中大脳動脈から膜電位を記録する微小電極浸入法
Summary
この記事の主な目的は、マイクロ電極衝撃法を用いて中大脳動脈から膜電位(V m)を記録する方法の詳細を提供することである。カニューアル化された中大脳動脈は、筋原性のトーンを得るために平衡化され、血管壁は、高抵抗マイクロ電極を使用して突き刺さる。
Abstract
血管平滑筋細胞の膜電位(Vm)は血管の緊張を決定し、したがって臓器への血流を決定する。イオンチャネルおよび疾患状態でVmを調節する電気原性ポンプの発現および機能の変化は、Vm、血管緊張、および血流を変化させる可能性がある。したがって、電気生理学の基本的な理解と、健康な状態や病気状態でVmを正確に記録するために必要な方法が不可欠である。この方法は、Vmを復元するために異なる薬理学的薬剤を使用してVmを調節することを可能にする。いくつかの方法がありますが、それぞれ長所と短所がありますが、この記事では、マイクロ電極の衝撃法を用いて中大脳動脈などのカニューズ抵抗血管からVmを記録するプロトコルを提供します。中大脳動脈は筋次室内で筋原性のトーンを得ることが可能であり、血管壁は高抵抗のマイクロ電極を使用して突き刺さる。Vm信号は、電気計を介して収集され、デジタル化され、分析されます。この方法は、細胞を損傷することなく、膜抵抗を変更することなく、血管壁のVmの正確な読み取りを提供します。
Introduction
細胞の膜電位(Vm)とは、血漿膜全体のイオン電荷の相対的な差と、これらのイオンに対する膜の相対的な透過性を指す。Vmはイオンの微分分布によって生成され、イオンチャネルおよびポンプによって維持される。K+、 Na+、および Clなどのイオン チャネルは、休止 Vmに実質的に寄与します。血管平滑筋細胞(VSMC)は、4種類以上のK+チャンネル1、2種類の電圧ゲートCa2+チャンネル(VGCC)2、2種類以上のCl-チャネル3を発現する。4,5、店舗運営Ca2+チャネル6、ストレッチ活性化陽イオンチャネル7、8、および電気原性ナトリウム-カリウムATPaseポンプ9は、その全てがプラズマ膜内にあり、そのすべてがVmの規制に関与する.
VSMCのVmは内気圧に依存する。非加圧血管では、Vmは-50から-65 mVまで変化しますが、加圧動脈セグメントでは、Vmは-37から-47 mV10の範囲です。血管内圧の上昇は、VSMCが脱分極11を引き起こし、VGCC開口の閾値を減少させ、筋因性トーン12の発症に寄与するカルシウム流入を増加させる。逆に、受動血管または非加圧血管において、膜過分化は、高いK+チャネル活性に起因して、VGCCが開くことを防ぎ、その結果、カルシウム入り口が限られ、細胞内カルシウムの減少に寄与し、血管の調子13.したがって、内気圧の変化によるVmは血管緊張発達に重要な役割を果たしているように見え、VGCCおよびK+チャネルの両方がVmの調節において重要な役割を果たしている。
Vmは、血管の種類と種によって異なります。Vmは、モルモット優れた腸間膜動脈ストリップ14、60mmHgルーメン圧力12におけるラット中脳動脈における-45±1 mV、および-35±1 mVのラット・パレンキマル動脈における40mmHgルーメン圧15における-54±1mVである。伸ばされていないラットリンパ筋に記録された残りのVmは、-48±2 mV16である。脳VSMCのVmは末梢動脈よりも陰性である。これに対し、ネコ中脳動脈は約-70mVのVmを持つことが報告され、腸間膜および冠動脈はそれぞれ-49と-58 mV、それぞれ17、18を持つことが報告された。血管床間のVmの違いは、イオンチャネルおよび電気原性ナトリウムカリウムポンプの発現および機能の違いを反映しうる。
Vmの増減は、それぞれ膜脱分極および過分極と呼ばれる。Vmにおけるこれらの変化は、イオンチャネルゲーティング、細胞シグナル伝達、筋肉収縮、作用電位伝播を含む多くの生理学的プロセスにおいて中心的な役割を果たす。一定の圧力では、K+チャネルを活性化する多くの内因性および合成血管拡張化合物が膜過分極を引き起こし、その結果、血管拡張1、13を生じる。逆に、持続的な膜脱分極は、アゴニスト誘発または受容体媒介血管収縮19において不可欠である。Vmは、VGCC13を介して Ca2+流入を規制するだけでなく、内部ストア 20、21およびCa2+の感度から Ca2+のリリースに影響を与える重要な変数です。収縮装置22.
異なる細胞タイプからVmを記録する方法はいくつかありますが、カニュート容器のマイクロ電極衝撃法から収集されたデータは、単離されたVSMCから得られたデータよりも生理学的であるように見えます。現在のクランプ法を用いて単離されたVSMCから記録された場合、VmはVSMC24における自発的過過極極と見なされる。分離されたVSMCはシンシチウムに含まれ、シリーズ抵抗の変化はVmの振動挙動に寄与する可能性がある。一方、Vmが無傷の血管から記録された場合、振動挙動は観察されず、おそらく動脈内の同期体であり、安定したVmにつながる血管全体に要約されるVSMC間の細胞接触によるものである。24.したがって、標準的なマイクロ電極衝撃技術を用いて加圧容器からのVmの測定は、生理学的条件に比較的近い。
カニュート血管からのVmの記録は、同期しているVSMCのVmが血管の緊張と血流の主要な決定要因の1つであり、Vmの変調が拡張する方法を提供することができるので、重要な情報を提供することができます。血管を収縮させる。したがって、Vmの記録に関わる方法論を理解することが不可欠である。本論文では、微小電極浸漬法を用いた中脳動脈(MCA)からのVmの細胞内記録について述べている。このプロトコルは、MCA、マイクロ電極を調作し、電気計をセットアップし、Vmを記録する衝撃法を実行する方法を説明します。また、代表的なデータ、この方法を使用する際に発生した一般的な問題、および潜在的な問題について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、カニューレト容器調製物からVmを記録するために鋭いマイクロ電極の衝撃法を使用する方法に関する必要な手順を提供します。この方法は広く使用され、実験的な質問の広い範囲に答えるVmの高品質で一貫した記録を提供しています。
メソッドを確実に成功させるために、いくつかの重要な考慮事項とトラブルシューティング手順について…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、UMMCの内部支援研究プログラム(IRSP)からの助成金、マリカルジュナ・R・パビディに授与されたAHAサイエンティスト開発助成金(13SDG14000006)の助成金によって一部支援されました。
Materials
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
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