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Medicine

Medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59064
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para probar la permeabilidad glomerular en ratones usando un trazador no radioactivo altamente sensible. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina.

Abstract

La pérdida de albúmina en la orina (albuminuria) predice el resultado cardiovascular. En condiciones fisiológicas, pequeñas cantidades de albúmina son filtradas por el glomérulo y reabsorbidas en el sistema tubular hasta que se alcanza el límite de absorción. Los primeros aumentos en la filtración patológica de albúmina pueden, por lo tanto, perderse mediante el análisis de la albúmina. Por lo tanto, el uso de trazadores para probar la permselectividad glomerular parece ventajoso. El trazador fluorescentemente etiquetado isotiocianato de fluoresceína (FITC)-polisucrosa (es decir, FITC-Ficoll), se puede utilizar para estudiar la permselectividad glomerular. Las moléculas FITC-polisucrosa son filtradas libremente por el glomérulo pero no reabsorbidas en el sistema tubular. En ratones y ratas, FITC-policrorosa se ha investigado en modelos de permeabilidad glomerular mediante el uso de procedimientos técnicamente complejos (es decir, mediciones radiactivas, cromatografía líquida de alto rendimiento [HPLC], filtración de gel). Hemos modificado y facilitado un protocolo basado en trazador de policrorosa FITC para probar aumentos tempranos y pequeños en la permeabilidad glomerular a FITC-policrorosa 70 (tamaño de la albúmina) en ratones. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina (5 l). Este protocolo contiene información sobre cómo se aplica por vía intravenosa el trazador FITC-policrorosa 70 y la orina se recoge a través de un simple catéter urinario. La orina se analiza a través de un lector de placas de fluorescencia y se normaliza a un marcador de concentración de orina (creatinina), evitando así procedimientos técnicamente complejos.

Introduction

Los defectos funcionales o estructurales dentro de la barrera de filtración glomerular aumentan la permeabilidad glomerular a la albúmina, lo que resulta en la detección de albúmina en la orina (albuminuria). La albúmina predice el resultado cardiovascular y es un marcador importante para la lesión glomerular1. Incluso los niveles bajos de albúmina, que se encuentran dentro del rango normal, se asocian con un aumento del riesgo cardiovascular1.

En condiciones fisiológicas, la albúmina se filtra a travésdel glomérulo y se reabsorbe casi por completo en el sistema tubular 2,3. En ratones, la detección de albúmina en la orina suele realizarse mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de albúmina (ELISA) a partir de las 24 horas de recolección de orina. Si se utiliza orina de una colección de orina de 24 horas o orina manchada, se pueden perder pequeñas diferencias en las concentraciones de albúmina debido a problemas de sensibilidad al ensayo. La mayoría de los investigadores, por lo tanto, utilizan modelos animales en los que la albuminuria es inducida por una lesión renal robusta debido a toxinas, medicamentos y cirugía renal.

Por lo tanto, la búsqueda de un método sensible para detectar pequeños y transitorios cambios en la permeabilidad glomerular es muy importante para el campo. Rippe et al. han presentado un modelo de rata para probar la permeabilidad glomerular mediante la aplicación de un trazador con etiqueta fluorescente, a saber, FITC-polisucrose 70 (es decir, FITC-Ficoll 70), en el tamaño de la albúmina4. La aplicación de trazador permite la prueba de cambios a corto plazo en la permeabilidad glomerular (en cuestión de minutos) y es muy sensible4. Dos estudios han utilizado elmétodo trazador en ratones 5,6. A pesar de sus beneficios, este método, por desgracia, tiene desventajas: es técnicamente muy complejo, radiactivo e invasivo. El análisis posterior de la orina sólo se realiza mediante el uso de filtración de gel o tamaño-exclusión HPLC5,6.

Dentro de este artículo, presentamos un método alternativo, sensible, no radioactivo y rápido para medir la permeabilidad glomerular en ratones utilizando fluorescentemente etiquetado FITC-policrorosa 70. Mediante la introducción de un catéter transuretral, la recolección de orina es menos invasiva que la punción vesical, la uretrotomía y la aplicación de catéter suprapúbico, y permite la recolección de orina al menos cada 30 minutos. El análisis de orina se realiza a partir de pequeñas cantidades (5 ol) utilizando un lector de placas fluorescentes. Las concentraciones de trazador en la orina se normalizan a las concentraciones de creatinina en la orina mediante un ensayo de creatinina enzimática.

Por lo tanto, este novedoso método ofrece una herramienta sensible para estudiar lesiones glomerulares tempranas con mayor permeabilidad glomerular.

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Protocol

Las investigaciones se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices descritas en la Guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio (Publicación No 85-23 de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos, revisada en 1996). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las aprobaciones institucionales pertinentes (el gobierno estatal Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] número de referencia 84-02.04.2012.A397).

1. Preparación de instrumentos, soluciones y equipos

  1. Reconstituir FITC-policrorosa 70 con cloruro de sodio estéril al 0,9% (NaCl) a una concentración final de 10 mg/ml (es decir, 100 mg en 10 ml de NaCl).
  2. Dialyze FITC-policrose 70 solución para eliminar las moléculas FITC libres durante la noche a 4 oC (corte de peso molecular [MWCO] a 10.000). Utilice 1 L de NaCl estéril al 0,9% por 10 ml de FITC-policrorosa 70 bajo agitación constante. Proteger de la luz. Aliquot el dializado FITC-policrorosa 70 y almacenarlo a -20 oC.
  3. Para la solución FITC-policrorosa 70 bolus, añadir 4 ml de 10 mg/ml de fitC-polisucrosa 70 solución a 996 ml de 0,9% de NaCl (la concentración final de FITC-policrorosa 70: 40 g/ml).
  4. Para la solución de perfusión de equilibrio, añadir 20 ml de una solución de 10 mg/ml de FITC-polisucrosa 70 a 9,98 ml de NaCl estéril al 0,9% que produzca una concentración final de 20 g/ml.
  5. Para la solución experimental, añadir fármacos o sustancias a la solución de perfusión (por ejemplo, para angiotensina II [Ang II] [100 ng/kg/min] para un ratón de 25 g, añadir 3 ml de Ang II de una solución de 1 mM).
  6. Para la cirugía, prepare una afeitadora, dos abrazaderas quirúrgicas, un par de tijeras quirúrgicas, dos pinzas, dos pinzas finas, un par de tijeras finas y hisopos. Prepare dos hilos de seda de 10 cm (4-0 a 6-0) para los procedimientos de ligadura.
  7. Para la colocación de un catéter venoso central, prepare una jeringa de 10 ml con una aguja de 21 G. Coloque la punta de la aguja en un catéter de 30 cm de largo (con un diámetro interior [ID] de 0,58 mm). Conecte el catéter de 0,58 mm a un catéter de 10 cm (con una identificación de 0,28 mm). Corte la punta del catéter oblicuo más pequeño para crear una punta afilada que se introduce en la vena yugular.
  8. Preparar la anestesia (es decir, ketamina de anestesia intraperitoneal, 100 mg/kg de peso corporal, y xilazina, 5 mg/kg de peso corporal).
  9. Prepare un angiocatéter de 22 G descartando la aguja y marcando el catéter a 1 cm de la punta. Precalentar la almohadilla de calentamiento a 37 oC.
  10. Prepare un dispositivo de presión arterial y cambie la membrana de medición de la presión arterial si es necesario.

2. Fase de preparación

  1. Catéter urinario
    NOTA: La sección 2.1 sigue el protocolo descrito por Reis et al.7. La Figura 1 y la Figura Suplementaria 1 muestran la colocación de un catéter urinario en ratones hembras.
    1. Anestetizar el ratón con ketamina/xilazina (ver paso 1.8). Utilice la prueba del dedo del pie para confirmar la anestesia adecuada. Para mantener la anestesia, repita la anestesia (por ejemplo, con la mitad de la dosis) después de 60 min. Se confirma la anestesia adecuada si la prueba de pellizco del dedo del rallado no da lugar a la retirada del reflejo.
      NOTA: En este protocolo se utilizan ratones FVB hembra.
    2. Coloque el ratón en la recumbencia dorsal en una almohadilla de calentamiento de 37 oC. Apriete la parte inferior del abdomen y encuentre el ostium uretral (por ejemplo, bajo un microscopio).
    3. Utilice la parte plástica del catéter de un angiocatéter de 22 G y lubrique con gel de xilocaína. Introducirlo cuidadosamente 3 mm en el ostium uretral mientras se paralece el eje uretral distal (Figura1A).
    4. Gire la parte superior del angiocatéter 180o manteniendo la punta dentro del ostium uretral y manteniendo el eje de la uretra (Figura1B).
    5. Introducir el catéter 7 mm más en el ratón para que se coloque dentro de la vejiga (Figura1C). No fuerce el catéter más allá de la resistencia. Corrija la posición del catéter desde el principio si se siente resistencia. Tenga en cuenta que si la posición del catéter urinario es correcta, la orina ya puede aparecer dentro del catéter.
    6. Coloque un tubo marrón de 1,5 ml sobre la parte superior del angiocatéter para recoger la orina. Aplicar 1 ml de 0,9% De NaCl por vía subcutánea para mejorar la producción de orina.
  2. Catéter venoso central
    1. Afeitar el cuello del ratón y colocarlo en la recumbencia con la cabeza hacia el cirujano. Hiperextender la cabeza del ratón con una cinta.
    2. Desinfectar el cuello con 70% isopropanol. Haga una pequeña incisión en la piel (5 mm) por debajo de la mandíbula, usando una pinza y un par de tijeras. Cortar la piel aproximadamente 1 cm en la dirección del esternón hasta que se alcance el centro del esternón.
    3. Disecciona cuidadosamente la piel en el lado derecho del cuello, usando un par de tijeras. Haga una incisión rectangular de la piel en el lado derecho del ratón para exponer el tejido blando del cuello. Usa unas tijeras y una pinza. Fije las aletas de la piel con dos abrazaderas.
      NOTA: La vena yugular corre a lo largo del lado izquierdo de la glándula tiroides o está ligeramente cubierta por el lóbulo derecho de la glándula tiroides. Después de este paso, use un microscopio para la cirugía.
    4. Exponer cuidadosamente la vena yugular mediante una preparación contundente, utilizando la punta de la pinza fina. Evite lesiones en las ramas de las venas.
      NOTA: Puede ser necesario extraer el tejido con tijeras finas. Tenga cuidado al usar tijeras para extraer tejido, ya que aumenta el riesgo de sangrado.
    5. Coloque y cierre una ligadura con un hilo de seda (4-0 a 6-0) en la parte distal de la vena yugular visible (hacia la cabeza del ratón). Ponga tensión en la ligadura fijando el hilo de seda con una cinta para asegurar una ligera tensión en la vena yugular. Prepare una ligadura alrededor de la parte proximal de la vena yugular.
    6. Llene el catéter con la solución de perfusión de equilibrio (ver paso 1.4) y fije el catéter con una cinta adhesiva para que el catéter alinee la vena yugular. Control de burbujas para evitar la embolia de aire.
    7. Levante la vena yugular con pinzas finas en el lugar de inserción (el sitio de inserción es de 1-2 mm proximal de la ligadura). Alinee el tubo paralelo a la vena yugular. Perforar la vena yugular, apuntando hacia el lumen, e insertar para aproximadamente 2-4 mm, en paralelo el eje de la vena yugular. Evite los movimientos rápidos.
    8. Cierre la ligadura para fijar el catéter. Control de la estanqueidad de la ligadura mediante la visualización cuidadosa a través del microscopio. Ponga un hisopo húmedo sobre el lugar de la cirugía.
  3. Medición de la presión arterial
    1. Coloque el manguito de cola en la parte inferior de la cola del ratón mientras el ratón se acostó en la recumbencia dorsal. Inicie las mediciones y repitalas 10 veces por punto de tiempo. Construir una media a partir de las mediciones.
    2. Ajuste la posición del manguito de la cola si las mediciones de la presión arterial no parecen correctas y se producen datos falsos.

3. Fase de equilibrio

  1. Cambie el tubo de recolección urinaria antes de que comience la fase de equilibrio y colóquelo en hielo.
  2. Introducir una jeringa de 10 ml llena de solución de fase de equilibrio FITC (ver paso 1.4) con una aguja de 21 G y el catéter más grande (con un ID de 0,58 mm) y colocarla en la bomba de la jeringa.
  3. Doble un hisopo y colóquelo alrededor del catéter de pequeño recipiente (con una identificación de 0,28 mm) que se introduce en la vena yugular. Coloca el catéter dentro del hisopo. Coloque una abrazadera sobre el hisopo para abolir el flujo sanguíneo retrógrado o la embolia aérea. Conecte una aguja de 27 G con una jeringa de 1 ml llena con el bolo FITC hasta el extremo del catéter de recipiente pequeño.
  4. Abra la abrazadera y aplique el bolo FITC (100 l). Cierre la abrazadera de nuevo y conecte el catéter más grande con el catéter más pequeño. Encienda la bomba de jeringa con 0,008 ml/min (0,480 ml/h). Continúe la perfusión durante 60 min.

4. Fase experimental

NOTA: En esta fase, se puede investigar el efecto de los fármacos sobre la permselectividad glomerular.

  1. Cambie el tubo urinario (punto de tiempo 0 min) a otro tubo marrón de 1,5 ml. Coloque un hisopo alrededor del catéter de recipiente pequeño y cierre una abrazadera como se indica en el paso 3.3.
  2. Desconecte el catéter grande del catéter de recipiente pequeño. Cambie las jeringas a las soluciones de fase experimental (ver paso 1.5). Deje que la bomba de perfusión funcione de modo que el catéter grande se llene con la solución de equilibrio.
  3. Vuelva a conectar los catéteres evitando la embolia de aire y vuelva a abrir la abrazadera. Encienda la bomba de jeringa a 0,008 ml/min.
  4. Continúe ejecutando la bomba de la jeringa durante 60 minutos y recoja la orina dentro del tubo urinario a partir de entonces (orina 60 min). Coloque el tubo de orina en hielo.
  5. Sacrificar el ratón por luxación cervical durante la anestesia. Antes de la eliminación, el ratón se observa durante 5 minutos para asegurarse de que está muerto.

5. Análisis de orina

  1. Medición de fluorescencia
    1. Descongelar la piscina urinaria y diluirla 1:10 con solución salina con fosfato tampón (PBS).
      NOTA: La piscina urinaria es un charco de orina que se ha recogido de ratones sanos en una colección de orina de 12-24 h en una jaula metabólica.
    2. Preparar normas para la medición de fluorescencia. Tome 10 tubos marrones de 1,5 ml y etiquételos para blanco (1:10 piscina de orina diluida) y las siguientes concentraciones de FITC-policrorosa 70 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 g/ml).
    3. Pipet 246 l de piscina de orina diluida en un tubo marrón de 1,5 ml y añadir 4 l de la concentración de material FITC-polisurosa 70 (ver paso 1.1) para obtener una concentración final de 160 g/ml FITC-policrorosa 70. Pipet 100 l de la piscina de orina diluida en todos los demás tubos.
    4. Diluir 1:2 pipeteando 100 l del tubo de 160 g/ml FITC-polisucrosa 70 en el tubo de 80 g/ml y continúe con las otras concentraciones. Asegurar la mezcla adecuada de las concentraciones diluidas (por ejemplo, vórtice el tubo antes de continuar).
    5. Diluir las muestras de orina del ratón (0 min, 60 min) 1:10 con piscina urinaria diluida.
    6. Pipetear 5 l de cada concentración estándar de FITC-policrorosa 70 y de las muestras de orina del ratón como triplicados en una placa negra de 384 pocillos. Centrifugar la placa a 1.000 x g durante 15 s para evitar burbujas.
    7. Analice la placa de 384 pocillos en un lector de placas. Realizar excitación a 496 nm y medir la fluorescencia a 525 nm.
  2. Medición de creatinina
    1. Siga las instrucciones del fabricante. En resumen, prepare las normas de creatinina diluyendo 10 ml de la solución estándar de creatinina de 100 mM con 990 ml de tampón de ensayo de creatinina para preparar una solución estándar de 1 mM.
    2. Agregue 0, 2, 4, 6, 8 y 10 l de la solución estándar de creatinina de 1 mM en una placa de 96 pocillos para generar 0, 2, 4, 6, 8 y 10 nmol/estándares de pozo, respectivamente. Añadir tampón de ensayo de creatinina a cada pozo para llevar el volumen a 50 sL.
    3. Preparar las mezclas de reacción añadiendo 42–44 l de tampón de ensayo de creatinina, 2 s de creatinasa, 2 ml de creatininasa, 2 l de mezcla enzimática de creatinina y 2 s de sonda de creatinina. Para el espacio en blanco, utilice 44 s de tampón de ensayo de creatinina, 2 ml de creatinasa, 2 ml de mezcla enzimática de creatinina y 1–2 l de sonda de creatinina.
    4. Añadir 50 l de la mezcla de reacción apropiada a cada pocto en la placa de 96 pocillos e incubarla durante 60 minutos en una coctelera horizontal a 37 oC. Proteja la placa de la luz durante la incubación. Mida la absorbancia a 570 nm en un lector de placas.
    5. Calcule las concentraciones de creatinina restando el valor en blanco de todas las lecturas. El resultado tendrá la unidad nanomoles/microlitro. Multiplique la concentración de creatinina por el peso molecular de la creatinina (113,12 ng/nmol) para recibir la unidad nanogramos/microlitro.

6. Análisis de datos

  1. Calcule la concentración de orina FITC-policrorosa 70 a partir de la curva estándar.
  2. Hacer referencia a las concentraciones de orina FITC-policrorosa 70 a las concentraciones de creatinina en la muestra de orina representativa.
  3. Hacer referencia a la orina muestras de 60 minutos a la orina 0 min muestras de controles y ratones tratados.

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Representative Results

Como se muestra en la Figura2, el método para probar la permeabilidad glomerular en ratones se construye en tres fases. La primera fase se denomina fase de preparación, en la que se colocan un catéter urinario y un catéter venoso central. La segunda fase se denomina fase de equilibrio, comenzando con una inyección intravenosa en bolo de FITC-policrorosa 70 y seguida de la perfusión continua de FITC-policrorosa 70 durante 60 min. La última fase se denomina fase experimental. En esta fase, se continúa la perfusión de FITC-policrorosa 70 y se pueden analizar fármacos u otras sustancias para influir en la permeabilidad glomerular. La orina se recoge al final de cada fase.

Para investigar la permeabilidad glomerular dentro de este modelo de trazador, es esencial colocar un catéter urinario correctamente y sin dañar la mucosa. La colocación de un catéter urinario en una vejiga de ratón hembra se demuestra en la Figura1. El catéter se coloca 3 mm en el ostium uretral, paralelo al eje uretral craneocaudal (Figura1A). El catéter se gira 180o hacia la cola del ratón (Figura1B)e introducido 7 mm más en la vejiga, paralelo a la columna vertebral murinos (Figura 1C,D).

Como se ha descrito anteriormente, los métodos anteriores para probar la permeabilidad glomerular en ratones utilizaron HPLC para purificar las señales FITC-policrorosa 70 de las muestras de orina5,6. Como este método utiliza la medición de fluorescencia sin una purificación previa del trazador, se analizaron PBS, orina de ratón y FITC-policrorosa 70 en orina de ratón. La Figura 3A muestra el escaneo de fluorescencia de PBS con un pico de fluorescencia a 325 nm, que parece ser un efecto del flash de excitación a 290 nm. La exploración de fluorescencia de la orina nativa del ratón muestra un máximo de fluorescencia de 395 nm (Figura3B). FITC-policrorosa 70 disuelta en orina de ratón muestra una fluorescencia máxima a 525 nm (Figura3C,D). La Figura 3C muestra que la orina del ratón no perturba la medición de fluorescencia de FITC-policrorosa 70 en la orina del ratón. El aumento de las concentraciones de FITC-policrorosa 70 muestra un aumento de la intensidad de la fluorescencia (Figura3E).

Para demostrar que este método es capaz de detectar diferencias en la permeabilidad glomerular, Ang II se aplicó en la fase experimental del modelo. Ang II aumentó la permeabilidad glomerular en ratones 60 min despuésde una administración continua en dosis no relevantes para la presión arterial (Figura 4A,B). El aumento de la permeabilidad glomerular debido a Ang II podría ser bloqueado por un bloqueador de receptores Ang II (ARB), a saber, candesartán (Figura 4A). Ang II washout disminuyó la permeabilidad glomerular (Figura4A). La presión arterial se midió mediante el método de cierre de cola y no mostró diferencias significativas entre los grupos (Figura4B). Los animales con polisurosa 70 y FITC-polisucrosa 70 infundidas sirven como controles para los animales tratados con POLIcrorosa 70 y Ang II (Figura4C).

Figure 1
Figura 1: Colocación de un catéter urinario en ratones hembra. Vista lateral del abdomen del ratón. (A) El catéter marcado y lubricado se introduce 3 mm en el ostium uretral externo de un ratón hembra. El eje craneocaudal de la uretra está paralelo con el catéter. La tensión cuidadosa en la parte inferior del abdomen con el dedo índice izquierdo facilita la introducción del catéter en el ostium uretral externo. (B) El catéter se gira 180o hacia la cola del ratón. La punta del catéter permanece 3 mm dentro del ostium uretral externo. (C) El catéter ahora se introduce 7 mm más en la vejiga. La dirección del catéter está alineada con la columna vertebral murina. (D) Vista ventral del abdomen del ratón. El catéter se coloca 10 mm en el ratón. (E) La orina aparece con una inserción correcta en la vejiga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ilustración esquemática de los procedimientos experimentales en una línea de tiempo. Después de la narcosis del ratón, se coloca un catéter urinario. Se implanta el catéter venoso central y se obtiene la orina basal (0 min). Después, el BOus FITC-policrorosa 70 se aplica a través del catéter venoso central y se inicia una perfusión continua de FITC-polisurosa 70. La fase de equilibrio para FITC-policrorosa 70 dura 60 min. La orina se recoge después de la fase de equilibrio (0 min) y antes de que comience la fase experimental. Dentro de esta fase, se pueden aplicar fármacos u otras sustancias (como la angiotensina II). Al final de la fase experimental, la orina se obtiene para su análisis (60 min). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Fluorescencia de PBS y orina de ratón con y sin FITC-policrorosa 70. (A) El escaneo de frecuencia de fluorescencia (excitación de 290 nm, emisión de 325-700 nm) de PBS muestra una señal a 325 nm, que parece ser un efecto del flash de excitación a 290 nm. (B) En la exploración de frecuencia de orina nativa del ratón (piscina de orina diluida a 1:10 y 1:20), hay una señal con un máximo de 395 nm, probablemente causada por la autofluorescencia de proteínas urinarias. (C) La orina de ratón que contiene FITC-policrorosa 70 (40 g/ml) muestra un pico de señal de 525 nm que no interfiere con la medición de la autofluorescencia de orina. (D) Ampliación del pico de fluorescencia FITC-policrorosa 70 dependiendo de la longitud de onda de emisión. Se muestran diferentes concentraciones de FITC-polisurosa 70 (1.25, 2.5, 5, 10, 20 y 40 g/mL). (E) El aumento de las concentraciones de FITC-policrorosa 70 muestra un aumento de la intensidad de la fluorescencia a la emisión de 525 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La angiotensina II (Ang II) aumenta la permeabilidad glomerular. (A) Ang II aumenta significativamente la permeabilidad glomerular en ratones, medida por la detección de FITC-policrorosa 70 en la orina de los ratones (media + SEM; n a 5; p < 0.004, probado por la prueba Kruskal-Wallis). Se hicieron referencia a las concentraciones de FITC-policrorosa 70 en la orina a las concentraciones de creatinina en orina. Las columnas blancas (0 min) representan los niveles FITC-policrose 70 antes del inicio de la estimulación Ang II, las columnas negras (60 min) representan FITC-policrorosa 70 niveles 60 min después del inicio de la estimulación Ang II, y las columnas grises (120 min o +60 min) después de un 60 min adicionales de estimulación Ang II o 60 min de lavado Ang II. (B) La presión arterial sistólica fue monitoreada por el método de manguito de cola (media + SEM). No se observaron diferencias significativas en la presión arterial entre los grupos tratados con Ang II. (C) La polisurosa 70 y la polisucrosa 70 FITC no alteran significativamente la permeabilidad glomerular en ratones. Ang II aumenta significativamente la permeabilidad glomerular en ratones (media + SEM; n x 7, p < 0,005). Esta cifra ha sido modificada de Konigshausen et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplemental Figure 1
Figura suplementaria 1: Diagrama esquemático de la colocación de un catéter urinario en ratones hembra. Vista lateral del abdomen del ratón. (A) El catéter marcado y lubricado se introduce 3 mm en el ostium uretral externo de un ratón hembra. El eje craneocaudal de la uretra está paralelo con el catéter. La tensión cuidadosa en la parte inferior del abdomen con el dedo índice izquierdo facilita la introducción del catéter en el ostium uretral externo. (B) El catéter se gira 180o hacia la cola del ratón. La punta del catéter permanece 3 mm dentro del ostium uretral externo. (C) El catéter ahora se introduce 7 mm más en la vejiga. La dirección del catéter está alineada con la columna vertebral murina. (D) Vista ventral del abdomen del ratón. El catéter se introduce 3 mm en el ostium uretral externo de un ratón hembra. (E) Después de girar el catéter 180o, se introduce 7 mm más en la vejiga del ratón. La dirección del catéter está alineada con la columna vertebral murina. Esta cifra ha sido modificada de Reis et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El método presentado permite al investigador probar la permeabilidad glomerular en ratones de una manera muy sensible utilizando un trazador. Con este método, los aumentos a corto plazo en la permeabilidad glomerular se pueden diagnosticar utilizando sólo pequeñas cantidades de orina. Los pasos más críticos para dominar con éxito esta técnica son 1) el desarrollo de la experiencia manual en cirugía de ratón, especialmente en la cannulación de una vena central, 2) la colocación del catéter urinario sin dañar la mucosa, y 3) la experiencia manual en el manejo Placas de 384 pocillos con pequeños volúmenes de muestras.

Al colocar el catéter venoso central, es esencial que el catéter no penetre en la vena yugular. Para evitar la penetración, recomendamos poner tensión en la vena yugular con una ligadura distal (ver paso 2.2.7) y levantar la vena yugular con pinzas finas para extender el lumen de la vena yugular. Para mantener el sitio de inserción pequeño, trate de evitar movimientos bruscos durante la inserción del catéter y siempre asegúrese de la mejor vista del campo quirúrgico mediante la eliminación de tejido adicional. El paso más crítico en la colocación del catéter urinario es la inserción final en la vejiga. Si se siente resistencia, recomendamos comenzar de nuevo desde el principio para no causar pistas falsas y lesiones a la mucosa. La rotación del catéter, la lubricación y los movimientos suaves, así como el entrenamiento, ayudan en casos difíciles7.

FITC-policrorosa 70 es un polímero fluorescentemente etiquetado, ramificado y reticulado desacarosa y epiclorohisdrina 9. Se comporta en solución como una molécula globular con forma esférica y con unabaja asimetría pero con una deformabilidad molecular 9. Al igual que otras moléculas de sacarosa, FITC-policrorosa 70 se filtra por el glomérulo y no se reabsorbe en el sistema tubular4. Para evitar moléculas FITC libres en la perfusión, marcamos la solución FITC-policrose 70 antes de su aplicación a los ratones. Es posible almacenar moléculas de FITC-policrorosa-policrorosa"70 dializadas a -20 oC durante meses. Como FITC-policrorosa 70 se aplica por vía intravenosa en este y otros protocolos, es esencial que ninguna sangre contamine las muestras de orina. Por lo tanto, el catéter urinario debe colocarse con precaución y se deben evitar las sustancias anticoagulantes dentro del experimento. La curva estándar para FITC-policrorosa 70 se disuelve en el grupo de orina del ratón para obtener los resultados más precisos. Debido a las diferencias de concentración en la orina en diferentes puntos de tiempo experimentales y entre grupos, las concentraciones de FITC-policrorosa 70 deben hacerse referencia a un marcador en la orina que refleje la concentración de orina (por ejemplo, creatinina). Es poco probable que se injera en un ensayo enzimático la interferencia de la fluorescencia DE LA POLIcrorosa 70 de FITC con la medición de la creatinina en un ensayo enzimático.

El análisis de la fluorescencia FITC-policrorosa 70 debe realizarse en placas negras de 384 pocillos, ya que se pueden medir pequeños volúmenes de orina de 5 ml en estas placas. No recomendamos reutilizar los mismos pozos dentro de las placas de 384 pocillos, incluso después de lavar las placas, ya que la fluorescencia todavía es medible. Como las burbujas interfieren con la lectura de la fluorescencia, las placas deben ser centrifugadas antes del análisis. Alternativamente, las burbujas se pueden destruir manualmente con la punta de una pipeta.

El uso de polisucrosis para probar la permselectividad glomerular se describió hace casi 40 años10. La polisucrosa con etiqueta fluorescente se ha investigado en estudios de lesión glomerular casi exclusivamente en ratas en los últimos años4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Esto puede tener razones anatómicas debido a procedimientos quirúrgicos más fáciles en ratas que en ratones. En ratas, la uretrotomía se utiliza para obtener muestras de orina4,5,9,12,13,14,21. Para analizar muestras de plasma y orina, las sondas se someten a cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento4,5,9,12,13,14 ,21. Además, la tasa de filtración glomerular (GFR) se mide por ácido tetraacético radiactivo 51Cr-etilendiamina (EDTA)4,5,9,12,13 ,14,21. Dos estudios anteriores han aplicado FITC-policrorosa 70 en ratones5,6. En ratones, se introduce un catéter urinariosuprapúbico en la vejiga 6,20. Las sondas urinarias y plasmáticas se someten a filtración en gel antes del análisis de la fluorescencia FITC-policrorosa 70. Similar a la de las ratas, GFR se analizó a través de la radiactividad6,20. La segunda publicación relativa a la aplicación de FITC-polisurosa 70 en ratones utiliza un modelo de permeabilidad peritoneal y,por lo tanto, no analiza la orina del ratón para LA fluorescencia 22 de FITC-polisurosa. Por lo tanto, el método presentado se modificó para facilitar el muestreo y el análisis de orina. Las muestras de orina se pueden obtener fácilmente a través de un catéter urinario transuretral no invasivo. El análisis de orina para la fluorescencia FITC-policrorosa 70 se realiza sin ninguna cromatografía de exclusión de alto rendimiento o filtración de gel previa. Al hacer referencia a la fluorescencia DE FITC-policrorosa 70 a la creatinina de orina del ratón, no es necesaria la medición de la GFR con un ensayo radiactivo.

Los aumentos en la presión arterial mejoran la permeabilidad glomerular. Por lo tanto, el control de la presión arterial es esencial mientras se investiga la permeabilidad glomerular. Las mediciones más precisas de la presión arterial en ratones se realizan a través de un catéter arterial central23 que necesita heparinización del catéter para evitar la coagulación. Hemos experimentado problemas con la hematuria después de la heparinización en dosis bajas y la colocación del catéter urinario. Por lo tanto, decidimos realizar la técnica de manguito de cola para medir la presión arterial, que no es invasiva y no necesita heparinización. Dependiendo de la profundidad de la anestesia, el control de la presión arterial con el método de manguito de cola a veces es un desafío. Las membranas de presión arterial deben revisarse con antelación y la posición del ratón debe optimizarse antes de la grabación de la presión arterial.

Además de los desafíos en la medición de la presión arterial, esta técnica también se limita mediante la producción de unidades arbitrarias de FITC-policrorosa 70. Hasta ahora, esta técnica sólo ha sido investigada en animales y, por lo tanto, su relevancia para el filtro glomerular humano aún se desconoce. Los intervalos de tiempo para investigar los aumentos en la permeabilidad glomerular dependen de la producción de orina del ratón. Por lo tanto, los aumentos a muy corto plazo en la permeabilidad glomerular (en minutos) pueden perderse debido a la falta de producción de orina de ratón. En este protocolo, FITC-policrorosa 70 se normaliza a la creatinina de orina, que se elimina de la sangre principalmente a través de la filtración glomerular, pero también por secreción tubular proximal. Esto introducirá un error al estimar la permeabilidad glomerular utilizando este método, reduciendo el aclaramiento fraccionario medido de polisucrosa24.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Christina Schwandt, Blanka Duvnjak y Nicola Kuhr por su excepcional asistencia técnica y al Dr. Dennis Sohn por su ayuda con el escaneo de fluorescencia. Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 a L.C.R. y L.S. El fundero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for neck cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery 
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
BD Insyte Autoguard BD 381823  urinary catheter
Multimode Detector DTX 880 Beckman Coulter plate reader
384 well microtiterplate Nunc 262260 384 well platte
Creatinine Assay Kit Sigma-Aldrich MAK080 to measure creatinine concentration
96 well plate Nunc 260836 for creatinine assay 
FITC-labeled polysuccrose 70 TBD Consultancy FP70 FITC-ficoll
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525 used to test glomerular permeability
BP-98A Softron for blood pressure measurement
OTS 40.3040 Medite 01-4005-00 heating plate for mouse surgery
Instillagel 6mL Farco-Pharma GmbH for urinary catheter
Exacta Aesculap GT415 shaver

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References

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Medicina Número 150 Permeabilidad glomerular polisucrosa trazador albúmina catéter urinario del ratón catéter venoso central del ratón diafragma de hendidura glomérulo
Medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70
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Königshausen, E., Potthoff, S.… More

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Woznowski, M., Stegbauer, J., Rump, L. C., Sellin, L. Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70. J. Vis. Exp. (150), e59064, doi:10.3791/59064 (2019).

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