavar la mezcla en un matraz con una solución de ácido clorhídrico de 1 M (3 x 5 mL).
- Recoger la fase orgánica y continuar lavarlo en un embudo de separatory, primero con una solución de 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL) y luego con agua (3 x 5 mL).
- Recoger la fase orgánica y agregar sulfato de magnesio para eliminar cualquier rastro de agua (ver paso 1.7). Filtra la mezcla utilizando un filtro de papel o medio frita.
- Utilizando un evaporador rotatorio, remover los solventes volátiles bajo presión reducida para permitir un sólido grisáceo.
- Volver a disolver este sólido en 10 mL de acetato de etilo y precipitar el producto a través de la incorporación gradual (p. ej., 2 mL a la vez) de 30 mL de ciclohexano.
- Filtrar la solución con papel de filtro o una frita de vidrio mediano para obtener el producto como un polvo blanco.
3. la síntesis de tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamato (3)
Nota: Debido a la sensibilidad a la luz de la sustancia, mantenga todas las reacciones en los vasos cubiertos de papel de aluminio.
- En un matraz de fondo redondo de 10 mL, disolver 30 mg (0.05 mmol, equivalente a 1) de 2 en 4 mL de diclorometano.
- Poco a poco añadir en 49 mg (0,2 mmol; 4 equivalentes) de 70% ácido de m-chloroperbenzoic a esta mezcla y cubrir el recipiente de la reacción con un tapón de vidrio. Agitar la solución durante la noche a temperatura ambiente, que en última instancia rinde una mezcla de amarillo.
- Lave la mezcla de amarillo en un embudo de separatory, primero con una solución de 0.1 M de NaOH (3 x 5 mL) y luego con agua (3 x 5 mL).
- Secar la fase orgánica con sulfato de magnesio y filtrar la mezcla utilizando un filtro de papel o medio frita.
- Utilizando un evaporador rotatorio, eliminar los disolventes a presión reducida para obtener el producto como un sólido claro.
4. la síntesis de N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] fenil} succinamide (vainas)
- En 25 mL del matraz de fondo redondo, disolver 30 mg de 3 en 2,0 mL de diclorometano.
- Añadir 400 μL de ácido trifluoroacético y sellar el frasco con un tapón de vidrio.
- Revuelva la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 3 horas.
- Utilizando un evaporador rotatorio, eliminar los volátiles bajo presión reducida a temperatura ambiente, dejando un residuo aceitoso.
- Disolver el residuo aceitoso en 7 mL de agua y, utilizando un embudo de separatory, lavar con acetato de etilo (3 x 4 mL). Mantenga la capa acuosa.
- Liofilizar la capa acuosa para permitirse el lujo de vainas como un polvo blanco.
Nota: Los coeficientes de absorción molar de las vainas a 280 y 298 nm son 9.900 y 12.400 cm-1M-1, respectivamente.
5. la síntesis de vainas-DOTA
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, disolver 10 mg de vainas en 300 μL de dimetilsulfóxido (0.018 mmol, equivalente a 1) y añadir 26 μL de N, N-diisopropylethylamine (0,15 mmol; 8 equivalentes).
- Disolver 15,2 mg de DOTA-Bn-NCS (0.02 mmol; 1,2 equivalentes) en 100 μL de dimetilsulfóxido y combinar esta solución con la solución del paso 5.1. Sellar el tubo de microcentrífuga.
- Permite la reacción a incubar durante una noche a temperatura ambiente.
- Purificar el producto usando cromatografía de HPLC de fase inversa C18 para quitar cualquier DOTA-Bn-NCS no reaccionado.
Nota: Tiempos de retención son obviamente muy dependientes de los equipos de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubería, etc.), y los controles adecuados se deben ejecutar antes de la purificación. Sin embargo, presentar un ejemplo, si un gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos con 0.1% TFA) a 70: 30 MeCN/H2O (ambos con 0.1% TFA) sobre 30 minutos, una columna de18 mm semi-preparativa de 19 x 250 C y un caudal de 6 mL/min se usan , Vainas, p-SCN-Bn-DOTA y DOTA de las vainas tienen tiempos de retención de alrededor de 14.4 y 18,8 19,6 min, respectivamente. Todos los compuestos de tres pueden ser controlados en 254 nm.
6. el bioconjugation de vainas DOTA a trastuzumab
Nota: Para este paso, comenzamos con una solución stock de 16,4 mg/mL de trastuzumab.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja proteína vinculante, diluir 61 μL de la solución madre de trastuzumab (1 mg; 6,67 nmol, 1 equivalente) con 859 μL de tampón fosfato salino (pH 7.4).
- A esta mezcla, añadir 6,7 μL de solución de 10 mM recién hecha de TCEP en H2O (66,7 nmol, 10 equivalentes).
- Preparar una solución de 1 mg/mL de vainas-DOTA en DMSO y añadir 73 μL de esta solución de vainas-DOTA a la mezcla de reacción (66.67 nmol, 10 equivalentes).
- Sellar el tubo de microcentrífuga e incubar la solución durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Después de 2 horas, purificar el immunoconjugate usando una columna de desalación de exclusión de tamaño desechable empacadas.
- En primer lugar, equilibrar la columna de exclusión de tamaño como se describe por el proveedor para eliminar conservantes presentes en la columna durante el almacenamiento. Un procedimiento típico consiste en lavar la columna 5 veces con un volumen de PBS que corresponde al volumen de la columna: 5 x 2, 5 mL de PBS.
- A continuación, agregue la mezcla de reacción a la columna de exclusión de tamaño teniendo en cuenta el volumen de la mezcla de reacción.
- Después de la mezcla de reacción ha entrado en la columna, agregar una cantidad apropiada de PBS para llevar el volumen total de solución añadida a la columna a 2,5 mL. Por ejemplo, si la reacción verbal dio lugar a un volumen total de 1,3 mL, 1,2 mL de PBS adicional tendría que se añade a la columna.
- Por último, recoger el producto con 2 mL de PBS como eluyente.
- Concentran el immunoconjugate final con las unidades de filtración centrífuga con corte de peso molecular de 50 kDa.
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Representative Results
Los cuatro primeros pasos de este protocolo, la síntesis de las vainas, se han diseñado para ser robusto y fiable. La desprotonación y sustitución de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol para formar el producto deseado thioether ofrece el thioether en > 99% de rendimiento después de sólo 45 minutos. A continuación, la ligadura entre 1 y N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine se logró a través de un péptido estándar procedimiento de acoplamiento, dando por resultado la recogida del producto (2) en el 55% de rendimiento. Entonces, la oxidación de los 2 se realizó con ácido m-cloroperbenzoico, un oxidante utilizado. Siguiendo los pasos de lavado, 3 se obtuvo un sólido pálido en ~ 90% de rendimiento. Finalmente, la eliminación del grupo protección terc-butyloxycarbonyl de 3 se realizó según los procedimientos estándar, usando una proporción de 4:1 de ácido dichloromethane:trifluoroacetic. Después de la liofilización de la fase acuosa, nuestro producto, las vainas, se obtuvo como un polvo blanco en el 98% de rendimiento. El progreso de la reacción se siguió por cromatografía en capa fina, y fue confirmada la identidad de cada producto mediante 1H NMR, 13C-RMN y HRMS-ESI (tabla 1).
Una de las principales ventajas de los reactivos de las vainas es su modularidad. Una variedad de quelantes, fluoróforos, toxinas u otras cargas puede ser añadida a amina de colgante del compuesto. En el protocolo a mano, estamos utilizando el quelante omnipresente DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacético) como una carga representativa. DOTA, por supuesto, se ha utilizado en una amplia gama de radiofármacos biomolecular como un quelante para radiometals incluyendo 68Ga, 64Cu, 111en 90Y, 177Lu y 225Ac. Para ello, una variante de rodamiento de isotiocianato de DOTA (p-SCN-Bn-DOTA) fue empleada y acoplada a la amina colgante de vainas por medio de las condiciones de acoplamiento directo. El quelante bifuncional resultante fue purificado por medio de fase reversa C18 HPLC y aislado en el ~ 75% de rendimiento. Como con otros precursores, el progreso de la reacción se siguió por cromatografía en capa fina, y la identidad del producto fue confirmada mediante 1H NMR, 13C-RMN y HRMS-ESI (tabla 1).
En la etapa final del Protocolo, discutimos el sitio selectivo bioconjugation de vainas-DOTA a la inmunoglobulina de un modelo, el trastuzumab anticuerpos dirigidos a la HER2. Para ello, los vínculos de disulfuro de la región de la bisagra de los anticuerpos selectivamente se reducen con el agente reductor, TCEP [tris(2-carboxyethyl) fosfino]. Después de este paso de reducción, el anticuerpo se incuban con vainas-DOTA durante 2 h a temperatura ambiente y posteriormente purificado mediante cromatografía por exclusión de tamaño. En este caso, el immunoconjugate purificada, DOTA-cojinete se obtuvo en el ~ 80% de rendimiento, y análisis de MALDI-ToF revelaron un grado de etiquetado (DOL) de ~1.8 DOTA/mAb. En general, hemos encontrado que 10 equivalentes de TCEP, 10 equivalentes de los reactivos de las vainas y una incubación de 2 h son suficientes para producir un immunoconjugate con un DOL de 2 cápsulas/mAb (tabla 2). Este resultado permanece constante en una amplia gama de anticuerpos IgG1 humanos, humanizados y quiméricas; sin embargo, las mismas condiciones producen immunoconjugates con un DOL de ~1.5 sólo cuando se trabaja con anticuerpos IgG1 murinos. Todo esto dicho, los investigadores deben optimizar estas condiciones de reacción para nuevos anticuerpos y cargas de rodamiento de las vainas. Finalmente y sobre todo, con respecto al producto final, reproducible y repetidamente encontramos que immunoconjugates basada en las vainas exhiben immunoreactivities iguales o mejores que la análogas constructos creados utilizando al azar o base de maleimida estrategias de la conjugación.
Figura 1: Ilustración esquemática de bioconjugations con (A) (B) amina reactiva, maleimida-rodamiento y rodamiento de vainas (C) cargas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La adición de Michael de una biomolécula de tiol-cojinete (verde) y un rodamiento de radionúclido maleimida (amarillo) para formar un bioconjugate radiactivo, así como las reacciones adicionales que el constructo radiactivo puede sufrir en presencia de endógeno moléculas de tiol-cojinete (rosa). RT = temperatura ambiente. Figura reimprimido con permiso de Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. tioles reactivos quelantes bifuncionales para la creación del sitio selectivamente modificado Radioimmunoconjugates con estabilidad mejorada. Química de Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema de la reacción entre las vainas y un tiol. Figura reimprimido con permiso de Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. tioles reactivos quelantes bifuncionales para la creación del sitio selectivamente modificado Radioimmunoconjugates con estabilidad mejorada. Química de Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La estructura de las vainas (A) y (B) el reactivo reportados por Barbas, et al.18,19haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Esquema de la síntesis de cuatro pasos de vainas. Figura reimprimido con permiso de Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. tioles reactivos quelantes bifuncionales para la creación del sitio selectivamente modificado Radioimmunoconjugates con estabilidad mejorada. Química de Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Esquema de la síntesis de vainas-DOTA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Esquema del bioconjugation de trastuzumab con vainas-DOTA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Comparación del comportamiento in vivo de 89marcado Zr radioimmunoconjugates de huA33 creado con base de maleimida (de89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation estrategias y basada en las vainas (de89Zr-DFO-vainas-huA33). Planar (izquierda) y las imágenes de PET (derecha) de proyección de máxima intensidad de ratones desnudos athymic A33 expresando antígeno SW1222 cáncer colorrectal xenoinjertos (flecha blanca) después de la inyección de 89Zr-DFO-vainas-huA33 y 89 ZR-DFO-mal-huA33 (μCi 140, 60-65 μg). Los cortes coronales cruzan en el centro de los tumores. Figura reimprimido con permiso de Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. tioles reactivos quelantes bifuncionales para la creación del sitio selectivamente modificado Radioimmunoconjugates con estabilidad mejorada. Química de Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Comparación del comportamiento in vivo de 89marcado Zr radioimmunoconjugates de huA33 creado con base de maleimida (de89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation estrategias y basada en las vainas (de89Zr-DFO-vainas-huA33). Datos de biodistribución después de la administración de 89Zr-DFO-vainas-huA33 y 89Zr-DFO-mal-huA33 (μCi 30, 15-18 μg) a ratones desnudos athymic A33 expresando antígeno subcutáneo SW1222 cáncer colorrectal humano xenoinjertos. Los valores para el estómago, intestino delgado e intestino grueso incluyen contenidos. Figura reimprimido con permiso de Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. tioles reactivos quelantes bifuncionales para la creación del sitio selectivamente modificado Radioimmunoconjugates con estabilidad mejorada. Química de Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Compuesto | 1 Cambios de H-NMR | 13 C-RMN cambios | HRMS | |||
| 1 | (500 MHz, CDCl3) 7.79 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,72 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 4.04 (2 H, br s), 2,75 (3 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 166.3 163.7 149.7, 128.5, 114,8, 113.5, 14,8 | m/z importe anual calculado para [C9H9N3OS + H]+: 208.0539; encontrados: 208.0539; Δ: 0.0 ppm | |||
| 2 | (500 MHz, CDCl3) 9,68 (1H, s), 7.91 (2H, d, J = 9,0 Hz), 7.71 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6,82 (1H, s), 4.99 (1H, s), 3.70 3.45 (12H, m), 3.41 (2H, q, J = 6,0 Hz), 3,20 (2H, q, J = 6,5 Hz), 2.76 (3H, s), 2.71 (2H, m), 2.63 (2H m), 1.80 1.70 (4 H, m), 1.42 (9 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171,3, 165,8, 164.6, 156.2, 141.8, 127,7, 119.6, 118.6, 79,2, 70.6, 70.5, 70.3, 70.1, 69.6, 38,8, 38.5, 33.5, 31.6, 29.9, 28.6, 14,8 | m/z importe anual calculado para [C28H43N5O8S + Na]+: 632.2725; encontrados: 632.2722; Δ:-0,470 ppm | |||
| 3 | (500 MHz, CDCl3) 9.99 (1 H, s), 7,98 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7,75 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6.88 (1 H, s), 4.99 (1 H, s) 3.66 3.50 (15 H, m), 3.41 (2 H, q, J = 6,0 Hz), 3,20 (2 H, q, J = 6,5 Hz), 2.71 (2 H, m), 2.65 (2 H, m) , 1.80 1.70 (4H, m) 1,43 (9H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.5, 166.5, 161.6, 156.1, 143.4, 128.7, 119.6, 116.4, 79.1, 70.5, 70.4, 70.2, 70.0, 69,4, 43.0, 38,8, 38.4, 33.2, 31.3, 29.7, 28.4 | m/z Importe anual calculado para [C28H43N5O10S + H]+: 642.2803; encontrados: 642.2797; Δ:-0,930 ppm | |||
| VAINAS | (500 MHz, D2O) 7.85 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7.55 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 3,60 3,45 (15 H, m), 3.45 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3,20 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3.04 (2 H, t, J = 7,0 Hz), 2.67 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 2,54 (2 H t, J = 6,5 Hz), 1.87 (H 2, qt, J = 6,5 Hz), 1,70 (H 2, qt, J = 6,5 Hz) | (125 MHz, D2O) 174.5, 173,2, 166.8, 161.4, 142.2, 128.6, 120.3, 116,6, 69,4, 69,4, 69.3, 69.2, 68,2, 68,2, 42.5, 37.6, 36.2, 31.9, 30.7, 28.2, 26.4 | m/z Importe anual calculado para [C23H35N5O8S + H]+: 542.2279; encontrados: 542.2281; Δ: 0,37 ppm | |||
| VAINAS-DOTA | (600 MHz, DMSO-d6) 10.46 (1 H, s), 9.74 (1 H, bs), 8.04 (2 H, d, J = 8,6 Hz), 7.99 (1 H, s), 7.90 (1 H, t, J = 5,0 Hz), 7.86 (2 H, d, J = 6,5 Hz), 7.44 (2 H, d, J = 7,9 Hz), 7.24 (2 H, d, J = 7,1 Hz), 4,35-2,41 (45 H, m) , 3.70 (3H, s), 1.76 (2H, q, J = 6,3 Hz), 1.61 (2H, q, J = 6,5 Hz) | (125 MHz, DMSO-d6) 171.8, 171.4, 166.1, 162,2, 158.8, 158,6, 129,8, 129.0m, 127.6, 123.3, 119.5, 118.5, 116.5, 116.4, 70.2, 70.1, 70.0, 68.7, 68.5, 43.4, 41.8, 36.3, 32.2, 30.4, 29.8, 29.1 | m/z Importe anual calculado para [C47H68N10O16S2+ H]+: 1093.4334; encontrados: 1093.4327; Δ:-0,640 ppm | |||
Tabla 1. Datos de caracterización para los intermedios sintéticos describen así como las vainas y vainas-DOTA.
| Anticuerpo | Tipo | Región constante | Proporción de vainas: mAb |
| Plasma humano IgG | Humano | Humanos de IgG | 2.1 ± 0,1 |
| Trastuzumab | Humanizado | IgG1 humana | 2,0 ± 0,1 |
| huA33 | Humanizado | IgG1 humana | 2.1 ± 0,1 |
| Cetuximab | Quimérica | IgG1 humana | 2.2 ± 0,1 |
| AR 9.6 | Murine | IgG1 murino | 1.4 ± 0.1 |
| Plasma de ratón IgG | Murine | Murino IgG | 1,5 ± 0,1 |
Tabla 2. Grado de etiquetado de diferentes anticuerpos después de la conjugación con un fluoróforo de rodamiento de las vainas. Los valores se muestran desviaciones estándar. Reimprimido con permiso de Adumeau, P., Davydova, mesa M., Zeglis, B. M. tioles reactivos quelantes bifuncionales para la creación del sitio selectivamente modificado Radioimmunoconjugates con estabilidad mejorada. Química de Bioconjugate. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society.
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Discussion
En este informe, hemos decidido no incluir cualquier protocolos de experimentación radiolabeling o en vivo. Las razones son sencillas. Con respecto al anterior, radiolabeling de un immunoconjugate basada en las vainas no difiere en absoluto de una immunoconjugate sintetizado usando otras estrategias bioconjugation, y estos procedimientos han sido exhaustivamente revisado en otra parte2 . Con respecto a este último, los aspectos específicos de preclínicos experimentos in vivo (es decir, modelos de ratón, dosis, etc.) pueden variar ampliamente según la aplicación y el sistema de antígeno/anticuerpo.
Nuestras investigaciones anteriores con 89Zr-labeled variantes de huA33 proporcionan un ejemplo convincente de las ventajas de bioconjugations basada en las vainas. HuA33 es un anticuerpo IgG1 humanizado dirigido al antígeno A33, una glicoproteína transmembrana que se expresa en > 95% de los cánceres colorrectales23,24. En nuestro anterior manuscrito22, se presenta la síntesis de radioimmunoconjugate 89Zr-DFO-huA33 utilizando ambos PODS-maleimida estrategias basadas y bioconjugation. Radiactiva de los dos anticuerpos — 89Zr-DFO-vainas-huA33 y 89Zr-DFO-mal-huA33 — fueron producidos en rendimiento casi idéntico, pureza, actividad de especificidad y el immunoreactivity. Críticamente, sin embargo, los dos radioimmunoconjugates expuesto dramáticamente diferentes estabilidades en suero humano: después de la incubación durante siete días a 37 ° C, 89Zr-DFO-vainas-huA33 intacta 86 ± 1%, mientras que su primo de maleimida sólo fue 61 ± 5% intacta. Proyección de imagen in vivo de mascota y experimentos de biodistribución en ratones desnudos athymic A33 expresando antígeno SW1222 cáncer colorrectal humano xenoinjertos reveló marcado las diferencias en el comportamiento in vivo de los dos radioimmunoconjugates (figura 8 y Figura 9). 89Zr-DFO-vainas-huA33 y 89Zr-DFO-mal-huA33 producen concentraciones de alta actividad en tejido tumoral: 56,4 ± 6.9%ID/g y 49,6 ± 9.3%ID/g, respectivamente, 48 h después de la administración. Sin embargo, el radioimmunoconjugate base de maleimida produjeron significativamente mayores concentraciones de actividad en los tejidos sanos que el agente, basado en cápsulas. Por ejemplo, 89Zr-DFO-mal-huA33 producido concentraciones de actividad de 3,1 ± 0,5 2,7 ± 0,4 y 12,2 ± 0,4% ID/g en los riñones, hígado y hueso, respectivamente, en inyección después de 120 h, valores que superan considerablemente las concentraciones de actividad producido por 89Zr-DFO-vainas-huA33 en los mismos tejidos (1.4 ± 0.1, 1.2 ± 0.3 y 4.3 ± 0,6% ID/g). De hecho, 89Zr-DFO-vainas-huA33 produjo concentraciones más bajas de la actividad en todos los tejidos no Diana (salvo intestino grueso) en comparado con 89Zr-DFO-mal-huA33 después de la inyección de 120 h. Como resultado, los coeficientes de concentración de actividad del tumor a órganos de 89Zr-DFO-vainas-huA33 son generalmente superiores a las del 89Zr-DFO-mal-huA33; en particular, el tumor de hígado, tumor en bazo, tumor del riñón y concentración de actividad del tumor al hueso son casi el doble para el immunoconjugate basada en las vainas en comparación con su primo derivados de maleimida. Teniendo en cuenta que la principal diferencia entre los dos radioimmunoconjugates fue la manija del bioconjugation del quelante, la mayor estabilidad de la vinculación de vainas-tiol es seguramente responsable de esta mejor actuación en vivo.
Tomando una visión más amplia, el sitio selectivo bioconjugation de sondas lisinas dentro de anticuerpos hay que reconocer que es un enfoque directo y fácil a la modificación de anticuerpos. Sin embargo, la presencia de múltiples lisinas distribuidos por toda la estructura de las inmunoglobulinas significa que es imposible ejercer un control sobre el sitio exacto o grado de bioconjugation2. Como resultado, esta estrategia al azar produce a menudo mal definidos y immunoconjugates altamente heterogénea que puede exhibir disminuyó immunoreactivity si trompas ocurren dentro de los dominios de unión a antígeno3. Los beneficios de los enfoques selectivo sitio bioconjugation han sido ilustrados repetidamente para ambos radioimmunoconjugates y fármacos de anticuerpos conjugados8,14,25,26, 2728,de,29,30. En definitiva, no sólo bioconjugation selectivo sitio estrategias producen más bien definida y homogénea immunoconjugates de metodologías tradicionales, también crean imágenes agentes radioimmunotherapeutics y ADCs con mejor performance en vivo. Sin embargo, ¿dónde trompas basada en las vainas encontramos en comparación a otras estrategias de modificación selectiva de sitio? En términos generales, los enfoques de la modificación sitio selectivo de anticuerpos pueden clasificarse en cuatro categorías: (1) trompas a residuos de cisteína, (2) la manipulación de los glicanos de cadena pesada, transformaciones (3) chemoenzymatic y (4) el uso de ingeniería genética4,5. Por supuesto, este sistema de clasificación no es perfecto, y algunos enfoques (por ejemplo, la modificación de los glicanos de la cadena pesada con enzimas) inevitablemente califican para dos categorías. Cada estrategia tiene sus propias ventajas y desventajas. Enfoques basados en la ingeniería genética proporcionan un control exquisito sobre el sitio de la conjugación, son complejos y costosos31,32,33. Acoplamiento oxidativo a los glicanos de la cadena pesada barato y sencillo, sin embargo, corren el riesgo de daño oxidativo a la integridad estructural de la inmunoglobulina34,35,36,37 ,38.
La principal ventaja de bioconjugations base de tiol, PODS incluidos — es su simplicidad y modularidad. Su principal limitación, por el contrario, surge de la presencia de varios tioles en un anticuerpo, una característica que reduce el grado de control sobre tanto el sitio de la conjugación y el número de modificaciones por anticuerpo. En este sentido, la combinación de anticuerpos que han sido genéticamente diseñados para poseen residuos de cisteína libre y basada en tiol trompas es un método particularmente atractivo. Como hemos observado, otra limitación de trompas tiol maleimida-basado es la susceptibilidad del vínculo thioether succinimidyl a adiciones de retro-Michael en vivo. Sin embargo, el uso de vainas abroga este problema.
Antes de concluir, es importante tener en cuenta que la naturaleza emergente de la tecnología de las vainas puede crear su propio conjunto de obstáculos. Por ejemplo, no quelantes bifuncionales de rodamiento de vainas (actualmente) están disponibles en el mercado y no hay datos a la inmunogenicidad de immunoconjugates basada en las vainas, farmacología clínica y toxicología. Sin embargo, creemos que bioconjugations basada en las vainas tienen el potencial para cambiar fundamentalmente la forma immunoconjugates se sintetizan en el laboratorio y la clínica. En la actualidad, hemos solamente aplicamos esta tecnología química para el desarrollo de radioimmunoconjugates para la proyección de imagen nuclear y radioinmunoterapia, aunque las investigaciones sobre la utilidad de este enfoque para la construcción de fármacos de anticuerpos conjugados y otros medicamentos de biomoléculas están actualmente en marcha. Al final, sinceramente esperamos que este protocolo y especialmente la química sencilla y simple que hemos desarrollado, ayudará a promover el uso de Sulfonas de metil phenyloxadiazolyl de conjugaciones basadas en sulfidrilo y estimular un cambio en el campo de maleimides a alternativas más estables y más confiables.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen Dr. Sai Kiran Sharma conversaciones útiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
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