Summary
Hier presenteren we een protocol voor het testen van de glomerulaire permeabiliteit in muizen met behulp van een zeer gevoelige, niet-radioactieve Tracer. Deze methode maakt repetitieve urine analyses mogelijk met kleine urine volumes.
Abstract
Het verlies van albumine in de urine (albuminurie) voorspelt cardiovasculaire uitkomst. Onder fysiologische omstandigheden worden kleine hoeveelheden albumine gefilterd door de glomerulus en weer geabsorbeerd in het buis systeem tot de absorptie limiet is bereikt. Vroege verhogingen van pathologische albumine filtratie kunnen dus worden gemist door het analyseren van albuminurie. Daarom lijkt het gebruik van tracers voor het testen van glomerulaire permselectiviteit voordelig. Fluorescently gelabeld Tracer fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-poly sucrose (d.w.z. FITC-Ficoll), kan worden gebruikt om glomerulaire permselectiviteit te bestuderen. FITC-poly sucrose moleculen worden vrij gefilterd door de glomerulus maar niet geabsorbeerd in het buis systeem. Bij muizen en ratten is FITC-poly sucrose onderzocht in modellen van glomerulaire permeabiliteit door gebruik te maken van technisch complexe procedures (d.w.z. radioactieve metingen, hogedrukvloeistofchromatografie [HPLC], gel filtratie). We hebben een FITC-polysucrose Tracer-gebaseerd protocol aangepast en vergemakkelijkt om vroege en kleine stijgingen van de glomerulaire permeabiliteit te testen op FITC-poly sucrose 70 (grootte van albumine) bij muizen. Deze methode maakt repetitieve urine analyses mogelijk met kleine urine volumes (5 μL). Dit protocol bevat informatie over hoe de Tracer FITC-poly sucrose 70 intraveneus wordt aangebracht en urine wordt opgevangen via een eenvoudige urinaire katheter. Urine wordt geanalyseerd via een fluorescentie plaat lezer en genormaliseerd naar een urine concentratie marker (creatinine), waardoor technisch complexe procedures te vermijden.
Introduction
Functionele of structurele defecten binnen de glomerulaire filtratie barrière verhogen glomerulaire permeabiliteit aan albumine, wat resulteert in de detectie van albumine in de urine (albuminurie). Albuminurie voorspelt cardiovasculaire uitkomst en is een belangrijke marker voor glomerulaire letsel1. Zelfs lage niveaus van albuminurie, liggend binnen het normale bereik, worden geassocieerd met een verhoogd cardiovasculair risico1.
Onder fysiologische omstandigheden, wordt albumine gefilterd door de glomerulus en wordt bijna volledig geabsorbeerd in het buisvormige systeem2,3. Bij muizen wordt de detectie van albumine in de urine gewoonlijk uitgevoerd door een albumine-enzym-gebonden immunosorptie test (ELISA) van 24 uur urine verzameling. Als urine uit een urine verzameling van 24 uur of spot urine wordt gebruikt, kunnen kleine verschillen in albumine concentraties worden gemist als gevolg van gevoeligheids problemen. De meeste onderzoekers gebruiken daarom diermodellen waarin albuminurie wordt geïnduceerd door robuuste nierschade als gevolg van toxines, drugs en nierchirurgie.
Daarom is de bevinding van een gevoelige methode voor het detecteren van kleine en voorbijgaande veranderingen in de glomerulaire permeabiliteit zeer belangrijk voor het veld. Rippe et al. hebben een rat-model gepresenteerd om de glomerulaire permeabiliteit te testen door een fluorescently gelabelde Tracer toe te passen, namelijk FITC-polysucrose 70 (d.w.z. FITC-Ficoll 70), op de grootte van albumine4. De Tracer applicatie maakt het testen van korte termijn veranderingen in glomerulaire permeabiliteit (binnen minuten) en is zeer gevoelig4. Twee studies hebben de Tracer methode gebruikt bij muizen5,6. Ondanks de voordelen heeft deze methode helaas nadelen: het is technisch zeer complex, radioactief en invasief. Verdere analyse van de urine wordt alleen bereikt door het gebruik van gel filtratie of grootte-uitsluiting HPLC5,6.
In dit document presenteren we een alternatieve, gevoelige, niet-radioactieve en snelle methode om de glomerulaire permeabiliteit bij muizen te meten met fluorescently gelabelde FITC-polysucrose 70. Door de invoering van een transurethrale katheter, urine inzameling is minder invasief dan blaas punctie, urethrotomie, en suprapubische katheter toepassing, en laat urine inzameling ten minste elke 30 min. urine analyse wordt uitgevoerd vanuit kleine hoeveelheden (5μL) met fluorescerende plaat lezer. Tracer concentraties in de urine worden genormaliseerd naar creatinine concentraties in de urine met behulp van een enzymatische creatinine test.
Daarom biedt deze nieuwe methode een gevoelig hulpmiddel om vroege glomerulaire letsels te bestuderen met verhoogde glomerulaire permeabiliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De onderzoeken zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen die zijn uiteengezet in de gids voorzorg en gebruik van proefdieren (US National Institutes of Health Publication No. 85-23, herziene versie van 1996). Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante institutionele goedkeuringen (staatsbestuur Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] referentienummer 84-02.04.2012. A397).
1. voorbereiding van instrumenten, oplossingen en apparatuur
- Reconstitueer FITC-poly sucrose 70 met 0,9% steriel natriumchloride (NaCl) tot een eindconcentratie van 10 mg/mL (d.w.z. 100 mg in 10 mL NaCl).
- Dialyze FITC-poly sucrose 70 oplossing voor het verwijderen van vrije FITC moleculen 's nachts bij 4 °C (molecuulgewicht cut-off [MWCO] bij 10.000). Gebruik 1 L 0,9% steriele NaCl per 10 mL FITC-polysucrose 70 onder constant roeren. Beschermen tegen licht. Aliquot de gedialyseerde FITC-poly sucrose 70 en bewaar deze bij-20 °C.
- Voeg voor de FITC-poly sucrose 70 bolus 4 μL 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 oplossing toe aan 996 μL 0,9% NaCl (de uiteindelijke concentratie van FITC-polysucrose 70:40 μg/mL).
- Voeg voor de oplossing voor infusie van de equilibratie 20 μL 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 oplossing toe aan 9,98 mL van 0,9% steriele NaCl die tot een eindconcentratie van 20 μg/mL heeft.
- Voeg voor de experimentele oplossing geneesmiddelen of stoffen toe aan de infuusoplossing (bijv. voor angiotensine II [ang II] [100 ng/kg/min] voor een 25 g muis, voeg 3 μL ang II toe van een 1 mM oplossing).
- Voor de operatie, bereiden een scheerapparaat, twee chirurgische klemmen, een paar chirurgische schaar, twee pincet, twee fijne pincet, een paar fijne schaar, en swabs. Bereid 2 10 cm zijde draden (4-0 tot 6-0) voor ligatie procedures.
- Voor de plaatsing van een centrale veneuze katheter, bereid een 10 mL spuit met een 21 G naald. Plaats de punt van de naald in een 30 cm lange katheter (met een binnendiameter [ID] van 0,58 mm). Sluit de 0,58 mm katheter aan op een 10 cm katheter (met een ID van 0,28 mm). Snijd de punt van de kleinere katheter schuin om een scherpe tip die wordt ingebracht in de halsader ader te creëren.
- Bereid de anesthesie (d.w.z. Intraperitoneale anesthesie ketamine, 100 mg/kg lichaamsgewicht, en xylazine, 5 mg/kg lichaamsgewicht).
- Bereid een angio katheter van 22 G door de naald te verwijderen en de katheter 1 cm van de punt te markeren. Verwarm het verwarmingspaneel voor op 37 °C.
- Bereid een bloeddruk apparaat en verander het bloeddrukmeetmembraan indien nodig.
2. voorbereidingsfase
- Urine katheter
Opmerking: sectie 2,1 volgt het protocol zoals beschreven door reis et al.7. Figuur 1 en aanvullend figuur 1 tonen de plaatsing van een urinaire katheter bij vrouwelijke muizen.- Anesthetiseer de muis met ketamine/xylazine (zie stap 1,8). Gebruik de toe-pinch test om de juiste anesthesie te bevestigen. Om anesthesie te handhaven, herhaalt u de anesthesie (bv, met de helft van de dosering) na 60 min. juiste anesthesie wordt bevestigd als teen pinch test niet resulteert in reflex optrekt.
Opmerking: vrouwelijke FVB-muizen worden in dit protocol gebruikt. - Plaats de muis in de dorsale ligpositie op een 37 °C verwarmingskussen. Draai de onderbuik vast en vind het urethrale buurt (bijv. onder een Microscoop).
- Gebruik het plastic deel van de katheter van een 22 G angio katheter en smeer het met xylocaine gel. Introduceer het zorgvuldig 3 mm in de urethrale buurt terwijl parallel aan de distale urethrale as (Figuur 1a).
- Draai de bovenkant van de angiocatheter 180 ° door de punt in het urethrale buurt te houden en de as van de urethra te behouden (Figuur 1b).
- Introduceer de katheter 7 mm verder in de muis zodat deze in de blaas wordt geplaatst (figuur 1c). Forceer de katheter niet meer dan weerstand. Corrigeer de positie van de katheter vanaf het begin als de weerstand wordt gevoeld. Houd er rekening mee dat als de positie van de urine katheter correct is, urine mogelijk al in de katheter verschijnt.
- Plaats een 1,5 mL bruine buis over de bovenkant van de angio katheter om de urine te verzamelen. Breng 1 mL 0,9% NaCl subcutaan aan om de urineproductie te verbeteren.
- Anesthetiseer de muis met ketamine/xylazine (zie stap 1,8). Gebruik de toe-pinch test om de juiste anesthesie te bevestigen. Om anesthesie te handhaven, herhaalt u de anesthesie (bv, met de helft van de dosering) na 60 min. juiste anesthesie wordt bevestigd als teen pinch test niet resulteert in reflex optrekt.
- Centraal veneuze katheter
- Scheer de nek van de muis en plaats hem in de ligigheid met het hoofd naar de chirurg. Hyperextend het hoofd van de muis met een tape.
- Desinfecteer de nek met 70% isopropanol. Maak een kleine huid incisie (5 mm) onder de kaaklijn, met behulp van een pincet en een schaar. Snijd de huid ongeveer 1 cm in de richting van het borstbeen tot het midden van het borstbeen is bereikt.
- Ontleden de huid voorzichtig aan de rechterkant van de nek met een schaar. Maak een rechthoekige incisie van de huid aan de rechterkant van de muis om het zachte weefsel van de nek bloot. Gebruik een schaar en een pincet. Bevestig de huid kleppen met twee klemmen.
Opmerking: de halsader ader loopt langs de linkerzijde van de schildklier of wordt lichtjes bedekt door de rechter kwel van de schildklier. Na deze stap, gebruik een Microscoop voor chirurgie. - Stel de halsader ader zorgvuldig bloot door een stompe voorbereiding, met behulp van de punt van de fijne pincet. Voorkom letsel aan ader takken.
Opmerking: het kan nodig zijn om weefsel te verwijderen met een fijne schaar. Wees voorzichtig bij het gebruik van een schaar om weefsel te verwijderen omdat het het risico op bloedingen verhoogt. - Plaats en sluit een ligatuur met een zijde draad (4-0 tot 6-0) aan het distale deel van de zichtbare halsader ader (in de richting van het hoofd van de muis). Leg de spanning op de ligatuur door de zijde draad te bevestigen met een tape om een lichte spanning op de jugulaire ader te garanderen. Maak een ligatuur rond het proximale deel van de halsader ader.
- Vul de katheter met de oplossing voor infusie van de equilibratie (zie stap 1,4) en bevestig de katheter met een tape zodat de katheter de halsader ader uitlijnt. Controle voor bellen om te voorkomen dat de lucht embolie.
- Til de halsader ader met fijne pincet op de plaats van inbrengen (de insertie plaats is 1 – 2 mm proximale van de ligatuur). Lijn de slang parallel met de halsader ader. Punctie de halsader ader, gericht op het lumen, en insert voor ongeveer 2 – 4 mm, parallel aan de as van de halsader ader. Vermijd stevige bewegingen.
- Sluit de ligatuur om de katheter te fixeren. Controle op dichtheid van de ligatuur door de Microscoop zorgvuldig te bekijken. Plaats een vochtige wattenstaafje over de plaats van de operatie.
- Bloeddrukmeting
- Plaats de tail-Cuff aan de onderkant van de muis staart terwijl de muis in dorsale recumbency legt. Start de metingen en herhaal ze 10x per tijdspunt. Bouw een gemiddelde van de metingen.
- Pas de positie van de staart-manchet als bloeddruk metingen lijken niet correct en valse gegevens worden geproduceerd.
3. equilibratie fase
- Verander de urine opvang buis voordat de evenwichts fase begint en plaats het op ijs.
- Introduceer een spuit van 10 mL gevuld met FITC-evenwichts fase oplossing (zie stap 1,4) met een naald van 21 G en de grotere katheter (met een ID van 0,58 mm) en plaats deze in de spuitpomp.
- Vouw een wattenstaafje en zet het rond de kleine-vat katheter (met een id van 0,28 mm) die wordt ingebracht in de halsader ader. Leg de katheter in het wattenstaafje. Plaats een klem over het wattenstaafje af te schaffen retrograde bloedtoevoer of lucht embolie. Sluit een 27 G naald aan met een 1 mL spuit gevuld met de FITC bolus tot aan het einde van de kleine katheter.
- Open de klem en breng de FITC bolus aan (100 μL). Sluit de klem opnieuw en verbind de grotere katheter met de kleinere katheter. Start de spuitpomp met 0,008 mL/min (0,480 mL/h). Ga door met de infusie voor 60 min.
4. experimentele fase
Opmerking: in deze fase kan het effect van geneesmiddelen op glomerulaire permselectiviteit worden onderzocht.
- Verander de urinebuis (tijdpunt 0 min) naar een andere 1,5 mL bruine buis. Plaats een wattenstaafje rond de kleine katheter en sluit een klem zoals aangegeven in stap 3,3.
- Koppel de grote katheter los van de katheter. Verander de spuiten in de experimentele fase oplossingen (zie stap 1,5). Laat de infusiepomp draaien zodat de grote katheter gevuld is met de equilibratie oplossing.
- Sluit de katheters opnieuw aan terwijl u de lucht embolie vermijdt en open de klem. Start de spuitpomp op 0,008 mL/min.
- Ga door met het uitvoeren van de spuitpomp voor 60 min en verzamel daarna de urine in de urinebuis (urine 60 min). Plaats de urinebuis op ijs.
- Offer de muis door cervicale dislocatie tijdens de anesthesie. Voorafgaand aan de verwijdering van de muis wordt waargenomen gedurende 5 minuten om ervoor te zorgen dat het dood is.
5. urine analyse
-
Fluorescentie meting
- Ontdooi de urine pool en Verdun deze 1:10 met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
Let op: de urine pool is een plas van urine die is verzameld van gezonde muizen in een 12 – 24 h urine collectie in een metabole kooi. - Bereid normen voor de fluorescentie meting. Neem 10 bruine 1,5 mL tubes en label ze voor Blank (1:10 verdunde urine pool) en de volgende concentraties FITC-poly sucrose 70 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 en 160 μg/mL).
- Pipet 246 μL verdund urine zwembad in een bruine buis van 1,5 mL en voeg 4 μL van de FITC-polysucrose 70 voorraad concentratie toe (zie stap 1,1) om een eindconcentratie van 160 μg/mL FITC-polysucrose 70 te krijgen. Pipet 100 μL van de verdunde urine pool in alle andere buisjes.
- Verdun 1:2 door Pipetteer 100 μL van de 160 μg/mL FITC-poly sucrose 70 buis in de 80 μg/mL buis en ga verder met de andere concentraties. Verzeker de juiste mengsel van de verdunde concentraties (bijv. door de buis te vortexeren voordat u doorgaat).
- Verdun de muis urine monsters (0 min, 60 min) 1:10 met verdund urine zwembad.
- Pipetteer 5 μL van elke standaard FITC-poly sucrose 70-concentratie en van de urine monsters van de muis als triplicaten in een zwarte 384-goed plaat. Centrifugeer de plaat bij 1.000 x g gedurende 15 s om bubbels te voorkomen.
- Analyseer de 384-put plaat in een plaat lezer. Voer excitatie uit op 496 nm en meet de fluorescentie bij 525 nm.
- Ontdooi de urine pool en Verdun deze 1:10 met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
-
Creatinine meting
- Volg de instructies van de fabrikant. Bereid in het kort de creatinine normen voor door 10 μL van de 100 mM creatinine standaardoplossing met 990 μL creatinine assay buffer te verdunen om een standaardoplossing van 1 mM te bereiden.
- Voeg 0, 2, 4, 6, 8 en 10 μL van de 1 mM creatinine standaardoplossing toe aan een 96-put om respectievelijk 0, 2, 4, 6, 8 en 10 nmol/well-normen te genereren. Voeg een creatinine assay buffer toe aan elke put om het volume naar 50 μL te brengen.
- Bereid de reactie mixen door een creatinine test buffer van 42 – 44 μL, 2 μL creatinase, 2 μL creatininase, 2 μL creatinine enzym mengsel en 2 μL creatinine sonde toe te voegen. Gebruik voor de blanco 44 μL creatinine assay buffer, 2 μL creatinase, 2 μL creatinine enzym mengsel en 1 – 2 μL creatinine sonde.
- Voeg 50 μL van de juiste reactiemix toe aan elk goed in de 96-put en inbroed het voor 60 min op een horizontaal Shaker bij 37 °C. Bescherm de plaat tegen licht tijdens de incubatie. Meet de extinctie op 570 nm op een plaat lezer.
- Bereken de creatinine concentraties door de blanco waarde van alle metingen af te trekken. Het resultaat zal de eenheid nanomoles/microliter. Vermenigvuldig de concentratie van creatinine door het molecuulgewicht van creatinine (113,12 ng/nmol) om de eenheid nano grammen/microliter te ontvangen.
6. gegevensanalyse
- Bereken de FITC-poly sucrose 70 urine concentratie uit de standaard curve.
- Referentie de FITC-poly sucrose 70 urine concentraties naar creatinine concentraties in het representatieve urinemonster.
- Referentie de urine 60 min. monsters naar urine 0 min. monsters van controles en behandelde muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals afgebeeld in Figuur 2, is de methode om de glomerulaire permeabiliteit bij muizen te testen opgebouwd in drie fasen. De eerste fase wordt de voorbereidingsfase genoemd, waarin een urine katheter en een centrale veneuze katheter worden geplaatst. De tweede fase wordt de evenwichts fase genoemd, beginnend met een intraveneuze bolusinjectie van FITC-poly sucrose 70 en gevolgd door de continue infusie van FITC-polysucrose 70 voor 60 min. De laatste fase wordt de experimentele fase genoemd. In deze fase wordt de infusie van FITC-poly sucrose 70 voortgezet en kunnen geneesmiddelen of andere stoffen worden getest om de glomerulaire permeabiliteit te beïnvloeden. Urine wordt verzameld aan het einde van elke fase.
Om de glomerulaire permeabiliteit binnen dit Tracer-model te onderzoeken, is het essentieel om een urine katheter goed te plaatsen en zonder het slijmvlies te inwonden. De plaatsing van een urine katheter in een vrouwelijke muis blaas wordt aangetoond in Figuur 1. De katheter wordt 3 mm in het urethrale ostium geplaatst, parallel aan de craniocaudale urethrale as (Figuur 1a). De katheter is 180 ° in de richting van de staart van de muis (Figuur 1b) en introduceerde 7 mm verder in de blaas, parallel aan de Murine wervelkolom (figuur 1c, D).
Zoals hierboven beschreven, eerdere methoden voor het testen van de glomerulaire permeabiliteit in muizen gebruikt HPLC om FITC-polysucrose 70-signalen uit urine monsters5,6te zuiveren. Omdat deze methode fluorescentie meting gebruikt zonder een eerdere zuivering van de Tracer, zijn PBS, muis urine en FITC-poly sucrose 70 in muis urine geanalyseerd. Figuur 3a toont de fluorescentie scan van PBS met een fluorescentie piek bij 325 nm, wat een effect lijkt te zijn van de excitatie flits bij 290 nm. De fluorescentie scan van inheemse muis urine vertoont een maximale fluorescentie bij 395 nm (Figuur 3b). FITC-poly sucrose 70 opgelost in muis urine geeft een maximum aan fluorescentie bij 525 nm (figuur 3c, D). Figuur 3c laat zien dat muis urine de fluorescentie meting van FITC-poly sucrose 70 in muis urine niet verstoort. Toenemende concentraties FITC-poly sucrose 70 vertonen een verhoogde intensiteit van de fluorescentie (figuur 3e).
Om te bewijzen dat deze methode in staat is om verschillen in glomerulaire permeabiliteit te detecteren, werd ang II toegepast in de experimentele fase van het model. Ang II verhoogde de glomerulaire permeabiliteit bij muizen 60 min na een continue toediening in niet-bloeddruk-relevante doseringen (figuur 4a, B). De toename van de glomerulaire permeabiliteit als gevolg van ang II kan worden geblokkeerd door een ang II-receptor blocker (ARB), namelijk Candesartan (figuur 4a). Ang II wegwassende werking verlaagde glomerulaire permeabiliteit (figuur 4a). De bloeddruk werd gemeten via de tail-Cuff methode en er werden geen significante verschillen tussen de groepen vertoond (figuur 4b). Poly sucrose 70-en FITC-poly sucrose 70-geïnfundeerde dieren dienen als controle voor FITC-polysucrose 70-en ang II-behandelde dieren (figuur 4c).
Figuur 1: plaatsing van een urine katheter bij vrouwelijke muizen. Laterale weergave van de buik van de muis. A) de gemarkeerde en gesmeerde katheter wordt 3 mm in het uitwendige urethrale buurt van een vrouwelijke muis geïntroduceerd. De craniocaudale as van de urethra is parallel met de katheter. Zorgvuldige spanning op de onderbuik met de linker wijsvinger vergemakkelijkt de introductie van de katheter in de uitwendige urethrale ostium. B) de katheter is 180 ° naar de staart van de muis gedraaid. De punt van de katheter blijft 3 mm binnen de uitwendige urethrale ostium. C) de katheter wordt nu 7 mm verder in de blaas geïntroduceerd. De richting van de katheter is uitgelijnd met de Murine wervelkolom. D) ventrale weergave van de buik van de muis. De katheter wordt 10 mm in de muis geplaatst. (E) urine verschijnt met een correcte inbrenging in de blaas. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Schematische illustratie van de experimentele procedures op een tijdlijn. Na narcose van de muis wordt een urine katheter geplaatst. De centrale veneuze katheter wordt geïmplanteerd en de baseline urine wordt verkregen (0 min). Daarna wordt de FITC-poly sucrose 70 bolus aangebracht via de centrale veneuze katheter en een continue infusie van FITC-polysucrose 70 wordt gestart. De evenwichts fase voor FITC-poly sucrose 70 duurt 60 min. urine wordt verzameld na de evenwichts fase (0 min) en voordat de experimentele fase begint. In deze fase kunnen geneesmiddelen of andere stoffen (zoals angiotensine II) worden toegepast. Aan het einde van de experimentele fase wordt urine verkregen voor analyse (60 min). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: fluorescentie van PBS en muis urine met en zonder FITC-poly sucrose 70. A) fluorescentie frequentie scan (excitatie van 290 nm, emissie van 325-700 nm) van PBS toont een signaal bij 325 nm, wat een effect lijkt te zijn van de excitatie flits bij 290 nm. (B) in de frequentie scan van muis inheemse urine (urine zwembad verdund op 1:10 en 1:20), er is een signaal met een maximum bij 395 nm, waarschijnlijk veroorzaakt door urine eiwit autofluorescentie. C) muis urine die FITC-poly sucrose 70 (40 μg/ml) bevat, toont een signaal piek bij 525 nm die de meting van de urine autofluorescentie niet verstoort. D) vergroting van de FITC-poly sucrose 70 fluorescentie piek, afhankelijk van de emissie golflengte. Er worden verschillende concentraties van FITC-poly sucrose 70 (1,25, 2,5, 5, 10, 20 en 40 μg/mL) weergegeven. E) toenemende FITC-poly sucrose 70-concentraties vertonen een toename van de intensiteit van de fluorescentie bij de emissie van 525 nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: angiotensine II (ang II) verhoogt de glomerulaire permeabiliteit. A) ang II verhoogt significant de glomerulaire permeabiliteit bij muizen, gemeten door FITC-polysucrose 70 detectie in de urine van de muizen (gemiddelde + SEM; n = 5; p < 0,004, getest door Kruskal-Wallis test). FITC-poly sucrose 70 concentraties in de urine werden verwezen naar creatinine concentraties in de urine. De witte kolommen (0 min) vertegenwoordigen FITC-poly sucrose 70 niveaus vóór de start van ang II stimulatie, de zwarte kolommen (60 min) vertegenwoordigen FITC-poly sucrose 70 niveaus 60 min na de start van ang II stimulatie, en de grijze kolommen (120 min of + 60 min) na een extra 60 min van ang II stimulatie of 60 min van ang II washout. B) de systolische bloeddruk werd gemonitord met de tail-Cuff Method (gemiddelde + SEM). Er werden geen significante bloeddruk verschillen waargenomen tussen de controlegroep en de met ang II behandelde groepen. C) poly sucrose 70 en FITC-poly sucrose 70 veranderen de glomerulaire permeabiliteit bij muizen niet significant. Ang II verhoogt de glomerulaire permeabiliteit bij muizen significant (gemiddelde + SEM; n = 7, p < 0,005). Dit cijfer is gewijzigd van Konigshausen et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: Schematisch diagram van de plaatsing van een urinaire katheter bij vrouwelijke muizen. Laterale weergave van de buik van de muis. A) de gemarkeerde en gesmeerde katheter wordt 3 mm in het uitwendige urethrale buurt van een vrouwelijke muis geïntroduceerd. De craniocaudale as van de urethra is parallel met de katheter. Zorgvuldige spanning op de onderbuik met de linker wijsvinger vergemakkelijkt de introductie van de katheter in de uitwendige urethrale ostium. B) de katheter is 180 ° naar de staart van de muis gedraaid. De punt van de katheter blijft 3 mm binnen de uitwendige urethrale ostium. C) de katheter wordt nu 7 mm verder in de blaas geïntroduceerd. De richting van de katheter is uitgelijnd met de Murine wervelkolom. D) ventrale weergave van de buik van de muis. De katheter wordt geïntroduceerd 3 mm in de uitwendige urethrale buurt van een vrouwelijke muis. (E) nadat de katheter 180 ° is gedraaid, wordt deze 7 mm verder in de blaas van de muis ingebracht. De richting van de katheter is uitgelijnd met de Murine wervelkolom. Dit cijfer is gewijzigd van reis et al.7. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde methode stelt de onderzoeker in staat om de glomerulaire permeabiliteit bij muizen op een zeer gevoelige manier te testen met behulp van een Tracer. Met deze methode, op korte termijn stijgingen van de glomerulaire permeabiliteit kan worden gediagnosticeerd met behulp van slechts kleine hoeveelheden urine. De meest kritieke stappen voor het succesvol beheersen van deze techniek zijn 1) ontwikkeling van handmatige expertise in muis chirurgie, vooral in de cannulatie van een centrale ader, 2) het plaatsen van de urine katheter zonder nadelige gevolgen voor het slijmvlies, en 3) handmatige expertise in de omgang 384-put platen met kleine hoeveelheden monsters.
Bij het plaatsen van de centrale veneuze katheter, is het essentieel dat de katheter niet doordringen in de halsader ader. Om penetratie te voorkomen, raden we aan om spanning op de jugulaire ader te zetten met een distale ligatuur (zie stap 2.2.7) en de halsader ader te tillen met fijne pincet om het lumen van de halsader ader uit te breiden. Om de insertie site klein te houden, proberen om bruto bewegingen te voorkomen tijdens het inbrengen van de katheter en altijd zorgen voor de beste weergave van het chirurgische veld door het verwijderen van extra weefsel. De meest kritieke stap in de plaatsing van de urine katheter is de laatste insertie in de blaas. Als weerstand wordt gevoeld, raden we aan om van het begin af aan te beginnen om geen valse sporen en letsel aan het slijmvlies te veroorzaken. Katheter rotatie, smering, en zachte bewegingen, evenals de opleiding, helpen in moeilijke gevallen7.
FITC-poly sucrose 70 is een fluorescently gelabeld, vertakt en kruislings gekoppeld polymeer van sucrose en epichloorhydrin9. Het gedraagt zich in oplossing als een bolvormig molecuul met een bolvormige vorm en met een lage vorm asymmetrie, maar met een moleculaire vervormbaarheid9. Net als andere sucrose-moleculen wordt FITC-poly sucrose 70 gefilterd door de glomerulus en niet hergeabsorbeerd in het buis systeem4. Om vrije FITC moleculen in de infusie te voorkomen, hebben we de FITC-polysucrose 70-oplossing gedialyseerd vóór toepassing op de muizen. Het is mogelijk om dialyzed FITC-poly sucrose 70 moleculen gedurende maanden bij-20 °C op te slaan. Aangezien FITC-polysucrose 70 in deze en andere protocollen intraveneus wordt toegepast, is het essentieel dat geen bloed de urine monsters vervuilt. Daarom moet de urine katheter met voorzichtigheid worden geplaatst en anticoagulerende stoffen binnen het experiment moeten worden vermeden. De standaard curve voor FITC-poly sucrose 70 wordt opgelost in de muis-urine pool om de meest nauwkeurige resultaten te krijgen. Als gevolg van concentratieverschillen in de urine op verschillende experimentele tijdspunten en tussen groepen, moeten FITC-polysucrose 70 concentraties worden verwezen naar een marker in de urine die de urine concentratie weerspiegelt (bijv. creatinine). Interferentie van FITC-poly sucrose 70 fluorescentie met de meting van creatinine in een enzymatische test is onwaarschijnlijk.
De analyse van FITC-poly sucrose 70 fluorescentie moet worden uitgevoerd in zwarte 384-put-platen, omdat kleine urine volumes van 5 μL in deze platen kunnen worden gemeten. We raden niet aan om dezelfde putten in de 384-Wells-platen opnieuw te gebruiken, zelfs na het wassen van de platen, omdat fluorescentie nog steeds meetbaar is. Omdat luchtbellen de fluorescentie meting verstoren, moeten de platen vóór analyse worden gecentrifugeerd. Als alternatief kunnen bellen handmatig worden vernietigd met de punt van een pipet.
Het gebruik van polysucroses om glomerulaire permselectiviteit te testen werd bijna 40 jaar geleden beschreven10. Fluorescently gelabelde poly sucrose is onderzocht bij glomerulaire letsel studies, bijna uitsluitend bij ratten in de afgelopen jaren4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Dit kan anatomische redenen hebben als gevolg van eenvoudigere chirurgische procedures bij ratten dan bij muizen. Bij ratten wordt urethrotomie gebruikt voor het verkrijgen van urine monsters4,5,9,12,13,14,21. Om plasma-en urine monsters te analyseren, worden sondes onderworpen aan een hoge prestatie-uitsluitings chromatografie4,5,9,12,13,14 ,21. Bovendien wordt de Glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) gemeten door radioactieve 51CR-ethyleendiamine tetraazijnzuur (EDTA)4,5,9,12,13 ,14,21. Twee eerdere studies hebben FITC-polysucrose 70 toegepast bij muizen5,6. Bij muizen wordt een suprapubische urine katheter geïntroduceerd in de blaas6,20. Urine-en plasma sondes worden onderworpen aan gelfiltratie vóór de analyse van FITC-poly sucrose 70 fluorescentie. Net als bij ratten werd GFR geanalyseerd via radioactiviteit6,20. De tweede publicatie betreffende de toepassing van FITC-polysucrose 70 bij muizen maakt gebruik van een model van peritoneale permeabiliteit en heeft daarom geen muis urine geanalyseerd voor FITC-poly sucrose 70 fluorescentie22. De gepresenteerde methode werd daarom aangepast om urine bemonstering en analyse te vergemakkelijken. Urine monsters kunnen gemakkelijk worden verkregen door middel van een niet-invasieve transurethrale urine katheter. Urine analyse voor FITC-poly sucrose 70 fluorescentie wordt uitgevoerd zonder voorafgaande High-Performance grootte uitsluitings chromatografie of gel filtratie. Door te verwijzen naar FITC-poly sucrose 70 fluorescentie naar muizen urine creatinine, is het meten van GFR met een radioactieve assay niet nodig.
Verhogingen van de bloeddruk verbeteren glomerulaire permeabiliteit. Daarom is de controle van de bloeddruk essentieel tijdens het onderzoeken van de glomerulaire permeabiliteit. De nauwkeurigste bloeddrukmetingen bij muizen worden uitgevoerd via een centrale arteriële katheter23 die heparinisatie van de katheter nodig heeft om stolling te voorkomen. We hebben problemen ondervonden met hematurie na lage dosis heparinisatie en urine katheter plaatsing. Daarom hebben we besloten om de tail-Cuff techniek uit te voeren om de bloeddruk te meten, wat niet-invasief is en geen heparinisatie nodig heeft. Afhankelijk van de diepte van de anesthesie, bloeddruk bewaking met de staart-manchet methode is soms uitdagend. Bloeddruk membranen moeten vooraf worden gecontroleerd en de positie van de muis moet worden geoptimaliseerd vóór de opname van de bloeddruk.
Naast uitdagingen in bloeddrukmeting wordt deze techniek ook beperkt door het produceren van willekeurige eenheden van FITC-poly sucrose 70. Tot nu toe is deze techniek alleen onderzocht bij dieren en daarom is de relevantie ervan voor het menselijke glomerulaire filter nog onbekend. Tijdsintervallen voor het onderzoeken van stijgingen van de glomerulaire permeabiliteit zijn afhankelijk van de productie van de muis urine. Daarom, zeer korte termijn verhogingen in glomerulaire permeabiliteit (in minuten) kan worden gemist als gevolg van het gebrek aan muis urineproductie. In dit protocol, FITC-poly sucrose 70 is genormaliseerd naar urine creatinine, die wordt verwijderd uit het bloed voornamelijk via glomerulaire filtratie, maar ook door proximale tubulaire secretie. Dit zal een fout introduceren bij het inschatten van de glomerulaire permeabiliteit met behulp van deze methode, waardoor de gemeten fractionele klaring van poly sucrose24wordt verminderd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Christina Schwandt, Blanka Duvnjak en Nicola Kuhr voor hun uitzonderlijke technische assistentie en Dr. Dennis Sohn voor zijn hulp bij de fluorescentie scan. Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP b18 tot L.C.R. en L.S. De Funder had geen rol in het studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
