Summary
Bu protokol için biz BAKLA, bir phenyoxadiazolyl metil sulfone tabanlı reaktif yükler site seçici bağlantı için biomolecules, özellikle antikorlar thiols sentezi anlatacağız. Buna ek olarak, biz malzemelerin ve BAKLA taşıyan bifonksiyonel şelatör ve onun konjugasyon bir modeli antikor için anlatacağız.
Abstract
Maleimide taşıyan bifonksiyonel sonda thiols biomolecules, özellikle antikorlar içinde site seçici modifikasyonu için yıllardır istihdam edilmiştir. Succinimidyl thioether bağlantı bir retro-Michael tepki tabi olabilir, çünkü henüz maleimide tabanlı conjugates sınırlı istikrar içinde vivo görüntüleyebilir. Bu, tabii ki, radyoaktif payload ya da onun exchange thiol taşıyan biomolecules dolaşımı ile sürümü yol açabilir. Bu işlemlerden her ikisi de sağlıklı organlar konsantrasyonlarda yükseltilmiş etkinlik üretebilir yanı sıra hedef dokular, azaltılmış görüntüleme kontrast ve alt terapötik oranları ile sonuçlanan faaliyet konsantrasyonlarda azalmıştır. 2018 yılında, biz modüler, istikrarlı ve kolayca erişilebilir phenyloxadiazolyl metil sulfone reaktif rapor — 'BAKLA' lakaplı — thiol tabanlı bioconjugations için bir platform olarak. BAKLA tabanlı site seçici bioconjugations homojen, iyi tanımlanmış, son derece immunoreactive ve son derece istikrarlı radioimmunoconjugates tekrarlanarak ve sağlam oluşturmak açıkça göstermiştir. Ayrıca, kolorektal kanser fare modelleri preklinik deneylerde bunlar sitesi-seçici radiolabeled antikorların sentez maleimide tabanlı yolu ile karşılaştırıldığında sergi çok daha üstün içinde vivo performans radioimmunoconjugates etiketli göstermiştir conjugations. Bu protokol için biz BAKLA, her yerde şelatör DOTA (BAKLA-DOTA) bifonksiyonel BAKLA taşıyan türevini ve BAKLA-DOTA konjugasyon HER2 hedefleme antikor trastuzumab için dört adımlı sentezi anlatacağız.
Introduction
Proton kimyagerler kadar seçicilik ve biyolojik hastalık her iki Nükleer görüntüleme için antikor özgüllüğü istismar ve radyoterapi1hedef. Sıra radiolabeling bir farkla en yaygın yaklaşım amino asitler için radiolabeled prostetik gruplar veya radiometal şelatörlerin eki gelişigüzel esas olan — en sık lysines — ( immünglobulin yapısı içinde Şekil 1A)2. Bu strateji kesinlikle etkili olmakla birlikte, rastgele, site özel olmayan doğası sorunlar oluşturabilir. Özellikle, kötü tanımlı geleneksel bioconjugation yaklaşımlar üretmek ve karışımları farklı regioisomers, her biri kendi kümesini biyolojik ve farmakolojik özellikleri3binlerce heterojen immunoconjugates oluşur. Ayrıca, kargo immünglobulin'ın antijen bağlayıcı etki alanlarına eklenir eğer rastgele bioconjugation antikorlar immunoreactivity engelleyebilir.
Yıllar içinde siteye özgü ve site-seçici bioconjugation stratejileri çeşitli sahip geliştirilen bu sorunları4,5gidermek için. Bu yaklaşımların en yaygın maleimide taşıyan problar katıldı (şekil 1B) sulfhydryl grupları için ligasyonu kullanır. Igg1 antikorlar doğal olarak 4 arası zinciri disülfür köprü, seçmeli olarak ücretsiz thiols Michael ek tepkiler maleimides succinimidyl thioether bağlar ile geçiyor yetenekli vermeye azaltılabilir bağlantıları içerir. Thiols ve maleimides kullanımı kesinlikle geleneksel yöntemleri üzerinde bir gelişme ve çok çeşitli maleimide taşıyan synthons ve bifonksiyonel şelatörlerin şu anda kullanılabilir. Ancak, bu yöntem de ciddi sınırlamaları olduğunu unutmamak gerekir. Thioether bağlantı bir retro-Michael reaksiyon (Şekil 2)6,7,8,9, tabi olabilir çünkü sınırlı istikrar içinde vivo Maleimide tabanlı immunoconjugates sergi 10. bu, tabii ki, radyoaktif payload ya da thiol taşıyan biomolecules dolaşımı (örneğin, glutatyon veya serum albümin) ile onun exchange sürümü yol açabilir. Bu işlemlerin her ikisini de sağlıklı organlar konsantrasyonlarda etkinliği artırmak olarak hedef dokular, azaltılmış görüntüleme kontrast ve alt terapötik oranları ile sonuçlanan faaliyet konsantrasyonlarda azaltmak. Birkaç alternatif thiol reaktif reaktif bir çaba tosylates, bromo ve iodo acetyls ve vinil sulfones11,12,13, de dahil olmak üzere bu sorunları aşmak için geliştirilmiştir 14 , 15 , 16 , 17. ancak, tüm bu yaklaşımların yaygın uygulama engel kısıtlamalar bulunmaktadır.
Yaklaşık beş yıl önce geç Carlos Barbas III Scripps Araştırma Enstitüsü'nde laboratuvar phenyloxadiazolyl metil sulfones kullanımı olarak thiols (şekil 1 c ve şekil 3) ile son derece kararlı bağlantıları seçici oluşumu Kimyasalları kurulmasına öncülük 18 , 19. sonuçta benzer daha yüksek istikrar ile immunoconjugates üreten floresein ücretsiz sistein kalıntıları, içerecek şekilde tasarlanmış birkaç antikorlar değiştirmek için bir phenyloxadiazolyl metil sulfone taşıyan türevi yazarlar istihdam maleimide tabanlı probları kullanılarak oluşturulan yapıları. Bu umut verici iş görme üzerine, biz bu teknoloji sadece pek radiochemistry kullanılmaya başlanmış ve henüz hiç bifonksiyonel şelatörlerin veya radioimmunoconjugates20,21 sentezinde kullanılır olmuştu değil biraz şaşırdık . Uygulamalar, ancak, bu eksiklik yakında daha fazla anlam ifade etmeye başladı: bozulma ürünleri ile karmaşık karışımlar alınmasından reaktif Sigma-Aldrich tedarik çeşitli girişimler sonuçlandı < istenen bahçedeki % 15. Yayımlanmış sentetik yolun biraz hantal ve karmaşık organik kimya donatım gerektirir gibi Ayrıca, bildirilen reaktif kendimizi sentezleme gerçekçi bir seçenek de, değildi bu en radiochemistry ve moleküler görüntüleme laboratuvarlar — bizim de dahil olmak üzere — sadece sahip olmayan.
Bu engelleri yanıt olarak, biz kolayca erişilebilir oluşturmak ve son derece güçlü ve makul facile sentetik rota yolu ile elde edilebilir phenyloxadiazolyl metil sulfone reaktif istikrarlı için yola çıktı. Bu yılın başlarında, biz modüler, istikrarlı ve kolayca erişilebilir phenyloxadiazolyl metil sulfone reaktif rapor — 'BAKLA' lakaplı — thiol tabanlı bioconjugations (şekil 1 c ve şekil 3)22için bir platform olarak. BAKLA ve reaktif arasındaki en önemli fark Barbas tarafından bildirilen vd. eski ikinci bir fenol (şekil 4) aynı konumda bulunuyor iken phenyloxadiazolyl metil sulfone yan için bağlı bir anilin yüzüğü istihdam olduğunu. Bir daha basit ve erişilebilir sentetik yolu bu değişiklik kolaylaştırır hem de — piyasada bulunan bileşik ile bizim deneyim sembolik ise — daha istikrarlı bir son reaktif. Bu çalışmada, ayrıca BAKLA taşıyan bifonksiyonel şelatörlerin çifti sentezlenmiş — BAKLA-DFO ve BAKLA-CHX-A''-DTPA — 89Zr - ve 177radioimmunoconjugates Lu etiketli, sırasıyla kolaylaştırmak için. Biz tartışacağız gibi biz PODS tabanlı site seçici bioconjugations homojen, iyi tanımlanmış, son derece immunoreactive ve son derece istikrarlı radioimmunoconjugates tekrarlanarak ve sağlam oluşturmak gösterdi. Ayrıca, kolorektal kanser fare modelleri preklinik deneylerde bunlar sitesi-seçici radiolabeled antikorların sentez maleimide tabanlı yolu ile karşılaştırıldığında sergi üstün içinde vivo performans radioimmunoconjugates etiketli göstermiştir conjugations.
Bu eser aşırı kemer iyi tanımlanmış, homojen, son derece istikrarlı ve son derece immunoreactive immunoconjugates tüp bebek ve içinde vivo uygulamaların oluşturulmasını kolaylaştırmak için hedeftir. Sentetik yaklaşım neredeyse herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilecek basit ve üst BAKLA reaktif farklı şelatörlerin, fluorophores veya yükleri bir bolluk ile değiştirilebilir. Bu iletişim kuralı ve beraberindeki video, BAKLA (şekil 5); basit, dört adımlı bir sentez anlatacağım DOTA, 64Cu koordinasyonu, 68Ga, 111, 177Lu ve 225Ac (şekil 6); için yaygın olarak kullanılan bir şelatör BAKLA taşıyan türevi oluşturulması ve BAKLA-DOTA bioconjugation için bir model antikor, Igg1 HER2 hedefleme trastuzumab (Şekil 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1) sentezi
Not: ışık duyarlılığı nedeniyle bahçedeki, folyo kaplı damarlarının bütün tepkiler devam et.
- Bir 10 mL alt şişesi yuvarlak, 100 mg (0.517 mmol, eşdeğeri olan 1) 3 ml metanol 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol geçiyoruz.
- Bu, diisopropylethylamine 360 μL ekleyin (DIPEA; 2.07 mmol; 4 eşdeğerleri; susuz) ve küçük manyetik heyecan bar. Şişeye bir kauçuk tıpa ile kapak ve oda sıcaklığında 10 dakika çözüm karıştırın.
- 1 mL cam şırınga kullanarak, kauçuk tıpa delik poke ve hızlı bir şekilde 32 μL (0.517 mmol, eşdeğeri olan 1) iodomethane bu karışıma ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika tepki karışım izin verin.
Not: iodomethane potansiyel zararlı etkileri nedeniyle, bu reaksiyon kimyasal duman mahallede yapılmalıdır. - Rotary Evaporatör su banyosu 40 ° C ila ayarla ve yavaş yavaş bir beyaz katı göze solvent kaldırmak için baskıyı azaltmak.
- Katı 3 ml Etil asetat dağıtılması ve 0.1 M Sodyum karbonat HCI'yi bir huni kullanarak bir 5 mL solüsyon ile en az üç kez yıkayın.
Not: Belirli aralıklarla nokta-testleri bir UV lamba altında sulu faz almak; bir kez hiçbir şey lamba altında görülür, yıkar durdurabilirsiniz. - HCI'yi bir huni organik aşamasında toplamak ve sulu faz pH 6.8-7.0 ulaşıncaya kadar su ile yıkayın (pH kağıdı kullanarak).
- Organik faz toplamak ve Magnezyum sülfat su izlerini kaldırmak için ekleyin.
Not: Magnezyum sülfat sonra çözüm swirled küçük bir spatula ile eklenmesi gerekir. İnce parçacıklar kurutma Aracısı hala görülüyor, Kuru çözümdür. Eğer değilse, ince parçacıklar görülebilir kadar az miktarda Magnezyum sülfat ekleyin. - Bir orta boy cam frit veya filtre kağıdı kullanarak karışımı filtre.
- Rotary Evaporatör, istenen ürün beyaz iğne üretmek gerekir bir işlem kullanarak tenler buharlaşır.
2. tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl sentezi] carbamate (2)
Not: ışık duyarlılığı nedeniyle bahçedeki, folyo kaplı damarlarının bütün tepkiler devam et.
- Bir 25 mL alt şişesi yuvarlak, 387 mg (0,92 mmol, 1.0 eşdeğeri) NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine 10 ml diklorometan geçiyoruz.
- Bu, 480 μL (2.76 mmol, 3 eşdeğerleri), DIPEA, n 264 mg (1,38 mmol; 1,5 eşdeğerleri) çözüm-etil - N′-[3-(dimetilamino) propil] carbodiimide hidroklorür (EDCI) ve 200 mg (0,97 mmol, 1.1 eşdeğerleri) 1. Bir cam stoper ile gemi mühür ve oda sıcaklığında 5 gün boyunca heyecan tepki izin.
Not: diklorometan buharlaşma dikkatli olun. Gerekirse, daha hafta boyunca ekleyin. - Karışımı HCI'yi huni 1 M hidroklorik asit (3 x 5 mL) bir çözüm ile yıkayın.
- Organik faz toplamak ve HCI'yi bir huni, bir çözüm 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL) ile ilk ve o zaman (3 x 5 mL) su ile yıkamak devam edin.
- Organik faz toplamak ve Magnezyum sülfat su izlerini kaldırmak için Ekle (bkz. Adım 1.7). Bir orta boy cam frit veya filtre kağıdı kullanarak karışımı filtre.
- Rotary Evaporatör kullanarak, bir off-beyaz katı satın alabilmek için düşük basınç altında uçucu çözücüler kaldırın.
- Bu katı 10 ml Etil asetat yeniden dağıtılması ve Siklokekzan 30 mL yavaş yavaş (örneğin, bir seferde 2 mL) eklenmesi üzerinden ürün çökelti.
- Filtre kağıdı veya beyaz bir toz olarak ürün elde etmek için bir orta cam frit ile çözüm filtre.
3. tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl sentezi] carbamate (3)
Not: ışık duyarlılığı nedeniyle bahçedeki, folyo kaplı damarlarının bütün tepkiler devam et.
- 10 mL yuvarlak alt şişeye 30 mg (0,05 mmol; 1 eşdeğeri) 2 4 ml diklorometan geçiyoruz.
- Yavaş yavaş 49 mg içinde (0.2 mmol; 4 eşdeğerleri) % 70 m-chloroperbenzoic asit bu karışıma ekleyin ve reaksiyon teknesi ile bir cam stoper kapak. Çözüm gecede oda sıcaklığında, sonuçta verimli bir sarı karışımı ilave edin.
- Sarı karışımı HCI'yi huni 0.1 M NaOH (3 x 5 mL) çözeltisi ile ilk ve o zaman (3 x 5 mL) su ile yıkayın.
- Magnezyum sülfat ile organik faz kuru ve karışımı bir orta cam frit veya filtre kağıdı kullanarak filtre uygulayabilirsiniz.
- Rotary Evaporatör kullanarak, solventler ürün sağlam bir soluk olarak elde etmek için düşük basınç altında kaldırın.
4. N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] fenil} succinamide (Pod) sentezi
- Bir 25 mL alt şişesi yuvarlak, 3 diklorometan 2.0 ml 30 mg geçiyoruz.
- Trifluoroacetic asit 400 μL ekleyin ve şişeye bir cam stoper ile mühür.
- Reaksiyon karışımı oda sıcaklığında 3 saat ilave edin.
- Rotary Evaporatör kullanarak, tenler, oda sıcaklığında, yağlı bir kalıntı bırakarak düşük basınç altında kaldırın.
- Su 7 ml yağlı kalıntı dağıtılması ve HCI'yi bir huni kullanarak, Etil asetat (3 x 4 mL) ile yıkayın. Sulu katman tutun.
- Sulu katmanın BAKLA bir beyaz toz olarak göze lyophilize.
Not: 280 ve 298 nm, molar emme katsayıları için Pod 9,900 ve 12,400 cm-1M-1, sırasıyla vardır.
5. BAKLA-DOTA sentezi
- Bir 1.5 mL microcentrifuge tüp BAKLA 10 mg Dimetil sülfoksit (0,018 mmol; 1 eşdeğeri) 300 μL içinde dağıtılması ve 26 μL n, N-diisopropylethylamine (0.15 mmol; 8 eşdeğerleri) ekleyin.
- DOTA-Bn-NCS (0,02 mmol; 1.2 eşdeğerleri) 15,2 mg dimethylsulfoxide 100 μL içinde dağıtılması ve bu çözüm ile eriyik--dan adım 5.1 birleştirmek. Microcentrifuge tüp kapatın.
- Gecede oda sıcaklığında kuluçkaya tepki sağlar.
- Herhangi bir unreacted DOTA-Bn-NCS kaldırmak için ters faz C18 HPLC Kromatografi kullanarak ürün arındırmak.
Not: Saklama kez belli ki son derece (Pompalar, sütun, boru, vb) her laboratuvar HPLC ekipman üzerinde bağımlı olan ve uygun kontroller arıtma önce çalıştırılmalıdır. Ancak, eğer 5:95 MeCN/H2O bir degrade bir örnek sunmak (% 0,1 ile her ikisi de TFA) 70:30 MeCN/H2O için (% 0,1 ile her ikisi de TFA) üzerinde 30 dk, yarı partiye hazırlık 19 x 250 mm C18 sütun ve bir akış hızı 6 mL/dk kullanılır , BAKLA, p-SCN-Bn-DOTA ve BAKLA-DOTA saklama zamanlarında 14,4, 18,8 ve 19,6 min, sırasıyla olacaktır. Tüm üç bileşikleri 254 izlenebilir nm.
6. bioconjugation BAKLA-DOTA trastuzumab için
Not: Bu adımda, biz 16.4 mg/mL bir hisse senedi çözüm trastuzumab ile başladı.
- Bir düşük protein bağlayıcı 1.5 mL microcentrifuge tüpte trastuzumab hisse senedi çözüm (1 mg; 6.67 nmol, eşdeğeri olan 1) 61 μL 859 μL fosfat tamponlu tuz (pH 7,4) ile sulandırmak.
- Taze yapılmış 10 mM çözeltilerine TCEP H2O (66.7 nmol, 10 eşdeğerleri) 6,7 μL bu karışıma ekleyin.
- BAKLA-DOTA DMSO içinde 1 mg/mL çözeltisi hazırlamak ve bu BAKLA-DOTA çözümün 73 μL (66.67 nmol, 10 eşdeğerleri) tepki karışıma ekleyin.
- Microcentrifuge tüp mühür ve çözüm oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya.
- 2 saat sonra ambalajlı tek kullanımlık boyutu dışlama desalting sütun kullanarak immunoconjugate arındırmak.
- İlk olarak, boyutu dışlama sütun sütun mevcut herhangi bir koruyucu Muhafazası sırasında kaldırmak için tedarikçi tarafından açıklandığı gibi equilibrate. Sütun sütun birime karşılık gelen PBS hacmi ile 5 kez yıkama tipik bir yordam içerir: PBS 5 x 2, 5 mL.
- Daha sonra reaksiyon karışımı tepki karışımı hacmi belirterek boyutu dışlama sütunu ekleyin.
- Reaksiyon karışımı sütun girdikten sonra PBS çözüm için sütun eklenen toplam hacmi getirmek için uygun bir miktar eklemek 2.5 mL. Örneğin, konjugasyon reaksiyon toplam hacmi 1.3 mL içinde oluştuysa, sütuna eklenecek ek PBS 1.2 mL gerekir.
- Nihayet, PBS 2 mL eluent kullanarak ürün toplamak.
- Son immunoconjugate 50 kDa molekül ağırlığı kesme ile santrifüj filtrasyon üniteleri ile konsantre ol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı ilk dört adımlardan — BAKLA sentezi — sağlam ve güvenilir olması için tasarladık. Deprotonation ve 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol istenen thioether ürün oluşturmak için ikame affords thioether > %99 verim sadece 45 dakika sonra. Daha sonra ligasyonu arasi 1 ve N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine yordam kaplin, % 55 verim (2) ürünü topluluğu sonuçlanan standart bir peptid üzerinden sağlanır. Sonra 2 oksidasyon m-chloroperoxybenzoic asit, yaygın olarak kullanılan bir oksidan kullanarak gerçekleştirildi. Çamaşır merdiven 3 ~ %90 verim soluk bir katı olarak elde edildi. Son olarak, 3 tert-butyloxycarbonyl koruma gruptan kaldırılması dichloromethane:trifluoroacetic asit 4:1 oranında kullanarak Standart prosedürler göre yapıldı. Sulu faz, ürünümüz lyophilization sonra — BAKLA — %98 verim beyaz bir toz olarak elde edildi. Reaksiyon ilerlemesini ince tabaka Kromatografi ile izledi ve her ürün kimliğini 1H-NMR, 13C-NMR ve HRMS-ESI (Tablo 1) yolu ile onaylandı.
Onun modülerlik BAKLA reaktif asıl avantajlarından biridir. Şelatörlerin, fluorophores, toksinler veya diğer yükleri çeşitli bileşik'ın kolye Amin için eklenebilir. Eldeki protokolünde bir temsilcisi yükü olarak her yerde şelatör DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic asit) kullanıyorsunuz. DOTA, tabii ki, kullanılan biyomoleküler Radyofarmasötikler geniş bir alanda bir şelatör 68Ga, 64Cu, 111 90Y, 177Lu,'de dahil olmak üzere radiometals için ve 225Ac. Bu amaçla, DOTA (p-SCN-Bn-DOTA) isothiocyanate taşıyan türevi istihdam ve BAKLA kolye Amin basit bağlantı koşulları ile birleştiğinde. Sonuç bifonksiyonel şelatör sonra ters faz C18 HPLC saflaştırılmış ve ~ %75 verim içinde izole. Diğer öncüleri olarak ile reaksiyon ilerlemesini ince tabaka Kromatografi ile izledi ve ürün kimliğini 1H-NMR, 13C-NMR ve HRMS-ESI (Tablo 1) yolu ile onaylandı.
Protokolü'nün son adımında biz BAKLA-DOTA sitesi-seçici bioconjugation için bir model immünglobulin, HER2 hedefleme antikor trastuzumab tartışıyorlar. Bu amaçla, antikor'ın menteşe bölgesi disülfür bağları seçerek indirgeyici TCEP ile azaltılır [tris(2-carboxyethyl) fosfamin]. Bu azaltma adım antikor oda sıcaklığında 2 h için BAKLA-DOTA ile inkübe ve daha sonra saf boyutu dışlama Kromatografi ile. Bu durumda, arıtılmış, DOTA-yatak immunoconjugate ~ %80 verim elde edildi ve maldı-ToF çözümleme (DOL) ~1.8 DOTA/mAb etiketleme bir ölçüde ortaya. Genel olarak, 10 TCEP, BAKLA reaktif ve 2 h kuluçka 10 karşılıkları karşılıkları 2 BAKLA/mAb (Tablo 2) DOL ile bir immunoconjugate verim için yeterli olduğunu bulmuşlardır. Bu sonuç bir insan, insanlaşmış ve chimeric Igg1 antikorlar aralığında tutarlı kalır; Ancak, aynı koşulları immunoconjugates sadece ~1.5 DOL ile fare Igg1 antikorlar ile çalışırken üretmek. Tüm bu, araştırmacılar bu reaksiyon koşulları yeni antikorlar ve BAKLA taşıyan yükleri için \t\ten söyledi. Son olarak ve önemlisi, nihai ürün ile ilgili olarak, biz tekrar tekrar tekrarlanarak BAKLA tabanlı immunoconjugates immunoreactivities eşit veya daha iyi benzer yapıları kullanılarak oluşturulan rasgele veya maleimide tabanlı sergi bulduk ve konjugasyon stratejileri.
Şekil 1: (A)Amin-reaktif, (B) maleimide-yatak ve (C) BAKLA taşıyan yükleri kullanarak bioconjugations şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Michael Ayrıca thiol taşıyan biomolecule (yeşil) ve radiolabeled bioconjugate gibi radiolabeled yapı huzurunda endojen geçirmek için ek karşılıklar oluşturmak için bir radyonüklid taşıyan maleimide (sarı) thiol taşıyan molekül (pembe). RT oda sıcaklığında =. Adumeau, P., Davydova, izni ile yayımlanmaktadır şekil M., Zeglis, B. M. Thiol reaktif bifonksiyonel şelatörlerin oluşturma, Site-seçmeli olarak değiştiren Radioimmunoconjugates ile geliştirilmiş istikrar için. Bioconjugate kimya. 29, 1364-1372 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: BAKLA ve bir thiol arasındaki reaksiyon şeması. Adumeau, P., Davydova, izni ile yayımlanmaktadır şekil M., Zeglis, B. M. Thiol reaktif bifonksiyonel şelatörlerin oluşturma, Site-seçmeli olarak değiştiren Radioimmunoconjugates ile geliştirilmiş istikrar için. Bioconjugate kimya. 29, 1364-1372 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: BAKLA (A) hem de (B) yapısını reaktif Barbas, et al.18,19raporBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: BAKLA dört adımlı sentezi şeması. Adumeau, P., Davydova, izni ile yayımlanmaktadır şekil M., Zeglis, B. M. Thiol reaktif bifonksiyonel şelatörlerin oluşturma, Site-seçmeli olarak değiştiren Radioimmunoconjugates ile geliştirilmiş istikrar için. Bioconjugate kimya. 29, 1364-1372 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: BAKLA-DOTA sentezi şeması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: Trastuzumab BAKLA-DOTA ile bioconjugation şeması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: 89Zr etiketli radioimmunoconjugates huA33 BAKLA tabanlı (89Zr-DFO-BAKLA-huA33) ve maleimide tabanlı (89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation stratejiler kullanılarak oluşturulan, içinde vivo davranışını karşılaştırılması. Düzlemsel (solda) ve en yüksek yoğunluk projeksiyon (sağda) evde beslenen hayvan görüntüleri korele çıplak fareler 89Zr-DFO-BAKLA-huA33 ve 89 enjeksiyonu ardından A33 antijen ifade SW1222 kolorektal kanser xenografts (beyaz ok) taşıyan ZR-DFO-mal-huA33 (140 µCi, 60-65 µg). Koronal dilimleri tümörler ortasına kesişir. Adumeau, P., Davydova, izni ile yayımlanmaktadır şekil M., Zeglis, B. M. Thiol reaktif bifonksiyonel şelatörlerin oluşturma, Site-seçmeli olarak değiştiren Radioimmunoconjugates ile geliştirilmiş istikrar için. Bioconjugate kimya. 29, 1364-1372 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: 89Zr etiketli radioimmunoconjugates huA33 BAKLA tabanlı (89Zr-DFO-BAKLA-huA33) ve maleimide tabanlı (89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation stratejiler kullanılarak oluşturulan, içinde vivo davranışını karşılaştırılması. Biodistribution veri 89Zr-DFO-BAKLA-huA33 ve 89Zr-DFO-mal-huA33 (30 µCi, 15-18 µg) korele çıplak farelere A33 antijen ifade subkutan SW1222 insan kolorektal kanser xenografts taşıyan İdaresi sonra. Mide, ince bağırsak ve kalın bağırsak için değerleri içeriği içerir. Adumeau, P., Davydova, izni ile yayımlanmaktadır şekil M., Zeglis, B. M. Thiol reaktif bifonksiyonel şelatörlerin oluşturma, Site-seçmeli olarak değiştiren Radioimmunoconjugates ile geliştirilmiş istikrar için. Bioconjugate kimya. 29, 1364-1372 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bileşik | 1 H-NMR vardiya | 13 C-NMR vardiya | HRMS | |||
| 1 | (500 MHz, CDCl3) 7,79 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,72 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 4,04 (2 H, br s), 2,75 (3 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 166.3, 163.7, 149.7, 128.5, 114.8, 113.5, 14,8 | m/z Hspln [C9H9N3işletim sistemi + H] için+: 208.0539; bulundu: 208.0539; Δ: 0.0 ppm | |||
| 2 | (500 MHz, CDCl3) 9.68 (1H, s), 7.91 (2H, d, J 9.0 Hz =), 7,71 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6.82 (1H, s), 4,99 (1H, s) 3,70-3,45 (12H, m), 3.41 (2H, q, J 6.0 Hz =), 3.20 (2H, q, J = 6.5 Hz), 2,76 (3H, s), 2.71 (2H, m), 2,63 (2H m), 1,80-1.70 (4 H, m), 1,42 (9 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.3, 165.8, 164.6, 156.2, 141.8, 127.7, 119.6, 118.6, 79.2, 70.6, 70.5, 70,3, 70.1, 69.6, 38.8, 38,5, 33.5, 31,6, 29,9, 28,6, 14,8 | m/z Hspln [C28H43N5O8S + Na] için+: 632.2725; bulundu: 632.2722; Δ:-0.47 ppm | |||
| 3 | (500 MHz, CDCl3) 9,99 (1 H, s), 7,98 (2 H, d, J 9.0 Hz =), 7.75 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6.88 (1 H, s), 4,99 (1 H, s), 3,66-3,50 (15 H, m), 3.41 (2 H, q, J 6.0 Hz =), 3.20 (2 H, q, J = 6.5 Hz), 2.71 (2 H, m), 2.65 (2 H, m) , 1,80-1.70 (4H, m), 1.43 (9H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.5, 166.5, 161.6, 156.1, 143.4, 128.7, 119.6, 116.4, 79.1, 70.5, 70,4, 70.2, 70,0, 69,4, 43,0, 38.8, 38.4, 33.2, 31.3, 29,7, 28,4 | m/z Hspln [C28H43N5O10S + H] için+: 642.2803; bulundu: 642.2797; Δ:-0.93 ppm | |||
| BAKLA | (500 MHz, D2O) 7.85 (2 H, d, J 9.0 Hz =), 7,55 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 3,60-3,45 (15 H, m), 3,45 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.20 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.04 (2 H, t, J 7.0 Hz =), 2,67 (2 H, t, J 6.5 Hz =), 2.54 (2 H t, J = 6.5 Hz), 1.87 (2 H, qt, J = 6.5 Hz), 1,70 (2 H, qt, J = 6.5 Hz) | (125 MHz, D2O) 174.5, 173.2, 166.8, 161.4, 142.2, 128.6, 120.3, 116.6, 69,4, 69,4, 69.3, 69.2, 68.2, 68.2, 42.5, 37.6, 36.2, 31.9, 30,7, 28.2, 26,4 | m/z Hspln [C23H35N5O8S + H] için+: 542.2279; bulundu: 542.2281; Δ: 0,37 ppm | |||
| BAKLA-DOTA | (600 MHz, DMSO-d6) 10.46 (1 H, s), 9.74 (1 H, k), 8,04 (2 H, d, J 8.6 Hz =), 7,99 (1 H, s), 7,90 (1 H, t, J = 5.0 Hz), 7,86 (2 H, d, J = 6.5 Hz), 7,44 (2 H, d, J 7.9 Hz =), 7.24 (2 H, d, J 7.1 Hz =), 4,35-2.41 (45 H, m) , 3.70 (3H, s), 1.76 (2H, q, J = 6.3 Hz), 1.61 (2H, q, J = 6.5 Hz) | (125 MHz, DMSO-d6) 171.8, 171.4, 166.1, 162.2, 158.8, 158.6, 129.8, 129.0, 127.6, 123.3, 119.5, 118.5, 116.5, 116.4, 70.2, 70.1, 70,0, 68.7, 68.5, 43.4, 41.8, 36,3, 32.2, 30,4, 29.8, 29.1 | m/z Hspln [C47H68N10O16S2+ H] için+: 1093.4334; bulundu: 1093.4327; Δ:-0.64 ppm | |||
Tablo 1. Sentetik ara ürün için karakterizasyonu verileri yanı sıra BAKLA ve BAKLA-DOTA nitelendirdi.
| Antikor | Türü | Sabit bölge | BAKLA: mAb oranı |
| İnsan plazma IgG | İnsan | İnsan IgG | 2.1 ± 0,1 |
| Trastuzumab | İnsanlaşmış | İnsan Igg1 | 2.0 ± 0,1 |
| huA33 | İnsanlaşmış | İnsan Igg1 | 2.1 ± 0,1 |
| Cetuximab | Chimeric | İnsan Igg1 | 2.2 ± 0,1 |
| AR 9,6 | Fare | Fare Igg1 | 1.4 ± 0,1 |
| Fare plazma IgG | Fare | Antikorundan IgG | 1.5 ± 0,1 |
Tablo 2. Farklı antikorlar konjugasyon bir BAKLA-yatak fluorophore ile takip etiketlerine göre derecesi. Değerler standart sapmalar gösterilir. Adumeau, P., Davydova, izni ile yayımlanmaktadır tablo M., Zeglis, B. M. Thiol reaktif bifonksiyonel şelatörlerin oluşturma, Site-seçmeli olarak değiştiren Radioimmunoconjugates ile geliştirilmiş istikrar için. Bioconjugate kimya. 29, 1364-1372 (2018). Telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu raporda, radiolabeling veya içinde vivo deneyler için herhangi bir iletişim kuralı eklemeyi seçtiniz. Bizim basit nedenidir. Eski ile ilgili olarak, BAKLA tabanlı immunoconjugate radiolabeling hiç, diğer bioconjugation stratejileri kullanarak sentezlenmiş bir immunoconjugate farklı değil ve bu yordamları kapsamlı olmuştur başka bir yerde2 gözden . İkincisi ile ilgili olarak, preklinik içinde vivo deneyler (fare modelleri, doz, vb), özellikleri geniş uygulama ve antikor/antijen sistemi göre değişebilir.
HuA33 89Zr etiketli türevleri ile önceki araştırmalarımız BAKLA tabanlı bioconjugations avantajları zorlayıcı bir örnek sağlar. HuA33 olduğunu A33 antijen olarak ifade edilen bir transmembran glikoprotein hedefleyen bir insanlaşmış Igg1 antikor > kolorektal kanserler23,%2495'i. Bizim önceki el yazması22, her iki BAKLA ve maleimide göre bioconjugation stratejileri kullanarak 89Zr-DFO-huA33 radioimmunoconjugate sentezi rapor. İki radiolabeled antikorlar — 89Zr-DFO-BAKLA-huA33 ve 89Zr-DFO-mal-huA33 — hemen hemen aynı verimi, saflık, özgüllük aktivite ve immunoreactivity üretildi. Eleştirel, ancak, iki radioimmunoconjugates insan serumu içinde önemli ölçüde farklı stabiliteleri sergiledi: onun maleimide tabanlı kuzeni sadece 61 ± %5 iken 37 ° C'de yedi gün için kuluçka sonra 89Zr-DFO-BAKLA-huA33 86 ± % 1 de sağlam kaldı bozulmamış. İn vivo hayvan görüntüleme ve A33 antijen ifade SW1222 insan kolorektal kanser xenografts ortaya stark farklılıkları (şekil 8 ve iki radioimmunoconjugates içinde vivo davranışını taşıyan korele çıplak farelerde biodistribution deneyleri Şekil 9). 89Zr-DFO-BAKLA-huA33 ve 89Zr-DFO-mal-huA33 üretmek tümör doku konsantrasyonlarda yüksek etkinlik: 56.4 ± 6.9%ID/g ve 49,6 ± 9.3%ID/g, sırasıyla, 48 h yönetim sonra. Ancak, maleimide tabanlı radioimmunoconjugate anlamlı olarak daha yüksek aktivite konsantrasyonlarda sağlıklı dokularda BAKLA tabanlı aracı daha üretti. Örneğin, 3.1 konsantrasyonları etkinlik 89Zr-DFO-mal-huA33 üretilen ± 0.5, 2.7 ± 0,4 ve % 12,2 ± 0,4 kimliği/g böbrekler, karaciğer ve kemik, sırasıyla, 120 h sonrası enjeksiyon değerleri önemli ölçüde aşan etkinlik konsantrasyonları 89Zr-DFO-BAKLA-huA33 aynı dokularda tarafından üretilen (1.4 ± 0,1, 1.2 ± 0,3 ve 4.3 ± % 0.6 kimliği/g). Gerçekten de, 89Zr-DFO-BAKLA-huA33 120 h sonrası enjeksiyon 89için Zr-DFO-mal-huA33 karşılaştırıldığında düşük aktivite konsantrasyonlarda (kalın bağırsak) hariç tüm sigara hedef dokularda üretilen. Sonuç olarak, tümör organ etkinliği toplama oranları 89Zr-DFO-BAKLA-huA33 için genellikle bu 89Zr-DFO-mal-huA33 üstündür; Özellikle, tümör karaciğer, tümör dalak, tümör böbrek ve tümör kemik etkinliği toplama içinde oranları neredeyse çift maleimide elde edilen onun kuzeni karşılaştırıldığında BAKLA tabanlı immunoconjugate için. İki radioimmunoconjugates arasındaki temel fark şelatör bioconjugation kolu olduğunu göz önünde bulundurursak, BAKLA-thiol bağlantı artan istikrar içinde vivo bu performansın için neredeyse kesin sorumludur.
Daha geniş bir görünüm alıyor, probları antikorlar içinde lysines için site seçici bioconjugation kuşkusuz bir basit ve facile antikorlar modifikasyonu yaklaşımdır. Ancak, birden çok lysines immünglobulin yapısı dağıtılan varlığı kesin site veya bioconjugation2derecesini kontrol uygulamak imkansız olduğunu anlamına gelir. Sonuç olarak, rastgele bu strateji kez kötü tanımlı üretir ve d antijen bağlayıcı etki alanları3içinde oluşursa sergilemek son derece heterojen immunoconjugates immunoreactivity düşmüştür. Bioconjugation sitesi-seçici yaklaşımlar faydaları tekrar tekrar her iki radioimmunoconjugates için resimli ve antikor-uyuşturucu conjugates8,14,25,26, 27,28,29,30. Kısacası, sadece site seçici bioconjugation stratejileri daha iyi tanımlanmış üretmek ve homojen immunoconjugates daha geleneksel yöntemleri de görüntüleme ajanları, radioimmunotherapeutics ve ADCs ile içinde vivo performansın yaratıyorlar. Henüz BAKLA tabanlı d diğer site seçici değişiklik stratejileri Karşılaştırmada nerede duracağım? Genel olarak, antikorlar site seçici modifikasyonu yaklaşımlar dört kategoride sınıflandırılabilir: d (1) sistein kalıntıları, (2) ağır zinciri glukanlardir, (3) chemoenzymatic dönüşümleri ve (4) kullanım manipülasyonu in genetik mühendisliği4,5. Tabii ki, bu sınıflandırma sistemi mükemmel değildir ve bazı yaklaşımlar (örneğin, ağır zincir glukanlardir enzimleri ile modifikasyonu) kaçınılmaz olarak iki kategori için geçerli. Her strateji kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Henüz onlar karmaşık ve pahalı31,32,33genetik mühendisliği tabanlı yaklaşımlar konjügasyon, site üzerinde nefis kontrol sağlar. Ağır zincir glukanlardir için oksidatif kuplajları are ucuz ve basit, henüz onlar oksidatif hasar immünglobulin34,35,36,37 yapısal bütünlüğünü tehlikeye ,38.
Thiol tabanlı bioconjugations baş avantaj — dahil BAKLA — onların basitlik ve modülerlik. Onların asıl sınırlama, öte yandan, bir antikor, konjugasyon sitenin hem üzerinde kontrol derecesi ve değişiklikleri antikoru başına sayısını azaltan bir özellik içinde birden çok thiols varlığı kaynaklanıyor. Bu anlamda, thiol tabanlı d ve genetik olarak ücretsiz sistein kalıntıları Uluslararas› mühendislik antikorlar ile birlikte özellikle çekici bir yaklaşımdır. Biz belirtildiği gibi başka bir maleimide tabanlı thiol d succinimidyl thioether Bond retro-Michael eklemeler içinde vivo karşı hassasiyeti kısıtlamasıdır. Henüz eleştirel, BAKLA kullanımı bu sorunu abrogates.
Biz bitirmeden önce acil doğa BAKLA teknoloji engellerin kendi kümesi oluşturabilirsiniz unutmamak gerekir. Örneğin, hiçbir BAKLA taşıyan bifonksiyonel şelatörlerin (şu anda) ticari olarak kullanılabilir ve klinik Farmakoloji, toksikoloji veya BAKLA tabanlı immunoconjugates immünojenisite adresleme veri yok. Ancak, biz BAKLA tabanlı bioconjugations temelde immunoconjugates laboratuar ve klinik sentezlenmiş şeklini değiştirmek için potansiyel olduğuna inanıyorum. Belgili tanımlık yarar soruşturmalar antikor-uyuşturucu inşası için bu yaklaşımın conjugates rağmen şu anda, biz sadece bu kimyasal teknoloji Nükleer görüntüleme ve radioimmunotherapy, radioimmunoconjugates gelişmesine uygulamış olan ve diğer biyomoleküler ilaçlar şu anda devam etmektedir. Sonunda, ciddiyetle umarız bu protokolü — ve hazırladığımız özellikle basit ve basit kimya — phenyloxadiazolyl metil sulfones sulfhydryl tabanlı conjugations için teşvik ve alandan bir kayma teşvik yardımcı olacaktır maleimides daha kararlı ve daha güvenilir alternatifler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Dr Sai Kiran Sharma yararlı konuşmaları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
References
- Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
- Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
- Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
- Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
- Shen, B. -Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
- Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
- Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
- Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
- Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
- Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
- Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
- Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
- Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -w, Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
- Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
- Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
- Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. III Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
- Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
- Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
- Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
- Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
- Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
- Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
- Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
- Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
- Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
- Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
- O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
- Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
- Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
