שיטת החלוקה של מיקרו-אלקטרודה להקלטת פוטנציאל ממברנה מעורק מוחי אמצעי של קאננולוב
Summary
המטרה העיקרית של מאמר זה היא לספק פרטים כיצד להקליט פוטנציאל ממברנה (Vm) מעורק המוח האמצעי באמצעות שיטת החלוקה של המיקרואלקטרודה. העורק האמצעי של המוח הבינוני הוא בינוני כדי לצבור טון מיוגני, והקיר כלי מופד באמצעות מיקרואלקטרודות עמידות גבוהה.
Abstract
פוטנציאל ממברנה (Vm) של תאים וסקולרית חלקה שרירים קובע את הטון כלי ולכן זרימת הדם לאיבר. שינויים בביטוי ובתפקוד של ערוצי יונים ומשאבות אלקטרוגניים המסדירים Vm בתנאי מחלה עלול לשנות vm, הטון כלי דם, זרימת הדם. לפיכך, הבנה בסיסית של האלקטרופיזיולוגיה והשיטות הדרושות לתיעוד מדויק של Vm במדינות בריאות וחולות חיוניות. שיטה זו תאפשר Vm מאפטינג באמצעות סוכני תרופתי שונים כדי לשחזר vm. למרות שישנן מספר שיטות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות, מאמר זה מספק פרוטוקולים להקליט Vm מכלי התנגדות can, כמו עורק המוח האמצעי באמצעות שיטת החלוקה מיקרואלקטרודה. העורקים האמצעיים מורשים לצבור טון מיוגני בחדר מיוגרף, וקיר כלי הקיבול מופד באמצעות מיקרואלקטרודות עמידות גבוהה. האות Vm נאסף דרך מד חשמלית, סרוקים, ומנותח. שיטה זו מספקת קריאה מדויקת של Vm של קיר כלי מבלי לפגוע בתאים ומבלי לשנות את התנגדות הקרום.
Introduction
פוטנציאל הממברנה (Vm) של תא מתייחס להפרש היחסי של המטען היוני על פני קרום הפלזמה והחדירות היחסיות של הקרום ליונים אלה. ה-Vm מופק על ידי התפלגות דיפרנציאלית של יונים והוא מתוחזק על ידי ערוצי יונים ומשאבות. ערוצי יונים כגון K+, Na+, ו- Cl לתרום באופן משמעותיעל V מנוחה. תאי שריר וסקולריים חלקים (VSMCs) מבטאים יותר מארבעה סוגים שונים של K+ ערוצים1, שני סוגים של Ca מגודרת מתח2 + ערוצים (וומשפ)2, יותר משני סוגים של הערוצים Cl3, ד , 5, Ca מופעל החנות2 + ערוצים6, מתיחה מופעל ערוצי הקטיון7,8, ו אלקטרוגניים נתרן אשלגן משאבות atpase9 בקרום הפלזמה שלהם, כולם עשויים להיות מעורב בוויסות של Vm.
המבקרים של VSMCs תלויים בלחץ של לומן. בכלי שאינו מווסת, Vm משתנה מ-50 ל-65 mV, עם זאת, במקטעים עורקים בלחץ, Vm טווחים מ-37 כדי-47 mV10. העלאת הלחץ הintravascular גורמת ל-VSMCs להקטטת11, מקטינה את הסף לפתיחת ומדינת ומגבירה את הזרמת הסידן לפיתוח הטון היוגני12. להיפך, בכלי של פסיבי או לא בלחץ, היפרפולריזציה ממברנה, בשל פעילות גבוהה K+ ערוץ, תמנע vgcc ש מפתיחה, וכתוצאה מכך כניסת סידן מוגבלת ירידה סידן תאיים, תורם פחות וסקולרית מגוון13 כך, Vm בשל שינויים בלחץ לומן מופיע לשחק תפקיד חיוני בפיתוח הטון כלי דם, הן vgcc ו-K+ ערוצים לשחק תפקיד מכריע בוויסות של Vm.
Vm משתנה בין סוג כלי ומינים. Vm הוא-54 ± 1.3 mV ב החזיר גינאה מעולה רצועות עורק מצע14,-45 ± 1 mV בתוך העורקים התיכונה במוח באמצע בשנת 60 mmhg לומן12, ו-35 ± 1 mV ב החולדה בתוך העורק העכברוש בשנת 40 משעה לומן לחץ15. Vm מנוחה הקליט שריר לימפטי עכברוש לא מתוח הוא-48 ± 2 mV16. Vm של המוח VSMCs שלילי יותר מאשר בעורקים היקפיים. לעומת זאת, העורקים האמצעיים הביניים של חתולים דווחו להיות Vm של כ-70 mV, בעוד מסנטרמית ועורקים כליליים דווחו יש-49 ו-58 mV, בהתאמה17,18. הבדלים ב Vm על פני מיטות כלי הדם עשויים לשקף את ההבדלים בביטוי ותפקוד של ערוצי יונים ומשאבות אלקטרוגניים נתרן אשלגן.
עליות וירידות ב Vm מכונים דפולריזציה קרום ו hyperpolarization, בהתאמה. שינויים אלה ב-Vm לשחק תפקיד מרכזי בתהליכים פיסיולוגיים רבים, כולל ערוץ יון הערוצים, איתות התא, התכווצות שרירים, פעולה פוטנציאלית התפשטות. בלחץ קבוע, הרבה אנדוגני וחומרים סינתטיים vasodilator המפעילים K+ ערוצים לגרום היפרפולריזציה ממברנה, וכתוצאה מכך vasodשיער1,13. לעומת זאת, הממברנה הקרום המתמשכת היא חיונית ב אגוניסט-המושרה או קולטן בתיווך מתווך19. Vm הוא משתנה קריטי שלא רק מווסת את ca2 + זרם דרך vgcc13 אלא גם משפיע על שחרורו של ca2 + מחנויות פנימיות20,21 ו-ca2-רגישות של את מנגנון הקונאקטולה22
אמנם ישנן מספר שיטות כדי להקליט Vm מסוגי תאים שונים, נתונים שנאספו מהשיטה החלוקה של המיקרו אלקטרודה של כלי הקנוליום נראה פיזיולוגי יותר מאשר נתונים שהתקבלו VSMCs מבודדים. כאשר הוקלט מ VSMC מבודדים באמצעות שיטות התפס הנוכחי, Vm הוא נראה כמו היפרפולציות חולף ספונטנית ב Vsmc24. VSMCs מבודדים אינם בסינציציום, והשינויים בהתנגדות הסדרה עשויים לתרום להתנהגות הנדנוד של Vm. מצד שני, התנהגות מנדנוד לא נצפתה כאשר Vm נרשם מכלי שלמים, כנראה בגלל מגע תא תא בין VSMCs כי הם בתוך syncytium בעורק ומואבקים ברחבי הכלי המוביל V m יציבה 24. לפיכך, המדידה של Vm מכלי הלחץ באמצעות טכניקת החלוקה המיקרואלקטרודה הסטנדרטית קרובה יחסית לתנאים הפיזיולוגיים.
הקלטת Vm מכלי הקיבול יכול לספק מידע חיוני, מאז Vm של vsmcs כי הם בסינציציום הוא אחד הדטרמיניזם העיקרי של הטון וזרימת הדם, והאפנון של Vm יכול לספק דרך להתרחב או כלי דם נוקשים. לכן, חיוני להבין את המתודולוגיה הכרוכה בהקלטת Vm. מאמר זה מתאר הקלטה תאיים של Vm מתוך העורקים האמצעיים הבינוני canנולה (mcas) באמצעות שיטת מימון מיקרואלקטרודה. פרוטוקול זה יתאר כיצד להכין MCAs, microelectrodes, להגדיר את מד האלקטו לבצע את שיטת החלוקה כדי להקליט Vm. כמו כן, נתונים מייצגים, בעיות נפוצות שאירעו בעת שימוש בשיטה זו ונדונו בעיות פוטנציאליות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מספק את השלבים הדרושים על אופן השימוש בשיטת החלוקה מיקרואלקטרודה חדה כדי להקליט את Vm מהכנה של כלי קיבול. שיטה זו משמשת רבות, ומציעה הקלטות באיכות גבוהה ועקביות של Vm העונים על מגוון רחב של שאלות נסיוניות.
מספר שיקולים קריטיים ושלבי פתרון בעיות מתוארים כאן …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת בחלק על ידי מענקים מתוכנית מחקר תמיכה של הפנים (IRSP) מ UMMC, AHA מדען פיתוח מענק (13SDG14000006) הוענק Mallikarjuna R. פאבאלי.
Materials
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
- Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
- Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
- Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
- Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
- Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
- Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
- Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
- Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
- Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
- Coca, A., Garay, R. . Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , (1993).
- Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
- Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
- Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
- Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
- Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
- Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
- Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
- Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
- Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
- Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
- Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
- Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).
