Microelektrode impalement methode om membraan potentieel van een gecanuleerde middelste cerebrale slagader record
Summary
Het primaire doel van dit artikel is om de details van hoe het membraanpotentiaal (Vm) van het midden cerebrale slagader met behulp van de microelektrode impalement methode te bieden. De gecanuleerde middelste cerebrale slagader is geëquilibreerd te krijgen myogene Toon, en het schipmuur is Impaled met behulp van hoge weerstand microelektrodes.
Abstract
Membraanpotentiaal (Vm) van vasculaire gladde spiercellen bepaalt het vaartuig Toon en dus de bloedtoevoer naar een orgaan. Veranderingen in de expressie en functie van ionenkanalen en electrogenic pompen die te reguleren Vm in ziekte omstandigheden zou kunnen veranderen vm, vasculaire Toon, en de bloedstroom. Aldus, is een basisbegrip van Elektrofysiologisch en de methodes noodzakelijk om Vm in gezonde en zieke staten nauwkeurig te registreren essentieel. Deze methode kan moduleren Vm met behulp van verschillende farmacologische middelen te herstellen vm. Hoewel er verschillende methoden, elk met zijn voor-en nadelen, dit artikel biedt protocollen voor het opnemen Vm van gecanuleerde weerstand schepen zoals het midden cerebrale slagader met behulp van de microelektrode impalement methode. Middelste cerebrale slagaders zijn toegestaan om myogene Toon te krijgen in een myograph kamer, en het schipmuur is inpaled met behulp van hoge weerstand microelektrodes. Het Vm -signaal wordt verzameld via een elektrometer, gedigitaliseerd en geanalyseerd. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige lezing van de Vm van een vaatwand zonder beschadiging van de cellen en zonder de membraan weerstand te veranderen.
Introduction
Het membraanpotentiaal (Vm) van een cel verwijst naar het relatieve verschil van Ionische lading over het plasmamembraan en de relatieve permeabiliteit van het membraan naar deze ionen. De Vm wordt gegenereerd door de differentiële verdeling van ionen en wordt onderhouden door ionenkanalen en pompen. De ionenkanalen zoals K+, na+, en cl− dragen wezenlijk tot het rusten Vmbij. Vasculaire gladde spiercellen (VSMCs) Express meer dan vier verschillende soorten K+ kanalen1, twee soorten van voltage-gated CA2 + kanalen (VGCC)2, meer dan twee soorten cl− kanalen3, 4 , 5, op te slaan-bediend CA2 + kanalen6, Stretch-activated kation kanalen7,8, en electrogenic natrium-kalium ATPase pompen9 in hun plasmamembranen, die allemaal kunnen worden betrokken bij de regulering van Vm.
De Vm van VSMCs hangt af van lumen druk. In niet-drukvaten, Vm varieert van-50 tot-65 mv, echter, in onder druk gezette arteriële segmenten, vm varieert van-37 tot-47 MV10. Elevatie van intravasculaire druk oorzaken VSMCs te depolariseren11, vermindert de drempel voor VGCC opening, en verhoogt de calcium instroom bij te dragen tot de ontwikkeling van myogene Toon12. Integendeel, in passieve of niet-drukvaten, membraan hyperpolarisatie, als gevolg van hoge K+ kanaal activiteit, zal voorkomen dat VGCC van de opening, wat resulteert in een beperkte calcium binnenkomst en een daling van de intracellulaire calcium, bij te dragen tot minder vasculaire Toon13. Zo, Vm als gevolg van veranderingen in de lumen druk lijkt te spelen een essentiële rol in de vasculaire Toon ontwikkeling, en zowel VGCC en K+ kanalen spelen een cruciale rol in de regulering van Vm.
Vm varieert tussen Scheepstype en soort. Vm is-54 ± 1,3 mv in proefkonijn superieure mesenterica arteriële stroken14,-45 ± 1 mv in de rat midden cerebrale slagaders op 60 mmHg lumen druk12, en-35 ± 1 mv in rat parenchymale slagaders op 40 mmHg lumen druk15. De rust Vm opgenomen in ongestrekte rat lymfatische spier is-48 ± 2 MV16. Vm van cerebrale VSMCs is negatiever dan in perifere slagaders. Ter vergelijking, katachtige middelste cerebrale slagaders werden gemeld aan een Vm van ongeveer-70 mV hebben, terwijl mesenterica en kransslagaders werden gemeld te hebben-49 en-58 mv, respectievelijk17,18. Verschillen in de Vm over vasculaire bedden kunnen weerspiegelen de verschillen in de expressie en functie van ionenkanalen en electrogenic natrium-kalium pompen.
De verhogingen en de dalingen in Vm worden bedoeld als membraan depolarisatie en hyperpolarisatie, respectievelijk. Deze veranderingen in Vm spelen een centrale rol in vele fysiologische processen, met inbegrip van ionen-kanaal gating, cel signalering, spiercontractie, en actie potentiële propagatie. Bij een vaste druk, veroorzaken vele endogene en synthetische vaatverwijdende samenstellingen die K+ kanalen activeren membraan hyperpolarisatie, resulterend in vasodilatatie1,13. Omgekeerd, aanhoudende membraan depolarisatie is van vitaal belang in agonist-geïnduceerde of receptor-gemedieerde vasoconstrictie19. Vm is een kritische variabele die niet alleen reguleert CA2 + instroom door VGCC13 , maar ook van invloed op de release van CA2 + van interne winkels20,21 en CA2 +-gevoeligheid van het samentrekbaar apparaat22.
Hoewel er verschillende methoden om Vm record van verschillende soorten cellen, gegevens verzameld uit de microelektrode impalement methode van gecanuleerde schepen lijkt meer fysiologische dan de gegevens verkregen uit geïsoleerde VSMCs. Wanneer geregistreerd van geïsoleerde VSMC gebruikend huidige klem methodes, wordt Vm gezien als spontane voorbijgaande Hyperpolarizations in VSMCs24. Geïsoleerde VSMCs zijn niet in de syncytium, en de veranderingen in de reeks weerstand kan bijdragen tot de oscillerende gedrag van Vm. Aan de andere kant, oscillerende gedrag wordt niet waargenomen wanneer Vm is opgenomen van intacte schepen, waarschijnlijk te wijten aan cel-cel contact tussen VSMCs die in syncytium in de slagader en zijn gesommeerd door het hele schip leidt tot een stabiele Vm 24. aldus, is de meting van Vm van onder druk gezette schepen gebruikend standaard microelektrode impalement techniek vrij dicht bij de fysiologische voorwaarden.
Opname Vm van gecanuleerde schepen kunnen vitale informatie, aangezien vm van VSMCs die in syncytium is een van de belangrijkste determinanten van vasculaire Toon en de doorbloeding, en de modulatie van de v-m kan een manier om verwijden of vernauwen bloedvaten. Zo is het essentieel om te begrijpen van de methodologie die betrokken zijn bij de opname Vm. Dit artikel beschrijft intracellulaire opname van Vm van gecanuleerde middelste cerebrale slagaders (MCAs) met behulp van een microelektrode impalement methode. Dit protocol zal beschrijven hoe te bereiden MCAs, microelektrodes, het opzetten van de elektrometer en uitvoeren van de impalement methode om Vmrecord. Ook representatieve gegevens, gemeenschappelijke problemen die werden aangetroffen bij het gebruik van deze methode en mogelijke problemen worden besproken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel bevat de nodige stappen op het gebruik van een scherpe microelektrode impalement methode om Vm record van een gecanuleerde schip voorbereiding. Deze methode wordt veel gebruikt, en biedt een hoge kwaliteit, consistente opnames van Vm dat antwoord op een breed scala van experimentele vragen.
Sommige kritieke overwegingen en stappen voor probleemoplossing worden hier beschreven om het succes van de methode te garanderen. De kwaliteit van de micro-elektrode (de s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd deels ondersteund door subsidies van het intramurale support Research Program (IRSP) van UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) uitgereikt aan Anna Pabbidi.
Materials
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
- Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
- Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
- Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
- Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
- Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
- Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
- Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
- Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
- Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
- Coca, A., Garay, R. . Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , (1993).
- Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
- Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
- Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
- Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
- Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
- Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
- Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
- Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
- Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
- Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
- Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
- Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).
